本發(fā)明涉及癌癥標(biāo)志物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

癌癥標(biāo)志物通常為糖蛋白類，是特定癌細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中制造分泌出來(lái)的，或藉由影響鄰近正常細(xì)胞使其生成的物質(zhì)。一般可在患者的血液、尿液、或特定組織中偵測(cè)到癌癥標(biāo)志物的出現(xiàn)，因此檢測(cè)體內(nèi)癌癥標(biāo)志物的變化可作為臨床上辨識(shí)腫瘤的輔助工具。當(dāng)體內(nèi)有癌細(xì)胞活動(dòng)時(shí)，癌癥標(biāo)志物濃度會(huì)升高，但若有其他生理因素或疾病影響，亦可能造成此類物質(zhì)的上升，因此在臨床上檢測(cè)出癌癥標(biāo)志物數(shù)值有變化不一定是罹患癌癥，而數(shù)值正常也不代表健康，所以人類癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果不能直接用于診斷或排除癌癥。

癌胚胎抗原(Carcino-embryonic antigen，CEA)最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，可廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，此外，在正常人血清中也有微量存在。臨床上CEA升高常見于大腸癌、胰腺癌、胃癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等，因此癌胚抗原可說是一個(gè)廣譜性的癌癥標(biāo)志物，能同時(shí)反映出多種癌癥的存在，尤對(duì)大腸癌、乳腺癌和肺癌的病情發(fā)展、診斷及監(jiān)測(cè)等，是一個(gè)較好的癌癥標(biāo)志物。CEA的特異性不強(qiáng)，對(duì)于癌癥早期診斷作用不明顯，但血清中CEA水平與大腸癌的分期有明確關(guān)系，越晚期的病變，CEA濃度越高。據(jù)統(tǒng)計(jì)表示，97％的健康成人其血清中CEA濃度會(huì)在2.5ng/ml以下，當(dāng)CEA超過20ng/ml時(shí)通常會(huì)伴隨有消化道癌，但若為良性腫瘤、炎癥和退化性疾病，如結(jié)腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎、胰腺炎等，CEA也會(huì)有部分升高的現(xiàn)象，但數(shù)值遠(yuǎn)低于惡性腫瘤，因此測(cè)定CEA亦可作為良性與惡性腫瘤的鑒別診斷依據(jù)。

甲型胎兒蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)是一種由胎兒的腸胃道、卵黃囊及肝臟分泌的球蛋白，其可經(jīng)由羊水通過胎盤進(jìn)入母體血液中，因此懷孕婦女血清中的甲型胎兒蛋白會(huì)升高，并于妊娠的第28至32周平均會(huì)達(dá)到最高。但若母體血清中的甲型胎兒蛋白異常上升，則有可能是胎兒發(fā)育異常，或是部分源于生殖細(xì)胞的腫瘤，如畸胎瘤病患其血清中甲型胎兒蛋白亦會(huì)異常上升。甲型胎兒蛋白可應(yīng)用于肝癌高危險(xiǎn)群病患的篩檢，一般慢性肝炎病患每六個(gè)月，以及肝硬化病患每三個(gè)月應(yīng)檢驗(yàn)血清甲型胎兒蛋白濃度，若有異常則須小心肝癌的可能。此外，甲型胎兒蛋白也可應(yīng)用于診斷肝癌及肝癌治療后追蹤，治療前甲型胎兒蛋白高的肝癌病患，若治療后甲型胎兒蛋白下降至正常范圍則代表治療效果佳，反之若甲型胎兒蛋白持續(xù)上升或先降后升，則代表治療效果差或肝癌有復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能。但急性肝炎或肝硬化病患的血清中的甲型胎兒蛋白也可能有上升的情形，此間接反映肝細(xì)胞壞死后的再生，因此在臨床上，甲型胎兒蛋白高不一定是肝癌，但正常也無(wú)法絕對(duì)性排除肝癌，所以肝癌的高危險(xiǎn)群病患必須結(jié)合其他檢查來(lái)追蹤診斷。

前列腺特異性抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)，是前列腺組織由前列腺上皮細(xì)胞合成具有絲氨酸蛋白酶活性的單鏈糖蛋白，大量存在于精液中，參與精液的液化過程。血漿中前列腺特異抗原濃度升高是前列腺癌的敏感監(jiān)測(cè)指標(biāo)，但前列腺癌并不是造成血漿前列腺特異抗原濃度升高的唯一原因。良性前列腺增生以及感染或其他人為因素也可能引起血漿前列腺特異抗原濃度升高。因此，在臨床上，常將前列腺特異性抗原用于前列腺癌的輔助診斷，以及監(jiān)測(cè)前列腺癌病情變化和療效判斷的指標(biāo)，但無(wú)法作為確診之用。前列腺癌患者的血清有PSA升高的現(xiàn)象，臨床上以血清PSA＞4.0μg/L判斷為陽(yáng)性，且PSA的血清濃度會(huì)隨病程進(jìn)展而升高。一般治療手術(shù)后，PSA濃度應(yīng)可逐漸降至正常，若是有不降或降后反升的現(xiàn)象，則應(yīng)考慮是否有腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的可能。但若病患有前列腺肥大、前列腺炎或腎臟和泌尿生殖系統(tǒng)等疾病，也可見血清有PSA升高的現(xiàn)象，因此必須結(jié)合其他檢查來(lái)做判斷。

腫瘤抗原19-9(Carbohydrate Antigen 19-9，CA19-9)是一種存在于血液中的黏液型醣蛋白，由胰臟細(xì)胞、膽管、胃、結(jié)腸、子宮內(nèi)膜等合成，一般人數(shù)值低，但在胰臟癌、胃癌、大腸直腸癌或是膽管癌、黏液型卵巢癌、子宮腺癌等患者血中會(huì)升高，因此，腫瘤抗原19-9對(duì)于監(jiān)控藥物治療、手術(shù)是否完全以及預(yù)后評(píng)估有很大的幫助，在臨床上尤對(duì)胰臟癌最有診斷價(jià)值。在臨床上，腫瘤抗原19-9一般會(huì)配合CEA檢驗(yàn)，對(duì)大腸直腸癌的診斷、治療和預(yù)后能有好的敏感度，或是配合CEA和CA72-4檢驗(yàn)，則對(duì)胃癌的診斷、治療和預(yù)后能有好的敏感度。

腫瘤抗原125(Carbohydrate Antigen 125，CA125)在婦產(chǎn)科是應(yīng)用相當(dāng)廣泛的癌癥標(biāo)志物，主要用來(lái)監(jiān)測(cè)上皮性卵巢癌以及當(dāng)作治療評(píng)估的指標(biāo)。此外，在非惡性疾病中，如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮外孕、卵巢纖維瘤、卵巢輸卵管膿瘍及骨盆腔炎等皆會(huì)使腫瘤抗原125升高，甚至在早期懷孕也會(huì)上升，所以使用腫瘤抗原125作為癌癥標(biāo)志物進(jìn)行篩檢時(shí)，必須結(jié)合其他臨床癥狀或患者病史等信息來(lái)做判斷。

腫瘤抗原15-3(Carbohydrate Antigen 15-3，CA15-3)是一種高分子量的糖蛋白。腫瘤抗原15-3在乳腺癌病患的血液中發(fā)現(xiàn)，是一種乳腺癌關(guān)聯(lián)性抗原，其對(duì)于乳腺癌的診斷和術(shù)后評(píng)估有一定的價(jià)值，唯在乳腺癌的初期敏感性較低約為60％，但轉(zhuǎn)移性乳腺癌的陽(yáng)性率可達(dá)80％，因此在歐洲國(guó)家，腫瘤抗原15-3的測(cè)定常作為原發(fā)性乳腺癌的輔助診斷指標(biāo)，在術(shù)后評(píng)估、監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移也具參考價(jià)值。

臨床上惡性腫瘤檢測(cè)常用的人類癌癥標(biāo)志物如下表1所示：

表1

目前市售常見的人類癌癥標(biāo)志物檢驗(yàn)試劑組與方法，有磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)、編碼懸浮微芯片法、免疫層析技術(shù)法及質(zhì)譜分析法等，皆尚存在缺點(diǎn)待改良，尤其是可進(jìn)行檢測(cè)得知有無(wú)但卻無(wú)法一次性辨識(shí)所有分型，在臨床上能協(xié)助醫(yī)師診斷的資訊有限。此外，現(xiàn)有技術(shù)大部分仍是機(jī)器讀取得檢測(cè)結(jié)果，無(wú)法結(jié)合使用影像辨識(shí)系統(tǒng)讀取并以軟體系統(tǒng)分析，以取得檢測(cè)結(jié)果與試劑組的完整信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種能夠結(jié)合影像辨識(shí)系統(tǒng)讀取并以相應(yīng)軟件分析的人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

一種人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒，包括微載體、包被抗體及檢測(cè)抗體；

所述微載體至少有一種，所述微載體具有編碼信息，且針對(duì)不同的人類癌癥標(biāo)志物的所述微載體的編碼信息不同；

所述包被抗體包被在所述微載體表面，所述包被抗體選自癌胚胎抗原的抗體、甲型胎兒蛋白的抗體、前列腺特異性抗原的抗體、腫瘤抗原19-9的抗體、腫瘤抗原125的抗體及腫瘤抗原15-3的抗體中的至少一種；

所述檢測(cè)抗體選自癌胚胎抗原的抗體、甲型胎兒蛋白的抗體、前列腺特異性抗原的抗體、腫瘤抗原19-9的抗體、腫瘤抗原125的抗體及腫瘤抗原15-3的抗體中的至少一種，所述檢測(cè)抗體連接有檢測(cè)標(biāo)記物；

所述檢測(cè)試劑盒中的所述微載體、所述包被抗體及所述檢測(cè)抗體的種類對(duì)應(yīng)，且對(duì)相應(yīng)的所述人類癌癥標(biāo)志物，所述包被抗體與所述檢測(cè)抗體具有不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)試劑盒還包括人類癌癥標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品選自癌胚胎抗原、甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原、腫瘤抗原19-9、腫瘤抗原125及腫瘤抗原15-3中至少一種，且所述標(biāo)準(zhǔn)品的種類與所述微載體的種類對(duì)應(yīng)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，包被有所述包被抗體的微載體及所述檢測(cè)抗體均有六種；其中，六種包被有所述包被抗體的微載體分別為癌胚胎抗原的抗體包被的微載體、甲型胎兒蛋白的抗體包被的微載體、前列腺特異性抗原的抗體包被的微載體、腫瘤抗原19-9的抗體包被的微載體、腫瘤抗原125的抗體包被的微載體及腫瘤抗原15-3的抗體包被的微載體；六種所述檢測(cè)抗體分別為癌胚胎抗原的抗體、甲型胎兒蛋白的抗體、前列腺特異性抗原的抗體、腫瘤抗原19-9的抗體、腫瘤抗原125的抗體及腫瘤抗原15-3的抗體。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述包被抗體通過其帶有的氨基與對(duì)應(yīng)的所述微載體表面的活化羧基反應(yīng)后包被在所述微載體表面。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)標(biāo)記物為生物素；所述檢測(cè)試劑盒還包括鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅熒光蛋白試劑。

一種人類癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)方法，使用上述任一實(shí)施例所述的人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)方法包括如下步驟：

于多孔板的微孔中加入含有預(yù)先包被有包被抗體的微載體的試劑，且對(duì)應(yīng)每種人類癌癥標(biāo)志物，所述微載體的編碼信息與所述包被抗體對(duì)應(yīng)；

于所述微孔中加入待測(cè)樣本，并于30～50℃、500-2000rpm震蕩反應(yīng)；

清洗所述多孔板后，于所述微孔中加入含有所述檢測(cè)抗體的試劑，于30-50℃、500-200rpm震蕩反應(yīng)；

清洗所述多孔板后，向所述微孔中加入熒光標(biāo)記物，于30-50℃、500-2000rpm震蕩反應(yīng)，所述熒光標(biāo)記物與所述檢測(cè)標(biāo)記物結(jié)合反應(yīng)；

清洗所述多孔板后，使用影像識(shí)別系統(tǒng)辨識(shí)所述微載體的編碼信息，并檢測(cè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)記信號(hào)，經(jīng)分析處理得到檢測(cè)結(jié)果。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)方法還包括向不同的所述微孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的步驟，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有已知量的人類癌癥標(biāo)志物，對(duì)所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的處理同所述待測(cè)樣本。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)方法還包括對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)結(jié)果繪制濃度與熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)標(biāo)記物為生物素，所述熒光標(biāo)記物為鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅熒光蛋白；所述檢測(cè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)記信號(hào)是使用熒光亮度檢測(cè)組件檢測(cè)并量化所述微載體上的熒光信號(hào)。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述影像識(shí)別系統(tǒng)為PlexBio100；所述分析處理是使用PlexBio100的軟件系統(tǒng)DeXipher進(jìn)行分析處理。

本發(fā)明的人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明通過對(duì)多種人類癌癥標(biāo)志物進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最終選擇針對(duì)癌胚胎抗原、甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原、腫瘤抗原19-9、腫瘤抗原125及腫瘤抗原15-3作為檢測(cè)對(duì)象，當(dāng)檢測(cè)試劑盒中微載體、包被抗體及檢測(cè)抗體有多種時(shí)，該檢測(cè)試劑盒可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)六種人類癌癥標(biāo)志物，從而可以豐富檢測(cè)結(jié)果，可更為有效的輔助臨床診斷；

(2)本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)癌胚胎抗原、甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原、腫瘤抗原19-9、腫瘤抗原125及腫瘤抗原15-3的多種抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選，得到可以用于對(duì)相應(yīng)的人類癌癥標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)的包被抗體和檢測(cè)抗體，包被抗體包被在微載體表面以固定抗原，檢測(cè)抗體與包被抗體對(duì)相應(yīng)的抗原具有不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而檢測(cè)抗體可以通過抗原連接在微載體上，而檢測(cè)抗體具有檢測(cè)標(biāo)記物，當(dāng)加入如該檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)應(yīng)熒光蛋白時(shí)，可以與該檢測(cè)標(biāo)記物反應(yīng)結(jié)合，進(jìn)而通過檢測(cè)該熒光蛋白的熒光亮度等信號(hào)可以得到相應(yīng)的抗原濃度數(shù)據(jù)；

(3)當(dāng)檢測(cè)試劑盒中微載體、包被抗體及檢測(cè)抗體有多種時(shí)，該檢測(cè)試劑盒可同時(shí)檢測(cè)多種人類癌癥標(biāo)志物，無(wú)需多次檢測(cè)，可減少所需樣本量，并可有效提高檢測(cè)效率及結(jié)果的準(zhǔn)確性；

(4)多元檢測(cè)以多重篩檢技術(shù)及結(jié)合多元化生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)可增加臨床精準(zhǔn)度與簡(jiǎn)便性；

(5)影像辨識(shí)系統(tǒng)結(jié)合軟體分析可取得大量且完整的檢測(cè)結(jié)果與試劑組信息，數(shù)據(jù)處理方便，結(jié)果信息全面。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制作的CEA標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1制作的AFP標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1制作的PSA標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1制作的CA19-9標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1制作的CA125標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例1制作的CA15-3標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實(shí)施方式。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施方式。相反地，提供這些實(shí)施方式的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

需要說明的是，當(dāng)元件被稱為“固定于”另一個(gè)元件，它可以直接在另一個(gè)元件上或者也可以存在居中的元件。當(dāng)一個(gè)元件被認(rèn)為是“連接”另一個(gè)元件，它可以是直接連接到另一個(gè)元件或者可能同時(shí)存在居中元件。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施方式的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“及/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。

一實(shí)施方式的人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒，包括微載體、包被抗體及檢測(cè)抗體。

微載體(Microcarrier)上設(shè)有用于供影像識(shí)別系統(tǒng)辨識(shí)的編碼信息。微載體優(yōu)選磁性材質(zhì)制作。微載體的表面設(shè)有修飾層，如物理修飾層或化學(xué)修飾層，優(yōu)選化學(xué)修飾層。其中化學(xué)修飾層可以但不限于經(jīng)由羧化作用處理形成的修飾層。對(duì)于經(jīng)羧化作用處理的微載體可藉NHS(N-Hydroxysuccinimide，N-羥基琥珀酰亞胺)與EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)活化羧基進(jìn)行反應(yīng)，將帶有氨基的專一性抗體結(jié)合于微載體表面，形成抗體包覆的微載體。微載體容量高，可作為多元載體。當(dāng)檢測(cè)樣本有多種時(shí)，微載體可以針對(duì)性的設(shè)計(jì)為多種。在本實(shí)施方式中，微載體至少有一種，且針對(duì)不同的人類癌癥標(biāo)志物的微載體的編碼信息不同。

包被抗體(Capture antibody)包被在微載體表面。包被抗體可與微載體通過物理作用或化學(xué)作用連接。對(duì)于化學(xué)作用連接的，可以在包被抗體上連接捕獲基團(tuán)。捕獲基團(tuán)與微載體表面的化學(xué)修飾層對(duì)應(yīng)，可以與微載體表面的化學(xué)修飾層共價(jià)結(jié)合。在一實(shí)施方式中，捕獲基團(tuán)可以為氨基等，氨基可以與微載體表面的活化羧基反應(yīng)結(jié)合。當(dāng)有多種包被抗體時(shí)，多種包覆有包被抗體的不同微載體混合制成混合制劑。采用直接包覆的方式，無(wú)需在檢測(cè)時(shí)進(jìn)行包覆，從而可以簡(jiǎn)化檢測(cè)過程，提高檢測(cè)效率。

在本實(shí)施方式中，包被抗體選自癌胚胎抗原的抗體、甲型胎兒蛋白的抗體、前列腺特異性抗原的抗體、腫瘤抗原19-9的抗體、腫瘤抗原125的抗體及腫瘤抗原15-3的抗體中的至少一種。優(yōu)選的，包被抗體有六種，六種包被抗體分別為癌胚胎抗原的抗體、甲型胎兒蛋白的抗體、前列腺特異性抗原的抗體、腫瘤抗原19-9的抗體、腫瘤抗原125的抗體及腫瘤抗原15-3的抗體。對(duì)應(yīng)地，微載體也有六種，六種微載體分別與六種包被抗體對(duì)應(yīng)。包被抗體能夠特異性的與人類癌癥標(biāo)志物結(jié)合，將相應(yīng)的人類癌癥標(biāo)志物固定在微載體上。

在本實(shí)施例中，微載體上包被抗體的包被過程可按照如下步驟進(jìn)行：

將微載體以含15％EtOH的100mM MES試劑進(jìn)行清洗后，依序加入50mg/ml NHS與50mg/ml EDC于15％EtOH的100mM MES中，反應(yīng)條件為溫育25-45℃、500-2000rpm震蕩十五分鐘，此反應(yīng)為活化微載體表面。移除上清液后加入欲包覆使用的抗體，反應(yīng)條件為溫育25-45℃、500-2000rpm震蕩一小時(shí)，再依序加入含50mM Tris(pH7.5),0.1％BSA,150mM NaCl,15ppm Proclin300的1X PBS，反應(yīng)條件為溫育25-45℃、500-2000rpm震蕩三十分鐘，以及PBST，反應(yīng)條件為溫育25-45℃、500-2000rpm震蕩五分鐘，待以上反應(yīng)完成，最后以PBST進(jìn)行清洗即完成包被過程。

檢測(cè)抗體(Detection antibody)選自癌胚胎抗原的抗體、甲型胎兒蛋白的抗體、前列腺特異性抗原的抗體、腫瘤抗原19-9的抗體、腫瘤抗原125的抗體及腫瘤抗原15-3的抗體中的至少一種。檢測(cè)抗體連接有檢測(cè)標(biāo)記物，如生物素等。

在本實(shí)施方式中，檢測(cè)抗體有六種。六種檢測(cè)抗體混合在一起制成檢測(cè)抗體試劑。六種檢測(cè)抗體分別為癌胚胎抗原的抗體、甲型胎兒蛋白的抗體、前列腺特異性抗原的抗體、腫瘤抗原19-9的抗體、腫瘤抗原125的抗體及腫瘤抗原15-3的抗體。在本實(shí)施方式中，檢測(cè)抗體與包被抗體對(duì)應(yīng)設(shè)置，且對(duì)相應(yīng)的人類癌癥標(biāo)志物，包被抗體與檢測(cè)抗體具有不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。檢測(cè)抗體與包被抗體可以相同也可以不同，只要包被抗體與檢測(cè)抗體能夠與抗原的不同位點(diǎn)結(jié)合就可以，例如，結(jié)合在抗原的兩端形成夾心結(jié)構(gòu)等。檢測(cè)抗體與包被抗體優(yōu)選能夠與抗原的不同的特征表位反應(yīng)結(jié)合。

進(jìn)一步，在本實(shí)施方式中，該檢測(cè)試劑盒還包括人類癌癥標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品選自癌胚胎抗原、甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原、腫瘤抗原19-9、腫瘤抗原125及腫瘤抗原15-3中至少一種。標(biāo)準(zhǔn)品可以制成人類癌癥標(biāo)志物含量已知的標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液中的人類癌癥標(biāo)志物的種類與微載體的種類對(duì)應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)溶液有多組。每種人類癌癥標(biāo)志物在不同組的標(biāo)準(zhǔn)溶液中濃度不同?？衫斫?，在其他實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)溶液也可以至少為一種，每一種標(biāo)準(zhǔn)溶液含有已知量的人類癌癥標(biāo)志物，如在一優(yōu)選實(shí)施方式中，該檢測(cè)試劑盒含有六種標(biāo)準(zhǔn)溶液，六種標(biāo)準(zhǔn)溶液分別含有已知量的癌胚胎抗原、甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原、腫瘤抗原19-9、腫瘤抗原125及腫瘤抗原15-3，在使用的時(shí)候，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別從各標(biāo)準(zhǔn)溶液中取出適量的溶液混合，制備各人類癌癥標(biāo)志物梯度濃度變化的混合液用于實(shí)驗(yàn)。

此外，在本實(shí)施方式中，該檢測(cè)試劑盒還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的樣本采集液、清洗試劑、標(biāo)準(zhǔn)曲線混合試劑(用于標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合，制備梯度濃度的混合液)及鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅熒光蛋白(SA-PE)試劑中的至少一種。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指特異定向于抗原位點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子。本文所述的抗體是指特異識(shí)別于人類癌癥標(biāo)志物的抗體，包括多克隆和單克隆抗體?？谷祟惏┌Y標(biāo)志物的抗體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來(lái)制備。其中，多克隆抗體可通過已知方法制備，其中將作為免疫原的人類癌癥標(biāo)志物注入動(dòng)物體中然后收集抗血清。被免疫的動(dòng)物包括但是不限于山羊、兔、綿羊、猴、馬、豬、牛和狗等。單克隆抗體可通過雜交瘤細(xì)胞融合方法、重組DNA方法或噬菌體抗體庫(kù)來(lái)制備。

本實(shí)施方式還提供了一種人類癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法使用上述人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑，該檢測(cè)方法包括如下步驟：

步驟S110，于多孔板的微孔中加入微載體試劑。

該微載體試劑含有微載體且該微載體預(yù)先包被有包被抗體。對(duì)應(yīng)每種人類癌癥標(biāo)志物，每種微載體的編碼信息與其上包被的包被抗體對(duì)應(yīng)。

步驟S120，于微孔中加入待測(cè)樣本，于30～50℃、500-2000rpm震蕩反應(yīng)。

若待測(cè)樣本中含有癌胚胎抗原、甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原、腫瘤抗原19-9、腫瘤抗原125及腫瘤抗原15-3，則會(huì)與微載體上的包被抗體反應(yīng)，被固定在微載體上。

在本實(shí)施方式中，該檢測(cè)方法還包括向不同微孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的步驟，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的處理同待測(cè)樣本。優(yōu)選的，可以向不同微孔中加入各人類癌癥標(biāo)志物梯度濃度變化的混合液，混合液的檢測(cè)結(jié)果用于繪制濃度與熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

步驟S130，清洗多孔板后，于微孔中加入含有檢測(cè)抗體的試劑，于30-50℃、500-200rpm震蕩反應(yīng)。

步驟S140，清洗多孔板后，向微孔中加入熒光標(biāo)記物，于30-50℃、500-2000rpm震蕩反應(yīng)。

步驟S150，清洗多孔板后，使用影像識(shí)別系統(tǒng)辨識(shí)微載體的編碼信息，并檢測(cè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)記信號(hào)，經(jīng)分析處理得到檢測(cè)結(jié)果。

本實(shí)施方式所用的標(biāo)記物為鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅熒光蛋白試劑，檢測(cè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)記信號(hào)是使用熒光亮度檢測(cè)組件檢測(cè)并量化微載體上的熒光信號(hào)，包括影像辨識(shí)系統(tǒng)與熒光亮度檢測(cè)組件，結(jié)合CCD相機(jī)與熒光顯微鏡之產(chǎn)品。本實(shí)施方式所用的影像識(shí)別系統(tǒng)為PlexBio100，包括影像辨識(shí)系統(tǒng)與熒光亮度檢測(cè)元件，反應(yīng)完成后使用者可將多孔板置于PlexBio100中進(jìn)行讀取與分析，該儀器會(huì)于所選擇區(qū)域拍照，并藉影像辨識(shí)系統(tǒng)辨識(shí)出影像中各微載體上的編碼信息。分析處理是使用PlexBio100的軟件系統(tǒng)DeXipher進(jìn)行分析處理，因各包被抗體于包覆時(shí)與微載體上的編碼信息對(duì)應(yīng)，該條件也預(yù)先寫入軟體系統(tǒng)，所以系統(tǒng)可成功辨識(shí)出每個(gè)微載體對(duì)應(yīng)的信號(hào)。經(jīng)軟件分析計(jì)算后輸出相關(guān)信息，包括:試劑名稱、試劑批號(hào)、操作者、微載體對(duì)應(yīng)之人類癌癥標(biāo)志物類型等信息及檢測(cè)結(jié)果。

上述人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法具有如下有益效果：

(1)當(dāng)檢測(cè)試劑盒中微載體、包被抗體及檢測(cè)抗體有多種時(shí)，該檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)多達(dá)六種人類癌癥標(biāo)志物，從而可以豐富檢測(cè)結(jié)果，可更為有效的輔助臨床診斷；

(2)當(dāng)檢測(cè)試劑盒中微載體、包被抗體及檢測(cè)抗體有多種時(shí)，該檢測(cè)試劑盒可同時(shí)檢測(cè)多種人類癌癥標(biāo)志物，無(wú)需多次檢測(cè)，可減少所需樣本量，并可有效提高檢測(cè)效率及結(jié)果的準(zhǔn)確性；

(3)多元檢測(cè)以多重篩檢技術(shù)及結(jié)合多元化生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)可增加臨床精準(zhǔn)度與簡(jiǎn)便性；

(4)影像辨識(shí)系統(tǒng)結(jié)合軟體分析可取得大量且完整的檢測(cè)結(jié)果與試劑組信息，數(shù)據(jù)處理方便，結(jié)果信息全面。

癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果可以作為臨床上辨識(shí)腫瘤的輔助工具，由于一些非癌癥等其他生理因素或疾病也往往會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的癌癥標(biāo)志物的出現(xiàn)，因此，在臨床上檢測(cè)出癌癥標(biāo)志物數(shù)值有變化不一定是罹患癌癥，而數(shù)值正常也不代表健康，所以人類癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果不能直接用于診斷或排除癌癥。

以下為具體實(shí)施例部分

實(shí)施例1

實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒可同時(shí)檢測(cè)六種人類癌癥標(biāo)志物，包括癌胚胎抗原、甲型胎兒蛋白、前列腺特異性抗原、腫瘤抗原19-9、腫瘤抗原125及腫瘤抗原15-3。相應(yīng)的，微載體試劑中含有六種對(duì)應(yīng)的微載體，每種微載體上包被有對(duì)應(yīng)的包被抗體。檢測(cè)抗體也對(duì)應(yīng)有六種。包被抗體與檢測(cè)抗體具體如下表2所示。標(biāo)準(zhǔn)溶液為Marker Plus Control(供應(yīng)商：Bio-rad，商品目錄號(hào)：Cat No.367)，其含有上述六種人類癌癥標(biāo)志物。

表2 包被抗體與檢測(cè)抗體

實(shí)施例1篩選的包被抗體與檢測(cè)抗體能夠與對(duì)應(yīng)的癌癥標(biāo)志物的特征位點(diǎn)結(jié)合，并且對(duì)應(yīng)不同的癌癥標(biāo)志物的包被抗體或檢測(cè)抗體之間不會(huì)相互影響與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合，從而該試劑盒檢測(cè)范圍廣，實(shí)用性強(qiáng)。

可理解，在其他實(shí)施例中，該檢測(cè)試劑盒可以含有用于檢測(cè)上述六種人類癌癥標(biāo)志物中的一種、兩種、三種、四種或五種對(duì)應(yīng)的微載體試劑、檢測(cè)抗體和標(biāo)準(zhǔn)溶液。

如圖1所示，實(shí)施例1的檢測(cè)方法包括如下步驟：

于一次性96微孔板的微孔中加入微載體試劑。

于一次性96微孔板的微孔中分別加入血清或血漿等待測(cè)樣本。于每批次進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需繪制當(dāng)次的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過加入不同濃度梯度的已知量人類癌癥標(biāo)志物的混合液，取得八個(gè)量測(cè)點(diǎn)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再利用內(nèi)建公式將測(cè)得的熒光強(qiáng)度(Mean Fluorescence Intensity，MFI)轉(zhuǎn)換成濃度單位，以得不同人類癌癥標(biāo)志物的檢測(cè)濃度，反應(yīng)條件為溫育30-50℃、500-2000rpm震蕩一小時(shí)。構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖2-7所示。

反應(yīng)結(jié)束后清洗一次性96微孔板。

于一次性96微孔板中加入含有六種檢測(cè)抗體的混合試劑進(jìn)行反應(yīng)，利用不同專一性的抗體與抗原結(jié)合，反應(yīng)條件為溫育30-50℃、500-2000rpm震蕩三十分鐘。

反應(yīng)結(jié)束后清洗一次性96微孔板。

于一次性96微孔板中加入鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅熒光蛋白試劑(SA-PE)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為溫育30-50℃、500-2000rpm震蕩十分鐘。

反應(yīng)結(jié)束后清洗一次性96微孔板。

將操作完成的一次性96微孔板放入影像辨識(shí)系統(tǒng)PlexBio100辨識(shí)微載體，以及熒光亮度檢測(cè)元件分析并量化微載體上的熒光訊號(hào)，最后經(jīng)由PlexBio100之軟體系統(tǒng)DeXipher進(jìn)行分析計(jì)算后，得到檢驗(yàn)試劑組信息的報(bào)告與檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果如下表3和表4所示。

表3 人類癌癥標(biāo)記物的交叉反應(yīng)性(Cross Reactivity)結(jié)果

表4 含有六種人類癌癥標(biāo)記物的待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果

表3數(shù)據(jù)是使用各標(biāo)準(zhǔn)品利用濃度梯度取得標(biāo)準(zhǔn)曲線與方程式，以利實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的換算(將所得MFI轉(zhuǎn)換成濃度單位)，該表所呈現(xiàn)的是交叉反應(yīng)(Cross activity)的結(jié)果，所使用之微載體能成功辨識(shí)欲結(jié)合的癌癥標(biāo)記物而得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且不會(huì)互相干擾影響背景值。

表4數(shù)據(jù)是利用本發(fā)明來(lái)檢測(cè)樣本，該表所呈現(xiàn)是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的確能成功辨識(shí)六種不同癌癥標(biāo)記物，且能將所測(cè)得之MFI帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式，轉(zhuǎn)換成濃度單位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

由上述表3和表4可以看出，該人類癌癥標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒可一次性針對(duì)含有多種人類癌癥標(biāo)志物的待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，從而可以減少所需的樣本量，并有效提高檢測(cè)效率，并且由于是一次性檢測(cè)，無(wú)需多次加樣，試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。該檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法可結(jié)合多元檢測(cè)以多重篩檢技術(shù)及結(jié)合多元化生醫(yī)檢測(cè)系統(tǒng)，從而可以增加臨床精準(zhǔn)度與簡(jiǎn)便性。并可結(jié)合影像辨識(shí)系統(tǒng)及相應(yīng)的軟體分析，可取得大量且完整的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)效率進(jìn)一步提高。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。