本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測磷酸化蛋白的熒光探針系統(tǒng)、其合成方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾中最廣泛的共價修飾方式之一，是所有生物中進(jìn)行的最廣泛、最獨(dú)特，并且亦是最具效率的一類蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)程。蛋白磷酸化是通過ATP的γ位磷酸基團(tuán)經(jīng)磷酸化激酶催化轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)上，而其反向過程即去磷酸化是由蛋白磷酸酶催化去除相應(yīng)磷酸基團(tuán)。

磷酸化后的蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈引入一個帶有非常強(qiáng)的負(fù)電荷磷酸基基團(tuán)，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)型、活性以及與其他小分子作用的性能，從而在信號傳遞、基因表達(dá)、細(xì)胞分裂的調(diào)控中起重要作用。異常的蛋白磷酸化通常與許多疾病有關(guān)，如癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、免疫疾病、心臟病等。它調(diào)控著大約30％的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)組，世界上有25％的藥物將磷酸化激酶作為靶標(biāo)，由此可見對蛋白質(zhì)磷酸化的研究具有重大意義。

目前對磷酸化蛋白的研究主要針對于三種蛋白，即磷酸化蛋白、激酶和磷酸酯酶。小分子熒光探針一般都是用金屬絡(luò)合物識別磷酸根離子引起熒光官能團(tuán)熒光性質(zhì)發(fā)生變化從而達(dá)到檢測目的。常用的金屬配合物包括有Zn²⁺、Mg²⁺、Tb³⁺，而將芘作為熒光響應(yīng)基團(tuán)。大部分小分子熒光探針只能單純的識別磷酸蛋白的磷酸基團(tuán)，而不能區(qū)分磷酸化蛋白磷酸化位點(diǎn)的空間距離遠(yuǎn)近，同時也不能夠跟蹤蛋白的磷酸化過程及去磷酸化過程。

基于以上，在本發(fā)明中我們構(gòu)建一種能識別磷酸化蛋白的熒光探針系統(tǒng)，能區(qū)分磷酸化蛋白磷酸化位點(diǎn)的空間距離遠(yuǎn)近，同時能夠跟蹤蛋白的磷酸化過程及去磷酸化過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供檢測磷酸化蛋白的熒光探針系統(tǒng)、其合成方法及應(yīng)用。該探針具有對磷酸化蛋白選擇性好、靈敏度高的特點(diǎn)，并且能識別蛋白磷酸化位點(diǎn)的空間距離，還能夠?qū)っ傅牧姿峄^程和磷酸酯酶的去磷酸化過程進(jìn)行跟蹤。該探針系統(tǒng)制備簡單，適合放大合成和實(shí)際應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種檢測磷酸化蛋白的熒光探針系統(tǒng)，該系類熒光探針結(jié)構(gòu)通式及代表性探針1-3結(jié)構(gòu)如下：

其中探針1、探針2為已發(fā)表化合物，本發(fā)明提供了熒光探針3的合成方法：

該方法具體步驟如下：

(1)1-(3-溴丙基)芘的合成

(2)溴取代芘在無水無氧條件下加入無水乙醚溶解，在冰浴條件下注入n-BuLi，攪拌0.5-2h后，滴入1,3-二溴丙烷，冰浴下繼續(xù)攪拌0.5-2h后，升溫至室溫攪拌過夜，即可得到1-(3-溴丙基)芘。3-(芘基-1)-N,N-2-吡啶基亞甲基正丙氨的合成

第一步產(chǎn)物與KI在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用DIPEA溶解。將DPA(雙-(吡啶基-2-亞甲基)胺)溶于無水乙腈中，再加入到反應(yīng)器中。升溫至80-90℃，攪拌回流，反應(yīng)12-48h即可得到3-(芘基-1)-N,N-2-吡啶基亞甲基正丙氨。

(3)探針3的合成

CHCl₃/CH₃CN溶液(CHCl₃/CH₃CN＝20:1～1:1，體積比)，溶解第二步產(chǎn)物。將用甲醇助溶的ZnClO₄﹒6H₂O加入反應(yīng)器中，在室溫條件下攪拌0.5-2小時后，將乙醚加入，攪拌過夜后析出探針3.

本發(fā)明的探針3的制備方法，步驟(1)中溴取代芘與無水乙醚的質(zhì)量/體積比為1:50-70(g/mL)，溴取代芘與n-BuLi的質(zhì)量/體積比為1：1.6-2(g/mL),溴取代芘與1,3-二溴丙烷的質(zhì)量/體積比為1:1.6-2(g/mL)；步驟(2)中第一步產(chǎn)物與 KI的摩爾比為1：0.5-0.7，第一步產(chǎn)物與DIPEA的質(zhì)量/體積比為1：9-11(g/mL),第一步產(chǎn)物與DPA的質(zhì)量/體積比為1：0.4-0.6(g/mL),第一步產(chǎn)物與無水乙腈的質(zhì)量/體積比為1：0.2-0.4(g/L)；步驟(3)中第二步產(chǎn)物與CHCl₃/CH₃CN混合溶液的質(zhì)量/體積比為1：50-70(g/mL),第二步產(chǎn)物與ZnClO₄﹒6H₂O的摩爾比為1：0.5-2，第二步產(chǎn)物與乙醚的質(zhì)量/體積比為1：1-2(g/mL)。

本發(fā)明的3-芘基-N,N-2-吡啶基亞甲基正丙氨的合成用的堿是DIPEA。

本發(fā)明的檢測磷酸化蛋白的熒光探針系統(tǒng)在檢測磷酸化蛋白、檢測磷酸化蛋白磷酸化位點(diǎn)的距離或檢測蛋白磷酸化過程和磷酸化蛋白去磷酸化過程中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的磷酸化蛋白的熒光探針系統(tǒng)能區(qū)分磷酸化位點(diǎn)不同間距的磷酸化蛋白。先利用A(探針1或2)與磷酸化蛋白作用，再利用B(探針3)與該磷酸化蛋白作用，若A、B均有響應(yīng)則為臨位磷酸化蛋白，若A無響應(yīng)、B有響應(yīng)則為磷酸化位點(diǎn)間隔一定距離的磷酸化蛋白。

本發(fā)明所述的芘類熒光化合物系統(tǒng)能對磷酸化過程進(jìn)行跟蹤，通過對ALP(堿性磷酸酶)、激酶與磷酸化蛋白的作用研究蛋白的磷酸化過程和去磷酸化過程。

附圖說明

圖1溴取代丙基芘的氫譜

圖2 3-芘基-N,N-2-吡啶基亞甲基正丙氨的氫譜

圖3 3-芘基-N,N-2-吡啶基亞甲基正丙氨的碳譜

圖4探針3的氫譜

圖5探針3的碳譜

圖6探針1對焦磷酸跟離子的熒光滴定

圖7探針2對焦磷酸跟離子的熒光滴定

圖8探針3對焦磷酸跟離子的熒光滴定

圖9探針1對a-casein蛋白的熒光滴定

圖10探針2對a-casein蛋白的熒光滴定

圖11探針3對a-casein蛋白的熒光滴定

圖12探針1對β-casein蛋白的熒光滴定

圖13探針2對β-casein蛋白的熒光滴定

圖14探針3對β-casein蛋白的熒光滴定

圖15探針1對BSA和a-casein蛋白選擇性

圖16探針3對BSA、a-casein和β-casein凝膠電泳

圖17探針1對ALP與a-casein作用研究

圖18探針2對ALP與a-casein作用研究

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限于此。

實(shí)施例1

1、1-(3-溴丙基)芘的合成

溴取代芘500mg(1.79mmol)置于25mL單口燒瓶中，將反應(yīng)器放在冰浴中，在無水無氧條件下加入30mL無水乙醚，在冰浴條件下用注射器注入0.9mLn-BuLi，攪拌0.5h后，滴入0.92mL 1,3-二溴丙烷，冰浴下繼續(xù)攪拌0.5h后，升溫至室溫攪拌過夜(24h)。減壓旋干溶劑，柱層析分離(濕法固體上樣法，石油醚裝柱、石油醚洗滌)得到米白色產(chǎn)物，103mg，收率為18％，洗脫劑為石油醚；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.48–7.71(m,1H),3.70–3.25(m,1H),2.53–2.17(m,1H).

2、3-(芘基-1)-N,N-2-吡啶基亞甲基正丙氨的合成

取51mg 1-(3-溴丙基)芘和15mg KI置于干燥的25mL兩口燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，用注射器注入500ul DIPEA于燒瓶中。將25ul DPA(雙-(吡啶基-2-亞甲基)胺)溶于15mL無水乙腈中，再用注射器加入到反應(yīng)器中。升溫至80℃，攪拌回流，反應(yīng)12h。減壓旋干溶劑，柱層析分離(濕法固體上樣法，先石油醚裝柱，石油醚、乙酸乙酯洗滌，再二氯甲烷裝柱，二氯甲烷、甲醇洗滌)得到黃色油狀產(chǎn)物，55mg，收率為78.5％，洗脫劑為石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇(梯度洗脫，先用石油醚：乙酸乙酯＝0-0.1洗滌，共2h，再二氯甲烷：甲醇＝0-0.2洗滌，共3h)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.49(d,J＝4.7Hz,1H),8.17(dd,J＝23.1,8.4Hz,2H),8.09–7.92(m,2H),7.75(d,J＝7.8Hz,1H),7.63–7.46(m,2H),7.15–7.03(m,1H),3.91(s,2H),3.31(t,J＝7.7Hz,1H),2.79(t,J＝7.1Hz,1H),2.19–1.99(m,1H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃):δ159.23,148.99,136.46,131.41,130.89,129.78,128.56,127.51,127.23,127.14,126.57,125.82,125.06,125.01,124.86,124.78,124.70,123.36,123.03,122.04,60.43,54.12,31.10,29.12.

3、探針3的合成

在50mL圓底燒瓶中加入10mL CHCl₃/CH₃CN溶液中(CHCl₃/CH₃CN＝20:1，體積比)，加入133.7mg 3-(芘基-1)-N,N-2-吡啶基亞甲基正丙氨溶解。稱504mg ZnClO₄﹒6H₂O溶于1mL甲醇配制鋅離子母液，取其中0.4mL緩慢加入燒瓶中，在室溫條件下攪拌0.5小時后，將50mL乙醚緩慢加入圓底燒瓶中，攪拌過夜(24h)后析出米黃色固體，過濾并干燥后制得探針3，138mg，收率為90％。

¹H NMR(400MHz,DMSO):δ8.56(d,J＝5.0Hz,1H),8.39(d,J＝9.3Hz,1H),8.35–8.19(m,2H),8.09(t,J＝7.6Hz,1H),7.98(t,J＝8.4Hz,1H),7.61–7.51(m,1H),7.47(d,J＝7.9Hz,1H),4.26(d,J＝16.2Hz,1H),3.95(d,J＝16.2Hz,1H),3.32(t,J＝7.4Hz,1H),2.92–2.78(m,1H),2.20(s,1H).

¹³C NMR(101MHz,DMSO):δ155.12,147.33(m),140.82,136.30,131.35,130.86,129.83,128.79,127.86,127.77,127.12,126.72,125.54,125.42,125.34,125.01,124.75,124.67,124.55,123.96,57.09,55.15,30.26,24.64.

實(shí)施例2

分別稱取來源實(shí)驗(yàn)室已知的探針15.06mg、探針21.24mg，以上實(shí)施例制備的探針35.22mg分別溶于5.27mL、1.26mL、5.22mL的DMSO中，制備母液濃度為2mM。取3根EP管，分別標(biāo)記為1，2，3，用5000uL移液槍，分別移取3980uL 20mM HEPES(20mM，pH＝7.4)溶液于3支EP管中，再用20uL移液槍分別移取20uL三種探針母液分別于3支EP管中，探針濃度為10^-5mol/L。每支EP管中逐步滴加4n(n＝1、2、3….10)uL的PPi溶液，其中PPi的濃度為0.01mol/L。用熒光分光光度計(jì)測定三種探針的熒光光譜，激發(fā)波長為345nm。

從圖6、圖7、圖8中可以看出當(dāng)用345nm的波長激發(fā)，三種探針都在478nm處產(chǎn)生一個芘激基復(fù)合物的熒光峰，三種探針對焦磷酸根離子都能選擇性結(jié)合，并隨碳原子數(shù)增加，絡(luò)合峰的強(qiáng)度越大。

實(shí)施例3

取3根EP管，分別標(biāo)記為1，2，3，用5000uL移液槍，分別移取3980uL20mM HEPES(20mM，pH＝7.4)溶液于3支EP管中，再用20uL移液槍分別移取20uL三種探針母液(2mM)分別于3支EP管中，探針濃度為10^-5mol/L。每支EP管中逐步滴加4n(n＝1、2、3….10)uL的a-casein蛋白溶液，其中a-casein蛋白的濃度為0.1mM。用熒光分光光度計(jì)測定三種探針的熒光光譜，激發(fā)波長為345nm。

從圖9、圖10、圖11中可以看出當(dāng)用345nm的波長激發(fā)，三種探針都在478nm處產(chǎn)生一個芘激基復(fù)合物的熒光峰，三種探針對a-casein蛋白都能選擇性 結(jié)合，并隨碳原子數(shù)增加，絡(luò)合峰的強(qiáng)度越大。

實(shí)施例4

取3根EP管，分別標(biāo)記為1，2，3，用5000uL移液槍，分別移取3980uL 20mM HEPES(20mM，pH＝7.4)溶液于3支EP管中，再用20uL移液分別槍移取20uL三種探針母液(2mM)分別于3支EP管中，探針濃度為10^-5mol/L。每支EP管中逐步滴加4n(n＝1、2、3….10)uL的β-casein蛋白溶液，其中β-casein蛋白的濃度為0.1mM。用熒光分光光度計(jì)測定三種探針的熒光光譜，激發(fā)波長為345nm。

從圖13、圖14、圖15中可以看出當(dāng)用345nm的波長激發(fā)，三種探針都在478nm處產(chǎn)生一個芘激基復(fù)合物的熒光峰，三種探針對β-casein蛋白都能選擇性結(jié)合，并隨碳原子數(shù)增加，絡(luò)合峰的強(qiáng)度越大。

通過圖9、圖10、圖11、圖12、圖13、圖14中各種探針對a-casein、β-casein蛋白的滴定中可以看出，該系統(tǒng)對a-casein蛋白的作用效果更強(qiáng)，而a-casein和β-casein蛋白比較，a-casein磷酸化位點(diǎn)多，空間距離近，β-casein磷酸化位點(diǎn)少，空間距離相對遠(yuǎn)一些。因此，該探針系統(tǒng)能夠用于識別磷酸化蛋白磷酸位點(diǎn)的空間距離，進(jìn)而利用該系統(tǒng)探針能區(qū)分磷酸化位點(diǎn)不同間距的磷酸化蛋白。

實(shí)施例5

取3根EP管，分別標(biāo)記為1，2，3，用5000uL移液槍，分別移取3980uL20mM HEPES(20mM，pH＝7.4)溶液于3支EP管中，再用20uL移液槍分別移取20uL三種探針母液(2mM)分別于3支EP管中，探針濃度為10^-5mol/L。每支EP管中逐步滴加4n(n＝1、2、3….10)uL的a-casein、BSA、BSA+a-casein蛋白溶液，第三支EP管中的V_{(BSA:a-casein)}＝1:1，其中各蛋白的濃度為0.1mM。激發(fā)波長為345nm。從圖15中可以看出激基復(fù)合物的熒光峰的強(qiáng)度隨a-casein濃度的變化而變化，而受BSA濃度變化影響不大，因此該系統(tǒng)探針能很好識別磷酸化蛋白。

實(shí)施例6

配制10％的Native-PAGE分離膠，分別將BSA、a-casein、B-casein三種蛋白加入1、2、3、4、5、6通道內(nèi)，在V＝200v、I＝20mA、P＝50W條件下跑電泳，三種蛋白加入12uL，其中蛋白的濃度為5ug/12uL。1h后1、2、3通道用考馬斯亮藍(lán)染色，4、5、6通道用探針3染色，其中探針3的濃度為2mg/10mL。從圖16可以看出，marker、BSA都沒有與探針3結(jié)合，只有磷酸化的蛋白結(jié)合，圖中1、2、3、4、5、6分別代表PAGE電泳的BSA、a-casein、β-casein和探針作用后的BSA、a-casein、β-casein電泳圖。

實(shí)施例7

稱取6.5mg a-casein蛋白，用650uL PH＝7.8，0.5mM的Tris-HCl-Mg緩沖溶液溶解，再加入ALP 2uL(ALP為100U/uL)使蛋白去磷酸化，即生成去磷酸化蛋白。取3根EP管，分別標(biāo)記為1，2，3。用5000uL移液槍，分別移取3980uL 20mM HEPES溶液于3支EP管中，再用20uL移液槍分別移取20uL探針1母液分別于3支EP管中，探針濃度為10^-5mol/L。分別加入12uL a-casein 蛋白溶液和、D-a-casein蛋白溶液于2、3號EP管中，其中各蛋白的濃度為0.1mM。激發(fā)波長為345nm。

再取3根EP管，分別標(biāo)記為4，5，6。用5000uL移液槍，分別移取3980uL 20mM HEPES溶液于3支EP管中，再用20uL移液槍分別移取20uL探針2母液分別于3支EP管中。分別加入12uL a-casein蛋白溶液和D-a-casein蛋白溶液于5、6號EP管中，其中各蛋白的濃度為0.1mM。激發(fā)波長為345nm。從圖17、圖18可以看出該系統(tǒng)探針能夠很好區(qū)分磷酸化蛋白和去磷酸化蛋白。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。