本發(fā)明涉及藥物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及藥物雜質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在多肽藥物合成中，為了加快氨基酸之間脫水反應(yīng)的反應(yīng)，形成酰胺鍵，常需加入一些縮合劑，目前應(yīng)用較為廣泛的縮合劑從分子結(jié)構(gòu)角度主要分為碳二亞胺類(lèi)型、磷正離子類(lèi)型和脲正離子類(lèi)型。

(1)碳二亞胺類(lèi)型縮合劑

(2)磷正離子類(lèi)型縮合劑

(3)脲正離子類(lèi)型縮合劑

(4)其它類(lèi)型縮合劑

以上這四種類(lèi)型的縮合劑中除第4種外，其它三種的結(jié)構(gòu)中均含有歐洲藥監(jiān)局 發(fā)布的基因毒性警示結(jié)構(gòu)?；蚨拘允侵冈谝詃na反應(yīng)物質(zhì)為主要研究對(duì)象的體內(nèi)/體外試驗(yàn)中，對(duì)dna有潛在的破壞性。基因毒性雜質(zhì)作為工藝雜質(zhì)的一類(lèi)，近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外的高度重視。歐盟醫(yī)藥管理局(ema)發(fā)布了《基因毒性雜質(zhì)限度指引》，并頒布了36種具有潛在基因毒性的化學(xué)結(jié)構(gòu)，旨在對(duì)潛在基因毒性雜質(zhì)的充分研究和有效控制，保障用藥安全性。如果我們?cè)诤铣墒褂昧松鲜鋈N具有警示結(jié)構(gòu)的縮合劑，由于其它們具有較低的水溶性，所以在工藝中一般較難除去，從藥品質(zhì)量控制的角度，我們應(yīng)對(duì)這些潛在的雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

由于基于上述基因毒性雜質(zhì)的限度一般都很低，而性質(zhì)又不穩(wěn)定，所以用常規(guī)的處理和分析方法大多檢測(cè)不到，或者得到的結(jié)果不準(zhǔn)確；同時(shí)有些基因毒性雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)中不具有紫外吸收，不能用常用的帶紫外檢測(cè)器的高效液相色譜來(lái)檢測(cè)，所以檢測(cè)這些基因毒性雜質(zhì)較為困難。開(kāi)發(fā)出快速并能準(zhǔn)確檢測(cè)這些基因毒性雜質(zhì)含量的分析方法是非常有必要的。

本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種檢測(cè)多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)的方法，其包括如下步驟：

1)以高效液相色譜儀和紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；

2)檢測(cè)條件為，以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相a為包含三氟乙酸的水溶液，流動(dòng)相b為有機(jī)溶劑；以流動(dòng)相a99％-85％，流動(dòng)相b1％-15％開(kāi)始進(jìn)行洗脫1-10分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至12-18分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a75％-65％，流動(dòng)相b25％-35％；達(dá)到流動(dòng)相a75％-65％，流動(dòng)相b25％-35％后0.01-0.5分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a99％-85％，流動(dòng)相b1％-15％繼續(xù)洗脫5-15分鐘；

優(yōu)選地，以流動(dòng)相a95％-88％，流動(dòng)相b5％-12％開(kāi)始進(jìn)行洗脫3-7分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至14-16分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a72％-68％，流動(dòng)相b28％-32％；達(dá)到流動(dòng)相a72％-68％，流動(dòng)相b28％-32％后，洗脫0.01-0.5分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a95％-88％，流動(dòng)相b5％-12％繼續(xù)洗脫8-12分鐘；

更優(yōu)選地，以流動(dòng)相a92％-88％，流動(dòng)相b8％-12％開(kāi)始進(jìn)行洗脫5分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至15分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a70％， 流動(dòng)相b30％；達(dá)到流動(dòng)相a70％，流動(dòng)相b30％后，洗脫0.1分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a92％-88％，流動(dòng)相b8％-12％繼續(xù)洗脫10分鐘；

其中，

所述多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)為具有紫外吸收的毒性雜質(zhì)，優(yōu)選為hobt、hatu、tbtu、hctu、tptu、bop、hoat；

高效液相色譜柱填料選自c18鍵合硅膠顆粒(3μm粒徑),色譜柱尺寸250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑。

進(jìn)一步地，進(jìn)樣樣品是通過(guò)以下方法獲得，取待測(cè)的多肽藥物，精密稱(chēng)定，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液溶解樣品，超聲處理，在室溫靜置1-3小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋。

進(jìn)一步地，流動(dòng)相b選自乙腈、甲醇、乙醇；流動(dòng)相a為0.05％-0.2％(0.1％)的三氟乙酸水溶液。

進(jìn)一步地，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為280nm，進(jìn)樣量10μl，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種檢測(cè)多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)的方法，其包括如下步驟：

1)以高效液相色譜儀和質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；

2)檢測(cè)條件為，以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相a為有機(jī)溶劑，流動(dòng)相b為甲酸溶液；以流動(dòng)相a99％-80％，流動(dòng)相b1％-20％開(kāi)始進(jìn)行洗脫0-5分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至12-18分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a40％-60％，流動(dòng)相b60-40％；達(dá)到流動(dòng)相a40％-60％，流動(dòng)相b60％-40％后0.01-0.5分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a99％-80％，流動(dòng)相b1％-20％繼續(xù)洗脫5-15分鐘；

優(yōu)選地，以流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％開(kāi)始進(jìn)行洗脫3-7分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至14-16分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a55％-45％，流動(dòng)相b45％-55％；達(dá)到流動(dòng)相a55％-45％，流動(dòng)相b45％-55％后，洗脫0.05-0.2分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％繼續(xù)洗脫5-15分鐘；

更優(yōu)選地，以流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％開(kāi)始進(jìn)行洗脫5分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至15分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a50％， 流動(dòng)相b50％；達(dá)到流動(dòng)相a50％，流動(dòng)相b50％后，洗脫0.1分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％繼續(xù)洗脫10分鐘；

其中，

所述多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)為dic、hbtu、pybop、hatu、tbtu、hctu、tptu、cdi、dcc、edc、bop、hoat、hobt，優(yōu)選為同時(shí)分離檢測(cè)多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop；

高效液相色譜柱填料選自硅膠顆粒填料(粒徑為1.7-10μm),色譜柱尺寸250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑。

進(jìn)一步地，流動(dòng)相a為乙腈、甲醇、乙醇，流動(dòng)相b為0.05％～0.2％甲酸溶液，含5～22mmol/l的甲酸銨，優(yōu)選0.1％甲酸溶液，含12mmol/l的甲酸銨。

一種檢測(cè)多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)的方法，其包括如下步驟：

1)以高效液相色譜儀和紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；

2)檢測(cè)條件為，以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相a為包含三氟乙酸的水溶液，流動(dòng)相b為有機(jī)溶劑；以流動(dòng)相a99％-85％，流動(dòng)相b1％-15％開(kāi)始進(jìn)行洗脫1-10分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至12-18分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a75％-65％，流動(dòng)相b25％-35％；達(dá)到流動(dòng)相a75％-65％，流動(dòng)相b25％-35％后0.01-0.5分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a99％-85％，流動(dòng)相b1％-15％繼續(xù)洗脫5-15分鐘；

優(yōu)選地，以流動(dòng)相a95％-88％，流動(dòng)相b5％-12％開(kāi)始進(jìn)行洗脫3-7分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至14-16分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a72％-68％，流動(dòng)相b28％-32％；達(dá)到流動(dòng)相a72％-68％，流動(dòng)相b28％-32％后，洗脫0.01-0.5分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a95％-88％，流動(dòng)相b5％-12％繼續(xù)洗脫8-12分鐘；

更優(yōu)選地，以流動(dòng)相a92％-88％，流動(dòng)相b8％-12％開(kāi)始進(jìn)行洗脫5分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至15分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a70％，流動(dòng)相b30％；達(dá)到流動(dòng)相a70％，流動(dòng)相b30％后，洗脫0.1分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a92％-88％，流動(dòng)相b8％-12％繼續(xù)洗脫10分鐘；

其中，

所述多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)為具有紫外吸收的毒性雜質(zhì)，優(yōu)選為hobt、hatu、tbtu、hctu、tptu、bop、hoat；

高效液相色譜柱填料選自c18鍵合硅膠顆粒(3μm粒徑)、色譜柱尺寸50-250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑。

進(jìn)一步地，進(jìn)樣樣品是通過(guò)以下方法獲得，取待測(cè)的多肽藥物，精密稱(chēng)定，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液溶解樣品，超聲處理，在室溫靜置1-3小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋。

進(jìn)一步地，流動(dòng)相b選自乙腈、甲醇、乙醇，流動(dòng)相a為0.05％-0.2％(0.1％)的三氟乙酸水溶液。

進(jìn)一步地，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為280nm，進(jìn)樣量10μl，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃

本發(fā)明的另一方面涉及一種檢測(cè)多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)的方法，其包括如下步驟：

1)以高效液相色譜儀和質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；

2)檢測(cè)條件為，以流動(dòng)相a和流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相a為有機(jī)溶劑，流動(dòng)相b為甲酸溶液；以流動(dòng)相a99％-80％，流動(dòng)相b1％-20％開(kāi)始進(jìn)行洗脫0-5分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至12-18分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a40％-60％，流動(dòng)相b60-40％；達(dá)到流動(dòng)相a40％-60％，流動(dòng)相b60％-40％后0.01-0.5分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a99％-80％，流動(dòng)相b1％-20％繼續(xù)洗脫5-15分鐘；

優(yōu)選地，以流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％開(kāi)始進(jìn)行洗脫3-7分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至14-16分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a55％-45％，流動(dòng)相b45％-55％；達(dá)到流動(dòng)相a55％-45％，流動(dòng)相b45％-55％后，洗脫0.05-0.2分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％繼續(xù)洗脫5-15分鐘；

更優(yōu)選地，以流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％開(kāi)始進(jìn)行洗脫5分鐘，逐漸減小流動(dòng)相a的比例，增加流動(dòng)相b的比例，至15分鐘時(shí)達(dá)到流動(dòng)相a50％，流動(dòng)相b50％；達(dá)到流動(dòng)相a50％，流動(dòng)相b50％后，洗脫0.1分鐘后將流動(dòng)相調(diào)整至流動(dòng)相a95％-80％，流動(dòng)相b5％-20％繼續(xù)洗脫10分鐘；

其中，

所述多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)為dic、hbtu、pybop、、hatu、tbtu、hctu、tptu、cdi、dcc、edc、bop、hoat、hobt，優(yōu)選為同時(shí)分離檢測(cè) 多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop；

高效液相色譜柱填料選自硅膠顆粒填料(粒徑為1.7-10μm)、色譜柱尺寸50-250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑。

進(jìn)一步地，流動(dòng)相a為乙腈、甲醇、乙醇，流動(dòng)相b為0.05％～0.2％甲酸溶液，含5～22mmol/l的甲酸銨，優(yōu)選0.1％甲酸溶液，含12mmol/l的甲酸銨。

進(jìn)一步地，其中高效液相色譜柱柱溫25-50℃；進(jìn)樣量5-200ul。

進(jìn)一步地，質(zhì)譜方法為，離子模式為正離子模式；離子流數(shù)據(jù)采集范圍為100～800da；離子源溫度為150～300℃；離子傳輸管溫度為300～400℃；鞘氣流為30au；輔氣流為0au；噴霧電壓為3kv；偏轉(zhuǎn)電壓為80kv。

本發(fā)明的在一個(gè)方面提供一種檢測(cè)多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)的方法，所述方法是將前述紫外檢測(cè)的方法與前述質(zhì)譜的方法組合使用。

本發(fā)明能方便快速的檢測(cè)出合成多肽中的基因毒性雜質(zhì)，有高通量、高靈敏度等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

附圖1為實(shí)施例1多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)hobt的檢測(cè)圖譜；

附圖2為實(shí)施例2多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)hobt的檢測(cè)圖譜；

附圖3為實(shí)施例3多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)hobt的檢測(cè)圖譜；

附圖4為實(shí)施例4多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)圖譜；

附圖5為實(shí)施例5多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖6為實(shí)施例6多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖7為實(shí)施例7多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖8為實(shí)施例8多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖9為實(shí)施例9多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖10為實(shí)施例10多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè) 方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖11為實(shí)施例11多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖12為實(shí)施例12多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖13為實(shí)施例13多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜；

附圖14為實(shí)施例14多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜。

具體實(shí)施方式

結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定且有紫外吸收的基因毒性雜質(zhì)的常用檢測(cè)方法

實(shí)施案例1

使用沃特世e2695高效液相色譜儀2489紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為280nm，色譜柱尺寸250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑，色譜柱填料為c18鍵合硅膠顆粒，3μm粒徑。流動(dòng)相a是0.1％的三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相b為色譜純的乙腈，流動(dòng)相a和b的比例依據(jù)下表1進(jìn)行設(shè)置。取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。進(jìn)樣量10μl，流速設(shè)為1.0ml/min，柱溫采用25℃。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)hobt的檢測(cè)圖譜見(jiàn)附圖1。

表1實(shí)施案例的梯度洗脫表：

實(shí)施案例2

使用沃特世e2695高效液相色譜儀2489紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為280nm，色譜柱尺寸250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑，色譜柱填料為c18鍵合硅膠顆粒，3μm粒徑。流動(dòng)相a是0.1％的三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相b為色譜純的乙腈， 流動(dòng)相a和b的比例依據(jù)下表2進(jìn)行設(shè)置。取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。進(jìn)樣量10μl，流速設(shè)為1.0ml/min，柱溫采用25℃。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)hobt的檢測(cè)圖譜見(jiàn)附圖2。

表2實(shí)施案例的梯度洗脫表：

實(shí)施案例3

使用沃特世e2695高效液相色譜儀2489紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為280nm，色譜柱尺寸250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑，色譜柱填料為c18鍵合硅膠顆粒，3μm粒徑。流動(dòng)相a是0.1％的三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相b為色譜純的乙腈，流動(dòng)相a和b的比例依據(jù)下表3進(jìn)行設(shè)置。取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。進(jìn)樣量10μl，流速設(shè)為1.0ml/min，柱溫采用25℃。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)hobt的檢測(cè)圖譜見(jiàn)附圖3。

表3實(shí)施案例的梯度洗脫表：

實(shí)施案例4

使用沃特世e2695高效液相色譜儀2489紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)為280nm，色譜柱尺寸250mm長(zhǎng)，4.6mm直徑，色譜柱填料為c18鍵合硅膠顆粒，3μm粒徑。流動(dòng)相a是0.1％的三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相b為色譜純的乙腈，流動(dòng)相a和b的比例依據(jù)下表1進(jìn)行設(shè)置。取某多肽藥物(含基因毒性雜質(zhì)dic、 hbtu和pybop)約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。進(jìn)樣量10μl，流速設(shè)為0.8ml/min，柱溫采用25℃。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop不具備紫外吸收結(jié)構(gòu)，在此方法中不能測(cè)得雜質(zhì)峰。檢測(cè)圖譜見(jiàn)附圖4。

結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且不具紫外吸收的基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法

實(shí)施案例5

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：25℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表4進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖5。

表4實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例6

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表5進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖6。

表5實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例7

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表6進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖7。

表6實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例8

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表7進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖8。

表7實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例9

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表8進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖9。

表8實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例10

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表9進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖10。

表9實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例11

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表10進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖11。

表10實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例12

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：1.0ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表11進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖12。

表11實(shí)施案例的梯度洗脫表

實(shí)施案例13

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：0.8ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表11進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖13。

實(shí)施案例14

使用安捷倫1260高效液相色譜儀，thermoltq質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)分析。

液相條件：

色譜柱：welchultimatesio24.6×250mm，5μm

柱溫：30℃

液相流速：0.8ml/min，調(diào)節(jié)分流比，使得進(jìn)質(zhì)譜的流速0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相a：乙腈

流動(dòng)相b：0.1％甲酸溶液(含12mmol/l的甲酸銨)

按表10進(jìn)行梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀檢測(cè)器：thermoltqxl

離子模式：正離子模式

離子流數(shù)據(jù)采集范圍：144～146da233～235da257～259da

離子源溫度:200℃

離子傳輸管溫度:320℃

鞘氣流：30au

輔氣流：0au

噴霧電壓:3kv

偏轉(zhuǎn)電壓:80kv

取待測(cè)的多肽藥物約100mg，精密稱(chēng)定，置于10ml量瓶中，加入含30％乙腈的1mol/l的鹽酸溶液1ml溶解樣品，超聲處理1min，在室溫靜置2小時(shí)，再用30％的乙腈溶液稀釋至刻度，供測(cè)試。某多肽藥物中基因毒性雜質(zhì)dic、hbtu和pybop的檢測(cè)方法的驗(yàn)證圖譜見(jiàn)附圖14。