本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)，主要涉及血漿乙醇檢測(cè)試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)：

乙醇(C₂H₅OH)俗稱酒精，是酒的主要成分。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人民生活水平日益提高，飲酒成為一種普遍的社會(huì)現(xiàn)象，然而也帶來(lái)了一系列影響深遠(yuǎn)的醫(yī)學(xué)問題和社會(huì)問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，全球每年飲酒人數(shù)大約20億，造成死亡人數(shù)多達(dá)180萬(wàn)，酒類已成為危害人類健康的第三大危險(xiǎn)因素。

飲酒后乙醇可于30min～90min內(nèi)在胃及腸道內(nèi)被完全吸收入血，15min～90min內(nèi)，濃度可達(dá)到峰值。其代謝主要是在肝臟內(nèi)被氧化分解，少量以原形經(jīng)呼吸道、尿、汗直接排出體外。一般乙醇中毒出現(xiàn)的癥狀為：興奮，狂躁，共濟(jì)失調(diào)，昏迷。長(zhǎng)期過量飲酒不僅可以引起酒精性肝病，而且心臟疾病、急性胰腺炎、胃腸道出血等疾病發(fā)病率明顯增加。近年來(lái)，飲酒人群呈現(xiàn)低齡化發(fā)展，因酒精導(dǎo)致青少年意外性傷害、猝死、性侵害的發(fā)生率不斷增加。飲酒所引發(fā)的問題越來(lái)越受到社會(huì)的廣泛關(guān)注。

目前，血液中乙醇濃度檢測(cè)的方法有：

1)氣相色譜法具有分離效率高、檢測(cè)靈敏度高、樣品用量少、選擇性好、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，但受限儀器設(shè)備因素難以廣泛用于普通實(shí)驗(yàn)室。

2)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用法結(jié)合了色譜定量和質(zhì)譜定性的強(qiáng)大功能，但儀器昂貴且需專人操作，維護(hù)保養(yǎng)麻煩，不能普及使用。

3)酶法由于酶促反應(yīng)的專一性、高效性，避免試樣中眾多共存組分的干擾，減少繁雜的預(yù)處理過程，縮短測(cè)定時(shí)間，節(jié)省試劑的用量，并獲得較高靈敏度。

電化學(xué)分析方法是根據(jù)物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律，建立在以電位、電導(dǎo)、電流和電量等電學(xué)量與被測(cè)物質(zhì)量之間的計(jì)量關(guān)系的基礎(chǔ)上，對(duì)組分進(jìn)行定性和定量的儀器分析方法。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有關(guān)于電化學(xué)分析方法檢測(cè)血漿乙醇的試劑盒及其使用方法的相關(guān)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明致力于提供一種試劑簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，使用方便的血漿乙醇檢測(cè)試劑盒及其使用方法，本試劑盒采用電化學(xué)分析法對(duì)血漿乙醇進(jìn)行快速準(zhǔn)確的測(cè)定。

本發(fā)明的血漿乙醇檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理為：利用待測(cè)血漿樣品中的乙醇在ADH酶特異性地催化下與氧化型輔酶I(NAD⁺)反應(yīng)生成乙醛及還原性輔酶I(NADH)，NADH在絲網(wǎng)印刷電極表面被氧化生成NAD⁺，同時(shí)失去電子產(chǎn)生電信號(hào)；利用電化學(xué)工作站對(duì)NADH所產(chǎn)生的氧化峰電流進(jìn)行檢測(cè)，其氧化峰電流與待測(cè)血漿樣品中乙醇的濃度呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血漿乙醇的間接定量分析。一種血漿乙醇檢測(cè)試劑盒，包括磷酸鹽緩沖液、氧化型輔酶I(NAD⁺)溶液、乙醇脫氫酶(ADH)溶液及絲網(wǎng)印刷電極。

其中，所述絲網(wǎng)印刷電極包括PET基板，PET基板上以碳漿印制工作電極和輔助電極、Ag/AgCl漿印制成參比電極，工作電極、輔助電極和參比電極與相應(yīng)的電極觸點(diǎn)間通過碳漿連接，再在PET基板上除工作電極、輔助電極和參比電極形成的一圓形工作區(qū)域外印刷上一層絕緣膠。

其中，更優(yōu)地，所述ADH溶液的濃度為360.0U/L，所述NAD⁺溶液的濃度為100.0mmol/L，所述磷酸鹽緩沖液為220.0mmol/L，pH＝10.4的磷酸鹽緩沖液。

其中，所述磷酸鹽緩沖液由220.0mmol/L磷酸鈉溶液與磷酸氫二鈉溶液配制。

本發(fā)明所述的血漿乙醇檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

1)將待測(cè)血漿樣品用所述磷酸鹽緩沖液稀釋，渦旋混勻；

2)分別取步驟1)得到的溶液、所述ADH溶液、所述NAD⁺溶液、所述磷酸鹽緩沖液于Ep管中渦旋混勻，在室溫下反應(yīng)12min，得到反應(yīng)混合液；

3)所述絲網(wǎng)印刷電極與電化學(xué)工作站連接，取步驟2)得到的所述反應(yīng)混合液滴加在所述電極的工作區(qū)域，用示差脈沖伏安法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物NADH的氧化峰電流進(jìn)行測(cè)定。

所述的血漿乙醇檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將所述待測(cè)血漿樣品用所述磷酸鹽緩沖液稀釋，渦旋混勻；

2)分別取步驟1)得到的溶液、360.0U/L的ADH溶液、100.0mmol/L的NAD⁺溶液以及220.0mmol/L，pH＝10.4的磷酸鹽緩沖液于Ep管中渦旋混勻，在室溫下反應(yīng)12min，得到反應(yīng)混合液，其中所述步驟1) 得到溶液，所述ADH溶液，所述NAD⁺溶液與所述磷酸緩沖液的體積比1∶1∶1∶20；

3)所述絲網(wǎng)印刷電極與電化學(xué)工作站連接，取步驟2)得到的所述反應(yīng)混合液滴加在所述電極的工作區(qū)域，用示差脈沖伏安法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物NADH的氧化峰電流進(jìn)行測(cè)定。

所述的血漿乙醇檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

1)取10μL所述待測(cè)血漿樣品于Ep管中，加入990μL的所述磷酸鹽緩沖液，渦旋混勻；

2)分別取步驟1)得到的溶液、360.0U/L的ADH溶液、100.0mmol/L的NAD⁺溶液各4μL，以及220.0mmol/L，pH＝10.4的磷酸鹽緩沖液80μL渦旋混勻，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)12min，得到反應(yīng)混合液；

3)所述絲網(wǎng)印刷電極與電化學(xué)工作站連接，將步驟2)得到的反應(yīng)混合液滴加在所述電極的工作區(qū)域，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物NADH的氧化峰電流進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)所述待測(cè)血漿樣品中的乙醇定量，其參數(shù)設(shè)置為：低電位0V，高電位+1.0V，電位增量0.005V、振幅0.1V、脈沖寬度0.05s、脈沖周期0.2s。

本發(fā)明所述血漿乙醇檢測(cè)試劑盒的有益效果如下：

1)本發(fā)明所述血漿乙醇檢測(cè)試劑盒使用絲網(wǎng)印刷電極配合電化學(xué)工作站對(duì)血漿乙醇進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)儀器操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，可移動(dòng)性強(qiáng)。

2)本發(fā)明使用的絲網(wǎng)印刷電極成本低，具有可批量制作的特點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)了電極的一次性使用，避免了對(duì)固體電極單調(diào)沉悶的打磨拋光；另外也避免重復(fù)使用造成實(shí)驗(yàn)交叉污染。

3)本發(fā)明所述的試劑盒中待測(cè)血漿樣品無(wú)需去蛋白等預(yù)處理，所用試劑種類少，用量小，降低了血漿乙醇檢測(cè)的成本，且可大大降低對(duì)環(huán)境的污染。

4)本發(fā)明所述的試劑盒用于血漿乙醇的檢測(cè)，檢測(cè)迅速，具有良好的精密度，較高的靈敏度，準(zhǔn)確度，可用于對(duì)血漿乙醇進(jìn)行快速準(zhǔn)確測(cè)定。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明絲網(wǎng)印刷電極結(jié)構(gòu)圖。

圖中1、工作電極，2、輔助電極，3、參比電極，4、圓形工作區(qū)域，5、PET基板。

圖2為血漿乙醇的示差脈沖伏安曲線圖。

圖中實(shí)線為加標(biāo)血漿示差脈沖伏安曲線，虛線為空白血漿示差脈沖伏安曲線。

圖3為本發(fā)明磷酸鹽緩沖液pH值影響NADH的氧化峰電流的曲線圖。

圖中◆代表血漿的氧化峰電流。

圖4為本發(fā)明NAD⁺濃度影響NADH的氧化峰電流的曲線圖。

圖5為本發(fā)明ADH濃度影響NADH的氧化峰電流的曲線圖。

圖6為本發(fā)明中NADH氧化峰電流對(duì)血漿乙醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖7為本發(fā)明血漿乙醇檢測(cè)結(jié)果與公安司法鑒定機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明電化學(xué)工作站僅以CHI852C電化學(xué)工作站為例，其購(gòu)自于上海辰華儀器有限公司，ADH購(gòu)于Sigma-Aldrich公司(A3263-7.5ku)，NAD⁺(Roche 10621650001)購(gòu)于羅氏控股股份有限公司。

實(shí)施例1：血漿乙醇檢測(cè)試劑盒的制備

1)配制磷酸鹽緩沖液：分別配制220.0mmol/L磷酸鈉與磷酸氫二鈉溶液，再按一定體積比混合配制pH＝10.4磷酸鹽緩沖液，置于容器中，2～8℃保存；

2)配制360.0U/L的ADH溶液：將購(gòu)買ADH的配制成濃度為360.0U/L的溶液，置于容器中，-20℃保存；

3)配制100.0mmol/L的NAD⁺溶液：將購(gòu)買的NAD⁺配制成濃度為100.0mmol/L的溶液，置于容器中，-20℃保存；

4)制備本發(fā)明所述絲網(wǎng)印刷電極的：

本發(fā)明所述絲網(wǎng)印刷電極是在聚對(duì)苯二甲酸二乙酯(PET)基板5上依次印刷碳漿、銀漿和絕緣漿。具體包括如下步驟：

a)清洗PET基板5，晾干后在PET基板5上印刷碳漿，制作工作電極1和輔助電極2，常溫干燥。

b)在上述PET基板5上印刷含有氯化銀的銀漿，制成參比電極3；上 述工作電極1、輔助電極2和參比電極3與相應(yīng)的電極觸點(diǎn)間以印刷的碳漿連接，常溫干燥。

c)避開工作電極區(qū)域4，在上述PET基板5上印刷絕緣漿，將導(dǎo)線覆蓋住，然后于30-40℃烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>

5)將制備的絲網(wǎng)印刷電極置于容器中；

6)將上述4個(gè)容器裝成血漿乙醇檢測(cè)試劑盒，封裝；將所述試劑盒置于-20℃保存(可保存6個(gè)月以上)，用前于室溫環(huán)境解凍即可。

實(shí)施例2：血漿乙醇檢測(cè)試劑盒的使用

1)將所述血漿乙醇檢測(cè)試劑盒置于室溫下解凍；

2)取10μL待測(cè)血漿樣品于Ep管中，加入990μL的磷酸鹽緩沖液，渦旋混勻；

3)分別取步驟2)得到的溶液、360.0U/L的ADH溶液、100.0mmol/L的NAD⁺溶液各4μL、220.0mmol/L(pH＝10.4)的磷酸鹽緩沖液80μL于Ep管中渦旋混勻，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)12min，得到反應(yīng)混合液；

4)將所述絲網(wǎng)印刷電極與CHI852C電化學(xué)工作站連接，將其參數(shù)設(shè)置為：低電位0V，高電位1.0V，電位增量0.005V、振幅0.1V、脈沖寬度0.05s、脈沖周期0.2s，將步驟3)得到的反應(yīng)混合液滴加在所述電極的工作區(qū)域，對(duì)NADH在電極所產(chǎn)生的氧化峰電流進(jìn)行檢測(cè)，其氧化峰電流與血漿中乙醇的濃度在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血漿乙醇的間接定量分析。

實(shí)施例3

本實(shí)施例是考察絲網(wǎng)印刷電極對(duì)酶催化反應(yīng)產(chǎn)物NADH的電化學(xué)響應(yīng)。分別對(duì)空白血漿和加標(biāo)血漿(本發(fā)明中指加入乙醇標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣本)進(jìn)行測(cè)定，操作步驟同實(shí)施例2，結(jié)果見圖2。虛線表示空白血漿的示差脈沖伏安曲線，圖中實(shí)線為加標(biāo)血漿的示差脈沖伏安曲線，說(shuō)明產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)為反應(yīng)產(chǎn)物NADH的電化學(xué)信號(hào)。

實(shí)施例4

本實(shí)施例是考察磷酸鹽緩沖液pH值對(duì)NADH的氧化峰電流(氧化峰電流◆表示)的影響。結(jié)果見圖3。pH在7.0～10.4時(shí)，隨著磷酸鹽緩沖液pH的增加氧化峰電流逐漸增加；在pH＝10.4時(shí)氧化峰電流最大，表明此時(shí)酶的活性最大；當(dāng) pH＞10.4，氧化峰電流迅速下降。磷酸鹽緩沖液pH值是乙醇檢測(cè)最關(guān)鍵的影響因素，直接影響酶催化反應(yīng)中酶的活性和氧化峰電流，故磷酸鹽緩沖液pH選擇10.4。

實(shí)施例5

本實(shí)施是考察酶催化反應(yīng)加入中NAD⁺濃度對(duì)NADH的氧化峰電流的影響。磷酸鹽緩沖液pH值為10.4，其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例3，在20.0～150.0mmol/L范圍內(nèi)考察NAD⁺濃度對(duì)所述氧化峰電流的影響，結(jié)果見圖4。在NAD⁺濃度大于100.0mmol/L時(shí)就可保證反應(yīng)充分進(jìn)行，過多的NAD⁺將造成試劑浪費(fèi)且降低氧化峰電流，故NAD⁺濃度選擇100.0mmol/L。

實(shí)施例6

本實(shí)施例是考察酶催化反應(yīng)中加入ADH濃度對(duì)NADH的氧化峰電流的影響。NAD⁺濃度為100.0mmol/L，其它實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)施例4，在200.0～500.0U/L范圍內(nèi)考察ADH濃度對(duì)氧化峰電流的影響，結(jié)果見圖5。當(dāng)ADH濃度為360.0U/L時(shí)信號(hào)最大，過多的ADH反而會(huì)降低氧化峰電流。故ADH濃度選擇為360.0U/L。

實(shí)施例7

本實(shí)施例是考察所述試劑盒定量血漿乙醇濃度與氧化峰電流之間的相關(guān)性。配制一系列含乙醇的血漿樣品(10.0～320.0)mg/100mL，在最優(yōu)的檢測(cè)條件(即220.0mmol/L，pH＝10.4磷酸鹽緩沖液，NAD⁺濃度選擇100.0mmol/L，ADH濃度選擇為360.0U/L)下，對(duì)NADH進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，NADH氧化峰電流與加入的乙醇濃度在(10.0～320.0)mg/100mL范圍內(nèi)呈良好的線性(圖6)，回歸方程為Y＝1.5839 1g X-1.5271(Y為氧化峰電流，X為乙醇濃度，r＝0.9928)。在信噪比為3(S/N＝3)時(shí)其最低檢測(cè)限為4.0mg/100mL。

實(shí)施例8

本實(shí)施例是考察本發(fā)明所述試劑盒用于測(cè)定血漿乙醇的精密度，在空白血漿中分別加入(10.0、40.0、160.0)mg/100mL濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，日內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5天，進(jìn)行精密度考察，結(jié)果見表1。變異系數(shù)最大為9.4％，表明本發(fā)明具有良好的精密度。

表1.精密度

實(shí)施例9

本實(shí)施例是考察本發(fā)明所述試劑盒用于測(cè)定血漿乙醇的回收率，在空白血漿中分別加入高、中、低濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定加入各濃度的乙醇前后血漿對(duì)應(yīng)的NADH氧化峰電流，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。相對(duì)回收率＝(加標(biāo)血漿中乙醇的濃度-空白血漿濃度)/加入乙醇的濃度×100％，結(jié)果見表2，回收率在81.4％～102.0％之間，表明本發(fā)明具有較好的準(zhǔn)確度。

表2.回收率

實(shí)施例10

本實(shí)施例是考察本發(fā)明所述試劑盒測(cè)定血漿乙醇與公安司法鑒定機(jī)構(gòu)(按照司法鑒定技術(shù)規(guī)范SF/Z JD0107001-2010，采用頂空進(jìn)樣GC法)測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性。分別用本發(fā)明所述試劑盒和司法鑒定機(jī)構(gòu)測(cè)定20例標(biāo)本，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，本發(fā)明所述試劑盒測(cè)定血漿乙醇結(jié)果和公安司法鑒定機(jī)構(gòu)測(cè)定結(jié)果具有良好的相關(guān)性(r＝0.9311)，說(shuō)明本發(fā)明所述試劑盒測(cè)定血漿乙醇穩(wěn)定、可靠，可用于實(shí)際標(biāo)本的檢測(cè)。