本發(fā)明涉及激光解吸離子化質(zhì)譜檢測的輔助基質(zhì)材料，具體地說是亞微米氧化碳球作為基質(zhì)在激光解吸離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自1988年Tanaka和Hillenkamp各自提出采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)技術(shù)，這一技術(shù)與飛行時間質(zhì)譜(MALDI-MS)聯(lián)用，已成為基因、蛋白組學(xué)等生命科學(xué)研究中的重要工具。(Rapid Commun Mass Sp 1988,2(8),151-153；Nature 2003,422(6928),198-207)

在MALDI-MS技術(shù)中，基質(zhì)起著吸收及傳遞激光能量、使樣品離子化的作用。MALDI-MS技術(shù)中常用的基質(zhì)都是小分子有機化合物，如α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、3-氨基喹啉(3-AQ)等。但是常規(guī)有機基質(zhì)的引入在低分子量范圍內(nèi)(〈500Da)帶來大量基質(zhì)峰，產(chǎn)生嚴重的背景干擾，限制了該方法在小分子分析中的應(yīng)用。

近年來，研究者提出使用無機材料(如表面修飾的硅、碳基材料等)作為基質(zhì)，克服傳統(tǒng)有機基質(zhì)帶來的背景干擾。(Nature 1999,399(6733),243-246；Anal Chem 2003,75(22),6191-6195)然而，早期的石墨、碳納米管通常水溶性差，作為基質(zhì)在金屬靶上分布不均勻，嚴重影響信號重復(fù)性；而且碳納米管作為基質(zhì)時形成的基質(zhì)層較疏松，激光輻射時容易飛離靶板，污染離子源。鄒漢法和鄧春暉等人先后提出對碳納米管進行強酸氧化處理或者多巴胺后修飾得到水溶性碳納米管。改善碳納米管作為基質(zhì)的弊端。(J Am Soc Mass Spectr 2005,16(6),883-8922005,16(6),883-892；ACS Appl Mater Inter 2013,5(16),7770-6)張靜等人對石墨烯進行改性，克服了石墨烯自身作為基質(zhì)時易發(fā)生聚合的缺陷，也可實現(xiàn)對小分子化合物的檢測。(張靜.一種具有選擇性的用于小分子MALDI-TOF MS檢測的基質(zhì)及其應(yīng)用[P].中國專利:103776892A,2014-05-07)

然而，碳納米管或石墨烯等碳材料的尺度控制較難，開發(fā)改性的水溶性碳基材料作為基質(zhì)制備工藝復(fù)雜，成本高，難為MALDI-MS提供尺寸穩(wěn)定的基質(zhì)材料，影響質(zhì)譜檢測的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，限制了碳基納米材料作為基質(zhì)的MALDI-MS應(yīng)用的適用性。為了彌補已報道碳基材料作為基質(zhì)在MALDI-MS應(yīng)用的局限性，本發(fā)明提供了一種亞微米級(sub-micrometer)氧化碳球為激光解吸離子化輔助基質(zhì)的MALDI-MS應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種將亞微米氧化碳球用于MALDI-MS的激光解吸離子化輔助基質(zhì)的應(yīng)用。提供的亞微米氧化碳球制備方法簡單可控，形貌規(guī)整， 尺寸均勻，成本低廉、水溶性好，此亞微米氧化碳球作為MALDI基質(zhì)可避免使用傳統(tǒng)有機基質(zhì)檢測小分子化合物的基質(zhì)干擾問題，也使得碳基材料作為激光解吸離子化輔助基質(zhì)時質(zhì)譜檢測的可操作性強、重復(fù)性好，實現(xiàn)了MALDI-MS對小分子化合物的高通量、高靈敏分析。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實施：

提供一種將亞微米氧化碳球用于MALDI-MS的激光解吸離子化輔助基質(zhì)的應(yīng)用。其特征在于：具體應(yīng)用過程如下，

1)稱取亞微米氧化碳球10mg，加入5-20mL乙醇水溶劑，乙醇與水的體積比為1:5～5:1，超聲分散均勻，制得亞微米氧化碳球基質(zhì)溶液；

2)取樣品溶液點于不銹鋼靶表面，自然干燥形成均勻樣品層；

3)取亞微米氧化碳球基質(zhì)溶液點于不銹鋼靶表面樣品層上，自然干燥后，進行激光解吸離子化MALDI-MS質(zhì)譜分析。

所述亞微米氧化碳球為直徑70-1000nm之間的規(guī)整圓球形氧化碳材料，可按如下改進后方法制備獲得，(Angewandte Chemie 2011,50(26),5947-51；Journal of Materials Chemistry 2012,22(25),12636)

(1)向30～50mL醇水溶劑(V_乙醇:V_水＝1:1～1:2)中加入陽離子表面活性劑CTAB(0～0.928g)和嵌段醚聚合物F127(0～0.96g)，室溫磁力攪拌20min得透明溶液。

(2)向步驟(1)溶液中加入46mg～186mg間苯二酚，85μL～171μL(質(zhì)量濃度25％)氨水。0.5h后加入126μL甲醛，30～70℃磁力攪拌，反應(yīng)過夜。

(3)離心步驟(2)反應(yīng)液，得土黃色固體，用乙醇水溶劑(體積比1:1)清洗3次，真空干燥，得碳球前軀體。

(4)步驟(3)中所得碳球前軀體在氮氣氛圍下高溫碳化，碳化溫度為500～1000℃，得亞微米碳球。

(5)稱取20mg步驟(4)中所得亞微米碳球，加入20mL稀硝酸溶液(質(zhì)量濃度26％)，電磁攪拌，90℃回流2h，自然降溫。反應(yīng)液水洗至中性，真空干燥即得亞微米氧化碳球。

所述亞微米氧化碳球作為激光解吸離子化輔助基質(zhì)在MALDI-MS中的應(yīng)用，其特征在于：所述MALDI-MS檢測對象為分子量小于1000Dalton的氨基酸、脂類化合物、肽、糖類、核苷酸、香豆素類、黃酮類、酚類、抗癌藥、獸殘、激素類、食品添加劑中任一種化合物或二種以上混合物。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：

本發(fā)明所涉及的亞微米氧化碳球作為MALDI基質(zhì)，能有效消除傳統(tǒng)有機基質(zhì)自身的背景干擾，輔助MALDI-MS實現(xiàn)對小分子化合物的快速、準(zhǔn)確分析。亞微米氧化碳球作為MALDI基質(zhì)形貌規(guī)整、粒徑在70nm-1000nm之間均勻可調(diào)，水溶性好，可在MALDI靶上形成均勻的基質(zhì)層，克服了碳納米管或石墨烯等碳納米材料的大小尺度控制較難及影響MALDI質(zhì)譜檢測的穩(wěn)定性的不足，提高了 信號的重復(fù)性。本發(fā)明涉及的亞微米氧化碳球MALDI基質(zhì)是一種制備簡單，成本低廉的碳基材料，具有更廣泛的MALDI-MS質(zhì)譜分析的可操作性，已成功應(yīng)用于分子量小于1000Dalton的氨基酸、脂類、肽、糖類、核苷、激素、藥物等小分子化合物的高靈敏高通量分析。

附圖說明

圖1為實例1中所制得直徑為180nm-250nm的氧化碳球透射電子顯微鏡照片；

圖2為實例2中所制得直徑為600nm-800nm的氧化碳球透射電子顯微鏡照片；

圖3為實施例3中外徑180nm-250nm的氧化碳球作為基質(zhì)分析D-木糖的質(zhì)譜圖；

圖4為實施例4中外徑600nm-800nm的氧化碳球作為基質(zhì)分析D-半乳糖的質(zhì)譜圖；

圖5為實施例5中碳球(左側(cè)CS)和氧化碳球(右側(cè)OCS)的水溶性對比圖；

圖6為實施例6中不同基質(zhì)所形成的基質(zhì)層形態(tài)圖；

圖7為實施例7中使用不同基質(zhì)MALDI-TOF MS分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖7中A為使用傳統(tǒng)CHCA作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖7中B為亞微米氧化碳球作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖7中C為微米級不規(guī)整氧化碳球作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖7中D為氧化碳納米管作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖7中E為氧化石墨烯作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但本發(fā)明并不限于下述實施例。

下述實施例中所用的容器、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1：直徑為180nm-250nm的氧化碳球的制備

(1)將0.029g CTAB和0.96g F127分散于乙醇/水(7mL/14mL)溶液中，室溫磁力攪拌20min，形成無色透明溶液。

(2)向步驟(1)加入0.093g(30mmoL)間苯二酚，0.171mL氨水(質(zhì)量濃度25％)，60℃下電磁攪拌。

(3)半小時后，向步驟(2)中加入0.126μL甲醛，繼續(xù)電磁攪拌16h。

(4)將步驟(3)中所得反應(yīng)液離心，水洗三次，乙醇洗兩次。真空干燥過夜，得土黃色碳球前軀體。

(5)步驟(4)中所得土黃色碳球前軀體在氮氣氣氛中600℃碳化4h，自然降溫得外徑為180nm-250nm的碳球。

(6)取20mg步驟(5)中所得碳球，加入20mL稀HNO₃(質(zhì)量分數(shù)26％)溶液，電磁攪拌，90℃回流2h，水洗至中性，真空干燥得外徑為180nm-250nm 的氧化碳球。

圖1為實施例1中所制得直徑為180nm-250nm的氧化碳球透射電子顯微鏡照片。

實施例2：直徑為600nm-800nm的氧化碳球的制備

實驗操作步驟同實施例1中步驟(1)-(6)所述，以下特殊說明步驟除外。

步驟(1)中所用CTAB量為0.232g。

步驟(5)中自然降溫得外徑為600nm-800nm的碳球。

步驟(6)中真空干燥得外徑為600nm-800nm的氧化碳球。

圖2為實施例2中所制得直徑為600nm-800nm的氧化碳球透射電子顯微鏡照片；

本發(fā)明涉及的亞微米氧化碳球制備方法簡單，所用原料價格低廉，制得材料為形貌規(guī)整的圓球形，粒徑可在70nm-1000nm之間調(diào)整。所得氧化碳球單分散性好，避免氧化碳球作為基質(zhì)時發(fā)生自身團聚，能與分析化合物充分接觸，并傳遞激光能量，大大提高樣品分析時的離子化效率。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

本發(fā)明下述實施例中所用的檢測儀器為：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)，儀器型號為AB SCIEX TOF 5800。脈沖為Nd:YAG激光器，發(fā)射波長為355nm。

實施例3：180nm-250nm的氧化碳球作為基質(zhì)MALDI-TOF MS檢測糖類化合物以不易離子化的糖化合物D-木糖(MW＝150.13)為檢測對象。

1、配制10Mm的D-木糖母液(水溶液)，采用梯度稀釋的方法得到1Mm的稀釋液?？?℃冰箱保存。

2、配制2mg/Ml實施例1中180nm-250nm的氧化碳球基質(zhì)溶液(所用溶劑為乙醇水混合溶液，V_乙醇:V_水＝1:1)。超聲5min分散均勻待用?？?℃冰箱保存。

3、取0.5μL步驟1中1Mm稀釋液，懸滴到384孔不銹鋼MALDI樣品靶上，自然晾干形成均勻樣品層。

4、取0.5μL步驟2中基質(zhì)溶液，點到樣品層上，自然風(fēng)干。

5、送入MALDI-TOF MS進行分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)在正離子反射模式下采集，每張譜圖為1000次測量平均圖，m/z范圍50-1000。

圖3為實施例3中外徑180nm-250nm的氧化碳球作為基質(zhì)分析D-木糖的質(zhì)譜圖。

實施例4：600nm-800nm的氧化碳球作為基質(zhì)MALDI-TOF MS檢測糖類化合物

操作步驟同實施例3中所述步驟，特殊說明的步驟除外。

檢測對象為D-半乳糖(MW＝180.16)，其為又一不易離子化的化合物代表。圖4為實施例4中外徑600nm-800nm的氧化碳球作為基質(zhì)分析D-半乳糖的質(zhì)譜圖。

尺寸為180nm-250nm和600nm-800nm的亞微米氧化碳球作為基質(zhì)時，MALDI-TOF MS分析不易離子化的糖類化合物，在低濃度下都表現(xiàn)出很高的靈敏度和高信噪比，而且在低分子量區(qū)域幾乎很少出現(xiàn)背景干擾，顯示出亞微米氧化碳球優(yōu)良的基質(zhì)輔助效果。

實施例5：氧化碳球與碳球水溶性比較

具體過程如下：

分別取20mg實施例1步驟(5)中的碳球(CS)、步驟(6)中的氧化碳球(OCS)，分別加入10Ml去離子水，超聲5min后，靜置48h；

圖5為碳球(左側(cè)CS)和氧化碳球(右側(cè)OCS)的水溶性對比圖。

可以看出，亞微米碳球在水中分散性較差，很容易沉降。而對其經(jīng)過溫和的氧化處理后所得亞微米氧化碳球水溶性大大提高，其分散狀態(tài)可在水中保持長久的穩(wěn)定性，使得亞微米氧化碳球作為基質(zhì)溶液的均勻性好、可操作性強。

實施例6：氧化碳球與其他形狀碳材料作為基質(zhì)靶板分布形態(tài)比較

具體過程如下：

1、分別取10mg亞微米氧化碳球、微米級不規(guī)整氧化碳球、氧化碳納米管、氧化石墨烯，分別加入5Ml乙醇水(V_乙醇：V_水＝1：1)，超聲分散5min，得2mg/Ml基質(zhì)溶液。

2、步驟1中所述微米級不規(guī)整氧化碳球、氧化石墨烯、氧化碳納米管制備方法見本實施例說明。亞微米氧化碳球為實施例1中所制180nm-250nm的氧化碳球。

3、分別取0.5μL步驟1中基質(zhì)溶液點于不銹鋼金屬靶板表面，自然干燥后形成基質(zhì)薄層。

說明：本實施例所述微米級不規(guī)整氧化碳球，氧化碳納米管，氧化石墨烯的制備過程，具體如下，

A、所述微米級不規(guī)整氧化碳球的制備

(1)將0.232g CTAB和0.96g F127分散于乙醇/水(28mL/14mL)溶液中，室溫磁力攪拌20min，形成無色透明溶液。

(2)向步驟(1)加入0.186g(60mmoL)間苯二酚，0.342mL氨水(質(zhì)量濃度25％)，60℃下電磁攪拌。

(3)半小時后，向步驟(2)中加入0.126μL甲醛，繼續(xù)電磁攪拌16h。

(4)將步驟(3)中所得反應(yīng)液離心，水洗三次，乙醇洗兩次。真空干燥過夜，得土黃色碳球前軀體。

(5)步驟(4)中所得土黃色碳球前軀體在氮氣氣氛中600℃碳化4h，自然降溫得外徑為1200nm-2500nm的球形不規(guī)整碳球。

(6)取20mg步驟(5)中所得碳球，加入20mL稀HNO₃(質(zhì)量分數(shù)26％)溶液，電磁攪拌，90℃回流2h，水洗至中性，真空干燥得外徑為1200nm-2500nm的球形不規(guī)整氧化碳球。

B、所述氧化碳納米管的制備

1、取100mg多壁碳納米管置于250mL燒瓶中，緩慢加入100mL濃硝酸；

2、磁力攪拌，加熱到120℃回流2h；撤去加熱，自然冷卻至室溫；

3、將燒瓶中溶液轉(zhuǎn)移到盛有300mL冷水的燒杯中，攪拌冷卻至室溫；

4、將稀釋后的溶液用0.45μm濾膜減壓抽濾，用去離子水反復(fù)洗滌至pH接近中性，無水乙醇沖洗2次；

5、將步驟4中濾膜和膜上濾餅小心轉(zhuǎn)移到真空干燥箱中，60℃真空干燥，得氧化碳納米管。

所用多壁碳納米管購于南京先鋒納米公司，外徑為18-22nm，長度為5-20μm。

氧化后所得氧化碳納米管壁結(jié)構(gòu)受到部分破壞，長度在500nm-3μm之間不等。

C、所述氧化石墨烯的制備

(1)將石墨(1.5g，325目)加入到12mL濃H₂SO₄，2.5g K₂S₂O₈和2.5g P₂O₅的混合物中，加熱上述混合體系至80℃，保持該溫度，磁力攪拌5小時，隨后冷卻反應(yīng)體系至室溫；

(2)將混合物傾入500mL去離子水中，靜置過夜；

(3)將上述靜置物經(jīng)0.2微米濾膜過濾，洗滌并自然晾干，得預(yù)氧化石墨；

(4)將該預(yù)氧化的石墨加入到0℃的濃H₂SO₄(120mL)中；

(5)隨后緩慢加入15g KMnO₄，并控制反應(yīng)溫度在20℃攪拌，高錳酸鉀加畢，控制反應(yīng)體系在35℃攪拌4小時，隨后，加入250mL去離子水，并通過外圍冰浴控制溫度在50℃以下，攪拌1.5小時后，再加入700mL去離子水，半小時后，逐滴滴入20mL 30％H₂O₂，反應(yīng)體系迅速由棕色轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色，撤去攪拌裝置；

(6)過濾該棕黃混合物，用1:10HCl(1L)洗滌以除去金屬離子，隨后再用1L去離子水反復(fù)洗滌，得棕色固體，室溫干燥后；

(7)將上述棕色固體制成水分散液(0.5％w/w)，連續(xù)透析一周，最后過濾，洗滌，重新分散超聲1小時，過濾，60℃真空干燥24小時，即可制備得到氧化石墨烯。

所得氧化石墨烯為片層結(jié)構(gòu)，尺寸分布在(1.5～4)μm×(1.5～8)μm，形狀不規(guī)則。

圖6為基質(zhì)溶液干燥后所形成的基質(zhì)層在MALDI-TOF-MS自配顯微鏡下形態(tài)圖，亞微米氧化碳球(圖中A)、微米級不規(guī)整氧化碳球(圖中B)、氧化碳納米管(圖中C)、氧化石墨烯(圖中D)。

可以看出本發(fā)明涉及的亞微米氧化碳球均勻鋪展在金屬靶板上形成致密的薄層，利于激光能量的傳遞和分析化合物的離子化；

而微米級不規(guī)整氧化碳球所形成基質(zhì)層較厚，表面較為粗糙，不利于分析物的離子化；

氧化后的碳納米管結(jié)構(gòu)被破壞，長短不一，尺寸不均，在靶板上分布形態(tài) 差，薄厚不均勻，易導(dǎo)致信號重復(fù)性差；

氧化石墨烯在靶上分布較為均勻，但是由于片狀的石墨烯自身易團聚折疊，分布呈褶皺形態(tài)，不利于激光能量的傳遞。

實施例7：亞微米氧化碳球作為基質(zhì)分析四種脂肪酸混合物與現(xiàn)有技術(shù)比較

1、配制四種脂肪酸(MW_(C14)＝228.37、MW_(C16)＝256.43、MW_(C18)＝284.48、MW_(C20)＝312.54)的10mM混合液。分散溶液為無水乙醇，采用梯度稀釋的方法得到20μM待上樣液。4℃冰箱保存。

2、取10mg傳統(tǒng)有機基質(zhì)CHCA，加入2mL乙腈水溶液(V_乙腈:V_水＝1:1)。超聲5min。得5mg/mL的CHCA基質(zhì)溶液，備用。

3、分別取實施例6步驟(1)中所制2mg/mL亞微米氧化碳球、微米級不規(guī)整氧化碳球、氧化碳納米管、氧化石墨烯的基質(zhì)溶液，備用。

4、取0.5μL步驟1中20μM樣品滴到不銹鋼MALDI靶上，自然晾干形成樣品層。

5、取0.5μL步驟2或步驟3中基質(zhì)溶液點到樣品層上，自然風(fēng)干。

6、進行MALDI-TOF MS分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)在負離子反射模式下采集，每張譜圖為200次測量平均圖，m/z范圍50-1000。

圖7為使用不同基質(zhì)時MALDI-TOF MS分析同等濃度脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖中A為使用傳統(tǒng)CHCA作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖中B為亞微米氧化碳球作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖中C為微米級不規(guī)整氧化碳球作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖中D為氧化碳納米管作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖；

圖中E為氧化石墨烯作為基質(zhì)分析脂肪酸混合物的質(zhì)譜圖。

可以看出，使用傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA在負離子模式下質(zhì)譜圖(A)中僅出現(xiàn)基質(zhì)本身的碎片峰，未觀測到脂肪酸的信號峰；而使用亞微米的氧化碳球作為基質(zhì)時，圖譜中(B)幾乎沒有任何背景干擾，四種脂肪酸的信號峰都以[M-H]^-(m/z＝227.258,255.298,283.338,311.378)的特征峰出現(xiàn)，在非常低的濃度下仍表現(xiàn)出很高的靈敏度和信號強度。與之對比的使用微米級不規(guī)整氧化碳球作為基質(zhì)時，圖譜(C)也幾乎沒有背景干擾，四種脂肪酸的[M-H]^-也都能檢測到，但信號強度遠低于亞微米的氧化碳球，這是因為不規(guī)整的微米氧化碳球能量傳遞效率較低；同樣的使用氧化碳納米管(D)和氧化石墨烯(E)作為基質(zhì)時，圖譜中都能觀測到四種脂肪酸的[M-H]^-信號峰，但是在信號峰附近還有很多干擾峰存在，掩蓋了分析物的信號峰，樣品信號強度也遠低于B圖譜，這可能由于基質(zhì)本身尺度跨度范圍大，加上石墨烯的片層結(jié)構(gòu)易團聚致使所形成基質(zhì)層分布不均勻，限制了激光能量傳遞效率和樣品的離子化效率。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)異效果：

本發(fā)明所涉及的亞微米氧化碳球作為MALDI基質(zhì)，能有效消除傳統(tǒng)有機基質(zhì)自身的背景干擾，輔助MALDI-MS實現(xiàn)對小分子化合物的快速、準(zhǔn)確分析。亞微米氧化碳球作為MALDI基質(zhì)形貌規(guī)整、粒徑在70nm-1000nm之間均勻可調(diào)， 水溶性好，相比于微米的氧化碳球或不規(guī)整的球形材料，在MALDI靶上形成更為均勻的基質(zhì)層，激光能量傳遞效率高，可以有效增強分析物的離子化效率，克服了已報道的碳納米管或石墨烯等碳納米材料的大小尺度控制較難及影響MALDI質(zhì)譜檢測的穩(wěn)定性的不足，提高了信號的重復(fù)性。

本發(fā)明涉及的亞微米氧化碳球MALDI基質(zhì)是一種制備簡單，成本低廉的碳基材料，具有更廣泛的MALDI-MS質(zhì)譜分析的可操作性，已成功應(yīng)用于分子量小于1000Dalton的氨基酸、脂類、肽、糖類、核苷、激素、藥物等多種結(jié)構(gòu)小分子化合物的高靈敏高通量分析。