本發(fā)明涉及腫瘤檢測芯片及試劑盒，特別涉及鼻咽癌EB病毒血清抗體標(biāo)簽檢測芯片及其試劑盒。

背景技術(shù)：

EB病毒屬于人皰疹病毒4型 (HHV-4)，是全長為172kb的雙鏈DNA，編碼85個基因。血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球超過90%的成人感染過此病毒。在大多數(shù)人群中，EB病毒可保持終生感染而不產(chǎn)生嚴(yán)重后果。幼兒感染EB病毒后多數(shù)無明顯癥狀，或僅引起上呼吸道感染。青少年期若發(fā)生原發(fā)感染，可出現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥。大量研究表明，EB病毒感染與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)，例如Burkitt's淋巴瘤，Hodgkin's病，胃癌，鼻咽癌等。

人感染EB病毒后會產(chǎn)生特異性抗體。在首次感染后，經(jīng)過4-6周的潛伏感染期，最先出現(xiàn)的是異嗜性抗體和病毒衣殼抗原(VCA)-IgM，然后是VCA-IgG和早期抗原(EA)抗體，再經(jīng)過2-4周，血清中可檢測到EB病毒相關(guān)核抗原1(EBNA1)-IgG。這些抗體都可應(yīng)用于血清學(xué)診斷。

在EB病毒感染與鼻咽癌關(guān)系研究方面，1964年Epstein MA和Barr YM首先建立了Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系并在電鏡下發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒，該病毒后被命名為Epstein－Barr病毒（簡稱EB病毒）。1966年美國學(xué)者Old用細(xì)胞培養(yǎng)的病毒抽提物在56% Burkitt淋巴瘤和85%鼻咽癌病人血清中發(fā)現(xiàn)EB病毒抗體陽性，建立了EB病毒與鼻咽癌的關(guān)系，開辟了鼻咽癌新的病因?qū)W研究領(lǐng)域。

已有的大量研究證實(shí)，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與EB病毒感染密切相關(guān)。例如95%以上的鼻咽癌患者血清中可檢測到EB病毒抗體的存在，并且這些抗體的滴度比正常人和其他頭頸部腫瘤患者明顯增高。鼻咽癌的癌細(xì)胞內(nèi)100%可檢測到EB病毒標(biāo)志物等。目前，鼻咽癌的確診主要依賴鼻咽組織活檢，由于鼻咽所在部位隱匿，鼻咽癌的早期癥狀不明顯，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，常導(dǎo)致漏診誤診或診斷延誤，很多患者在確診時已處于晚期。雖然早期鼻咽癌患者治療后5年生存率可達(dá)80%以上，但分期越晚，其5年生存率降至50%左右。因此，早期診斷對鼻咽癌對提高鼻咽癌病人的生存率具有重要意義。

曾毅等在上個世紀(jì)70年代末用免疫酶法對廣西蒼梧縣9萬余人的血清進(jìn)行EB病毒殼抗原IgA（VCA/IgA）抗體測定，陽性率為1293.67/10萬，陽性平均滴度為1：20.6；陽性人群中28人確診為鼻咽癌，占陽性人群的2.36%，病人的平均滴度為1：127，明顯高于當(dāng)?shù)厝巳骸?997年，黃騰波等報(bào)道了廣東省中山、四會和廣州市三個高發(fā)區(qū)共10萬人群的9年的跟蹤觀察：VCA/IgA滴度<1:5的陰性人群的發(fā)病率為2.98/10萬，滴度>1:5的陽性人群為253.1/10萬，而且滴度越高，發(fā)病率越高，當(dāng)?shù)味?gt;1:80，發(fā)病率達(dá)1974/10萬。對人群的篩查所發(fā)現(xiàn)的鼻咽癌絕大部分患者都為早期病人。以上流行病學(xué)資料不僅充分顯示了EB病毒感染與鼻咽癌發(fā)病之間的密切關(guān)系，也說明了血清學(xué)篩查對鼻咽癌二級預(yù)防的重要性。

在血清學(xué)研究方面，用于早期檢測的指標(biāo)主要有EB病毒殼抗原(VCA)的IgA、IgG和IgM、病毒早期抗原(EA)的IgA和IgG、病毒核抗原(EBNA)抗體、膜抗原(MA)IgA和IgG、補(bǔ)體修飾(CS/F)病毒特異性抗體、病毒DNA酶抗體等。用來檢測的病毒抗原多是從感染EB病毒的細(xì)胞系制備出來的，如用B95-8細(xì)胞用作檢測抗病毒VCA抗體的靶細(xì)胞，而Raji細(xì)胞則用作檢測EA抗體的靶細(xì)胞。中山大學(xué)腫瘤防治中心的腫瘤研究所在20世紀(jì)80年代初的研究顯示，VCA-IgA和EA-IgG在鼻咽癌病人血清中的滴度明顯高于非癌鼻咽病變病人和正常人，且與鼻咽癌分期和頸轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)大小相關(guān)。

到目前為止，有許多的EB病毒抗原用于檢測鼻咽癌患者血清抗體水平的研究。然而，真正在臨床上常規(guī)應(yīng)用的檢測項(xiàng)目主要還是已經(jīng)應(yīng)用了二十多年的VCA-IgA、EA-IgA以及DNA酶抗體等。導(dǎo)致這種現(xiàn)狀的主要原因有：第一，EB病毒在人群中普遍感染，正常人體內(nèi)也產(chǎn)生EB病毒抗體，某些腫瘤的發(fā)生也與EB病毒有關(guān)，因此，目前所用的檢測指標(biāo)并不十分理想，需要尋找更好的抗原－抗體標(biāo)志物；第二，單一血清免疫學(xué)標(biāo)志物的特異性和敏感性有限，需要聯(lián)合檢測多項(xiàng)血清免疫標(biāo)志物，但用現(xiàn)有技術(shù)檢測標(biāo)志物將導(dǎo)致費(fèi)用增加而效率降低，若采用液態(tài)芯片檢測，其缺點(diǎn)是儀器十分昂貴且尚未能商品化；第三，雖然已經(jīng)有不少的EB病毒抗原被研究，但仍不到EB病毒全部蛋白的20%，而且這些抗原主要限于病毒殼抗原、早期抗原、膜抗原、核抗原、核酸聚合酶和激活因子等，相對于EB病毒全蛋白組的80多個蛋白來說，現(xiàn)有的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，而且未能系統(tǒng)和全面地觀測全部EB病毒蛋白在人類所引起的血清免疫反應(yīng)。

開發(fā)出特異性好、靈敏度高的鼻咽癌血清檢測標(biāo)簽具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鼻咽癌EB病毒血清抗體標(biāo)簽檢測芯片及其試劑盒。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

用于鼻咽癌檢測的芯片，檢測芯片中含有可檢測出下述10個EBV血清抗體中至少2個、3個、5個、10個的EB病毒蛋白或多肽，10個EBV血清抗體為：BMRF1-IgG、LF1-IgA、BNLF2b-IgA、BKRF4-IgG、BMRF1-IgA、BXLF1-IgG、BaRF1-IgG、BKRF3-IgG、BZLF1-E1-IgG和BNLF2b-IgG。

一種鼻咽癌檢測試劑盒，試劑盒中含有定量BMRF1-IgG、LF1-IgA、BNLF2b-IgA、BKRF4-IgG、BMRF1-IgA、BXLF1-IgG、BaRF1-IgG、BKRF3-IgG、BZLF1-E1-IgG和BNLF2b-IgG中至少2種、3種、5種、10種的EB病毒蛋白或多肽。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的鼻咽癌檢測芯片和試劑盒，具有很好的特異性和很高的靈敏度，可以有效地用于鼻咽的篩查、臨床早期診斷和預(yù)后評估等。

附圖說明

圖1是EB病毒全基因組95 閱讀框（ORF）擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果；

圖2是EB病毒ORF與載體重組克隆質(zhì)粒的酶切電泳結(jié)果，驗(yàn)證了所有的重組體；

圖3是構(gòu)建的EB病毒全蛋白組芯片的質(zhì)控結(jié)果；

圖4是一例有代表性的EB病毒全蛋白組芯片檢測鼻咽癌病人血清的雜交結(jié)果；

圖5是由EB病毒蛋白芯片檢測鼻咽癌病人和正常人血清抗體譜的聚類分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

應(yīng)用高通量的PCR重組克隆和表達(dá)平臺，擴(kuò)增EB病毒全基因組84個基因共95個ORF片段，并通過體內(nèi)同源重組克隆方法將其克隆到構(gòu)建的重組質(zhì)粒載體pGEM-XTE上。應(yīng)用體外無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯試劑盒表達(dá)目的蛋白。未經(jīng)純化的表達(dá)蛋白直接點(diǎn)于硝酸纖維素膜覆蓋的玻片上，制備成EB病毒全蛋白組芯片，對收集的未治療鼻咽癌病人和健康人進(jìn)行EB病毒血清學(xué)抗體譜檢測，從全蛋白組水平篩選區(qū)分鼻咽癌和正常人的血清抗體譜。

重組質(zhì)粒載體構(gòu)建

根據(jù)D. Huw Davies等的報(bào)道，用化學(xué)合成方法合成以下DNA序列（共300bp），其文本序列如下：

TTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCATATCGACGACGACGACAAGCATATGAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGGTACCCGGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTGTCGTCGCCGGTATAGCTGCTGCTGCTGTTCGTATACCTCGAGGATCCTACCCATACGATGTTCCGGATTACGCTTAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAGAGCTCCTAGGATGGGTATGCTACAAGGCCTAATGCGAATTCTAGGCCGACGATTGTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTATATTGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGATATAGGCCTATAGGGCGTTCTCCGGGCCGTCAT（SEQ ID NO：1）

將以上化學(xué)合成的300bp序列（兩端有游離的A堿基），用T4 DNA ligase連接到載體pGEM?-T Esay（Promega）的游離T堿基之間，形成pGEM-XTE重組載體，大小約3315bp。以上工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，重組載體的序列已經(jīng)過測序驗(yàn)證。

重組質(zhì)粒載體線性化

反應(yīng)體系：pGEM-XTE (300ng/ul) 6.5ul

10×NEBuffer3 2ul

100×BSA（10mg/ml） 0.2 ul

BamHI (20 IU/ul) 1.5 ul

ddH₂O 補(bǔ)至20μl

37℃水浴過夜，1.5%瓊脂糖凝聚電泳證實(shí)載體線性化后，對線性化載體進(jìn)行純化，純化方法按照TIANGEN超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行。

線性化pGEM- XTE 重組質(zhì)粒載體PCR擴(kuò)增

設(shè)計(jì)針對線性化載體的特異性引物，引物序列為

Forward: 5’-CTACCCATACGATGTTCCGGATTAC-3’（SEQ ID NO：2）

Reverse: 5’-CTCGAGCATA TGCTTGTCGTCGTCG-3’ （SEQ ID NO：3）

反應(yīng)體系：vector DNA 2.0μg

2.5 mM dNTPs 8.0μl

10mM 10×LA PCR buffer 5.0 μl

Forward and reverse primer 0.5μl each

LA Taq 2.5U

ddH₂O 補(bǔ)至50μl

反應(yīng)條件：94℃ 5min，（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 3.5min，循環(huán)30次），72℃ 10min。

個EBV 開放讀碼框(ORF)PCR引物設(shè)計(jì)

EBV全長為172kb，編碼85個基因，其中LMP2A的N端序列與LMP2B全長序列一致，因此只克隆LMP2A。對于只有一個編碼序列(CDS)的基因，引物設(shè)計(jì)原則上針對全長序列。其中，BLLF1，BNRF1和BPLF1的ORF被分為兩個片段；BARF0，BOLF1, EBNA-1和LF3則克隆ORF的C端或N端。對于有多個CDS的基因，選取其中一至兩個CDS設(shè)計(jì)引物。

在上下游的5’分別添加接頭序列，其中上游引物添加接頭5’-CATATCGACGACGACGACAAGCATATGCTCGAG（SEQ ID NO：4），下游引物添加接頭 5’-ATCTTAAGCGTAATCCGGAACATCGTATGGGTA（SEQ ID NO：5）。

引物設(shè)計(jì)軟件為DNAClub?？偣苍O(shè)計(jì)了針對84個基因的95個ORF片段。

設(shè)計(jì)的引物用BLAST排除與其他基因同源的序列，所有引物交由廣州英韋創(chuàng)津公司合成，并采用PAGE純化。

擴(kuò)增

所有PCR引物經(jīng)廣州英韋創(chuàng)津公司合成后，加入滅菌ddH₂O稀釋成10μM的母液，-20℃保存。B95-8 細(xì)胞株DNA中缺乏LF3，LF3由C666-1細(xì)胞株擴(kuò)增。

反應(yīng)體系：B95-8 or C666-1 DNA (5ng/μl) 1.0μl

2.5 mM dNTPs 8.0μl

10mM 10×LA PCR buffer 5.0 μl

Forward and reverse primer 0.5μl each

LA Taq 2.5U

ddH₂O 補(bǔ)至50μl

對于GC含量較高的基因，反應(yīng)體系為

B95-8 or C666-1 DNA (5ng/μl) 1.0μl

2.5 mM dNTPs 8.0μl

2×GC PCR buffer 25.0 μl

Forward and reverse primer 0.5μl each

LA Taq 2.5U

ddH₂O 補(bǔ)至50μl

反應(yīng)條件：94℃ 5min，（94℃ 30s，50～42℃ 30s，72℃ 1-3min（60s/kb），循環(huán)35次），72℃ 10min。

所有PCR產(chǎn)物經(jīng)1%～1.5%的瓊脂糖凝聚電泳證實(shí)，根據(jù)條帶亮度選用超薄或普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化，定量后-20℃保存。

體內(nèi)同源重組克隆

(1)反應(yīng)體系：質(zhì)粒載體 40ng/載體濃度(ng/μl)

純化DNA 克隆后片段大小/100/純化DNA濃度(ng/μl)

DH5α（或Top10）感受態(tài)細(xì)胞 10μl

ddH₂O 補(bǔ)至20μl

(2) 4℃水浴45mins；

(3) 42℃水浴1min；

(4) 4℃水浴1min；

(5) 加入250μl SOC培養(yǎng)液；

(6) 37℃恒溫振蕩2h；

(7) 取200μl 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物于濃度為100 μg/ml Amp的瓊脂糖平板鋪板，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

重組克隆質(zhì)粒鑒定

測序

在每個瓊脂糖平板上隨機(jī)挑選3個菌落，加入濃度為100 μg/ml Amp的LB培養(yǎng)液中，部分菌液送廣州英韋創(chuàng)津公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST與原始序列進(jìn)行比對。

重組克隆質(zhì)粒提取

將測序正確的重組克隆質(zhì)粒37℃過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取方法按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行。

酶切

反應(yīng)體系：

重組質(zhì)粒DNA 1.0ug

10×H buffer 2.0ul

EcoR I (20 IU/ul) 1.5ul

ddH₂O 補(bǔ)至20μl

37℃水浴過夜，1%～1.5%瓊脂糖凝聚電泳。

體外無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/表達(dá)

經(jīng)測序與酶切鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒，使用Promega 公司的S30 T7 High-Yield Protein Expression System進(jìn)行體外無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/表達(dá)。

蛋白芯片點(diǎn)制

在384孔板中，加入Tween-20和6中表達(dá)的蛋白液，用芯片點(diǎn)片機(jī)點(diǎn)在被覆NC膜的16-pad Fast slide玻片上，點(diǎn)片時的溫度控制在20℃～22℃，濕度控制在30%～35% ，一張玻片上點(diǎn)制16個獨(dú)立的相同矩陣，每個蛋白液點(diǎn)兩個重復(fù)點(diǎn)。具體點(diǎn)片過程參考博奧Smart Arrayer 136 printer使用說明。

蛋白芯片雜交

1)將點(diǎn)制好的玻片用16-wellarrayincubationchamber固定于FASTFrameslide holders上；

2)封閉：向每個pad里加入100μlblockingbuffer，室溫濕盒（在鐵盒底部放上3張紙巾，用水浸濕）振蕩孵育30min，60rpm/min；

3)向2個200μl的PCR管中各加入100μllowcrossbuffer-mild，一管加入小鼠抗His6，另一管加入大鼠抗HA。抗體濃度分別為1:100和1:250。室溫下振蕩孵育1h，150rpm/min；

4)血清預(yù)處理：在冰上解凍血清后，向200μl的PCR管中加入：0.5μl血清，89.5μllow cross buffer-mild，10μl E.coli lysate，使血清濃度為1：200。室溫下振蕩孵育1h，150rpm /min。

5)吸出blockingbuffer，加入100μl預(yù)處理后的(3)和(4)，將FASTFrameslide holders置于濕盒，4℃冷庫振蕩過夜，60rpm/min；

6)二抗預(yù)處理：將生物素化馬抗小鼠IgG(H+L)，生物素化兔抗大鼠IgG(H+L)，Biotin conjugated Goat Anti-Human IgG(H+L)和Biotin conjugated Goat Anti-Human IgA 分別加入low cross buffer-mild，使抗體濃度分別為1:400，1:400，1:400和1:200。室溫下振蕩孵育30min，150rpm/min；

7)將pad里的液體吸出，加入TBST洗三次，5mins/次；

8)加入100μl預(yù)處理二抗，室溫濕盒振蕩孵育1h，60rpm/min；

9)重復(fù)(7)的步驟；

10)向low cross buffer-mild中加入Cy5 conjugated streptavidin，使抗體濃度為1：200。避光室溫濕盒振蕩孵育1h，60rpm/min；

11)將玻片取下，置于染色缸中，TBST洗兩次，5min/次； TBS洗兩次，5min/次；蒸餾水洗兩次，1min/次；

12)將玻片離心甩干。

芯片掃描

芯片掃描步驟參見LuxScan 10K Microarray Scanner使用說明書。

數(shù)據(jù)提取

數(shù)據(jù)提取用Genepix6.0軟件進(jìn)行，具體如下：

1)建立gal文件。

2)打開Genepix6.0軟件。

3)打開保存的掃描圖像。

4)打開相應(yīng)的gal文件。

5)利用程序自動定位功能進(jìn)行定位。

6)手動調(diào)整自動定位未定位準(zhǔn)確的點(diǎn)。

7)提取數(shù)據(jù)，保存為.gpr文件。

統(tǒng)計(jì)分析

采用R統(tǒng)計(jì)軟件中的vsn數(shù)據(jù)包進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。SAM(Significance Analysis of Microarrays)挑選差異抗體。MeV對差異抗體進(jìn)行聚類。SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對差異抗體進(jìn)行ROC分析。p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

應(yīng)用基因特異性引物擴(kuò)增EBV 84個基因的ORF。5’寡核苷酸包含53個核苷酸，33個核苷酸構(gòu)成5’延伸區(qū)，20個核苷酸組成基因特異性序列。3’寡核苷酸同樣也包含53個核苷酸，33個核苷酸構(gòu)成3’延伸區(qū)，20個核苷酸組成基因特異性序列。PCR擴(kuò)增EBV全基因組95 ORF片段電泳結(jié)果如圖1所示，根據(jù)PCR擴(kuò)增片段大小從左至右排列。全部84個EBV基因的95個片段均擴(kuò)增成功，片段大小與預(yù)期相符。

體內(nèi)同源重組克隆

BamHI內(nèi)切酶酶切pGEM-XTE重組質(zhì)粒后，得到編碼N-端 His標(biāo)簽和C-端 HA標(biāo)簽的T7線性載體，PCR擴(kuò)增此線性載體，消除環(huán)狀載體。用包含33個核苷酸的特異性引物序列擴(kuò)增EBV全基因組DNA的ORF。將PCR擴(kuò)增的ORF與線性載體共轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并在Amp抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得重組環(huán)狀克隆。

全基因組重組克隆質(zhì)粒酶切鑒定

將PCR擴(kuò)增的ORF和線性載體以1:1摩爾比，共轉(zhuǎn)染入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，瓊脂糖平板鋪板培養(yǎng)，挑選三個克隆測序鑒定。序列正確的克隆在Amp抗性培養(yǎng)基中過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液變渾濁時，收取細(xì)菌并抽提質(zhì)粒。部分質(zhì)粒濃度較低的克隆轉(zhuǎn)染入Top10感受態(tài)細(xì)胞，以提高質(zhì)粒濃度。pGEM?-T Esay Vector上攜帶有兩個EcoRI酶切位點(diǎn)，當(dāng)重組克隆質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后，會被分為質(zhì)粒載體和克隆的目的片段兩個片段。瓊脂糖凝聚電泳結(jié)果如圖2所示，圖中，條帶1顯示的是重組質(zhì)粒載體，大小約3315bp；條帶2～4顯示的是克隆的目的片段；按照克隆目的片段的大小從左至右排列。電泳結(jié)果顯示，除BBRF3外，每個重組質(zhì)粒均被酶切為重組質(zhì)粒載體和克隆的目的片段。經(jīng)測序鑒定，BBRF3克隆載體上的其中一個EcoRI酶切位點(diǎn)由GAATTC突變?yōu)镚AACTC，因此只有一個片段。EBNA3A-E2、BXLF2、BALF3、BNRF1-C、BGRF1/BDRF1-E1、BARF0-N、BSLF2/BMLF1-E2-C的ORF內(nèi)部有一個EcoRI酶切位點(diǎn)，目的片段被分為兩個片段。BLLF1-N的ORF內(nèi)部有兩個EcoRI酶切位點(diǎn)，目的片段被分為三個片段。

蛋白芯片質(zhì)控

通過化學(xué)合成的300bp DNA序列上包含了翻譯起始核糖體結(jié)合SD序列(GAAGGAG)、起始密碼子ATG、T7終止序列、載體線性化Bam HI酶切位點(diǎn)和PCR擴(kuò)增載體的引物序列。此序列中還包含了10×His和HA標(biāo)簽，His標(biāo)簽緊接在起始密碼子之后，HA標(biāo)簽在插入序列之后、翻譯終止碼之前。當(dāng)載體翻譯成蛋白質(zhì)，可通過檢測His標(biāo)簽以確定翻譯是否包含了插入子的起始部分，檢測HA標(biāo)簽以確定翻譯是否包含了插入子的末端從而確保整個插入子的翻譯完整。圖3 A圖顯示的是用小鼠抗His₆抗體檢測His標(biāo)簽的結(jié)果，陽性率為96.8%。圖3 B圖顯示的是用大鼠抗HA抗體檢測HA標(biāo)簽的結(jié)果，陽性率為86.3%。

血清標(biāo)本雜交

用于合成EBV蛋白芯片蛋白液的反應(yīng)體系中包含E.coli提取物，其中的E.coli抗原可與人血清中的E.coli抗體結(jié)合，產(chǎn)生非特異性雜交。在進(jìn)行芯片雜交前，使用10% E.coli lysate對血清標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，中和血清中的E.coli抗體。血清標(biāo)本分別用山羊抗人的IgG和IgA進(jìn)行抗體譜檢測。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上對EBV基因組的蛋白質(zhì)功能描述，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道A73、BARF0、BWRF1和LF3基因編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此將這4種重組質(zhì)粒以及未加入任何DNA模板的體外表達(dá)產(chǎn)物作為陰性對照。圖4顯示的是一例有代表性的鼻咽癌血清雜交情況。芯片信號強(qiáng)度大于陰性對照信號強(qiáng)度均值2倍以上被認(rèn)為是有信號的抗體。

血清抗體譜區(qū)分鼻咽癌患者和正常人

來源于芯片的數(shù)據(jù)，其標(biāo)準(zhǔn)差隨著測量信號平均水平的增加而增加，使得數(shù)據(jù)的變異程度較大，不能客觀的對數(shù)據(jù)進(jìn)行評價，因此就必須對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使其基本上服從正態(tài)分布。Durbin和Huber提出一種稱為vsn(variance-stabilizing transformation)的log-variant數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法，減小數(shù)據(jù)的變異程度，并使測量值處在相近的范圍內(nèi)。采用R統(tǒng)計(jì)軟件的vsn數(shù)據(jù)包對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，SAM挑選差異抗體，共有27個抗體的變化倍數(shù)在2倍以上，即在鼻咽癌患者血清中的芯片信號強(qiáng)度是正常人的2倍以上，p值均<0.05。

選取變化在2倍以上的十個血清抗體組成一個標(biāo)簽，具體的血清抗體如下表所示：

使用10個EBV抗體進(jìn)行ROC曲線分析，曲線下面積AUC均達(dá)到0.8以上，具體見表2。

表2 鼻咽癌病人和非鼻咽癌病人差異抗體ROC分析

用這10個抗體進(jìn)行1120例鼻咽癌病人和非鼻咽癌病人的聚類分析，其中鼻咽癌病人為485例，非鼻咽癌病人635例。采用Mev（Multi Experiment Viewer）軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖5所示。顯示用這10個抗體可將鼻咽癌和非鼻咽癌病人區(qū)分出來。在這485例鼻咽癌病人中，有112為臨床I期和II期，其診斷結(jié)果與下面表格的結(jié)果基本一致，因此，本研究篩選出來的10個抗體標(biāo)簽將可應(yīng)用于鼻咽癌現(xiàn)場篩查和臨床早期診斷。

<110> 王輝云

<120> 鼻咽癌EB病毒血清抗體標(biāo)簽檢測芯片及其試劑盒

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> EB病毒

<400> 1

ttgtttaact ttaagaagga gatataccat gggccatcat catcatcatc atcatcatca 60

tcacagcagc ggccatatcg acgacgacga caagcatatg aacaaattga aattcttcct 120

ctatatggta cccggtagta gtagtagtag tagtagtagt agtgtcgtcg ccggtatagc 180

tgctgctgct gttcgtatac ctcgaggatc ctacccatac gatgttccgg attacgctta 240

agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca 300

gagctcctag gatgggtatg ctacaaggcc taatgcgaat tctaggccga cgattgtttc 360

gggctttcct tcgactcaac cgacgacggt ggcgactcgt ataactagca taaccccttg 420

gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatatc 480

ccgcaagagg cccggcagta tattgatcgt attggggaac cccggagatt tgcccagaac 540

tccccaaaaa acgactttcc tccttgatat aggcctatag ggcgttctcc gggccgtcat 600

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctacccatac gatgttccgg attac 25

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcttgtcgt cgtcg 15

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catatcgacg acgacgacaa gcatatgctc gag 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcttaagcg taatccggaa catcgtatgg gta 33