本發(fā)明用于赤潮毒素的檢測(cè)，主要包括的赤潮毒素為一種麻痹性貝毒（paralyticshellfishpoisoning，psp）的快速檢測(cè)試紙條，以及包括試紙條制法。
背景技術(shù)：
麻痹性貝毒是我國(guó)近岸海域常見的貝毒種類之一，在近岸海域貝類體內(nèi)?？蓹z出，已嚴(yán)重影響了貝類出口貿(mào)易，引起了各級(jí)政府及研究領(lǐng)域的極大關(guān)注。建立麻痹性貝毒的快速靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和產(chǎn)品，對(duì)確保海產(chǎn)品食用安全和維持水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)健康可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。目前已知有麻痹性貝毒檢測(cè)試紙，主要檢測(cè)麻痹性貝毒組分為stx、dcstx、gtx5、gtx2/3、dcgtx2/3、c1/c2，檢測(cè)靈敏度為110ng/ml，室溫下可保存6個(gè)月。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種麻痹性貝毒快速檢測(cè)膠體金試紙條及其制法，將抗麻痹性貝毒單克隆抗體用膠體金標(biāo)記，包被在膠金墊上，將石房蛤毒素stx與蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成的檢測(cè)線和羊抗鼠抗體(多抗或單抗)構(gòu)成的質(zhì)控線包被在賽多利斯nc膜上。以此來實(shí)現(xiàn)麻痹性貝毒膠體金試紙條的研制，并用于麻痹性貝毒的快速檢測(cè)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：麻痹性貝毒快速檢測(cè)膠體金試紙條，樣本墊、膠金墊、nc膜、吸水墊按順序依次粘附在pvc背襯上，所述膠金墊包被有抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，所述nc膜上分別包被有石房蛤毒素-卵清蛋白偶聯(lián)抗原的檢測(cè)線和包被有羊抗鼠單抗的質(zhì)控線。試紙條外包裝試紙條卡，試紙條卡上面開有加樣孔和顯色區(qū)。
麻痹性貝毒快速檢測(cè)膠體金試紙條的制法，步驟如下：
1）將石房蛤毒素stx與血藍(lán)蛋白klh或卵清蛋白o(hù)va偶聯(lián)，制備得到stx-klh和stx-ova偶聯(lián)物，備用；
2）用stx-klh偶聯(lián)物免疫balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，經(jīng)hat選擇性培養(yǎng)，獲得分泌抗麻痹性貝毒單克隆抗體的雜交瘤陽性細(xì)胞系；
3）制備抗麻痹性貝毒單克隆抗體；
4）制備免疫膠體金：將步驟3）制備的抗體加入到膠體金中得到標(biāo)記物，用噴點(diǎn)儀包被到經(jīng)預(yù)處理的膠金墊上；
5）將stx-ova偶聯(lián)物噴點(diǎn)在nc膜上構(gòu)成檢測(cè)線，并將羊抗鼠單抗噴點(diǎn)在nc膜上構(gòu)成質(zhì)控線；
6）將樣本墊、膠金墊、nc膜、吸水墊按順序依次粘附在pvc背襯上，安裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)。陽性100ng/ml完全抑制，無條帶出現(xiàn)；加樣量為80μl/孔；判斷時(shí)間為小于10min；最低檢測(cè)限為小于100ng/ml。真空封裝，常溫保存，有效期大于12個(gè)月。
本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提高了檢測(cè)靈敏度，延長(zhǎng)了保存有效期。而提高靈敏度，可提高貝類體內(nèi)麻痹性貝毒的檢出率，含量較低的麻痹性貝毒仍可檢出，對(duì)于水產(chǎn)品的食用安全問題具有重要意義；而延長(zhǎng)了保存有效期，對(duì)于該試紙條日后的推廣，降低失效的可能。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋說明。
1、麻痹性貝毒完全抗原的獲得。將石房蛤毒素(stx)溶于0.002m的乙酸鈉緩沖液中，加入溶于pbs(ph7.0)緩沖液的血藍(lán)蛋白(klh)或卵清蛋白(ova)及少量甲醛，25℃反應(yīng)72小時(shí)，再4℃過夜。將反應(yīng)混合物透析3d，4℃，每12h換液1次。制備得到stx-klh和stx-ova偶聯(lián)物即兩種麻痹性貝毒完全抗原，備用。
2、麻痹性貝毒單克隆陽性細(xì)胞株的獲得。用stx-klh偶聯(lián)物免疫balb/c小鼠，免疫6次后殺鼠取脾與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0融合，經(jīng)hat選擇性培養(yǎng)，獲得分泌抗麻痹性貝毒單克隆抗體的雜交瘤陽性細(xì)胞系。
3、制備抗麻痹性貝毒單克隆抗體；分泌抗麻痹性貝毒(psp)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。取8周齡健康balb/c雌性小鼠或雜交一代鼠，腹腔注射液體石蠟0.5ml/每只，待用。1500r/min離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的陽性雜交瘤細(xì)胞，懸浮于生理鹽水中，濃度為106/ml。在石蠟油處理的小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml雜交瘤細(xì)胞懸液誘生腹水，收集腹水，3000r/min離心10min，收集上清液即為含單克隆抗體腹水。腹水用優(yōu)化的辛酸硫酸氨純化方法得到粗制抗體蛋白，再用0.01m的pbs緩沖液(ph7.4)透析3天。取出用紫外分光光度計(jì)測(cè)得蛋白濃度為8.0mg/ml。
4、制備免疫膠體金。取膠體金溶液于干凈的燒杯中，用1%的k2co3調(diào)節(jié)其ph值為8.4，加入100倍稀釋的抗麻痹性貝毒單克隆抗體，使其在膠體金中終濃度為6.25%（體積比），攪拌20min，加入少量peg20000，繼續(xù)攪拌20min，10000rpm離心30min，取沉淀，用10％bsa的tris溶液重懸后離心，沉淀用tris緩沖液（含bsa、蔗糖、海藻糖）溶解，用噴點(diǎn)儀包被到經(jīng)預(yù)處理的膠金墊上。37°c真空干燥備用。
5、檢測(cè)線和質(zhì)控線的獲得。將stx-ova偶聯(lián)物噴點(diǎn)(包被)在nc膜上構(gòu)成檢測(cè)線，并將羊抗鼠單抗噴點(diǎn)(包被)在nc膜上構(gòu)成質(zhì)控線。
6、將樣本墊、膠金墊、nc膜、吸水墊按順序依次粘附在pvc背襯上，并包裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)，得到檢測(cè)麻痹性貝毒的免疫膠體金試紙條。抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備及包被膠金墊。
7、試紙條組裝。將處理好的樣本墊、包被有抗麻痹性貝毒單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的膠金墊、包被有石房蛤毒素-卵清蛋白偶聯(lián)抗原作為檢測(cè)線和包被有羊抗鼠單抗作為質(zhì)控線的nc膜、吸水墊按順序依次粘附在pvc背襯上，安裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區(qū)。陽性100ng/ml完全抑制，無條帶出現(xiàn)；加樣量為80μl/孔；判斷時(shí)間為小于10min；最低檢測(cè)限為小于100ng/ml。真空封裝，常溫保存，有效期大于12個(gè)月。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。