本發(fā)明涉及一種中藥藥材的質(zhì)量控制方法，特別涉及平貝母藥材高效液相色譜法指紋圖譜的建立方法。

背景技術(shù)：

平貝母為百合科貝母屬多年生草本植物平貝母(Fritillaria ussurienis Maxim)的干燥鱗莖，又名平貝，是藥用貝母的一種，收載于2010版《中國藥典》及香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三期(2010年)。

平貝母主產(chǎn)東北三省，性苦、甘，微寒；歸肺、心經(jīng)。早在秦漢時期《神農(nóng)本草經(jīng)》將貝母列為中品，能清熱潤肺，化痰止咳，用于肺熱燥咳、干咳少痰、陰虛勞咳、咳痰帶血。

甾體生物堿成分是現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的公認(rèn)的平貝母藥材的主要活性成分，也是作為平貝母清熱潤肺、化痰止咳的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前中國藥典(2010年)控制平貝母藥材質(zhì)量的方法主要包括性狀鑒定、薄層鑒別及含量測定等方法。含量測定主要通過利用分光光度法測定平貝母藥材中總生物堿含量來達(dá)到控制平貝母藥材質(zhì)量的目的。而香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三期(2010年)還收載了平貝母的指紋圖譜，但其方法中供試品制備取樣量大，因使用三氯甲烷為提取溶劑且量多，毒性大，指紋圖譜特征峰較少。閔會等研究了不同貝母的指紋圖譜鑒別研究，指紋圖譜只分離出了7個特征峰，對于藥材中可能存在的其他共同特征峰或許沒有完全被檢測。

貝母辛、貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿為平貝母中主要的生物堿，由于它們?nèi)鄙侔l(fā)色團(tuán)，無紫外吸收，因此不能用紫外吸收檢測器檢測。研究者用薄層掃描法、柱前衍生化法、質(zhì)譜液相聯(lián)用法、氣相色譜法測定平貝母中這類生物堿含量，但多因檢測的局限性難以得到理想的結(jié)果。近年，使用高效液相色譜法檢測平貝母中生物堿成分的研究較多，李慧婷等人用ELSD-HPLC測定平貝母中貝母素甲、貝母素乙含量，吳曉民等人用HPLC測定平貝母中貝母甲素的含量，洪梅等人用ELSD-HPLC等度洗脫測定平貝母中貝母素甲的含量，這些方法只能測定一種或兩種生物堿成分，并不能完全反映藥材的整體特征。王世曼等人曾用HPLC研究吉林產(chǎn)貝母生物堿不同提取方法的指紋圖譜，以貝母素乙為參照，但經(jīng)查閱文獻(xiàn)，貝母素乙在平貝母中含量極低，以貝母素乙為參照會對準(zhǔn)確性造成一定的影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及平貝母藥材高效液相色譜法指紋圖譜的建立方法，以及由此方法得到的平貝母藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。通過測定平貝母藥材的指紋圖譜有效地控制平貝母藥材的質(zhì) 量，彌補了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，從而確保平貝母藥材的有效性、穩(wěn)定性和均一性。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的：一種平貝母藥材的指紋圖譜，該方法包括采用高效液相色譜法對平貝母進(jìn)行檢測，其中色譜條件包括；

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；

流動相：流動相A為含1mmol/L乙酸銨的0.1％三乙胺水溶液，流動相B為乙腈溶液；

采用梯度洗脫，洗脫步驟如下，其中流動相比例均為體積百分比：

0～8min，流動相A為70％～65％，流動相B為30％～35％；

8～25min，流動相A為65％～55％，流動相B為35％～45％；

25～40min，流動相A為55％～5％，流動相B為45％～95％；

40～43min，流動相A為5％，流動相B為95％；

43～48min，流動相A為5％～70％，流動相B為95％～30％；

48～58min，流動相A為70％，流動相B為30％。所述平貝母指紋圖譜的建立方法，

還包括通過以下步驟制備對照品溶液：

取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿四種生物堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml含貝母辛0.140mg、貝母素甲0.133mg、貝母素乙0.100mg、西貝母堿0.372mg的混合對照品溶液，即得。

所述平貝母指紋圖譜的建立方法，還包括通過以下步驟制備供試品溶液：把平貝母打粉，過四號篩，取2g平貝母藥材粉末，加氨水4ml浸潤2h，用比例為4:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液40ml回流提取，過濾。取濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解定容至2ml，12000r/min離心10min沉淀不溶性物質(zhì)，取上清液，將上清液與1g硅膠混合均勻，通過內(nèi)徑為1.5cm、填料重量為5g的薄層層析硅膠柱，以水30ml洗脫，棄去水洗液，繼用比例為9:1的乙酸乙酯-甲醇40ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解定容至2ml，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

優(yōu)選地，所述平貝母指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟：

(a)制備供試品溶液：把平貝母打粉，過四號篩，取2g平貝母藥材粉末，加氨水4ml浸潤2h，用比例為4:1的三氯甲烷-甲醇混合溶液40ml回流提取，過濾。取濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解定容至2ml，12000r/min離心10min沉淀不溶性物質(zhì)，取上清液，將上清液與1g硅膠混合均勻，通過內(nèi)徑為1.5cm、填料重量為5g的薄層層析硅膠柱，以水30ml洗脫，棄去水洗液，繼用比例為9:1的乙酸乙酯-甲醇40ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解定容至2ml，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得；

(b)制備對照品溶液：取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿四種生物堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml含貝母辛0.140mg、貝母素甲0.133mg、貝母素乙 0.100mg、西貝母堿0.372mg的混合對照品溶液，即得；

(c)測定：精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下條件進(jìn)行測定，得到平貝母藥材指紋圖譜；

其中，色譜條件包括：

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；

流動相：流動相A為含1mmol/L乙酸銨的0.1％三乙胺水溶液，流動相B為乙腈溶液；

采用梯度洗脫，洗脫步驟如下，其中流動相比例均為體積百分比：

0～8min，流動相A為70％～65％，流動相B為30％～35％；

8～25min，流動相A為65％～55％，流動相B為35％～45％；

25～40min，流動相A為55％～5％，流動相B為45％～95％；

40～43min，流動相A為5％，流動相B為95％；

43～48min，流動相A為5％～70％，流動相B為95％～30％；

48～58min，流動相A為70％，流動相B為30％；流速為1ml/min；

柱溫為25℃；

進(jìn)樣量為10μl；蒸發(fā)光散射器的條件包括：

漂移管溫度：85℃；霧化器流速：2.2L/min；

Grain：1。所述平貝母指紋圖譜的建立方法，還包括：對多個平貝母指紋圖譜進(jìn)行比較，選出共有特征峰，得到平貝母特征指紋圖譜。所述平貝母指紋圖譜的建立方法，在于平貝母指紋圖譜或平貝母特征指紋圖譜中，以貝母辛對照品為參照峰，各特征峰的相對保留時間如下：峰1:0.79、峰2:0.97、峰3:1.00、峰4:1.32、峰5:1.51、峰6:1.83、峰7:2.10、峰8:2.21、峰9:2.28、峰10:2.32、峰11:2.43、峰12:2.59、峰13:2.62、峰14:2.74，其相對保留時間在上述值的±10％之內(nèi)。所述平貝母指紋圖譜或平貝母特征指紋圖譜中，3號峰為貝母辛對照峰。本發(fā)明還提供一種平貝母藥材的鑒定方法，該方法包括將根據(jù)上述方法建立待測樣品指紋圖譜或特征指紋圖譜與根據(jù)上述方法建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜或特征指紋圖進(jìn)行比較。

所述平貝母藥材的鑒定方法，包括以下步驟：

(a)測定待測平貝母藥材生物堿類指紋圖譜；

(b)將待測平貝母藥材指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜對比，以特征峰計算，相似度不低于0.85的藥材質(zhì)量合格，其中所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括14個共有峰，其中3號峰為貝母辛 對照峰，各對照峰的相對保留時間為：峰1:0.79、峰2:0.97、峰3:1.00、峰4:1.32、峰5:1.51、峰6:1.83、峰7:2.10、峰8:2.21、峰9:2.28、峰10:2.32、峰11:2.43、峰12:2.59、峰13:2.62、峰14:2.74，其相對保留時間在上述值的±10％之內(nèi)。

不同色譜條件的對比

1、色譜柱：比較C18柱、C8柱、苯基柱、氨基柱等常用色譜柱，發(fā)現(xiàn)C8柱與苯基柱對平貝母有藥材中成分保留極差，不能全面反映平貝母藥材成分。氨基柱為正向分配體系，不適合本次實驗。本方法選擇C18柱進(jìn)行分離，得到了較好的效果。

2、流動相：單純使用乙腈-三乙胺水體系或者甲醇-三乙胺水體系，無法將藥品中的成分盡可能的分離，且峰形難看，保留時間波動較大，從而很難依據(jù)其圖譜進(jìn)行鑒別，根本不能滿足特征圖譜的建立要求。本方法結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的流動相及其分離的平貝母中生物堿的峰的特點，最終確定使用乙腈-三乙胺-乙酸銨的三元體系，此條件下，各色譜峰峰形尖銳，分離度較好，保留時間適中。

3、檢測器：平貝母中生物堿成分屬于甾體類生物堿，無紫外吸收，且單一的有效成分含量極低，不能適宜選擇常用的紫外檢測器，本方法選用靈敏度高的蒸發(fā)光散色檢測器，檢測條件為，漂移管溫度：85℃；霧化器流速：2.2L/min；Grain：1。

本發(fā)明將平貝母藥材作為一個整體對待，通過比較其特征峰可以找出不同藥材之間的細(xì)微差異，適用于平貝母藥材真?zhèn)?、產(chǎn)地、品質(zhì)的鑒別和控制。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：

1、現(xiàn)行《中國藥典》(2010年)標(biāo)準(zhǔn)中，對平貝母的鑒別方法只有薄層鑒定和總生物堿含量鑒定，本發(fā)明所述平貝母藥材的鑒定方法簡便、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確率高，只要供選擇的藥材中出現(xiàn)本申請所指定的指紋圖譜，即可確認(rèn)藥材為平貝母藥材，確保了藥材選擇的準(zhǔn)確性，確保了成藥的質(zhì)量。

2、本發(fā)明采用乙腈-三乙胺-乙酸銨系統(tǒng)，利用梯度洗脫的方法建立了平貝母藥材生物堿類指紋圖譜，利用乙酸銨屏蔽硅醇基改善峰形，三乙胺調(diào)節(jié)峰拖尾。該方法操作簡便，穩(wěn)定可靠，精密度高，分離度好。

3、平貝母藥材多以總生物堿為質(zhì)量控制指標(biāo)，但并不能完成反映中藥的質(zhì)量。近年來，中藥指紋圖譜和特征指紋圖譜已廣泛應(yīng)用于質(zhì)量控制，我們運用指紋圖譜技術(shù)有效地控制平貝母藥材質(zhì)量，彌補了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，從而確保平貝母藥材的有效性、穩(wěn)定性和均一性。

4、生物堿類成分試現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的公認(rèn)的平貝母藥材的主要活性成分，文獻(xiàn)報道測定平貝母中生物堿類成分只能測定一種或兩種成分，平貝母共有峰一般被檢測出6-7個共有峰，本發(fā)明在測定平貝母生物堿類成分中，同時測定平貝母中貝母辛、貝母素甲、貝母 素乙、西貝母堿四種有效生物堿成分。

5、本發(fā)明所述平貝母藥材的鑒定方法中，還包括對該藥材的供試品制備方法的步驟，首先利用傳統(tǒng)的方法氨水浸潤、氯仿-甲醇提取后，繼用薄層層析硅膠吸附，水溶液洗脫除去水溶性物質(zhì)，再用乙酸乙酯-甲醇液將生物堿成分洗脫，減少雜質(zhì)對液相測定的影響。

6、本發(fā)明具有方法簡便，易于掌握，穩(wěn)定，精密度高，重現(xiàn)性好的特點。

附圖說明

圖1為實施例1平貝母藥材生物堿類成分標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

圖2為對比例1中所述平貝母藥材特征峰的指紋圖譜—香港指紋圖譜方法

圖3為對比例2中所述平貝母藥材特征峰的指紋圖譜—參考文獻(xiàn)方法

圖4為實施例2十批平貝母藥材樣品生物堿類成分指紋圖譜

具體實施方式

下面通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

實施例1：平貝母藥材生物堿類成分指紋圖譜建立實驗

1、儀器、試藥和供試樣品

儀器：高效液相色譜儀：Aglient1200，蒸發(fā)光散色器：Alltech 3300；

電子天平：型號：CP214，奧豪斯儀器上海有限公司制造；

對照品：貝母辛對照品(中國食品藥品檢定研究，批號：11892-201201)；貝母素甲對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為98.3％，批號：110750-201110)；貝母素乙對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為99.9％，批號：110751-201110)；西貝母堿對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為99.1％，批號：110767-201107)。

樣品：平貝母藥材(梧州制藥有限公司采購部供應(yīng)，批號：13082101、13082102、13082103、13082104、13082105、13082106、13082107、13082108、13082109、13082110)。

2、液相色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為0.1％三乙胺(含1mmol/L的乙酸銨)的水溶液，流動相B為乙腈溶液；流速為1.0ml/min，采用梯度洗脫，洗脫程序如下，

0～8min，流動相A為70％～65％，流動相B為30％～35％；

8～25min，流動相A為65％～55％，流動相B為35％～45％；

25～40min，流動相A為55％～5％，流動相B為45％～95％；

40～43min，流動相A為5％，流動相B為95％；

43～48min，流動相A為5％～70％，流動相B為95％～30％；

48～58min，流動相A為70％，流動相B為30％；

流速為1ml/min；

柱溫為25℃；

進(jìn)樣量為10μl；

3、蒸發(fā)光散射器的條件：

漂移管溫度：85℃；

霧化器流速：2.2L/min；

Grain：1。

4、對照品溶液的制備

取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿四種生物堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml含貝母辛0.140mg、貝母素甲0.133mg、貝母素乙0.100mg、西貝母堿0.372mg的混合對照品溶液，即得。

5、供試品溶液的制備

把平貝母打粉，過四號篩，取2g平貝母藥材粉末，加氨水4ml浸潤2h，用三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液40ml回流提取，過濾。取濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解定容至2ml，12000r/min離心10min沉淀不溶性物質(zhì)，取上清液，將上清液與1g硅膠混合均勻，通過薄層層析硅膠柱(內(nèi)徑為1.5cm，5g)，以水30ml洗脫，棄去水洗液，繼用乙酸乙酯-甲醇(9:1)40ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解定容至2ml，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

6、平貝母藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定

取平貝母藥材10批，按照供試品溶液的制備方法制備供試品，在上述液相色譜條件下，分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。依據(jù)10批樣品的指紋圖譜，制定特征圖譜。供試品特征圖中應(yīng)呈現(xiàn)14個特征峰，其中4個峰應(yīng)與相應(yīng)的對照品峰保留時間相一致；以貝母辛參照峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，結(jié)果表明，各共有特征峰的相對保留時間的RSD均小于2％，符合指紋圖譜分析要求。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，相對保留時間規(guī)定值為峰1：0.79、峰2:0.97、峰3:1.00、峰4:1.32、峰5:1.51、峰6:1.83、峰7:2.10、峰8:2.21、峰9:2.28、峰10:2.32、峰11:2.43、峰12:2.59、峰13:2.62、峰14:2.74。在14個特征峰中，3號峰與貝母辛對應(yīng)的峰，14號峰與西貝母堿，其保留時間一致。

表1共有特征峰相對保留時間表

對比例1：平貝母藥材生物堿類成分指紋圖譜建立實驗

1、儀器、試藥和供試樣品

儀器：高效液相色譜儀：Aglient1200，蒸發(fā)光散色器：Alltech 3300；

電子天平：型號：CP214，奧豪斯儀器上海有限公司制造；

對照品：貝母辛對照品(中國食品藥品檢定研究，批號：11892-201201)；貝母素甲對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為98.3％，批號：110750-201110)；貝母素乙對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為99.9％，批號：110751-201110)；西貝母堿對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為99.1％，批號：110767-201107)。

樣品：平貝母藥材(梧州制藥有限公司采購部供應(yīng)，批號：13082101、13082102、13082103)。

2、液相色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為0.1％三乙胺溶液，流動相B為乙腈溶液；流速為1.0ml/min，采用梯度洗脫，洗脫程序如下，

0～10min，流動相A為70％～65％，流動相B為30％～35％；

10～32min，流動相A為65％～56％，流動相B為35％～44％；

32～60min，流動相A為56％～45％，流動相B為44％～55％；

蒸發(fā)光散色檢測器，檢測條件為漂移管溫度：105℃；霧化器流速(N₂)：2.8L/min；Grain：1。

3、對照品溶液的制備取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿四種生物堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml含貝母辛0.140mg、貝母素甲0.133mg、貝母素乙0.100mg、西貝母堿0.372mg的混合對照品溶液，即得。

4、供試品溶液的制備

把平貝母打粉，過四號篩，取5g平貝母藥材粉末，加氨水10ml浸潤1h，加二氯甲烷100ml，加熱回流2小時，放冷至室溫，過濾。取濾液，濾液轉(zhuǎn)移與200ml圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干。殘渣溶于甲醇，轉(zhuǎn)移與2ml量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

5、平貝母藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定

在上述液相色譜條件下，分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品特征圖中特征峰少，多數(shù)集中在30分鐘前，30分鐘后無顯著的特征峰，主要檢測出貝母辛成分。

圖2為對比例1中所述平貝母藥材特征峰的指紋圖譜—香港指紋圖譜方法。

對比例2：平貝母藥材生物堿類成分指紋圖譜建立實驗

1、儀器、試藥和供試樣品

儀器：高效液相色譜儀：Aglient1200，蒸發(fā)光散色器：Alltech 3300；

電子天平：型號：CP214，奧豪斯儀器上海有限公司制造；

對照品：貝母辛對照品(中國食品藥品檢定研究，批號：11892-201201)；貝母素甲對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為98.3％，批號：110750-201110)；貝母素乙對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為99.9％，批號：110751-201110)；西貝母堿對照品(中國食品藥品檢定研究，含量為99.1％，批號：110767-201107)。

樣品：平貝母藥材(梧州制藥有限公司采購部供應(yīng)，批號：13082101、13082102、13082103)。

2、液相色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為水溶液，流動相B為甲醇溶液(含0.05％三乙胺)；流速為1.0ml/min，采用梯度洗脫，洗脫程序如下，

0～10min，流動相A為40％～30％，流動相B為60％～70％；

10～35min，流動相A為30％～10％，流動相B為70％～90％；

35～50min，流動相A為10％～0％，流動相B為90％～100％；

50～60min，流動相A為0％，流動相B為100％；

蒸發(fā)光散色檢測器，檢測條件為漂移管溫度：70℃；霧化器流速(N₂)：1.6L/min。

3、對照品溶液的制備

取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿四種生物堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每ml含貝母辛0.140mg、貝母素甲0.133mg、貝母素乙0.100mg、西貝母堿0.372mg的混合對照品溶液，即得。

4、供試品溶液的制備

取2g平貝母藥材粉末，加氨水4ml浸潤1h，用三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液40ml回流提取2h，放冷，精密加入6ml無水乙醇，用力搖勻，精密量取續(xù)濾液20ml，水浴蒸干，殘渣加甲醇5ml溶解，濾過，即得。

5、平貝母藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制定

在上述液相色譜條件下，分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品特征圖中特征峰保留時間長，在29.78min、40.75min出現(xiàn)，特征峰只檢測出貝母辛和西貝母堿兩種成分，41分鐘后無顯著的特征峰。

圖3為對比例2中所述平貝母藥材特征峰的指紋圖譜—參考文獻(xiàn)方法。

實施例2：平貝母藥材HPLC特征圖譜建立：

平貝母藥材由廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司采購部提供。

照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VID)測定：

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相A為0.1％三乙胺(含1mmol/L的乙酸銨)的水溶液，流動相B為乙腈溶液；流速為1.0ml/min，采用梯度洗脫，洗脫程序如下，

0～8min，流動相A為70％～65％，流動相B為30％～35％；

8～25min，流動相A為65％～55％，流動相B為35％～45％；

25～40min，流動相A為55％～5％，流動相B為45％～95％；

40～43min，流動相A為5％，流動相B為95％；

43～48min，流動相A為5％～70％，流動相B為95％～30％

48～58min，流動相A為70％，流動相B為30％

對照品溶液的制備：取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙、西貝母堿四種生物堿對照品適 量，精密稱定，加甲醇制成每ml含貝母辛0.140mg、貝母素甲0.133mg、貝母素乙0.100每個、西貝母堿0.372每個的混合對照品溶液，即得。

供試品溶液的制備：把平貝母打粉，過四號篩，取2g平貝母藥材粉末，加氨水4ml浸潤2h，用三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液40ml回流提取，過濾。取濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解定容至2ml，12000r/min離心10min沉淀不溶性物質(zhì)，取上清液，將上清液與1g硅膠混合均勻，通過薄層層析硅膠柱(內(nèi)徑為1.5cm，5g)，以水30ml洗脫，棄去水洗液，繼用乙酸乙酯-甲醇(9:1)40ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解定容至2ml，用0.22μm微孔濾膜濾過，即得。

測定法：分精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl注入高效液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，即得：

供試品特征圖譜中應(yīng)呈現(xiàn)14個特征峰，其中峰3和峰14分別與相應(yīng)的對照品峰保留時間一致，以貝母辛對照品參照峰為S峰，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，結(jié)果表明，各共有特征峰的相對保留時間的RSD均小于2％，符合指紋圖譜分析要求。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，相對保留時間規(guī)定值為峰1：0.79、峰2:0.97、峰3:1.00、峰4:1.32、峰5:1.51、峰6:1.83、峰7:2.10、峰8:2.21、峰9:2.28、峰10:2.32、峰11:2.43、峰12:2.59、峰13:2.62、峰14:2.74，其相對保留時間在上述值的±10％之內(nèi)。