本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，涉及一種定量檢測低豐度蛋白及其后修飾蛋白的方法。具體涉及利用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)結(jié)合鄰位連接技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)及其后修飾實(shí)現(xiàn)快速靈敏特異定量的方法；該方法具備酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的快速，準(zhǔn)確，便于操作等優(yōu)點(diǎn)和鄰位連接技術(shù)的高特異性，高靈敏度的特點(diǎn)。該方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度后修飾蛋白快速靈敏準(zhǔn)確定量。

背景技術(shù)：

夾心酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(elisa)是蛋白快速準(zhǔn)確定量的金標(biāo)準(zhǔn)之一。捕獲抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的富集和洗滌步驟使夾心酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)能夠快速準(zhǔn)確低背景的定量目標(biāo)蛋白。該方法的主要缺點(diǎn)就是它的檢測限在納克每毫升水平，不能檢測低濃度的蛋白。

鄰位連接技術(shù)(pla)是對(duì)傳統(tǒng)免疫方法的重要補(bǔ)充，自從在2002年被首次提出就由于高靈敏高特異性而得到了廣泛的關(guān)注。該方法很眾多領(lǐng)域都得到了應(yīng)用，例如腫瘤標(biāo)志物的帥選和組蛋白修飾的發(fā)掘。鄰位連接技術(shù)的主要原理就是待檢測物同時(shí)被多個(gè)標(biāo)記有核酸序列的抗體識(shí)別，當(dāng)這些抗體與目標(biāo)待檢測物結(jié)合后，修飾的核酸序列就被固定在臨位，這些核酸序列在核酸連接酶的作用下連接，連接后的核酸序列作為模板進(jìn)行后續(xù)的核酸擴(kuò)增。簡而言之，鄰位連接技術(shù)通過多種抗體的識(shí)別獲得高特異性，通過核酸擴(kuò)增獲得高靈敏性。

目前，鄰位連接技術(shù)分為三類：均相鄰位連接技術(shù)，原位固相鄰位連接技術(shù)，離體固相鄰位連接技術(shù)。雖然均相鄰位連接技術(shù)步驟簡單，但是由于所有實(shí)驗(yàn)步驟都在一個(gè)溶液中缺乏洗滌步驟，導(dǎo)致均相鄰位連接技術(shù)背景相對(duì)較高；原位固相鄰位連接技術(shù)不能直接用于檢測如血清樣的液體樣品；離體固相鄰位連接技術(shù)主要是基于微球和試管，該方法應(yīng)用于分析各類液體樣品取得很好的效果，主要是由于富集步驟和洗滌步驟減低了背景干擾。但是，目前實(shí)踐中存在微球價(jià)格比較昂貴并且干擾熒光信號(hào)，修飾過的試管跟常規(guī)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)儀器不兼容等缺陷。以上這些缺點(diǎn)阻礙了鄰位連接技術(shù)的應(yīng)用。

因此，本領(lǐng)域亟需發(fā)展一種便捷，快速，靈敏，特異的定量方法來檢測低豐度蛋白及其后修飾蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種便捷，快速，靈敏，特異的定量方法來檢測低豐度蛋白及其后修飾蛋白。具體涉及利用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)結(jié)合鄰位連接技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)及其后修飾實(shí)現(xiàn)快速靈敏特異定量的方法；該方法具備酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的快速，準(zhǔn)確，便于操作等優(yōu)點(diǎn)和鄰位連接技術(shù)的高特異性，高靈敏度的特點(diǎn)。該方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度后修飾蛋白快速靈敏準(zhǔn)確定量。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

1.將抗體蛋白夾心復(fù)合物固定在96孔板；

2.結(jié)合鄰位連接技術(shù)探針進(jìn)行核酸序列配對(duì)；

3.連接配對(duì)核酸序列；

4.進(jìn)行基于滾環(huán)擴(kuò)增的信號(hào)放大；

5.信號(hào)檢測。

具體的，本發(fā)明的一種定量檢測低豐度蛋白及其后修飾蛋白的方法，其包括步驟：

1.50ng捕獲抗體在50μl的ph9.6的碳酸鹽包被液37攝氏度2小時(shí)后，加入1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白37攝氏度1小時(shí)；

2.添加待檢測溶液50μl，37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘；

3.50ng檢測抗體在50μl的1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白中4攝氏度12小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘；

4.兩種鄰位連接探針(兔二抗結(jié)合非引物核酸序列，鼠二抗結(jié)合引物核酸序列)1ng/μl溶于1％牛血清白蛋白溶液37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘；

5.延伸序列和連接核酸序列溶于t4dna核酸連接酶緩沖液中，終濃度為100nm。在96孔板每孔加入50μl該溶液37攝氏度孵育40分鐘后，每孔加入0.3ult4dna核酸連接酶后37攝氏度孵育1小時(shí)，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌一次五分鐘；

6.每孔加入50μl滾環(huán)擴(kuò)增溶液(50mm三異丙基乙磺酰-鹽酸,10mm氯化鎂,10mm硫酸銨,0.16mm脫氧核糖核苷三磷酸,0.25mg/ml牛血清白蛋白,0.05％吐溫20,0.3ulph29dna核酸聚合酶，ph7.5)37攝氏度孵育1.5小時(shí)使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌一次五分鐘；

7.每孔加入50μl的100nm辣根過氧化酶標(biāo)記核酸檢測探針溶液37攝氏度孵育30分鐘后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘，使用酶標(biāo)儀檢測光密度信號(hào)。

本發(fā)明中，使用商業(yè)化的96孔板，能對(duì)捕獲抗體進(jìn)行簡便快速包被，捕獲抗體可以目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集捕獲，在復(fù)雜體系中可以降低背景干擾；

本發(fā)明中，使用鄰位連接探針對(duì)雙抗夾心中的兩種一抗同時(shí)進(jìn)行識(shí)別，可以提高該方法的特異性；

本發(fā)明中，以鄰位連接技術(shù)探針中的核酸序列作為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，可以提高該方法的靈敏度。

表1為本技術(shù)所用的核酸序列

表1

本方法用于檢測綠色熒光蛋白，結(jié)果顯示，其比常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的靈敏度提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)；其中分別使用位點(diǎn)特異性磷酸化抗體和泛磷酸化抗體，成功的定量細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化水平變化；

結(jié)果還顯示，本方法還可用于定量o連接n-乙酰氨基葡萄糖化(o-glcnac)的目標(biāo)蛋白，結(jié)果顯示，相對(duì)于常規(guī)的o-glcnac修飾蛋白定量技術(shù)(蛋白免疫沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)印跡法)，本方法更為快速靈敏。

本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度蛋白及其后修飾實(shí)現(xiàn)快速靈敏特異性檢測。

附圖說明

圖1為本方法的示意圖。

圖2為鄰位連接探針合成示意圖。

圖3鼠鄰位連接探針合成后鼠二抗的活性(a),兔鄰位連接探針合成后兔二抗的活性(b)。

圖4二抗與巰基修飾的核酸序列連接效果。

圖5對(duì)比elisa和elisa-pla檢測綠色熒光蛋白(gfp)在不同樣品摻雜中的效果:綠色熒光蛋白在血清中的摻雜(a),綠色熒光蛋白在細(xì)胞提取物中的摻雜(b),綠色熒光蛋白在組織提取物中的摻雜(c)，其中黑色正方形表示elisa結(jié)果，灰色正方形表示elisa-pla結(jié)果。

圖6elisa-pla檢測磷酸化蛋白(a),蛋白質(zhì)印跡檢測磷酸化蛋白(b)。

圖7elisa和elisa-pla檢測o-glcnac修飾蛋白(a),免疫蛋白沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)印跡檢測o-glcnac修飾蛋白(b)。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)例是對(duì)本發(fā)明提出的利用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)結(jié)合鄰位連接技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)及其后修飾實(shí)現(xiàn)快速靈敏特異定量的新方法的進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1合成鄰位連接探針的活性的考察

鄰位連接探針合成如圖2所示：各取溶于10μl磷酸鹽緩沖液(ph7.4)20ug兔二抗和20ug鼠二抗，分別加入0.5μl8mmsulfo-smcc,室溫反應(yīng)2小時(shí)；使用截留為3k道爾頓的超濾管超濾四次，除去過量的sulfo-smcc；在超濾的鼠二抗中加入4μl的100um巰基修飾引物核酸序列，在超濾的兔二抗中加入4μl的100μm巰基修飾非引物核酸序列，室溫反應(yīng)2小時(shí)后，置于-20攝氏度保存。

1)考察鼠鄰位連接探針合成后鼠二抗的活性

取濃度為1ng/μl的鼠一抗50μl包被在96孔板中，封閉后分別按照鼠鄰位連接探針比辣根過氧化酶標(biāo)記鼠二抗比例為1,10,50的比例加入96孔板室溫結(jié)合1小時(shí)，洗滌三次后進(jìn)行顯色，結(jié)果如圖3(a)所示,鼠二抗與核酸反應(yīng)后依然保持活性；

2)考察兔鄰位連接探針合成后鼠二抗的活性

將兔一抗包被后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3(b)所示,鼠二抗與核酸反應(yīng)后依然保持活性；

3)考察鼠二抗與巰基修飾的核酸序列連接效果

將鼠鄰位連接探針取0.5μl吸附到pvdf膜，封閉后，延伸序列和連接核酸序列溶于t4dna核酸連接酶緩沖液中，終濃度為100nm。在膜上加入200μl該溶液37攝氏度孵育40分鐘后，每孔加入0.9μlt4dna核酸連接酶后37攝氏度孵育1小時(shí)，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌一次五分鐘。在膜上加入200μl滾環(huán)擴(kuò)增溶液(50mm三異丙基乙磺酰-鹽酸,10mm氯化鎂,10mm硫酸銨,0.16mm脫氧核糖核苷三磷酸,0.25mg/ml牛血清白蛋白,0.05％吐溫20,0.3μlph29dna核酸聚合酶，ph7.5)37攝氏度孵育1.5小時(shí)使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌一次五分鐘。每孔加入50μl的100nm辣根過氧化酶標(biāo)記核酸檢測探針溶液37攝氏度孵育30分鐘后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，顯色，結(jié)果如圖4所示，鼠二抗與巰基修飾的核酸序列連接成功；

4)考察兔二抗與巰基修飾的核酸序列連接效果

鼠鄰位連接探針取0.5μl吸附到pvdf膜后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，兔二抗與巰基修飾的核酸序列連接成功。

實(shí)施例2

對(duì)比elisa和elisa-pla檢測綠色熒光蛋白(gfp)在不同樣品摻雜中的效果

1)綠色熒光蛋白在血清中的摻雜

elisa實(shí)驗(yàn)步驟：50ng鼠抗gfp抗體在50μl的ph9.6的碳酸鹽包被液37攝氏度2小時(shí)后，加入1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白37攝氏度1小時(shí)。添加待檢測溶液50μl，37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。50ng兔抗gfp抗體在50μl的1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白中4攝氏度12小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。加入50μl的1:5000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的兔二抗37攝氏度1小時(shí)，洗滌三次后顯色，結(jié)果如圖5(a)所示；

elisa-pla實(shí)驗(yàn)步驟：50ng鼠抗gfp捕獲抗體在50ul的ph9.6的碳酸鹽包被液37攝氏度2小時(shí)后，加入1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白37攝氏度1小時(shí)。添加待檢測溶液50μl，37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。50ng兔抗gfp檢測抗體在50μl的1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白中4攝氏度12小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。兩種鄰位連接探針(兔二抗結(jié)合非引物核酸序列，鼠二抗結(jié)合引物核酸序列)1ng/μl溶于1％牛血清白蛋白溶液37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。延伸序列和連接核酸序列溶于t4dna核酸連接酶緩沖液中，終濃度為100nm。在96孔板每孔加入50μl該溶液37攝氏度孵育40分鐘后，每孔加入0.3μlt4dna核酸連接酶后37攝氏度孵育1小時(shí)，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌一次五分鐘。每孔加入50μl滾環(huán)擴(kuò)增溶液(50mm三異丙基乙磺酰-鹽酸,10mm氯化鎂,10mm硫酸銨,0.16mm脫氧核糖核苷三磷酸,0.25mg/ml牛血清白蛋白,0.05％吐溫20,0.3μlph29dna核酸聚合酶，ph7.5)37攝氏度孵育1.5小時(shí)使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌一次五分鐘。每孔加入50μl的100nm辣根過氧化酶標(biāo)記核酸檢測探針溶液37攝氏度孵育30分鐘后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。使用酶標(biāo)儀檢測光密度信號(hào)。如圖5(a)所示，elisa-pla比elisa的檢測限低兩個(gè)數(shù)量級(jí)；

2)綠色熒光蛋白在細(xì)胞提取物中的摻雜

重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果圖5(b)所示；

3)綠色熒光蛋白在組織提取物中的摻雜

重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果圖5(c)所示。

實(shí)施例3使用elisa-pla來檢測磷酸化蛋白

1)位點(diǎn)特異性磷酸化抗體實(shí)驗(yàn)組

elisa-pla實(shí)驗(yàn)步驟：1：1000稀釋的鼠抗erk1/2捕獲抗體在50μl的ph9.6的碳酸鹽包被液37攝氏度2小時(shí)后，加入1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白37攝氏度1小時(shí)。1μl大鼠腦組織提取液稀釋至50μl，37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。取50μl的1：1000稀釋的兔抗磷酸化erk1/2抗體加入96孔板后，4攝氏度12小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。其他實(shí)驗(yàn)步驟同上elisa-pla，結(jié)果如圖6(a)所示，慢性痛大鼠的erk1/2的磷酸化水平要高于正常大鼠；

2)泛磷酸化抗體實(shí)驗(yàn)組

elisa-pla實(shí)驗(yàn)步驟：1：1000稀釋的鼠抗erk1/2捕獲抗體在50ul的ph9.6的碳酸鹽包被液37攝氏度2小時(shí)后，加入1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白37攝氏度1小時(shí)。1μl大鼠腦組織提取液稀釋至50μl，37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。取50μl的1：1000稀釋的兔抗磷酸化酪氨酸抗體加入96孔板后，4攝氏度12小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘；其他實(shí)驗(yàn)步驟同上elisa-pla，結(jié)果如圖6(a)所示，慢性痛大鼠的erk1/2的磷酸化水平要高于正常大鼠。使用泛磷酸化抗體可以取得與使用位點(diǎn)特異性磷酸化抗體相同的效果；

3)蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證elisa-pla結(jié)果，結(jié)果如圖6(b)所示，慢性痛大鼠的erk1/2的磷酸化水平要高于正常大鼠，此結(jié)果驗(yàn)證了elisa-pla技術(shù)的可靠性。

實(shí)施例4使用elisa-pla來檢o連接的n乙酰葡萄糖胺(o-glcnac)化蛋白

1)使用elisa-pla檢測o-glcnac化的akt蛋白

elisa-pla實(shí)驗(yàn)步驟：1：1000稀釋的兔抗akt捕獲抗體在50μl的ph9.6的碳酸鹽包被液37攝氏度2小時(shí)后，加入1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的牛血清白蛋白37攝氏度1小時(shí)。5μl大鼠腦組織提取液稀釋至50μl，37攝氏度孵育1小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。取50μl的1：1000稀釋的鼠抗o-glcnac化抗體ctd110.6加入96孔板后，4攝氏度12小時(shí)后，使用20mm磷酸緩沖溶液中(ph7.4)洗滌三次，每次五分鐘。其他實(shí)驗(yàn)步驟同上elisa-pla，結(jié)果如圖7(a)所示，elisa-pla結(jié)果表明腦缺血小鼠的akt的o-glcnac修飾水平要高于正常大鼠，而常規(guī)elisa方法的靈敏度不足以區(qū)分該差異；

2)使用蛋白免疫沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證elisa-pla結(jié)果

蛋白免疫沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)步驟：取200μl腦組織裂解液加入2ul的akt抗體4攝氏度緩慢搖晃孵育過夜。取50μl的proteing-beads加入到細(xì)胞裂解液4攝氏度緩慢搖晃孵育過夜。免疫沉淀反應(yīng)后，在4℃以3,000g速度離心5min,將proteing-beads離心至管底；將上清小心吸去，proteing-beads用1ml裂解緩沖液洗3次。最后加入15ul的2×sds加樣緩沖液，沸水煮10分鐘。使用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測上述蛋白免疫沉淀獲得的akt蛋白的o-glcnac化水平，結(jié)果如圖7(b)所示，常規(guī)方法蛋白免疫沉淀結(jié)合蛋白印跡表明腦缺血小鼠的akt的o-glcnac修飾水平要高于正常大鼠，驗(yàn)證了elisa-pla的可靠性，但是由于常規(guī)的蛋白免疫沉淀結(jié)合蛋白印跡技術(shù)靈敏度較低，需要使用更多的樣品，整個(gè)試驗(yàn)流程耗時(shí)更長。