本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及CD81介導丙型肝炎病毒種屬特異性入侵的關(guān)鍵分子特征。

背景技術(shù)：

丙型肝炎病毒(HCV)感染是導致慢性肝病的主要原因，自1989年發(fā)現(xiàn)至今，HCV在全球范圍內(nèi)已感染1.7億人次，且由于缺乏疫苗，每年還有約300-400萬的新發(fā)感染，已成為世界范圍內(nèi)接受肝移植的首要病因。HCV感染的標準治療方法為聚乙二醇干擾素-α和利巴韋林聯(lián)合用藥，此治療方法可以引起持續(xù)病毒學應答(SVR)。但此方法存在明顯的缺陷，例如應答率不足50％，顯著的副作用，耐受性差，對晚期疾病治療無效等。為了更好的治療HCV感染，直接作用抗病毒藥物(DAAs)應運而生。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)最近批準了幾種蛋白酶抑制劑類DAAs，如Telaprevir(VERTEX),Boceprevir(Merck),Harvoni(Gilead Sciences)和Viekira Pak(AbbVie)。在標準治療方法中引入此類DAAs使得治療效果顯著改善，對治療有反應的患者數(shù)量明顯增加，治療周期明顯縮短。但此類藥物價格昂貴，想要利用此方法完全控制HCV傳播并不現(xiàn)實，HCV疫苗的研發(fā)勢在必行。

HCV是單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科，9.6kb的基因組翻譯產(chǎn)生全長3011個氨基酸的多聚蛋白，在細胞和病毒蛋白酶的共同作用下，其被切割產(chǎn)生3個結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白，E1，E2)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。

HCV病毒顆粒表面裝載著兩種表面蛋白E1和E2，二者以異源二聚體的形式存在。病毒入侵過程需要E1/E2異源二聚體與宿主細胞表面受體相互作用。參與HCV入侵過程的細胞表面受體有很多，其中有確切證據(jù)表明，糖胺聚糖(GAG)和低密度脂蛋白受體(LDL-R)是病毒顆粒與宿主細胞起始黏附所必須的。此外，還有4個受體確定參與病毒入侵過程，分別是清道夫受體B類1型(SR-B1)，CD81，Claudin-1和Occludin。

細胞表面蛋白CD81參與多種生理過程，例如免疫細胞的黏附，形態(tài)，活化，增殖，分化。該分子可以介導多種病原體的入侵，包括寄生蟲、細菌、真菌和病毒，其中最受關(guān)注的是該分子是HCV入侵必不可少的受體。CD81屬于四次跨膜蛋白超家族，哺乳動物的CD81通常是由236個氨基酸組成，主要由四個跨膜區(qū)，三個胞內(nèi)環(huán)和兩個胞外環(huán)串聯(lián)而成，其中兩個胞外環(huán)分別是一個小胞外環(huán)(SEL)和一個大胞外環(huán)(LEL)。CD81分子中大胞外環(huán)(LEL)是其發(fā)揮功能的重要區(qū)域，因為該區(qū)域負責與伴侶蛋白結(jié)合。據(jù)報道，CD81-LEL可以介導自身二聚并且直接結(jié)合HCV-E2。

由于HCV感染具有高度嚴格的宿主特異性，只有人和黑猩猩可支持HCV感染，HCV小動物模型的研發(fā)成為了阻滯HCV相關(guān)研究，特別是疫苗研發(fā)的瓶頸之一。HCV宿主特異性的基礎(chǔ)來源于病毒入侵過程的復雜性。CD81直接與HCV-E2相結(jié)合，其介導HCV的入侵具有很強的種屬特異性，只有人和黑猩猩的CD81以很高的親和力結(jié)合HCV-E2并支持HCV入侵，但其分子機制至今尚不明確。因此解析小鼠和非洲綠猴兩種不能支持HCV感染的動物的CD81-LEL的晶體結(jié)構(gòu)，對比發(fā)現(xiàn)其與人CD81-LEL晶體結(jié)構(gòu)中存在的差異，將揭示CD81介導HCV入侵種屬特異性的分子基礎(chǔ)，為感染性動物模型的建立提供篩選的理論依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供檢測待測動物中CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供的檢測待測動物中CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)在制備輔助檢測或輔助預測待測動物是否能被HCV感染的產(chǎn)品中的應用。

上述應用中，所述產(chǎn)品為試劑盒。

上述應用中，所述檢測待測動物中CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)包括如下1)和/或2)：

1)、用于蛋白結(jié)晶的試劑；

2)、記載XDS package軟件的可讀載體、記載Phaser軟件的可讀載體、記載COOT軟件的可讀載體和記載Phenix軟件的可讀載體。

上述應用中，

所述待測動物為人或小鼠或非洲綠猴。

本發(fā)明另一個目的是提供輔助檢測或輔助預測待測動物是否能被HCV感染產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，為檢測待測動物中CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基與第196位之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)。

上述產(chǎn)品中，

所述檢測待測動物中CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)包括如下1)和/或2)：

1)、用于蛋白結(jié)晶的試劑；

2)、記載XDS package軟件的可讀載體、記載Phaser軟件的可讀載體、記載COOT軟件的可讀載體和記載Phenix軟件的可讀載體

上述產(chǎn)品中，

所述待測動物為人或小鼠或非洲綠猴。

本發(fā)明第三個目的是提供檢測待測動物中CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供的檢測待測動物中CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)在鑒定HCV感染性動物模型中的應用。

本發(fā)明第四個目的是提供促進或抑制CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供的促進或抑制CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)在制備HCV感染性動物模型或細胞模型中的應用。

上述應用中，所述促進或抑制CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)為：使CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基和/或第196位氨基酸殘基產(chǎn)生突變的物質(zhì)。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過解析不支持HCV感染的小鼠CD81-LEL(mCD81-LEL)和非洲綠猴CD81-LEL(agmCD81-LEL)的三維晶體結(jié)構(gòu)，通過與支持HCV感染的人CD81-LEL(hCD81-LEL)結(jié)構(gòu)對比分析發(fā)現(xiàn)：在mCD81-LEL和agmCD81-LEL中分別存在188-196氨基酸殘基之間形成了分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵，而類似的分子內(nèi)相互作用在hCD81-LEL中是不存在的。綜上所述，188-196氨基酸殘基之間是否可形成的分子內(nèi)氫鍵/鹽鍵為成為判別是否支 持HCV入侵的序列標準之一，可以此特征為依據(jù)選擇支持HCV入侵的動物模型?？衫么颂卣鬏o助HCV疫苗設(shè)計。

附圖說明

圖1為分子篩層析圖譜。

圖2為mCD81-LEL和agmCD81-LEL溶液的SDS-PAGE電泳圖。

圖3為mCD81-LEL和agmCD81-LEL的Rikagu衍射結(jié)果。

圖4為mCD81-LEL和agmCD81-LEL的晶體照片。

圖5為mCD81-LEL和hCD81-LEL結(jié)構(gòu)對比圖。

圖6為agmCD81-LEL和hCD81-LEL結(jié)構(gòu)對比圖。

圖7為E2-CD81-LEL結(jié)合試驗。

圖8為CD81缺失Huh7.5.1細胞功能檢測

圖9為HCVpp感染試驗結(jié)果。

圖10為HCVcc感染試驗結(jié)果

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。

以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。

小鼠CD81大胞外環(huán)又稱mCD81-LEL，其氨基酸序列如序列表的序列1自N末端第113至202位氨基酸殘基所示；mCD81-LEL蛋白的編碼基因，又稱mCD81-LEL基因，其核苷酸序列如序列表的序列2自5’末端第229至608位核苷酸所示；

非洲綠猴CD81大胞外環(huán)又稱agmCD81-LEL，氨基酸序列如序列表的序列3自N末端第113至202位氨基酸殘基所示；agmCD81-LEL蛋白的編碼基因，又稱agmCD81-LEL基因，其核苷酸序列如序列表的序列4自5’末端第229至608位核苷酸所示。

質(zhì)粒pET-28a(+)：Novagen:69864-3。大腸桿菌Rosseta：Novagen:71402-4。

實施例1、小鼠CD81大胞外和非洲綠猴CD81大胞外環(huán)的蛋白結(jié)構(gòu)差異

(一)mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白的制備

一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將序列表的序列2自5’末端第229至608位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入質(zhì)粒pET-28a(+)的Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點之間，得到重組質(zhì)粒pET28a-mCD81-LEL；

將序列表的序列4自5’末端第229至608位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入質(zhì)粒pET-28a(+)的Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點之間，得到重組質(zhì)粒pET28a-agmCD81-LEL。

二、mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白的制備

1、將步驟一得到的重組質(zhì)粒pET28a-mCD81-LEL和pET28a-agmCD81-LEL導入大腸桿菌Rosseta的感受態(tài)細胞，得到重組菌。

2、將步驟1得到的重組菌的單克隆接種至20ml含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。

3、取20ml步驟2得到的菌液，以1：50的體積比接種至1L含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)至OD600nm＝1.2后放置冰上；冰上放置半小時后加入IPTG并使其濃度為0.5mmol/L，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)5小時。

4、取完成步驟3的培養(yǎng)體系，4000rpm離心15min，收集菌體，用100ml裂解液(溶劑為pH8.5、50mM的Tris-HCl緩沖液，含100mM NaCl)重懸，然后在冰上進行超聲波破碎(功率600W，作用5s，間隔5s，99次)，然后15000rpm離心30min，取沉淀即包涵體進行變性復性。

5、包涵體加150mL變性液(8M Urea,100mM NaH2PO4,10mM Tris-HCl pH8.5)溶解，攪拌至完全溶解，4℃，12000rpm，30min離心后取上清，倒入透析袋中浸入1L變性液中，向其中滴加2L透析液(50mM Tris-HCl pH 8.5,100mM NaCl)，滴加完成后銅洗液中尿素終濃度位2.67M；次日倒出2L再加入2L透析液，此時尿素終濃度為0.89M，次日全部倒出向其中加入2L透析液，此時尿素終濃度為0M，經(jīng)梯度透析復性后得到可溶性的mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白,12000rm，30min離心后取上清。

6、將步驟5得到的上清上樣于鎳柱，先用10倍柱體積的除雜液(溶劑為水，含100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH8.5)洗脫以去除雜蛋白，再用洗脫液(溶劑為水，含100mM NaCl，50mM Tris-HCl，300mM咪唑，pH8.5)洗脫以收集目的蛋白，取過柱后的洗脫液。

7、將步驟6得到的鎳柱洗脫液加50μL Thrombin，倒入透析袋中透析切除N-端6×His tag，透析液為50mM Tris-HCl pH8.5,100mM NaCl。透析過夜后將溶液自透析袋中倒出，4℃，4000rpm，30min離心除去可能存在的沉淀。

8、取步驟7得到的溶液，采用截留分子量為3KD的超濾濃縮管進行超濾濃縮，得到1ml左右的濃縮液。

9、將步驟8得到的濃縮液上樣并進行分子篩層析。

分子篩層析采用選用Suerdex75 10/300柱子進行進一步分離純化，洗脫液：50mM Tris-HCl pH 8.5，100mM NaCl。流速為0.5ml/min，收集保留體積為12mL-16mL之間的過柱后洗脫液(圖1)。

10、取步驟9得到的過柱后溶液，采用截留分子量為3KD的超濾濃縮管進行超濾濃縮，得到約1mL的溶液(蛋白濃度約為30mg/ml)，將其分別命名為mCD81-LEL(10KD，圖2a)和agmCD81-LEL蛋白(10KD，圖2b)。

采用同樣的方法，制備hCD81-LEL(10KD)。

(二)、mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白的晶體解析

取(一)獲得的mCD81-LEL蛋白溶液(溶劑為50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH 8.5的緩沖溶液)與結(jié)晶緩沖液(0.1M Sodium Citrate pH5.5,5％PEG1000,35％isopropano))按照體積比為1:1混勻，在22℃下結(jié)晶3天獲得mCD81-LEL晶體，并解析得到結(jié)構(gòu)。

取(一)獲得的agmCD81-LEL蛋白溶液(溶劑為50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH 8.5的緩沖溶液)與結(jié)晶緩沖液(5％Ethanol,5％MPD,0.1M Tris pH8.5,200mM Sodium Chloride)按照體積比為1:1混勻，在22℃下結(jié)晶2天獲得agmCD81-LEL晶體，并解析得到結(jié)構(gòu)。

取(一)獲得的hCD81-LEL蛋白溶液(溶劑為50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH 8.5的緩沖溶液)與結(jié)晶緩沖液(0.2M Magnesium acetate,20％PEG3350)按照體積比為1:1混勻，在22℃下結(jié)晶2天獲得hCD81-LEL晶體，并解析得到結(jié)構(gòu)。

mCD81-LEL晶體和agmCD81-LEL晶體分別在瑞士同步輻射(SLS)X06DA線站和本實驗室家用RigakuX射線衍射儀上收集。對數(shù)據(jù)進行初步的處理與整合(XDS package)后，通過分子置換(Phaser,CCP4package)的方法解析結(jié)構(gòu)生成電子云密度圖，經(jīng)過逐步的精 修和優(yōu)化(COOT和Phenix)得到最終的結(jié)構(gòu)。

mCD81-LEL晶體和agmCD81-LEL晶體的衍射結(jié)果見圖3(左圖為小鼠CD81-LEL晶體衍射結(jié)果；右圖為非洲綠猴CD81-LEL晶體衍射結(jié)果)和表1。晶體結(jié)構(gòu)照片見圖4(左圖為小鼠CD81-LEL晶體；右圖為非洲綠猴CD81-LEL晶體)。

表1為晶體數(shù)據(jù)

將mCD81-LEL晶體和agmCD81-LEL晶體通過X射線衍射后收集數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行初步的處理與整合(XDS package)后，通過分子置換(Phaser,CCP4package)的方法解析結(jié)構(gòu)生成電子云密度圖，經(jīng)過逐步的精修和優(yōu)化(COOT和Phenix)得到最終的結(jié)構(gòu)，分析晶體中氫鍵或鹽鍵。以hCD81-LEL晶體為對照。

mCD81-LEL晶體檢測結(jié)果如圖5，左圖為mCD81-LEL晶體結(jié)構(gòu)的電子云密度圖局部，右圖為mCD81-LEL晶體和hCD81-LEL晶體結(jié)構(gòu)對比，金色為小鼠，藍色為人；

agmCD81-LEL晶體檢測結(jié)果如圖6所示，右圖為agmCD81-LEL晶體結(jié)構(gòu)的電子云密度圖局部，左圖為agmCD81-LEL晶體和hCD81-LEL晶體結(jié)構(gòu)對比，綠色為非洲綠猴，藍色為人?？梢钥闯?，

CD81-LEL是直接介導與HCV-E2結(jié)合的Loop，從小鼠到人CD81-LEL的氨基酸序列是高度保守的，但只有人和大猩猩的CD81可以以納摩爾級親和力結(jié)合HCV-E2并且介導HCV入侵。通過多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，CD81-LEL的序列在人和大猩猩中是完全相同的，而在人、非洲綠猴和小鼠中存在著細微的差別(81％-96％的序列同源性)，其中agmCD81-LEL和hCD81-LEL之間只有四個氨基酸殘基的差別(殘基163,186,188和196)，把CD81與HCV的E2結(jié)合決定性因素的識別范圍限制在此四個氨基酸殘基內(nèi)。基于結(jié)構(gòu)的序列分析發(fā)現(xiàn)，此四個氨基酸殘基所處的區(qū)域是最不保守的，其中已知的是F186對于直接結(jié)合E2至關(guān)重要，而其他殘基的貢獻尚不明確。CD81-LEL的多序列比結(jié)果顯示，能夠介導HCV入侵的CD81的188位殘基一般是帶負電的，而在不能介導HCV入侵的CD81中188位氨基酸殘基往往是電中性的或者是帶正電的。

hCD81-LEL和mCD81-LEL的晶體經(jīng)X射線衍射都得到了高分辨率的數(shù)據(jù)，最終的模型都表現(xiàn)出了良好的立體化學性質(zhì)。mCD81-LEL結(jié)構(gòu)的整體構(gòu)象與hCD81-LEL類似，都是由5個α-螺旋組成的“蘑菇型”結(jié)構(gòu)。hCD81-LEL和mCD81-LEL的結(jié)構(gòu)重疊疊加得出的r.m.s.d值為87Cα原子。在高分辨率結(jié)構(gòu)信息的支持下，在原子水平對結(jié)構(gòu)細節(jié)進行分析發(fā)現(xiàn)，在mCD81-LEL的Q188和E196之間存在一個分子內(nèi)氫鍵(Q188Nε2-H:E196 Oε2,distance:angle:124)。值得注意的是，此氫鍵在hCD81-LEL中是不存在的，在hCD81-LEL中對應位置的E188和D196都是帶負電的，其側(cè)鏈由于靜電排斥的作用而相距甚遠。兩個殘基之間最近的距離為E188 Oε2:D196 Oδ2,

從序列中可以看出在agmCD81-LEL中，188位是一個帶正電的賴氨酸，理論上可以和D196之間形成鹽鍵，agmCD81-LEL的晶體X射線衍射分辨率達到了其結(jié)構(gòu)顯示殘基K188和殘基D196之間形成了鹽鍵，但該鍵強度較弱，可能是由于D196的側(cè)鏈長度不夠造成的。

上述實驗表明，

人CD81-LEL的188位的谷氨酸和196位的天冬氨酸之間即不存在氫鍵也不存在鹽鍵，

mCD81-LEL的188位的谷氨酰胺和196位的谷氨酸之間存在一個分子內(nèi)氫鍵，agmCD81-LEL的188位的賴氨酸和196位的天冬氨酸之間形成鹽鍵。

目前公知人可以感染HCV，小鼠和非洲綠猴不可以感染HCV，比較三個CD81-LEL的差別，得出可以根據(jù)檢測待測動物的CD81-LEL蛋白晶體結(jié)構(gòu)，其188和196氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵可以預測待測動物是否為能被HCV感染，若待測動物的CD81-LEL的第188位氨基酸殘基和第196位氨基酸殘基之間不能形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵，則待測動物能或候選能被HCV感染；

若待測動物的CD81-LEL的第188位氨基酸殘基和第196位氨基酸殘基之間能形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵，則待測動物不能或候選不能被HCV感染。

人的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間不能形成分子內(nèi)氫鍵也不能形成鹽鍵，人能被HCV感染；人的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基為谷氨酸，且第196位氨基酸殘基為天冬氨酸；

小鼠的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間形成的分子內(nèi)氫鍵，小鼠不能被HCV感染；小鼠CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基為谷氨酰胺，且第196位氨基酸殘基為谷氨酸；

非洲綠猴的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間形成的分子內(nèi)鹽鍵，非洲綠猴不能被HCV感染；非洲綠猴的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸殘基為賴氨酸，且第196位氨基酸殘基為天冬氨酸。

輔助預測或輔助檢測待測動物是否為能被HCV感染的試劑盒包括將用于檢測待測動物的CD81-LEL第188位氨基酸殘基與第196位氨基酸殘基之間能否形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵的物質(zhì)，物質(zhì)包括結(jié)晶緩沖液、記載XDS package軟件的可讀載體、記載Phaser軟件的可讀載體、記載COOT軟件的可讀載體和記載Phenix軟件的可讀載體。

實施例2、輔助預測或輔助檢測待測動物是否為能被HCV感染

一、蛋白的制備

采用實施例1的方法，制備人CD81-LEL蛋白(hCD81-LEL，氨基酸序列為序列5)、小鼠CD81-LEL蛋白和非洲綠猴CD81-LEL蛋白。

二、蛋白結(jié)晶

按照實施例1的方法結(jié)晶，得到人CD81-LEL蛋白晶體、小鼠CD81-LEL蛋白晶體和非洲綠猴CD81-LEL蛋白晶體。

三、檢測蛋白晶體中的氫鍵或鹽鍵

采用實施例1的方法，用XDS package，Phaser,COOT和Phenix軟件分析人CD81-LEL蛋白晶體、小鼠CD81-LEL蛋白晶體和非洲綠猴CD81-LEL蛋白晶體，檢測上述人CD81-LEL蛋白晶體、小鼠CD81-LEL蛋白晶體和非洲綠猴CD81-LEL蛋白晶體中的第188位氨基酸殘基和第196位氨基酸殘基之間是否形成氫鍵或鹽鍵。

結(jié)果：

人CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基和第196位氨基酸殘基之間沒有形成氫鍵或鹽鍵，預測人能被HCV感染；

小鼠CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基和第196位氨基酸殘基之間沒有形成氫鍵，預測小鼠不能被HCV感染；

非洲綠猴CD81-LEL蛋白晶體第188位氨基酸殘基和第196位氨基酸殘基之間沒有形成鹽鍵，預測非洲綠猴不能被HCV感染。

這與已知人可以被HCV感染，而小鼠和非洲綠猴不能被HCV感染一致，說明本發(fā)明的方法正確。

實施例3、CD81-LEL蛋白晶體188-196氨基酸殘基之間是否形成氫鍵去檢測是否被HCV感染的驗證

一、結(jié)合試驗

為研究CD81-LEL中188-196殘基之間分子內(nèi)鍵和HCV-E2結(jié)合親和性的之間的關(guān)系，根據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計突變原核表達CD81-LEL及一系列突變體，利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法檢測其與重組可溶性HCV-E2之間的結(jié)合能力。

針對人CD81-LEL蛋白晶體，則第188位為谷氨酸且196位為天冬氨酸，不能形成氫鍵或鹽鍵，如果突變?yōu)槠渌瑒t可能形成氫鍵或鹽鍵；

針對小鼠CD81-LEL蛋白晶體，則第188位為谷氨酰胺且196位為谷氨酸，能形成氫鍵，如果突變?yōu)槠渌?，則不形成氫鍵；

針對非洲綠猴CD81-LEL蛋白，則第188位為賴氨酸且196位為天冬氨酸，能形成鹽鍵，如果突變?yōu)槠渌瑒t不形成鹽鍵；

下述CD81-LEL及其突變體分別為：hCD81-LEL(hCD81-WT，氨基酸序列為序列5)、hCD81-LEL-E188K(為將序列5第196位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?、hCD81-LEL-D196E(為將序列5第196位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?、hCD81-LEL-D196Q(為將序列5第196位天冬氨酸突變?yōu)楣劝滨０?、hCD81-LEL-D196K(為將序列5第196位天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼?、hCD81-LEL-D196R(為將序列5第196位天冬氨酸突變?yōu)榫彼?、hCD81-LEL-D196E(為將序列5第196位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?、hCD81-LEL-D196E-E188K(為將序列5第196位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼?，且將?88位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?、mCD81-LEL(mCD81-WT)、mCD81-LEL-L186F(為將序列1第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?、mCD81-LEL-L186F-Q188E(為將序列1第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?88位谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼?、mCD81-LEL-L186F-E196D(為將序列1第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?96位谷氨酸突變?yōu)樘於彼?、mCD81-LEL-L186F-Q188A(為將序列1第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?88位谷氨酰胺突變?yōu)楸彼?、mCD81-LEL-L186F-Q188E E196D(為將序列1第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?88位谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼?，?96位谷氨酸突變?yōu)樘於彼?、agmCD81-LEL(agmCD81-WT)、agmCD81-LEL–L186F(為將序列3第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?、agmCD81-LEL–L186F-K188A(為將序列3第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?88位賴氨酸突變?yōu)楸彼?、agmCD81-LEL–L186F-E196D(為將序列3第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?96位谷氨酸突變?yōu)樘於彼?、agmCD81-LEL–L186F-K188E-E196D(為將序列3第186位亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?88位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?96位谷氨酸突變?yōu)樘於彼?。

具體實驗操作如下：

本試驗中CD81-LEL及其突變體作為捕獲抗體固定在板子上(1μg/well)，用包被緩沖液(PBS,137mM NaCl,8.1mM Na₂HPO₄,1.5mM KH₂PO₄,2.7mM KCl,pH 7.4)將蛋白稀釋至10μg/mL，每孔中加100μL，封板后4℃過夜。每孔中加250μL封閉液(5％non-fat miLk in PBST)室溫孵育2h后，用PBST溶液(0.05％Tween-20)洗板一次。把重組可溶性E2蛋白(序列6)稀釋至500ng/mL加入到孔內(nèi)，室溫孵育2h后，用PBST溶液(0.05％Tween-20)洗板3次。加入E2抗體(0.5μg/mL,100μL/weLL)室溫孵育2h。再次用PBST溶液(0.05％Tween-20)洗板3次后，在孔中加入HRP標記的二抗，室溫孵育1h。使用TMB(SoLarbio science&technology co.,LTD)作為底物進行檢測，所有試驗平行重復3次。

結(jié)果如圖7所示，在所有CD81-LEL的野生型和突變體中，hCD81-LEL與E2具有最高的結(jié)合親和力，而mCD81-LEL和agmCD81-LEL與E2的結(jié)合親和力幾乎檢測不到。如hCD81-LEL-D196E為在hCD81-LEL中進行D196E的保守突變，188-196殘基之間不能形成氫鍵或者鹽鍵，則該突變對其與E2的結(jié)合親和力幾乎沒有任何影響。hCD81-LEL-E188K的單點突變使得188位電性翻轉(zhuǎn)，突變體中K188-D196之間可以形成微弱的鹽鍵(K-D的配對是被agmCD81b-LEL的結(jié)構(gòu)所啟發(fā))，該突變體與E2得結(jié)合親和力下降大約20％。而hCD81-LEL-D196E-E188K的雙點突變中，196位的D突變成E延伸了側(cè)鏈長度，并同時保持E188K的突變的電性翻轉(zhuǎn)，促使188-196位點之間可以形成穩(wěn)定K-E配對型鹽鍵，該突變體與E2的結(jié)合親和力下降了約80％，類似于不能介導HCV入侵的CD81-LEL。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示K-D配對的鹽鍵由于側(cè)鏈長度不足，形成的鹽鍵不夠穩(wěn)定，不能對螺旋-D的構(gòu)象構(gòu)象靈活性產(chǎn)生足夠的束縛作用，所以與E2仍有一定的結(jié)合力。與之相比，K-E配對型的鹽鍵足夠穩(wěn)定，可以對螺旋-D的構(gòu)象靈活性產(chǎn)生強有力的束縛作用，所以其與E2的結(jié)合親和力顯著下降。正如預期所料，D196K和D196R此類196位發(fā)生電性翻轉(zhuǎn)的突變體，其與E2的結(jié)合親和力都顯著降低，此結(jié)果證實188-196位點之間K-E和E-R配對都足夠形成穩(wěn)定的鹽鍵，對螺旋-D的構(gòu)象靈活性產(chǎn)生束縛作用從而削弱其與E2的結(jié)合親和力。

同時，mCD81-LEL-D196Q的突變可以促使Q196-E188之間形成氫鍵，該突變體與mCD81-LEL結(jié)構(gòu)中觀察到了Q188-E196配對的氫鍵方向相反，結(jié)果也證明該突變導致了其與E2結(jié)合能力的顯著下降。

設(shè)計的hCD81-LEL-D196E-E188K突變體，等同于在hCD81-LEL中引入了和mCD81-LEL中Q188-E196配對相同的分子內(nèi)氫鍵，該突變體與E2的結(jié)合親和力下降到了背景的水平，盡管此時F186仍然是存在的。

結(jié)果證實誘導hCD81-LEL 188-196位間形成氫鍵或者鹽鍵，會削弱其與E2的結(jié)合親和力；接下來設(shè)計了mCD81-LEL和agmCD81-LEL的不同突變體，破壞其分子內(nèi)天然存在的188-196間氫鍵或鹽鍵，分析是否可以增強其與HCV-E2的結(jié)合能力。之前有研究報道，F(xiàn)186位點對于其與E2的結(jié)合至關(guān)重要，首先對L186F單點突變的貢獻進行研究，結(jié)果顯示L186F的單點突變后其與HCV-E2的結(jié)合能力并無明顯增強。接下來，在保持L186F突變的同時，在mCD81-LEL引入了Q188E，Q188A，E196D，Q188E/E196D(一個類似hCD81的188-196氨基酸的組合)的不同突變，擾亂188-196之間的化學鍵，結(jié)果顯示與L186F單點突變和野生型mCD81-LEL相比，這些突變體與E2的結(jié)合親和力有了提高。在agmCD81-LEL中引入K188A或者K188E的單點突變破壞188-196之間的化學鍵，同樣觀察到了類似的結(jié)果，與 L186F單點突變體和野生型agmCD81-LEL相比，其與E2的結(jié)合親和力有了改善。在agmCD81-LEL中引入E196D的突變的設(shè)計是通過縮短羧基側(cè)鏈來削弱K188-D196之間鹽鍵，該突變改善了其E2的結(jié)合，再次證明了K-D配對型鹽鍵不夠穩(wěn)定，不能對螺旋-D的構(gòu)象靈活性產(chǎn)生足夠的束縛作用，并削弱其與E2的結(jié)合能力。

上述結(jié)果表明，在CD81-LEL的第188和196位氨基酸之間沒有形成氫鍵或鹽鍵可以結(jié)合HCVE2蛋白，如果形成氫鍵或鹽鍵，則不能結(jié)合HCVE2蛋白。

二、病毒入侵試驗

上述結(jié)合實驗進一步證明，在CD81-LEL中發(fā)現(xiàn)的188-196分子內(nèi)鍵影響其與HCV-E2的結(jié)合能力，但尚未可知在生理條件下該分子內(nèi)鍵是否影響CD81介導HCV入侵的功能，利用病毒入侵試驗對其進行深入研究。

1、構(gòu)建CD81缺陷型Huh7.5.1細胞系

進行病毒入侵試驗之前，首先利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立了CD81缺陷型的Huh7.5.1細胞系(Huh7.5.1^CD81-)。

具體如下：

為減少脫靶效應，本試驗設(shè)計兩條sgRNA，序列如下CD81-sgRNA1-F:CAC CGG CGC CCA ACA CCT TCT ATG T；CD81-sgRNA1-R:AAA CAC ATA GAA GGT GTT GGG CGC C；CD81-sgRNA2-F:CAC CGC ATG ATG TTC GTT GGC TTC C；CD81-sgRNA2-R:AAA CGG AAG CCA ACG AAC ATC ATG C。首先將sgRNA構(gòu)建到線性化好的lentiCRSPER(addgene，49535)載體上。轉(zhuǎn)染前18～24小時用含10％FBS的培養(yǎng)基在10cm平皿內(nèi)接種培養(yǎng)293T細胞，37℃，CO₂(5％)恒溫培養(yǎng)過夜，次日細胞密度達到80％為適。18～24小時后使用TransMAXi轉(zhuǎn)染試劑(北京北方健特生物科技有限公司)共轉(zhuǎn)染構(gòu)建的重組載體與pVSVg(addgene，8454)質(zhì)粒和psPAX2(addgenen，12260)質(zhì)粒，在293T細胞中包裝過表達sgRNA的慢病毒。48～72小時后收集上清，離心，分裝。-70℃冰箱保存，備用。

sgRNA的慢病毒感染Huh7.5.1細胞(由Dr.Francis Chisari惠贈，記載在如下文獻中，Zhong J,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 2005；102:9294-9299.)，感染48h后，將Huh7.5.1細胞進行傳代，在含10％胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。兩周后，分離得到穩(wěn)定的細胞克隆Huh7.5.1^CD81-。

利用Trizol試劑收取部分細胞，提取細胞總RNA，以總RNA為模板，使用QuantiFast SYBR Green熒光實時定量RT-PCR試劑盒(購于TakaRa公司)對細胞內(nèi)宿主基因CD81的mRNA水平進行定量測定。此外，用HCVcc感染Huh7.5.1^CD81-細胞，感染48h后對HCV病毒基因組的RNA水平進行絕對定量檢測。本系統(tǒng)中反轉(zhuǎn)錄和PCR都在同一個反應體系中完成，反應體系包括(20uL)：上下游引物(10uM)各0.6uL，RNA模板1uL，酶混合物(RNA反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶)0.2ul，2xQuantiFastSYBR GreenRT-PCRMaster Mix 10uL，RNA-free水7.6ul。反應條件為50℃，10min；95℃，5min；40次循環(huán)反應，循環(huán)條件為95℃，10s，60℃，30s；溶解曲線65～95℃連續(xù)。

RT-PCR引物序列：

CD81：上游5′-TGTTCTTGAGCACTGAGGTGGTC-3′

下游5′-TGGTGGATGATGACGCCAAC-3′；

HCV 5’UTR：上游5′-GTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3′

下游5′-CTCCCGGGGCACTCGCAAGC-3′

結(jié)果如圖8所示，(a)構(gòu)建Huh7.5.1^CD81-的原理是使用慢病毒介導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。(b)使用qRT-PCR分別檢測和CD81缺陷型Huh7.5.1細胞中內(nèi)源性CD81RNA的水平；(c)使用基因型H77的包膜蛋白包被的HCVpp分別感染和CD81缺陷型Huh7.5.1細胞，用熒光酶素基因報告系統(tǒng)進行定量；(d)使用HCVcc分別感染和CD81缺陷型Huh7.5.1細胞，分別使用qRT-PCR(d)和In-Cell Western assay(e)的方法對細胞內(nèi)HCV基因組RNA的拷貝數(shù)和感染灶的數(shù)量進行定量，與缺失前的naive Huh7.5.1細胞相比，在Huh7.5.1CD81-細胞中幾乎檢測不到內(nèi)源性CD81的mRNA。此外，當Huh7.5.1細胞被HCVcc感染的時候，細胞內(nèi)HCV的RNA的水平明顯下降了。以上結(jié)果表明Huh7.5.1^CD81-細胞可以作為一種很好的模型來研究病毒感染時CD81在環(huán)境中的功能。

2、擴增HCVpp和HCVcc病毒顆粒

1)假病毒的制備

轉(zhuǎn)染前18～24小時在10cm平皿內(nèi)接種培養(yǎng)293T細胞，37℃，CO2(5％)恒溫培養(yǎng)過夜，18～24小時后用TransMAXi轉(zhuǎn)染試劑分別共轉(zhuǎn)染等量PNL4-3.Luc.R-E-(由Dr.F.Cosset惠贈，Bartosch B，et al.J Exp Med 2003；197:633-642.)和空載體、等量PNL4-3.Luc.R-E-和PCMV-E1E2(由Dr.Linqi Zhang惠贈McKeating JA，et al.J Virol2004；78:8496-8505)及等量PNL4-3.Luc.R-E.-和VSV-G，分別產(chǎn)生Env-PP、HCV假病毒顆粒HCVpp及VSV-G假型慢病毒VSVpp。48～72小時后收集上清，離心，分裝。-70℃冰箱保存，備用?？稍谄渲屑尤?～8μg/ml的聚凝胺以保持病毒活力。

2)JFH1HCVcc的制備

用實驗室原有的JFH1HCVcc(J Virol.2008Jul；82(14):7034-46.doi:10.1128/JVI.00118-08.Epub 2008May 14.Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.Steinmann E1,Brohm C,Kallis S,Bartenschlager R,Pietschmann T.)感染Huh7.5.1細胞，通過不斷地傳代培養(yǎng)，收集含有病毒顆粒的細胞上清。一般隔2天后收集1次細胞培養(yǎng)上清。對收集的上清首先進行450×g離心5分鐘，以去掉其中的細胞碎片等沉淀物，然后5ml/15ml離心管分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3、HCVpp感染試驗

為了降低轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達水平對試驗的影響，使用免疫印記(Western Blotting)對外源CD81野生型及突變體重組質(zhì)粒的表達進行定量。

將上述二中的CD81及其突變體編碼基因分別插入pcDNA3.1-myc(Invitrogen)表達載體的BamHI和XhoI位點，得到不同的表達不同蛋白的重組載體。

將不同的表達不同蛋白的重組載體分別轉(zhuǎn)入Huh7.5.1^CD81-，得到轉(zhuǎn)染不同CD81的轉(zhuǎn)基因細胞。

轉(zhuǎn)染不同CD81的轉(zhuǎn)基因細胞使用添加了蛋白酶抑制劑(Sigma or Pierce)的裂解液(50mMTris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,1％Nonidet P40,50mM NaF,1mM Na₃VO₄,5mMβ-glycerophosphate,1mM dithiothreitol,1mM phenylmethylsulfonyL fluoride)在冰上裂解后，14,000×g 20min離心。樣品加入2×SDS上樣緩沖液(Loading buffer)后煮沸處理，使用9-12％SDS-PAGE膠進行電泳。之后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Bio-Rad,Hercules,CA)，10％牛奶封閉1h，4℃孵育一抗過夜。二抗使用的時 1:2000稀釋的HRP標簽的anti-IgG抗體。ECL試劑(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)作為檢測底物。實驗結(jié)果表明CD81野生型和所有突變體的表達量水平相當。

轉(zhuǎn)染不同CD81的轉(zhuǎn)基因細胞在轉(zhuǎn)染24h后，每孔中加入200μL包含HCVpp，VSV-Gpp或者bald virus的上清，8μg/mL聚凝胺和2μL 2M HEPES(pH 7.55)，在臺式離心機中旋轉(zhuǎn)感染1.5h(2500rpm,30CeLsius degree)，再在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5h。旋轉(zhuǎn)感染后48h，裂解細胞，使用ModuLus MicropLate Luminometer(Turner BioSystems,Sunnyvale,CA,USA)對熒光酶素檢測系統(tǒng)(Luciferase Assay System，Promega,Madison)進行檢測。所有的試驗重復三次。通常計數(shù)范圍為10,000-900,000，而bald virus感染的作為背景的信號通常低于100。所有試驗重復三次。

結(jié)果如圖9所示，a為HCVpp入侵試驗結(jié)果，b為western－blot試驗結(jié)果，HCVpp感染試驗與ELISA檢測的HCV-E2結(jié)合試驗結(jié)果相同。在hCD81中引入D196E保守突變，HCVpp的入侵效率幾乎沒有任何損失；而如果在hCD81中引入D196Q，D196K，D196R，E188Q/D196E和E188K/D196E這些利于形成188-196間化學鍵(氫鍵或者鹽鍵)的突變，則會引起HCVpp入侵效率的顯著下降。E188K的突變可以促使188-196間形成一個較弱的K-D型鹽鍵，此鍵對HCVpp入侵效率影響基本可以忽略。在破壞188-196間分子內(nèi)鍵增加mCD81或agmCD81介導HCVpp入侵的效率之前，先評估了L186F單點突變的影響，如圖所示，在mCD81和agmCD81中引入L186F的單點突變，HCVpp的入侵效率會有輕微的升高。如果保留L186F的同時，在mCD81中引入了其他的突變Q188E，Q188A，E196D，和Q188E/E196D來破壞188-196之間的化學鍵，與天然的mCD81和L186F單點突變相比HCVpp的入侵效率有了明顯的提升。在agmCD81中得到了類似的結(jié)果，保留L186F突變的同時引入K188A，K188E和K188E/E196D的突變破壞188-196分子內(nèi)鍵，使得HCVpp的入侵效率有了顯著的提高。在agmCD81中引入E196D的突變，可以促使188-196之間形成K-D型弱鹽鍵，其作用等同于削弱188-196之間分子內(nèi)鍵，故也可以提高HCVpp的入侵效率。

可以看出，CD81-LEL的第188和196位氨基酸之間無法形成氫鍵或鹽鍵可以提高HCVpp的入侵效率，如果形成氫鍵或鹽鍵，則HCVpp不能入侵。

4、HCVcc感染試驗

使用JFH1 HCVcc和In-CeLL Western(ICW)的方法檢測表達不同CD81的Huh7.5.1CD81-中HCVcc的感染效率。將Huh7.5.1CD81-細胞以1×104密度接種于96孔板中，次日在細胞中轉(zhuǎn)染CD81野生型及突變變表達質(zhì)粒(將人、小鼠和非洲綠猴CD81全長基因及其突變體基因插入到pcDNA3.1-myc載體(Invitrogen)的BamHI和XhoI酶切位點中得到的質(zhì)粒)。

24h后，使用HCVcc(MOI＝0.01)對細胞進行感染。感染72h后，加入免疫染色的抗-HCV核心蛋白的抗體(1:400稀釋)和IRDye二抗(1:1000稀釋,Li-Cor,Nebraska,USA)，之后使用多聚甲醛將細胞固定的在原始孔中，使用Triton X-100滲透。最終通過Odyssey Infrared Imaging System(Li-Cor,Lincoln,NE,USA)獲得數(shù)據(jù)圖片。Huh7.5.1^CD81-細胞的免疫染色使用抗HCV核心蛋白的抗體，使用Leica SPW5共聚焦顯微鏡獲得數(shù)據(jù)圖片使用DAPI進行核酸染色。

結(jié)果如圖10所示，a為HCVcc入侵試驗結(jié)果，b為HCVcc入侵的免疫熒光共聚焦顯微鏡顯示模式，試驗結(jié)果與E2結(jié)合試驗和HCVpp入侵效率試驗的結(jié)果基本一致。簡而言之，在hCD81中引入不能誘導188-196之間成鍵的D196E突變和能促使形成K-D弱鹽鍵的E188K 突變對HCVcc入侵影響很小，而可以誘導188-196間形成穩(wěn)定鹽鍵的E188K/D196E突變會導致HCVcc入侵明顯降低。在mCD81和agmCD81中引入L186F單點突變后HCVcc入侵無明顯增高。在mCD81和agmCD81中，保持L186F的突變，再分別額外引入破壞或者減弱188-196之間氫鍵的突變，與L186F單點突變和野生型CD81相比這些突變體使得HCVcc的入侵顯著提高。使用免疫熒光(immunefluorescent)給HCV核心蛋白著色并使用共聚焦成像(confocal imaging)檢測，也得到了類似的結(jié)果。

上述均證明，待測動物的CD81-LEL的188-196氨基酸殘基之間形成分子內(nèi)氫鍵/鹽鍵可以判斷該待測動物能被HCV感染。