本發(fā)明涉及免疫化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株、以及應(yīng)用該單克隆抗體檢測(cè)H9亞型禽流感病毒特異性抗體的阻斷ELISA試劑盒。
背景技術(shù)：
：禽流感(Avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的一種嚴(yán)重危害禽類健康的急性傳染病。該病自1878年意大利雞群首次爆發(fā)以來，世界各地都相繼有各種亞型禽流感病毒引起AI爆發(fā)。其中H9亞型禽流感最早于1966年從美國威斯康辛州的一個(gè)火雞養(yǎng)殖場(chǎng)中被分離到，自20世紀(jì)90年代開始其傳播越來越廣泛，并在亞洲、中東和北非許多國家形成地方流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來沉重的打擊，也造成無法估量的經(jīng)濟(jì)損失。在我國，H9N2亞型AIV從1992年開始在部分省區(qū)局部流行，1998年以來已在全國大部分地區(qū)形成地方流行。H9N2亞型AIV還可以直接感染人，同時(shí)還是H5N1/1997、H7N9/2013、H10N8/2013等可以感染并致死人的流感病毒的內(nèi)部基因的供體。AI的潛伏期從幾個(gè)小時(shí)到幾天不等，潛伏期長短與病毒的致病性高低、感染強(qiáng)度、傳播途徑和感染禽種類有關(guān)。AI的臨診癥狀也因感染禽的種類、年齡、性別、并發(fā)感染情況有所感染毒株的毒力和其它環(huán)境因素等不同而表現(xiàn)很不一致，可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神經(jīng)系統(tǒng)。因此，對(duì)雞群免疫后的效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)對(duì)禽流感的防控將有積極的意義，同時(shí)也要加強(qiáng)對(duì)家禽養(yǎng)殖運(yùn)輸銷售相關(guān)從業(yè)人員的禽流感感染監(jiān)測(cè)工作。目前，針對(duì)病毒檢測(cè)的分子診斷方法已經(jīng)建立，本研究室在2013年也建立了病毒檢測(cè)的熒光定量PCR法(胡濤,滕巧泱,申偉霞,張?jiān)露?李國新,李雪松,閆麗萍,姜秀云,李澤君,H9N2亞型禽流感病毒熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用.中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2013.21(2):p.7-13.)。ELISA診斷方法具備高敏感性和特異性、檢測(cè)方便易行、自動(dòng)化程度高，而且價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為一種常用的檢測(cè)方法。針對(duì)H9亞型特異抗體的ELISA檢測(cè)方法，有報(bào)道的是以桿狀病毒表達(dá)的HA1分子蛋白為包被抗原建立的間接ELISA方法，該方法若用于不同宿主來源的血清抗體檢測(cè)需要不同的二抗試劑才能進(jìn)行，并且使得結(jié)果判定不能統(tǒng)一。阻斷ELISA(blockingeELISA,bELISA)以其特異性更高、不受宿主種類限制的優(yōu)勢(shì)在各種病毒疾病診斷和抗體檢測(cè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。以A型流感病毒NP(nucleoprotein)單抗為基礎(chǔ)建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法可以檢測(cè)不同宿主來源，包括鴨、鵝和野鳥中的流感病毒抗體。目前，還沒有特異性檢測(cè)H9亞型AIV特異性抗體的方法，為了更好地掌握H9亞型AIV在雞群和人群中的抗體水平，建立一種可以大規(guī)模、準(zhǔn)確、敏感、安全便捷的抗體檢測(cè)方法很有必要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決目前沒有特異性針對(duì)H9亞型禽流感病毒的抗體檢測(cè)方法的技術(shù)問題，提供一種抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體可用于特異、靈敏地檢測(cè)H9亞型禽流感病毒。此外，還需要提供一種應(yīng)用上述單克隆抗體檢測(cè)H9亞型禽流感病毒抗體的試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種一種抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體，其結(jié)合H9亞型禽流感病毒的HA蛋白，并具有血凝抑制活性。優(yōu)選的，所述單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCCNO.C2015211的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。優(yōu)選的，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏號(hào)為CCTCCNO.C2015211。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種檢測(cè)H9亞型禽流感病毒抗體的試劑盒，包含上述單克隆抗體。優(yōu)選的，本發(fā)明試劑盒還包含ELISA酶標(biāo)板、H9亞型禽流感病毒抗原、酶標(biāo)二抗、顯色液、陽性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清。優(yōu)選的，所述抗原的最佳包被濃度為10ng/孔；所述待測(cè)血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:10；所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗，其最佳稀釋倍數(shù)為1:5000。所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：用純化的H9亞型禽流感病毒抗原包被ELISA酶標(biāo)板；將待測(cè)血清與包被抗原作用后，依次加入上述單克隆抗體、酶標(biāo)二抗和顯色液；利用酶標(biāo)儀讀取吸光度值OD450nm,并按公式：抑制率(％)＝(陰性對(duì)照的吸光度值-待測(cè)血清的吸光度值)/陰性對(duì)照的吸光度值×100％，計(jì)算待測(cè)血清的抑制率，得檢測(cè)結(jié)果。所述試劑盒檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑制率≥25.0％為陽性，17.6％≤抑制率<25.0％為可疑,抑制率＜17.6％為陰性。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述單克隆抗體的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述單克隆抗體在制備診斷禽流感的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體，以及應(yīng)用該單克隆抗體檢測(cè)H9亞型禽流感病毒抗體的阻斷ELISA試劑盒，具有良好的特異性和敏感性，適用于大規(guī)模不同宿主血清的抗體檢測(cè)篩查和監(jiān)測(cè)，在H9亞型禽流感病毒病的診斷及抗體檢測(cè)方面具有很好的應(yīng)用前景。附圖說明下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體的免疫熒光鑒定結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2的bELISA檢測(cè)5份H9N2陽性血清以及H3、H4、H5、H7和H10亞型流感病毒血清、NDV陽性血清、DHV-1陽性血清、DPV陽性血清的結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2的H9N2亞型AIV感染試驗(yàn)雞后不同時(shí)間血清的HI法和bELISA法檢測(cè)結(jié)果比較圖。本發(fā)明的抗H9亞型禽流感病毒HA蛋白小鼠雜交瘤細(xì)胞株S1B1，已于2015年11月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO.C2015211。具體實(shí)施方式下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯,R.E.金斯頓,J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍,舒躍龍的譯.北京：科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。本發(fā)明采用純化的H9N2亞型禽流感病毒(H9N2AIV)SH441株(A/chicken/Shanghai/441/2009)免疫BALB/c小鼠，利用單克隆抗體制備技術(shù)，篩選獲得了1株穩(wěn)定分泌抗SH441株單抗的雜交瘤細(xì)胞株，該株單抗經(jīng)鑒定針對(duì)SH441株HA蛋白、且具有HI中和活性，命名為S1B1。用純化的SH441株滅活病毒包被ELISA板，將待檢血清與包被抗原作用后，然后分別加入了S1B1單抗、抗鼠IgG抗體和顯色液來測(cè)定特異性單抗結(jié)合量，建立了檢測(cè)H9亞型禽流感病毒抗體的阻斷ELISA方法(blockingELISA,bELISA)。經(jīng)篩選確定，抗原最佳包被濃度為10ng/孔，待測(cè)血清最佳稀釋倍數(shù)為1:10，單抗腹水最佳稀釋倍數(shù)為1:1000，HRP抗鼠二抗為1:5000。特異性試驗(yàn)表明，該方法僅與H9N2AIV抗體呈陽性，具有良好的特異性。適用性試驗(yàn)表明，該方法能夠檢測(cè)2003-2010年不同H9N2AIV分離株的陽性血清，具有對(duì)H9N2AIV抗體檢測(cè)的普遍適用性。與血清抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutinationinhibition,HI)相比,相關(guān)性達(dá)96.1％，且所建bELISA方法比HI更敏感，更安全，適用于對(duì)不同宿主血清的抗體檢測(cè)，克服了異源紅細(xì)胞對(duì)HI抗體檢測(cè)的影響，在大規(guī)模不同宿主血清篩查監(jiān)測(cè)中具有優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例1H9N2亞型禽流感病毒(H9N2AIV)SH441株單克隆抗體的制備及鑒定1.材料和方法1.1病毒、細(xì)胞與試驗(yàn)動(dòng)物H9N2亞型禽流感病毒SH441株(A/chicken/Shanghai/441/2009)由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；MDCK細(xì)胞、293T細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；清潔級(jí)BALB/c小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；所用4-5周齡試驗(yàn)雞由SPF雞胚孵化飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中。pCAGGS-H9-HA重組真核質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。1.2主要材料和試驗(yàn)用血清DMEM，Opti-MEM培養(yǎng)基購自GBICO公司；8-氮鳥嘌呤、PEG1450、HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、β-丙內(nèi)酯(β-propiolactone，BPL)溶液購自Sigma公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購自JacksonImmunoResearch公司；ISA70VG佐劑購自發(fā)國SEPPIC公司。H9N2AIV陽性和陰性血清、其他H9病毒分離株，以及H3、H4、H5、H7和H10亞型流感病毒血清、新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)、I型鴨肝炎病毒(typeⅠduckhepatitisvirus，DHV-1)、鴨瘟病毒(duckplaguevirus，DPV)陽性血清均為本實(shí)驗(yàn)室保存。1.3SH441株抗原的制備將種毒SH441以104TCID50的劑量感染SPF雞胚，72h收集含有病毒的尿囊液，0.05％BPL在4度滅活12h，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化病毒，測(cè)定蛋白濃度，分裝于-70℃保存，用作免疫抗原和包被抗原。1.4SH441株單克隆抗體的制備及其鑒定1.4.1小鼠免疫用純化的SH441株抗原加入等量弗氏完全佐劑乳化后，經(jīng)腹部和背部皮下注射6-8周齡雌性BALB/c小鼠，每只50μg；用純化的SH441株抗原加入等量弗氏不完全佐劑乳化后，每隔兩周分別進(jìn)行第二次和第三次免疫，劑量與首免相同；三免兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，靜脈注射25μg純化抗原后第三天開始細(xì)胞融合。1.4.2陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立按常規(guī)方法制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按10:1的比例在融合劑PEG1450作用下融合，按有限稀釋法進(jìn)行克隆，經(jīng)間接ELISA和HI法篩選抗體分泌陽性的雜交瘤細(xì)胞。結(jié)果：利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，通過間接ELISA和HI法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清，共獲得一株能夠穩(wěn)定分泌抗H9亞型禽流感病毒的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并將該細(xì)胞株命名為抗H9亞型禽流感病毒HA蛋白小鼠雜交瘤細(xì)胞株S1B1，該雜交瘤細(xì)胞株已于2015年11月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO.C2015211。1.4.3單克隆抗體腹水的制備將0.5mL滅菌的石蠟油注射小鼠腹腔，一周后再注入106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7-10天后，小鼠腹部的腹水極度膨脹時(shí)抽取腹水，分裝備用。1.4.4單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定(IFA)將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長成單層后，用SH441株感染MDCK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔。感染24h后，棄上清，細(xì)胞用4％的多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌三次，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗體，繼續(xù)37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌三次，最后在熒光下顯微鏡下觀察，凡有綠色熒光者判為陽性；無熒光者判為陰性。結(jié)果：用SH441感染MDCK細(xì)胞，用S1B1單抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，設(shè)未感染MDCK細(xì)胞為空白對(duì)照。呈現(xiàn)特異綠色熒光信號(hào)的為陽性，無綠色熒光信號(hào)的為陰性。試驗(yàn)結(jié)果顯示：S1B1單抗可產(chǎn)生特異性的綠色熒光(見圖1)，圖1中，A為S1B1單抗，B為空白對(duì)照。1.4.5抗H9N2AIV(SH441株)HA蛋白單克隆抗體的鑒定將293T培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長成單層后，將重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-H9-HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照孔。轉(zhuǎn)染24h后，棄上清，細(xì)胞用4％的多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌一次，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌三次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗體，繼續(xù)37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌三次，最后在熒光顯微鏡下觀察，凡有特異的綠色熒光者判為陽性；無熒光者判為陰性。結(jié)果：經(jīng)pCAGGS-H9-HA真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的IFA檢測(cè)，對(duì)照轉(zhuǎn)染空pCAGGs質(zhì)粒的293T細(xì)胞沒有特異的熒光，S1B1單抗出現(xiàn)特異的綠色熒光，結(jié)果見圖1C&D，進(jìn)而確認(rèn)S1B1單抗為抗H9N2AIVHA蛋白的單抗。圖1中，C為pCAGGS-HA轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞，D為pCAGGs轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞。實(shí)施例2H9N2AIV抗體阻斷ELISA方法(blockingELISA,bELISA)的建立1.H9N2AIV抗體阻斷ELISA操作方法⑴用PH9.6的碳酸鹽緩沖液包被純化的SH441株滅活病毒抗原，每孔100ng/孔,4℃過夜。次日取出后，用0.05％Tween-20PBS(PBST)洗滌三次，每次3min；⑵用5％脫脂乳的PBS封閉酶標(biāo)板，37℃2h，洗滌3次，方法同上；⑶加入抗體稀釋液稀釋10倍的待測(cè)血清、陰性和陽性對(duì)照，每孔100μL37℃孵育1小時(shí)，洗滌方法同上；⑷每孔100μLS1B1單克隆抗體腹水(1000×)，37℃孵育1小時(shí)，洗滌3次；⑸每孔加入抗體稀釋液稀釋到的辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(5000×)100微升，37℃1小時(shí)，洗滌3次；⑹每孔加入TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)底物顯色液100微升，室溫避光顯色10分鐘；⑺每孔加入2MH2SO450uL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取吸光度值OD450nm,計(jì)算抑制率，抑制率(％)＝(陰性對(duì)照的吸光度值-待測(cè)樣本的吸光度值)/陰性對(duì)照的吸光度值×100％。2.臨界值的確定對(duì)58份鴨陰性血清和58份雞陰性血清進(jìn)行bELISA檢測(cè)，對(duì)所得的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算陰性樣本的平均抑制率和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。根據(jù)公式：臨界值＝陰性樣本的平均抑制率+2或3×標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，分別計(jì)算其臨界值。結(jié)果：利用bELISA方法共檢測(cè)116份陰性血清的平均抑制率為2.8％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.4％。根據(jù)公式：陽性臨界值＝陰性樣本的平均抑制率+3×標(biāo)準(zhǔn)偏差，陽性樣品臨界值為25.0％，即當(dāng)樣品的抑制率(Percentinhibitionvalue,PIvalue)≥25.0％時(shí)，該血清為陽性；陰性臨界值＝陰性樣本的平均抑制率+2×標(biāo)準(zhǔn)偏差，陰性樣品臨界值為17.6％，即當(dāng)樣品的抑制率PI＜17.6％時(shí)，該血清為陰性；當(dāng)17.6≤PI＜25.0％時(shí)，該血清為可疑，需重復(fù)檢測(cè)一次，若仍低于25.0％，則判定為陰性，否則判為陽性。3.適用性和特異性試驗(yàn)用建立的B-ELISA方法分別檢測(cè)H9N2亞型AIV2003-2010年的26個(gè)分離株免疫雞血清，這些分離株的HA序列顯示具有不同的進(jìn)化分支，來確定該bELISA方法的適用性。用本發(fā)明試劑盒來檢測(cè)H3、H4、H5、H7和H10亞型流感病毒血清、NDV陽性血清、DHV-1陽性血清、DPV陽性血清，驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒對(duì)其它病毒的陽性血清的交叉反應(yīng)性，來確定該bELISA方法的特異性。結(jié)果顯示：bELISA檢測(cè)后，只有H9N2亞型AIV陽性血清呈陽性，PI在77.9％-85.3％，所有樣品用HI法進(jìn)行平行檢測(cè)，結(jié)果見表1；其他病毒血清均為陰性(見圖2)。說明該方法適用于不同進(jìn)化分支的H9亞型禽流感病毒特異抗體的檢測(cè)，且不與其他亞型流感病毒及禽常見的其他病毒性疾病具有交叉反應(yīng)，特異性良好。表126株H9亞型禽流感病毒血清的HI法和bELISA法檢測(cè)結(jié)果4.敏感性和相關(guān)性試驗(yàn)用SH441株病毒靜脈感染4周齡負(fù)壓隔離飼養(yǎng)的SPF雞后，不同時(shí)間(0h，12h，24h，48h，72h，96h)采集動(dòng)物血清，分別用建立的bELISA方法和血清抗體檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutinationinhibition,HI)進(jìn)行檢測(cè)，以比較兩者的敏感性和相關(guān)性。結(jié)果：見圖3，0h-24h兩種方法均顯示血清抗體為陰性，48h后兩種方法均顯示抗體水平為陽性，兩者的相關(guān)系數(shù)為96.1％。5.重復(fù)性試驗(yàn)⑴批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：用同一批次包被的酶標(biāo)板檢測(cè)不同的樣本，一份陽性樣本，一份陰性樣本，每份樣本重復(fù)6孔，進(jìn)行bELISA檢測(cè)，計(jì)算出同一樣本PI值的變異系數(shù)，以檢驗(yàn)批內(nèi)檢測(cè)樣品的重復(fù)性；⑵批間重復(fù)性試驗(yàn)：用不同批次包被的酶標(biāo)板6塊重復(fù)檢測(cè)1份陽性樣本和1份陰性樣本，進(jìn)行bELISA檢測(cè)，計(jì)算同一份樣本PI值的變異系數(shù)，以檢驗(yàn)批間檢測(cè)樣本的重復(fù)性。結(jié)果：對(duì)同一批次和不同批次的bELISA進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，其PI值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變異系數(shù)均小于10％，說明本發(fā)明試劑盒重復(fù)性良好(見表2和表3)。表2批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)實(shí)施例3檢測(cè)H9亞型禽流感病毒特異性抗體的阻斷ELISA(B-ELISA)試劑盒的組成和應(yīng)用1、試劑盒的組成按表4所列的試劑盒內(nèi)容，裝配成試劑盒，組裝后置于相應(yīng)條件保存。表4H9亞型禽流感病毒抗體阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒內(nèi)容編號(hào)內(nèi)容數(shù)量備注1待包被可拆卸酶標(biāo)板1塊8×12規(guī)格，4℃保存2包被抗原一管100μL/管，-20℃保存3包被緩沖液(1×)一瓶10mL/瓶，4℃保存4封閉液一瓶20mL/瓶，4℃保存5陽性對(duì)照血清1管50μL/管，-20℃保存6陰性對(duì)照血清1管50μL/管，-20℃保存7單克隆抗體1管100μL/管，-20℃保存8HRP-抗鼠IgG(5000×)1管5微升/管，-20℃保存9抗體稀釋液(1×)1瓶10mL/管，4℃保存10TMB顯色液1瓶10mL/瓶，4℃保存11終止液1瓶10mL/瓶，4℃保存12PBS-T洗滌液(10×)1瓶50mL/瓶，4℃保存13試劑盒說明書1份2、本發(fā)明試劑盒的使用方法：1)使用步驟A包被：于檢測(cè)前一天用包被抗原包被待包被可拆卸酶標(biāo)板，即將上述試劑的包被抗原置于包被液中混勻，每孔100微升，4℃過夜，次日取出后，用1×PBS-T洗滌液三次，每次3min；B封閉：封閉液200微升/孔，37℃1h，1×洗滌液洗滌3次，每次3min；C將待測(cè)血清、陰性及陽性對(duì)照血清用抗體稀釋液稀釋10倍備用，每孔100微升加入酶標(biāo)板中，37℃孵育1小時(shí)。1×洗滌液洗滌3次，每次3min，方法同上；D將單克隆抗體用抗體稀釋液稀釋20×，每孔100μL單抗，37℃孵育1h，洗滌3次；E每孔加入用抗體稀釋液稀釋到1×的HRP-抗鼠IgG100μL，37℃1h，洗滌3次；F每孔加入TMB底物顯色液100μL，室溫避光顯色10min；G每孔加入終止液50uL，酶標(biāo)儀讀取吸光度值OD450nm,計(jì)算抑制率，抑制率(％)＝(陰性對(duì)照的吸光度值-待測(cè)血清的吸光度值)/陰性對(duì)照的吸光度值×100％。2)檢測(cè)結(jié)果的判定及分析當(dāng)陽性血清的抑制率大于50％，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信，根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判定：當(dāng)血清樣本的抑制率值大于等于25.0％時(shí)，該樣本判定為H9亞型禽流感病毒抗體陽性；當(dāng)血清樣本的抑制率值小于17.6％時(shí)，該樣本判定為H9亞型禽流感病毒抗體陰性；當(dāng)血清樣本的抑制率值介于二者之間時(shí)，判定可疑，重新檢測(cè)可疑樣本，若抑制率仍低于25.0％，則判定為陰性，否則判為陽性。3、本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用用建立的bELISA方法測(cè)定鴨和雞免疫H9N2滅活疫苗之后的免疫抗體產(chǎn)生情況，鴨和雞各22只，檢測(cè)了免疫后1w，2w，3w，5w，7w，9w，11w，13w，15w，17w，19w，21w，23w，25w和27w的共計(jì)660份血清樣品，同時(shí)用HI試驗(yàn)平行檢測(cè)上述樣本。結(jié)果顯示，本發(fā)明bELISA檢測(cè)試劑盒可以更快速便捷地檢測(cè)大量不同宿主來源的血清樣品，與HI試驗(yàn)相比，不需要使用活病毒，不受異源紅細(xì)胞影響檢測(cè)結(jié)果，且可以減少檢測(cè)血清的用量。對(duì)于免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的330份鴨血清和330份雞血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示bELISA與HI實(shí)驗(yàn)的符合率達(dá)100％(見表5)。表5H9N2滅活疫苗免疫后鴨和雞血清的抗體檢測(cè)結(jié)果以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3