本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及一種快速定量檢測(cè)小分子化合物的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

常用的小分子化合物的檢測(cè)方法，包括化學(xué)顯色法、免疫層析檢測(cè)法、高效液相色譜檢測(cè)法(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用色譜檢測(cè)法(GC/MS)法等。其中，化學(xué)顯色法需要大量檢測(cè)樣品，而且靈敏度及精密度均不高；后兩者有較高的靈敏度及精密度，但檢測(cè)要求高，難以推廣。

免疫層析檢測(cè)法(Immunochromatographic test)是80年代興起的一項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)。經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷，毒品檢測(cè)和食品安全等領(lǐng)域。在免疫層析方法中，將小分子物質(zhì)的完全抗原固定于硝酸纖維膜上的檢測(cè)區(qū)(固相抗原)，待檢樣品溶液中的小分子物質(zhì)(游離抗原)與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金或彩色乳膠微球標(biāo)記的抗小分子物質(zhì)的單克隆抗體(標(biāo)記抗體)。如果待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)，將抑制標(biāo)記抗體與固定抗原的結(jié)合，抑制在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)形成色帶。測(cè)定后檢測(cè)區(qū)如果形成色帶，則結(jié)果為陰性，待測(cè)樣品不含待測(cè)小分子物質(zhì)；反之，不形成色帶，則結(jié)果為陽(yáng)性，檢測(cè)樣品含有待測(cè)小分子物質(zhì)。由于膠體金或彩色乳膠微球標(biāo)記檢測(cè)是通過(guò)肉眼來(lái)判別結(jié)果，目前以膠體金或彩色微球標(biāo)記的檢測(cè)方法只能作為一種定性或半定量的檢測(cè)。

熒光定量免疫層析技術(shù)，是免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)和傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合發(fā)展創(chuàng)新的一種定量檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)以熒光微球作為標(biāo)記，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的定量。

但是，由于免疫層析檢測(cè)的材料中硝酸纖維膜等均會(huì)在激發(fā)光作用下發(fā)出不同程度的熒光，同時(shí)檢測(cè)樣本如血液、尿樣及唾液等均含有蛋白、核酸、糖類(lèi)均具有熒光效應(yīng)，因此而導(dǎo)致檢測(cè)的背景較高，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。為克服上述問(wèn)題，有研究者開(kāi)發(fā)了時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)，以消除樣本中的熒 光物質(zhì)、激發(fā)光和膜本身對(duì)檢測(cè)的干擾。

然而，雖然時(shí)間分辨熒光免疫層析有助于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但是由于種種原因，在定量檢測(cè)時(shí)仍會(huì)出現(xiàn)較大的偏差和波動(dòng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際需要。尤其是對(duì)于小分子化合物(如搖頭丸、嗎啡等毒品)，定量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性一方面與遏制毒品的行動(dòng)密切相關(guān)，也是對(duì)于罪犯的量刑的重要參考因素。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)快速、定量、且準(zhǔn)確(偏差小)的檢測(cè)小分子化合物的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速定量檢測(cè)小分子化合物的試劑盒和方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測(cè)小分子化合物的試劑盒，所述試劑盒包括：

(a)測(cè)試條，所述測(cè)試條包括背襯以及位于背襯上的樣品墊、反應(yīng)膜和吸收墊，其中所述反應(yīng)膜上設(shè)置有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；以及

(b)第一容器，以及位于所述第一容器內(nèi)且與所述測(cè)試條獨(dú)立設(shè)置(或放置)的抗體復(fù)合物，其中所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及特異性針對(duì)小分子化合物的抗體，所述特異性針對(duì)小分子化合物的抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒；

其中，所述的檢測(cè)區(qū)固定有所述小分子化合物的完全抗原。

在另一優(yōu)選例中，在所述的測(cè)試條上，所述樣品墊和反應(yīng)膜是直接相鄰或相接觸的。

在另一優(yōu)選例中，按樣品的液體流動(dòng)方向，所述的測(cè)試條上依次包括樣品墊、反應(yīng)膜、和吸收墊。

在另一優(yōu)選例中，所述測(cè)試條由樣品墊、反應(yīng)膜、吸收墊、和背襯構(gòu)成。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗體復(fù)合物位于獨(dú)立的包裝或容器內(nèi)。

在另一優(yōu)選例中，所述的測(cè)試條不設(shè)有結(jié)合區(qū)。

在另一優(yōu)選例中，所述的測(cè)試條在未使用時(shí)，不含有用于特異性與所述小分子化合物結(jié)合的抗體或所述抗體復(fù)合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器為獨(dú)立的且封閉的包裝或試劑杯。

在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器中還含有

在另一優(yōu)選例中，所述小分子化合物的分子量為1-1000Da，較佳地為5-800Da，更佳地為10-500Da。

在另一優(yōu)選例中，所述的小分子化合物為搖頭丸。

在另一優(yōu)選例中，所述熒光乳膠微粒為鑭系金屬和/或鑭系金屬螯合物包被的乳膠微粒。

在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)控區(qū)包含第二抗體，所述第二抗體特異性結(jié)合于特異性針對(duì)小分子化合物的抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的第二抗體為多抗或抗血清。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性針對(duì)小分子化合物的抗體為鼠抗體，而所述的第二抗體為兔抗鼠IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性針對(duì)小分子化合物的抗體為兔抗體，而所述的第二抗體為羊抗兔IgG抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的小分子化合物的完全抗原為小分子化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。

在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白包括BSA蛋白。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)小分子化合物的方法，包括步驟：

(1)將待測(cè)物樣品與一抗體復(fù)合物進(jìn)行混合，獲得第一處理混合物，其中所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及特異性針對(duì)小分子化合物的抗體，并且所述特異性針對(duì)小分子化合物的抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒；

(2)將所述的第一處理混合物加至一測(cè)試條的樣品墊，其中，所述測(cè)試條包括背襯以及位于背襯上的樣品墊、反應(yīng)膜和吸收墊，其中所述反應(yīng)膜上設(shè)置有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述的檢測(cè)區(qū)固定有所述小分子化合物的完全抗原；

(3)采用時(shí)間分辨熒光免疫層析方法測(cè)量所述測(cè)試片的檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度及質(zhì)控區(qū)的熒光強(qiáng)度，從而確定小分子化合物是否存在，和/或確定為小分子化合物的含量。

在另一優(yōu)選例中，所述的小分子化合物包括搖頭丸。

在另一優(yōu)選例中，所述的樣品包括水溶液、飲料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、淚液或唾液。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，將測(cè)試區(qū)的熒光強(qiáng)度與質(zhì)控區(qū)的熒光強(qiáng)度的比值，和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較，從而確定小分子化合物的含量。

在另一優(yōu)選例中，所述熒光乳膠微粒為鑭系金屬和/或鑭系金屬螯合物包被的乳膠微粒。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種定量檢測(cè)待測(cè)物的熒光測(cè)量裝置，所述的裝置包括：

(a)本發(fā)明第一方面所述的試劑盒；和

(b)用于檢測(cè)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)器。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了本發(fā)明的一種實(shí)施例中免疫層析試紙條(板)的結(jié)構(gòu)示意圖，

其中，各標(biāo)識(shí)如下：1為樣品墊，3為檢測(cè)區(qū)，4為反應(yīng)膜，5為質(zhì)控區(qū)(對(duì)照區(qū))，6為吸收墊，7為背襯。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，通過(guò)大量篩選和摸索，發(fā)現(xiàn)首次意外地發(fā)現(xiàn)了一種新的快速定量檢測(cè)小分子化合物的試劑盒和方法。實(shí)驗(yàn)表明，檢測(cè)時(shí)先將待測(cè)樣品和獨(dú)立放置的熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物混合，再將該混合物加至測(cè)試條，并通過(guò)時(shí)間分辨熒光免疫層析方法進(jìn)行檢測(cè)，可以顯著提高檢測(cè)的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

具體而言，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的層析檢測(cè)條的結(jié)構(gòu)對(duì)于定量檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)(或偏差)造成較大的影響。一個(gè)主要的影響因素是結(jié)合墊部分(或結(jié)合區(qū))。如果將偶聯(lián)抗體的乳膠微粒包被在結(jié)合墊上，進(jìn)行干燥。檢測(cè)時(shí)乳膠從結(jié)合墊上釋放就成為影響檢測(cè)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素之一。此外，乳膠微粒釋放的程度、釋放的快慢和/或結(jié)合墊的材質(zhì)，都可能是導(dǎo)致定量測(cè)定結(jié)果波動(dòng)性大的因素。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)結(jié)合墊進(jìn)行處理時(shí)，結(jié)合墊的處理方式以及乳膠的干燥程度也難以保持一致，且固定或位于所述結(jié)合墊的檢測(cè)抗體(如熒光乳膠微粒標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物)的性質(zhì)易發(fā)生變化，導(dǎo)致長(zhǎng)期穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)性大。

此外，發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，在檢測(cè)區(qū)(或檢測(cè)線(xiàn))直接設(shè)置搖頭丸等小分子化合物(標(biāo)準(zhǔn)品)時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)性大。

為此，申請(qǐng)人優(yōu)化了檢測(cè)試劑的結(jié)構(gòu)，一方面省略了結(jié)合墊，另一方面在質(zhì)控區(qū)(或質(zhì)控線(xiàn))設(shè)置第二抗體(如針對(duì)熒光乳膠微粒標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物的第二抗體)，并在檢測(cè)區(qū)(或檢測(cè)線(xiàn))涉及所述小分子化合物的完全抗原，這樣不僅可以顯著提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，減少偏差，而且所述檢測(cè)試劑即使長(zhǎng)期存放(≥2年)仍可保持穩(wěn)定，并具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度。

術(shù)語(yǔ)

搖頭丸

如本文所用，“搖頭丸”包括搖頭丸及其類(lèi)似物，搖頭丸的化學(xué)名稱(chēng)是3,4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(methylene dioxy methamphetamine)，英文縮寫(xiě)為MDMA。由于吸毒者食用MDMA后，大腦皮層受到了藥物的控制，在沒(méi)有音樂(lè)的時(shí)候，頭會(huì)輕微地晃動(dòng)，有一種疲憊、欲睡的感覺(jué)。但當(dāng)服用者受到音樂(lè)的刺激時(shí)，就會(huì)隨著音樂(lè)的節(jié)拍不由自主地手舞足蹈、瘋狂地?fù)u頭，音樂(lè)節(jié)奏越強(qiáng)烈，頭晃動(dòng)得越厲害，感覺(jué)越舒服，故此被服用者稱(chēng)之為“搖頭丸”。MDMA的興奮致幻作用使神經(jīng)系統(tǒng)受到侵害，曾有案例報(bào)道，服用MDMA者不能自控地?fù)u頭，甚至搖斷了脖子。搖頭丸這個(gè)名稱(chēng)很形象地表達(dá)了MDMA類(lèi)藥物的興奮致幻作用。搖頭丸是21世紀(jì)全球范圍濫用最為廣泛的毒品之一。

免疫層析技術(shù)

免疫層析技術(shù)(Immunochromatography)是20世紀(jì)80年代末90年代初建立的一種快速檢測(cè)技術(shù)。由于免疫層析技術(shù)不須進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記物與自由標(biāo)記物的分離，因而操作簡(jiǎn)單、快速，非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)之用。

時(shí)間分辨熒光免疫分析

時(shí)間分辨熒光免疫分析(Time resolved fluoro immunoassay,TRFIA)是20世紀(jì)80年代初在傳統(tǒng)熒光免疫分析的基礎(chǔ)上創(chuàng)立的一種新型非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，是目前最靈敏的微量分析技術(shù)。

測(cè)試條上檢測(cè)區(qū)域的檢測(cè)信號(hào)的獲取，將測(cè)試條上的檢測(cè)信號(hào)傳遞過(guò)來(lái)的光信號(hào)，通過(guò)光學(xué)聚光裝置、分光裝置，和光學(xué)光路整形等，得到615nm±10nm 左右的熒光光斑，將此熒光光斑傳遞到光學(xué)傳感器光電倍增管，獲得測(cè)試條上檢測(cè)區(qū)域的檢測(cè)光信號(hào)。通過(guò)控制信號(hào)讀取時(shí)間為10微秒到400微秒，得到一個(gè)扣除熒光本底的檢測(cè)信號(hào)。通過(guò)光電信號(hào)轉(zhuǎn)換，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)傳送給計(jì)算控制部件處理，最終完成檢測(cè)。

與傳統(tǒng)的熒光素標(biāo)記不同，它所用的示蹤物是具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素及其螯合物，可有效排除樣品自然熒光的干擾，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和無(wú)放射性污染等特點(diǎn)，靈敏度高達(dá)10^-19，較放射免疫分析(RIA)高出3個(gè)數(shù)量級(jí)。在臨床免疫檢驗(yàn)和科學(xué)研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)

時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)是基于免疫層析技術(shù)的時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)，是在時(shí)間分辨熒光免疫分析儀的基礎(chǔ)上，將時(shí)間分辨熒光免疫分析和免疫層析技術(shù)相結(jié)合，省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟，試劑穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，靈敏度高，可廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)，也可作為POCT(Point of Care Test，床邊診斷或即時(shí)檢測(cè))分析儀。

鑭系元素

目前，己有5種鑭系元素被用于TRFIA，其中常用的有Eu、Tb和Sm，而Eu(銪元素)又是在標(biāo)記抗原抗體中應(yīng)用最廣的元素。鑭系元素在游離狀態(tài)下，熒光信號(hào)很微弱，僅僅是分子間共振能級(jí)的能量傳遞，無(wú)輻射躍遷回基態(tài)發(fā)射熒光的機(jī)率很小，但其螯合物在紫外光源的激發(fā)下能發(fā)射熒光。與傳統(tǒng)的熒光素標(biāo)記物相比，鑭系元素具有較寬的激發(fā)光譜帶和較窄的發(fā)射光譜帶，熒光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且熒光光譜的Stocks位移較大，利用光譜分辨技術(shù)和時(shí)間分辨技術(shù)可有效排除激發(fā)光和非特異性熒光的干擾。

乳膠微粒

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“乳膠微?！?、“乳膠微球”可以互換使用；“熒光微球”、“熒光微粒”、“熒光乳膠”、“熒光乳膠微?！?、“熒光乳膠微球”可以互換使用。

在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，從最早的乳膠凝集試驗(yàn)發(fā)展到今天復(fù)雜的多元化檢測(cè)。以乳膠微粒作為抗原抗體的標(biāo)記物，主要是由于乳膠微粒本身的特性，它可以 進(jìn)行多種形式表面功能化修飾，密度改變和特殊屬性的改變(比如：顏色改變、熒光或磁性等)，使得乳膠成為檢測(cè)中的一個(gè)重要部分。

乳膠微球的直徑一般為100-300nm，最佳地為150-200nm。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的時(shí)間分辨熒光乳膠微粒是具有發(fā)射波長(zhǎng)在610-620nm的熒光乳膠微粒，以便于檢測(cè)。一種優(yōu)選的乳膠微粒是含鑭系元素的熒光乳膠微粒，較佳地，含有銪螯合物。可用于本發(fā)明的乳膠微球沒(méi)有特別限制，可以選用市售的或用常規(guī)方法制備的乳膠微球。

采用內(nèi)部含銪的乳膠微粒，即結(jié)合銪螯合物的熒光微粒。該結(jié)合銪螯合物的熒光微粒，在紫外光激發(fā)下，發(fā)出610-620nm的紅色熒光，可以用來(lái)作為抗體標(biāo)記。

抗體復(fù)合物

如本文所用“抗體復(fù)合物”、“熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物”和“熒光微粒標(biāo)記抗體”可互換使用。

本發(fā)明中，經(jīng)熒光乳膠微粒標(biāo)記的抗體為單/多克隆抗體。經(jīng)標(biāo)記后，抗體被偶聯(lián)于熒光乳膠微粒。當(dāng)然，也可視為乳膠微粒被偶聯(lián)于抗體。

較佳地，抗體共價(jià)偶聯(lián)于熒光乳膠微粒。

更佳地，將抗體偶聯(lián)于熒光乳膠微粒是將抗體通過(guò)熒光乳膠微粒表面活化的羧基、羥基或醛基而共價(jià)偶聯(lián)于熒光乳膠微粒。

其中，所述熒光乳膠微球的直徑為100-300nm，較佳地為150-200nm。

此外，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為為1:2～1:50，較佳地為1:5～1:25。

更佳地，所述抗體與所述乳膠微粒的重量比例為1：8～12。

檢測(cè)試劑盒

本發(fā)明提供了一種可用于檢測(cè)飲用水、飲料、全血、血漿、血清、尿液、汗液、淚液、唾液等樣本中特定小分子化合物的檢測(cè)試劑盒。

所述試劑盒包括：

(a)測(cè)試條，所述測(cè)試條包括背襯以及位于背襯上的樣品墊、反應(yīng)膜和吸收墊，其中所述反應(yīng)膜上設(shè)置有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；以及

(b)第一容器，以及位于所述第一容器內(nèi)且與所述測(cè)試條獨(dú)立設(shè)置(或放 置)的抗體復(fù)合物，其中所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及特異性針對(duì)小分子化合物的抗體，所述特異性針對(duì)小分子化合物的抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒；

其中，所述的檢測(cè)區(qū)固定有所述小分子化合物的完全抗原；

較佳地，所述特異性針對(duì)小分子化合物的抗體采用含銪的熒光乳膠微粒標(biāo)記。

一種優(yōu)選的測(cè)試條是利用側(cè)流原理的免疫層析側(cè)流片或免疫層析試紙條。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“測(cè)流片”、“試紙片”、“試紙條”、“試紙板”、“層析條”、“測(cè)試條”具有相同的含義，可以互換使用。

本發(fā)明優(yōu)選的免疫層析側(cè)流片(或測(cè)試條)的結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中包括：樣品墊1，檢測(cè)區(qū)(或檢測(cè)線(xiàn))3，反應(yīng)膜4，對(duì)照區(qū)(或質(zhì)控區(qū)、對(duì)照線(xiàn)、質(zhì)控線(xiàn))5，吸收墊6，背襯7。

其中，背襯7的長(zhǎng)度與測(cè)試條相同。

樣品墊1位于測(cè)試條的一端，吸收墊6位于測(cè)試條的另一端。

檢測(cè)區(qū)3(也稱(chēng)檢測(cè)線(xiàn))位于樣品墊1和吸收墊6之間，通常檢測(cè)區(qū)3設(shè)置在反應(yīng)膜4上，通過(guò)所述反應(yīng)膜連接樣品墊1和吸水墊6。優(yōu)選地，所述反應(yīng)膜4上還設(shè)置有質(zhì)控區(qū)5(也稱(chēng)質(zhì)控線(xiàn))，質(zhì)控區(qū)5位于檢測(cè)區(qū)3和吸收墊6之間。

其中，所述檢測(cè)區(qū)固定有小分子化合物的完全抗原，所述質(zhì)控區(qū)固定有羊抗鼠IgG，通過(guò)對(duì)兩個(gè)區(qū)域的熒光信號(hào)分別加以分析，獲得檢測(cè)物的定量指標(biāo)。

測(cè)試條的制造方法，優(yōu)選地，分別將樣品墊1、反應(yīng)膜4、吸收墊6通過(guò)粘合劑粘貼于背襯7上，即得所述測(cè)試條。

在本發(fā)明中，所述測(cè)試條的各組成元件(或組件)可選用本領(lǐng)域已有的材料制成。

背襯7可以用任何穩(wěn)定的、無(wú)孔的材料制成，其強(qiáng)度應(yīng)足以支承材料和粘于其上的各組成元件。因?yàn)樵S多測(cè)定用水作為擴(kuò)散介質(zhì)，因此背襯7較佳地是基本上不透水的。在一個(gè)優(yōu)選例中，背襯7是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC膠板)。

樣品墊1可用任何吸收性材料制成?？墒褂玫牟牧侠影ǎ豪w維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。

反應(yīng)膜4可以用任何材料制成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內(nèi)部發(fā)生流體的毛細(xì)管作用。反應(yīng)膜4應(yīng)有足夠的孔隙度，從而允許涂有抗體或抗原的顆粒移動(dòng)。反應(yīng)膜4還可被含待檢測(cè)分析物的樣品中所用的液體潤(rùn)濕(例如，對(duì)于水性液體具有親水性，對(duì)于有機(jī)溶劑具有疏水性)。通過(guò)例如在美國(guó)專(zhuān)利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉(zhuǎn)變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用于水性液體?？捎糜谥圃旆磻?yīng)膜4的材料例子包括但不限于：聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一個(gè)優(yōu)選例中，反應(yīng)膜4是用硝酸纖維素膜制成的。

吸收墊6可以用任何能吸收作為樣品和緩沖液的液體的材料制成。吸收墊6的吸收能力應(yīng)足夠大，以便吸收添加至測(cè)試條的液體。適用于吸收墊6的材料的例子包括纖維素和吸水濾紙。

為了便于理解本發(fā)明，給出本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理。應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受該原理的影響或限制。

本發(fā)明采用競(jìng)爭(zhēng)法免疫層析的原理，將小分子物質(zhì)的完全抗原固定于硝酸纖維膜上的檢測(cè)區(qū)(固相抗原)。預(yù)混合待測(cè)樣本和獨(dú)立放置的熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物，將該混合物加至測(cè)試條的樣品墊，如果樣本中不含有特定的小分子化合物，所述熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物將沿反應(yīng)膜(如硝酸纖維膜)向前流動(dòng)，到達(dá)檢測(cè)線(xiàn)位置時(shí)，熒光微粒標(biāo)記抗體被固定在反應(yīng)膜上的小分子與載體蛋白偶聯(lián)物捕獲，通過(guò)365nm紫外光的激發(fā)，在檢測(cè)區(qū)T線(xiàn)位置形成紅色的615nm熒光條帶。如果待檢樣品中含有一定濃度的小分子物質(zhì)，將會(huì)抑制熒光微粒標(biāo)記抗體與固定抗原的結(jié)合，在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)的熒光條帶將會(huì)減弱。熒光條帶的強(qiáng)弱與待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)的濃度呈一定的線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)光電倍增管采集熒光信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而計(jì)算出待檢樣品中含有的小分子物質(zhì)的濃度。本發(fā)明在反應(yīng)膜(如硝酸纖維膜)的質(zhì)控區(qū)設(shè)置羊抗鼠IgG多抗，無(wú)論待檢樣品中是否含有待測(cè)小分子化合物，熒光微粒標(biāo)記抗體總能與質(zhì)控區(qū)的羊抗鼠IgG多抗結(jié)合形成一條熒光質(zhì)控帶，該熒光條帶是判定層析過(guò)程是否正常和檢測(cè)板是否失效的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為定量分析中控制批間差的計(jì)算指標(biāo)。

檢測(cè)裝置

本發(fā)明的檢測(cè)裝置可以包括：測(cè)試條、檢測(cè)器、光源、光導(dǎo)纖維和計(jì)算機(jī)。還可以包括一份檢測(cè)方法的使用說(shuō)明。其中測(cè)試條的工作原理如上所述，任何可用于檢測(cè)熒光強(qiáng)度的時(shí)間分辨熒光分析方法均可用于本發(fā)明的檢測(cè)裝置。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(a)本發(fā)明的試劑盒穩(wěn)定性好，靈敏度和準(zhǔn)確性高。

(b)本發(fā)明的試劑盒特異性好。

(c)本發(fā)明的試劑盒可以用于多種樣品的檢測(cè)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

材料

抗搖頭丸單克隆抗體和搖頭丸完全抗原以及羊抗鼠IgG多克隆抗體購(gòu)自上海八通生物科技有限公司；含銪的乳膠微粒(Carboxylate-Modified Dyed Microparticles，F(xiàn)luoro-MAX,PART NO:93470520010150)粒徑為0.199nm，購(gòu)自于ThermoFisher Scientific公司。EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)和小牛血清白蛋白(BSA)均為Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜為Millipore公司產(chǎn)品，孔徑為8μm；玻璃纖維膜為Millipore公司產(chǎn)品；搖頭丸對(duì)照品為中檢所國(guó)家麻醉品實(shí)驗(yàn)室提供；時(shí)間分辨熒光定量檢測(cè)儀由上海伊思柏生物科技有限公司提供。

實(shí)施例1

熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物的制備

取1％熒光乳膠微球250μL加1000μL 0.05M 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)(ph6.0)混勻。15000rpm離心20分鐘，棄上清液，用1000μL 0.05M MES重懸，超聲(50W，工作時(shí)間1秒，間隔時(shí)間1秒)后15000rpm離心20分鐘。 棄上清液，用0.05M MES稀釋至500μL，超聲。加入38.5μL的NHS(10mg/ml)和5μL EDC(15mg/ml)混勻后反應(yīng)15分鐘。加入0.15mg的搖頭丸單克隆抗體混勻。搖床上避光室溫下反應(yīng)2小時(shí)。加入25μL 0.1M乙醇胺反應(yīng)30分鐘以封閉微球表面未結(jié)合羧基。13000rpm離心10分鐘后棄上清，用500μL酪蛋白封閉液反應(yīng)1小時(shí)。15000rpm離心10分鐘，收集標(biāo)記的熒光乳膠微球用酪蛋白封閉液稀釋至250μL，超聲后2-8℃保存。

實(shí)施例2

冷凍干燥的熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物的制備

將標(biāo)記上抗體的熒光乳膠微粒溶液與冷凍干燥處理液(Borax0.1M、BSA1％、S17 2％、蔗糖5％、海藻糖5％)混合，將混合溶液加入96孔板中25μL/孔，放入-80℃冰箱冷凍30分鐘。將冷凍后的96孔板放入預(yù)先開(kāi)啟并已經(jīng)降溫至-35℃的真空冷凍干燥機(jī)中，分段升溫并進(jìn)行真空干燥，2小時(shí)30分鐘后取出，用真空包裝機(jī)將冷凍干燥后的乳膠微粒進(jìn)行真空包裝，包裝后放置于2-8℃保存。

實(shí)施例3

樣品墊的封閉處理

樣品墊采用玻璃纖維，為減少檢測(cè)中的非特異性結(jié)合和增加穩(wěn)定性，用表面活性劑和聚合物對(duì)樣品墊進(jìn)行封閉處理。具體地，用含有0.2％Tween 20和0.5％PVA的pH 8.0，0.1M Tris緩沖液水溶液浸泡吸水濾紙，37℃烘16小時(shí)。

實(shí)施例4

免疫層析測(cè)試條的制備

在硝酸纖維素膜上用點(diǎn)膜機(jī)分別劃?rùn)z測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，檢測(cè)線(xiàn)為搖頭丸-BSA(完全抗原)(0.8mg/mL)，質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))為純化后的羊抗鼠IgG多抗(1.0mg/mL)，37℃干燥后18-24小時(shí)。依次將硝酸纖維薄膜和樣品墊粘貼于PVC支持材料上。用切條機(jī)切成4mm的試劑條，置于塑料盒內(nèi)，加樣孔對(duì)準(zhǔn)檢測(cè)條樣品墊位置，壓緊后組裝成檢測(cè)試劑盒，加入干燥劑密封保存。

進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，樣品中的搖頭丸與固定在硝酸纖維膜上的搖頭丸-BSA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合熒光乳膠微粒-抗體偶聯(lián)物，檢測(cè)區(qū)(T)的熒光強(qiáng)弱與樣品中的搖頭丸含量相 關(guān)，通過(guò)時(shí)間分辨定量檢測(cè)儀閱讀觀察窗檢測(cè)區(qū)(T)位置的熒光條帶的熒光值，通過(guò)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品可以得出熒光值和搖頭丸濃度的相關(guān)曲線(xiàn)和計(jì)算公式，由此可以準(zhǔn)確地對(duì)樣品中的搖頭丸進(jìn)行定量。

實(shí)施例5

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

從密封袋中取出冷凍干燥的熒光微?？贵w偶聯(lián)物，用移液槍加100μL不同濃度的搖頭丸標(biāo)準(zhǔn)品于孔內(nèi)，用移液槍將溶液吹打混勻，取50μL滴入加樣孔內(nèi)，10分鐘后加入100μL沖洗液，再等待5分鐘，將試劑板插入檢測(cè)儀中讀取熒光值。根據(jù)不同濃度的搖頭丸標(biāo)準(zhǔn)品和熒光值，通過(guò)四參數(shù)法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

結(jié)果顯示，通過(guò)四參數(shù)擬合的回歸方程為：Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，且R²＜0.99。

實(shí)施例6

樣品檢測(cè)方法

方法同實(shí)施例5所述方法，將100μL待測(cè)樣品與熒光微粒抗體偶聯(lián)物混合后進(jìn)行檢測(cè)，獲得熒光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的計(jì)算公式，計(jì)算樣本中搖頭丸的含量。

實(shí)施例7

特異性分析

特異性測(cè)試,對(duì)提供的多種常見(jiàn)毒品、毒物和藥物，在一定的濃度范圍內(nèi)進(jìn)行交叉實(shí)驗(yàn)。

a)選擇的毒品、毒物和藥物標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照物如下表所示：

注：K為千

b)以無(wú)毒品的凍融尿作為陰性對(duì)照，檢測(cè)各交叉干擾物(標(biāo)準(zhǔn)品)對(duì)陰性樣品的干擾，即在陰性樣品檢測(cè)時(shí)有陽(yáng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為儀器讀數(shù)反應(yīng)為T(mén)線(xiàn)讀數(shù)下降(相對(duì)于陰性對(duì)照儀器讀數(shù))。

c)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定無(wú)交叉反應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)品濃度，獲得可用于評(píng)估的可能發(fā)生交叉反應(yīng)的濃度。

d)獲得用于評(píng)估的發(fā)生交叉反應(yīng)的濃度大于檢測(cè)限濃度100倍以上，則可認(rèn)定為滿(mǎn)足特異性測(cè)試要求。

結(jié)果如下表所示：本發(fā)明試劑盒僅與搖頭丸類(lèi)樣品發(fā)生反應(yīng)，與其他物質(zhì)沒(méi)有交叉反應(yīng)，具有很強(qiáng)的特異性。

實(shí)施例8

穩(wěn)定性分析

將檢測(cè)試劑盒密封后置于烘箱45℃溫度下破壞性試驗(yàn)一個(gè)月。方法同實(shí)施例5所述方法，分別用破壞性處理的試劑盒與未烘烤過(guò)的試劑盒，對(duì)含不同濃度搖頭丸的樣本及陰性樣本進(jìn)行測(cè)試。

結(jié)果表明，45℃破壞性處理一個(gè)月的試劑盒與未烘烤過(guò)的試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致(偏差≤±2％)。表明該檢測(cè)試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

實(shí)施例9

靈敏度分析

方法同實(shí)施例5中的方法，分別檢測(cè)濃度為2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的搖頭丸樣品，每個(gè)檢測(cè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次。計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差(SD值)、平均值(AVG值)和變異系數(shù)(CV值)，其中，CV值應(yīng)在10％以?xún)?nèi)，則可認(rèn)為滿(mǎn)足靈敏度測(cè)試要求。

結(jié)果如下表所示：本發(fā)明的搖頭丸測(cè)試條的靈敏度約0.5ng/ml，檢測(cè)的CV<10％。

實(shí)施例10

準(zhǔn)確性分析

方法同實(shí)施例5中的方法，同本發(fā)明試劑盒對(duì)10例實(shí)際案例樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)與GC-MS的結(jié)果進(jìn)行比較，符合率均大于95％。結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒具有很高的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例11

檢測(cè)速度測(cè)試

將準(zhǔn)備好的測(cè)試條(卡)插入檢測(cè)儀器，開(kāi)始測(cè)試并計(jì)時(shí)，測(cè)試完成得到測(cè)試讀數(shù)，停止計(jì)時(shí)，得到計(jì)時(shí)時(shí)間，計(jì)時(shí)時(shí)間在10分鐘內(nèi)則可認(rèn)定為滿(mǎn)足測(cè)試要求。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：檢測(cè)時(shí)間均小于5分鐘，檢測(cè)速度符合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速檢測(cè)的要求。

對(duì)比例C1

測(cè)試條C1的制備和性能測(cè)試

1.制備

測(cè)試條C1的結(jié)構(gòu)與本發(fā)明測(cè)試條類(lèi)似，其區(qū)別在于，測(cè)試條C1包括一結(jié)合墊，所述結(jié)合墊位于樣品墊1和吸收墊6之間，在樣品墊1的近端和吸收墊6的遠(yuǎn)端，臨近樣品墊1。并且，所述結(jié)合墊上包含抗體復(fù)合物，所述抗體復(fù)合物包含熒光乳膠微粒以及小分子化合物抗體，所述小分子化合物抗體偶聯(lián)于所述熒光乳膠微粒。

2.準(zhǔn)確性

采用該測(cè)試條C1，對(duì)于實(shí)施例10中的實(shí)際案例樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)數(shù)據(jù)與GC-MS的結(jié)果進(jìn)行比較，符合率僅為70％。這表明，檢測(cè)條C1的準(zhǔn)確性不高，不適合準(zhǔn)確性要求高的定量檢測(cè)應(yīng)用。

3.穩(wěn)定性

方法同實(shí)施例8，對(duì)該測(cè)試條C1進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。

結(jié)果表明，45℃破壞性處理一個(gè)月的試劑盒與未烘烤過(guò)的試劑盒檢測(cè)結(jié)果發(fā)生了一定程度的偏差(偏差度≥10％)，此外，45℃破壞性處理二個(gè)月后，偏差度進(jìn)一步上升到≥20％。這表明，測(cè)試條C1的長(zhǎng)期穩(wěn)定性較差。

4.靈敏度

方法同實(shí)施例9，對(duì)該測(cè)試條C1進(jìn)行靈敏度測(cè)試。

結(jié)果表明，該測(cè)試條C1的靈敏度為約2ng/ml，雖然可以滿(mǎn)足一般需要，但是靈敏度遠(yuǎn)低于本發(fā)明測(cè)試條。

對(duì)比例C2

測(cè)試條C1的制備和性能測(cè)試

在對(duì)比例C2中，測(cè)試條C2的結(jié)構(gòu)與本發(fā)明測(cè)試條類(lèi)似，其區(qū)別在于，檢測(cè)區(qū)設(shè)有搖頭丸小分子化合物，而不設(shè)置搖頭丸完全抗原。

方法同實(shí)施例9，對(duì)該測(cè)試條C2進(jìn)行靈敏度測(cè)試。

結(jié)果表明，該測(cè)試條C2的靈敏度為大于25ng/ml，靈敏度遠(yuǎn)低于本發(fā)明測(cè)試條。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。