本發(fā)明涉及一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的血清酶法乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，屬于臨床體外檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

血液中的乙醇一般是飲酒攝入，被胃腸道吸收后進(jìn)入血液，由肝臟以恒定速率代謝清除。在代謝過程中產(chǎn)生乙醛，其可與蛋白結(jié)合，形成乙醛-蛋白結(jié)合物可直接作為細(xì)胞毒物質(zhì)直接引起細(xì)胞損傷，也可作為具有抗原性的刺激物，產(chǎn)生抗體。乙醇對(duì)身體也有直接毒性作用，長(zhǎng)期過量飲酒容易形成脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化、酒精性胰腺炎以及酒依賴性精神障礙等疾病。懷孕婦女飲酒可導(dǎo)致胎兒精神與運(yùn)動(dòng)器官發(fā)育不良以及胎兒酒精綜合癥。酒依賴者一次性飲酒過量可引起急性中毒，其中毒癥狀與血中乙醇濃度有一定相關(guān)性，血乙醇濃度越高，中毒癥狀越深。因此，根據(jù)臨床癥狀和血中乙醇濃度可以判斷中毒程度。

目前檢測(cè)血液酒精的方法較多，常見的有早期的蒸餾氧化法、滲透壓法，化學(xué)比色法，酶法，均相酶免測(cè)定法，氣相色譜法等檢測(cè)方法，其中血液中酒精濃度測(cè)定早期用蒸餾氧化法和滲透壓法，準(zhǔn)確性和特異性均較差，均相酶免測(cè)定法，氣相色譜分析法，雖然準(zhǔn)確性高，但儀器價(jià)格昂貴，一般醫(yī)院難以推廣，隨著乙醇脫氫酶提取技術(shù)的不斷優(yōu)化，酶法試劑檢測(cè)血液乙醇的檢測(cè)方法逐漸推廣而來，并且酶法檢測(cè)血清乙醇具有操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，能夠較好的配合全自動(dòng)生化分析儀器的使用，但是隨著逐步的使用發(fā)現(xiàn)試劑非常容易受到血液中乳酸脫氫酶，羥丁酸脫氫酶等酶類的影響，容易時(shí)檢測(cè)結(jié)果偏高，造成假陽(yáng)性升高，而對(duì)于尿素、抗壞血酸等物質(zhì)則容易產(chǎn)生負(fù)干擾，使檢測(cè)結(jié)果偏低，甚至出現(xiàn)負(fù)值，這給臨床使用帶來較大的問題。

為了能夠很好的去除血液乙醇在檢測(cè)中各種不同物質(zhì)的干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，增強(qiáng)抗干擾能力，特發(fā)明了一種抗干擾能力強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的酶法檢測(cè)血液乙醇的檢測(cè)試劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的酶法乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，以及檢測(cè)方法。

檢測(cè)原理：

在乙醇脫氫酶（ADH）的存在下，乙醇被氧化型輔酶（NAD）氧化成乙醛，并生成還原型輔酶NADH，在波長(zhǎng)340nm處檢測(cè)吸光度變化率，其變化程度與樣本中的乙醇的含量成正比。

乙醇脫氫酶

乙醇+NAD 乙醛+NADH

一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的酶法乙醇（ALC）檢測(cè)試劑試劑組成成分如下：

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

試劑 R1：

緩沖液 100mmol/L

草酸銨 2mmol/L-5mmol/L

鹽酸肼 1mmol/L-3mmol/L

亞硝酸鐵氰化鉀 20umol/L-50umol/L

離子平衡劑 10g/L-30g/L

抗壞血酸氧化酶 500U/L-2KU/L

保護(hù)劑 5g/L-10g/L

表面活性劑 1ml/L-5ml/L

NAD 3mmol/L-5mmol/L

防腐劑 0.1g/L-1g/L

試劑 R2：

緩沖液 50mmol/L

保護(hù)劑 5g/L-10g/L

重金屬離子螯合劑 10mmol/L-20mmol/L

乙醇脫氫酶 450U/L-600U/L

防腐劑 0.1g/L-1g/L

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R1中緩沖液為25℃，PH=9.5濃度為100mmol/L的硼砂緩沖液；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R2中緩沖液為25℃，PH=6.5濃度為50mmol/L的PIPES緩沖液；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R1中所述離子平衡劑為氯化鈉；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R1所述防腐劑為硫酸慶大霉素；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R1所述保護(hù)劑為殼聚糖；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R1所述表面活性劑為十二烷基二甲基甜菜堿；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R2所述的保護(hù)劑為NADH2；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R2所述的重金屬離子螯合劑為氨基三乙酸；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑R2中所述的防腐劑為硫酸慶大霉素；

所述的一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，使用全自動(dòng)生化分析儀利用終點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)主波長(zhǎng)為340nm。

所述的試劑為液態(tài)雙試劑，試劑比例為4:1。

本發(fā)明的創(chuàng)新之處：

1）通過優(yōu)化反應(yīng)體系，在試劑R1中優(yōu)先選擇了硼砂緩沖液，能夠有效地提供較好的偏中強(qiáng)堿性環(huán)境，在試劑R2中優(yōu)先選擇了PIPES生物緩沖體系，對(duì)乙醇脫氫酶具有較好的保護(hù)作用 ；

2）在試劑R1中添加了草酸銨和鹽酸肼能夠有效地去除乳酸脫氫酶和羥丁酸脫氫酶的干擾，加入少量的亞硝酸鐵氰化鉀則有效地去除膽紅素等還原性物質(zhì)的干擾，從而大大提高試劑的抗干擾能力，加入抗壞血酸氧化酶，則可以有效地去除抗血酸的干擾；

3）試劑R1中殼聚糖的加入則能夠有效地保護(hù)NAD(氧化型輔酶I)，試劑R2中的保護(hù)劑NADH2的加入則能夠非常好的提高乙醇脫氫酶的穩(wěn)定性尤其是熱穩(wěn)定性，從而保證檢測(cè)結(jié)果的持久穩(wěn)定準(zhǔn)確；

4）重金屬離子螯合劑氨基三乙酸的加入則非常好的去除重金屬離子尤其是鈣離子對(duì)脫氫酶活性的干擾，從而提高乙醇脫氫酶的活性；

5）本發(fā)明還優(yōu)先選擇了硫酸慶大霉素作為防腐抑菌劑，既起到了良好的防腐抑菌的作用，還起到了不破壞乙醇脫氫酶的活性。

附圖說明

圖1實(shí)施例2與對(duì)照的相關(guān)性曲線圖，

圖2實(shí)施例3與對(duì)照的相關(guān)性曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1

一種市場(chǎng)現(xiàn)有的血液乙醇檢測(cè)試劑組成成分：

試劑 R1：

TRIS緩沖液 100mmol/L

曲拉通-100 1ml/L-5ml/L

NAD 3mmol/L-5mmol/L

試劑 R2：

磷酸鹽緩沖液 50mmol/L

乙醇脫氫酶 450U/L-600U/L。

實(shí)施例2

一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑試劑，組成成分：

試劑 R1：

硼酸緩沖液 100mmol/L

草酸銨 2mmol/

鹽酸肼 1mmol/

亞硝酸鐵氰化鉀 20umol/

氯化鈉 10g/

抗壞血酸氧化酶 500U/L

殼聚糖 5g/L

十二烷基二甲基甜菜堿 1ml/L

NAD 3mmol/L

硫酸慶大霉素 0.1g/L

試劑 R2：

PIPES 50mmol/L

NADH2 5g/L

氨基三乙酸 10mmol/L

乙醇脫氫酶 450U/L

硫酸慶大霉素 0.1g/L。

實(shí)施例3

一種抗干擾能力強(qiáng)且準(zhǔn)確度高的乙醇（ALC）檢測(cè)試劑，試劑組成成分增加的方案：

1）試劑R1：

硼酸緩沖液 100mmol/L

草酸銨 5mmol/L

鹽酸肼 3mmol/L

亞硝酸鐵氰化鉀 50umol/L

氯化鈉 30g/L

抗壞血酸氧化酶 2KU/L

殼聚糖 10g/L

十二烷基二甲基甜菜堿 5ml/L

NAD 5mmol/L

硫酸慶大霉素 1g/L；

2）試劑 R2：

PIPES 50mmol/L

NADH2 10g/L

氨基三乙酸 20mmol/L

乙醇脫氫酶 600U/L

硫酸慶大霉素 1g/L；

3）本實(shí)施例試劑的使用方法：

本實(shí)施例描述的血清乙醇檢測(cè)試劑，在使用時(shí)采用具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀，如日立7180全自動(dòng)分析儀等，利用速率法進(jìn)行測(cè)定；將R1和R2按照4:1的比例放置到對(duì)應(yīng)的試劑位上，在樣品盤的對(duì)應(yīng)位置放置好蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，操作如表1：

表1 實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3試劑檢測(cè)方法

計(jì)算：乙醇含量（mmol/L）＝（?A測(cè)定÷?A標(biāo)準(zhǔn)）×C標(biāo)準(zhǔn)

4）干擾性試驗(yàn)：取新鮮混合血清，分成2等份，然后將每等份再分成5等份，加入不同的干擾物質(zhì)，使其在血清中的濃度達(dá)到表2的要求。然后分別用實(shí)施例1所得試劑，與市場(chǎng)現(xiàn)有的的血清乙醇試劑同時(shí)對(duì)比測(cè)定血清中乙醇的含量，對(duì)照組測(cè)定結(jié)果與加入不同干擾物質(zhì)后各組的測(cè)定結(jié)果見表2。相對(duì)偏差(%)=(干擾樣本的測(cè)定均值－對(duì)照樣本的測(cè)定均值)/對(duì)照樣本的測(cè)定均值×100%。

由表2可以看出，實(shí)施例2和實(shí)施例3試劑在抗壞血酸≤50mg/dL、膽紅素≤40mg/dL、尿酸≤40mg/dL乳酸脫氫酶≤2000U/L、氫丁酸脫氫酶≤2400U/L對(duì)測(cè)試結(jié)果沒有明顯干擾。而對(duì)照組試劑在上述濃度干擾物質(zhì)存在時(shí)，受到明顯干擾，這說明通過優(yōu)化反應(yīng)緩沖體系，增加抗干擾物質(zhì)之后，實(shí)施例2和實(shí)施例3中的試劑的抗干擾性能顯著提高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于實(shí)施例1中的對(duì)比試劑。

表2實(shí)施例試劑抗干擾性能比較

5)相關(guān)性實(shí)驗(yàn)：利用實(shí)施例2和實(shí)施例3配方配制試劑，與均相免疫測(cè)定法檢測(cè)血清乙醇進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)了20個(gè)臨床血清樣本，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。并獲得了兩種試劑的相關(guān)性曲線（如圖1所示），通過檢測(cè)結(jié)果顯示，兩個(gè)試劑盒的相關(guān)系數(shù)為0.9997，說明了兩者有極大的相關(guān)性。

表3 實(shí)施例2和實(shí)施例3試劑與均相免疫測(cè)定法檢測(cè)血清乙醇對(duì)比檢測(cè)結(jié)果