本發(fā)明涉及一種用于確定感染和可能的相關(guān)病癥的生物傳感器、包括所述傳感器的診斷裝置、以及用于確定病毒感染和與所述感染相關(guān)的可能的瘤形成的存在和程度的方法。

背景技術(shù)：

宮頸癌代表了在全球范圍內(nèi)在女性中第二的惡性瘤形成（來源于WHO），每年估計有約500,000個新病例，覆蓋15和44歲之間的年齡范圍。僅在意大利，就報道了每年約3,400個新病例和超過1000例的死亡；預(yù)計在2030年之內(nèi)將增加20％。

引起宮頸癌的發(fā)生的最重要的發(fā)病原因是乳頭瘤病毒（HPV）。存在100多個HPV的血清型，但只有其中的一個子類被認為是高險（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、和82 ），以及另一子類被認為是可能危險（26、53、和66）（Munoz et al. New Eng. J. Med. 2003, 348, 518-527）。在HPV的這些血清型之間，16和18對約70％的宮頸癌負有責(zé)任。

估計超過70％的女性在其一生中會感染一種生殖道HPV感染，但得益于免疫系統(tǒng)的作用，這些感染的大多數(shù)在幾個月內(nèi)注定會自發(fā)消失。只有在高致癌風(fēng)險的HPV感染持續(xù)一段時間的情況下、少數(shù)情況下超過幾年，才可能發(fā)生惡性宮頸癌。

宮頸癌是一種進展緩慢的腫瘤。從HPV感染，到引起癌歷時10年到20年。描述這種過程中的主要步驟是：

1. 高危HPV血清型的初次感染

2. 持續(xù)感染

3. 非侵入性癌性病變的發(fā)生

4. 侵入性腫瘤的發(fā)生。

對HPV存在的報道很普遍，尤其是在年輕女性中。然而，許多感染被身體的免疫應(yīng)答解決。反過來，基于FIGO分類系統(tǒng)（International Federation of gynaecology and obstetrics），根據(jù)腫瘤在體內(nèi)已擴散的多少，宮頸腫瘤的步驟（4）可以分為四個階段（Doorbar, The official publication of the Pan American Society for Clinical Virology 2005, 32 Suppl 1, S7-15）。

? 階段I：腫瘤局限于宮頸；

? 階段II：腫瘤已到達子宮的后部，但尚未侵入骨盆或陰道的下部；

? 階段III：腫瘤已侵入陰道的下部、骨盆或腎，危害它們的功能；

? 階段IV：腫瘤已侵入鄰近器官（膀胱或直腸），并還可能已引起更遠的器官中的轉(zhuǎn)移。

用于檢測宮頸癌的主要試驗是巴氏試驗（Pap試驗），即一種細胞學(xué)檢查，其基于來自頸部和子宮頸的細胞中可能的變化的視覺研究（在顯微鏡下），以確定正在進行的瘤形成的存在。巴氏試驗自其在五十年代的發(fā)明后已基本保持不變，它有幾個缺點：它提供了病例中20％-25％的假陰性，它需要額外的驗證試驗，且對溫和實體的癌前病變是無效的（Franceschi, S. Epidemiologia&Prevenzione 2012, 142-144）。傳統(tǒng)的巴氏試驗是不準(zhǔn)確的，它僅限于可能的正在進行的瘤形成，即它不檢測是瘤形成的觸發(fā)因素的HPV感染，三分之一的婦女認為其是痛苦的。為了進行傳統(tǒng)的巴氏試驗，需要足夠的機構(gòu)和高素質(zhì)人才。由于文化或宗教原因，很多女性不進行婦科檢查。更靈敏和準(zhǔn)確的診斷試驗、以及在家中實施的可能性，將明顯有助于防止很多與HPV相關(guān)的腫瘤病例（主要是致命的后果）。

迄今已知的HPV感染的診斷試驗通過病毒DNA定量來檢測它的存在，這些試驗需要高度專業(yè)化的醫(yī)務(wù)工作者的介入，因為它們在來自子宮頸的細胞上進行，這些細胞必須由醫(yī)務(wù)人員在門診病人或醫(yī)院環(huán)境中采樣，并隨后在專門的實驗室中處理，用于通過分子生物學(xué)技術(shù)進行病毒DNA的分析。目前醫(yī)院處方費中，進行HPV DNA試驗的費用（30-40歐元）超過巴氏試驗的兩倍（10-20歐元）；對于兩種試驗，實施費用為每進行一次試驗50歐元起。

本發(fā)明的一個任務(wù)是提供一種方法，該方法用于確定由致病因子引起的感染（例如由HPV引起感染）的存在、其進展程度、以及與所述感染相關(guān)的病癥（例如與HPV相關(guān)的瘤形成）的可能存在，該方法無創(chuàng)、無痛、精準(zhǔn)、快速、不昂貴、易在家庭環(huán)境中使用、并適于在公共/私人醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)使用。

在該任務(wù)內(nèi)，本發(fā)明的一個目的是提供一種傳感器，其能夠檢測對象中可能的由HPV引起的感染的存在和進展階段和/或與HPV病毒相關(guān)的瘤形成的存在。

發(fā)明概述

該目的以及將在下文中強調(diào)的其他目的通過一種生物傳感器而實現(xiàn)，所述生物傳感器用于確定致病因子（pathogenic agent）、或源于由所述致病因子引起的感染的病癥（pathology）的存在，其中所述生物傳感器包括轉(zhuǎn)換器，所述轉(zhuǎn)換器包括具有陽極表面（a）、陰極表面（c）和確保在所述表面之間的電絕緣的材料的層的微電極，其中表面（a）和表面（c）由導(dǎo)體材料制成并且部分地或完全地涂覆有碳納米管和/或金屬納米顆粒，其中致病因子的至少有一種抗原、或源自由所述致病因子引起的感染的病癥的特異性抗體的抗原被共價地結(jié)合至所述碳納米管和/或金屬納米顆粒。

根據(jù)本發(fā)明，這些目的進一步通過包括至少一個如上所述的生物傳感器的診斷裝置而實現(xiàn)，所述生物傳感器用于確定致病因子的存在和由所述致病因子引起的感染或源自所述感染的瘤形成（neoplasias）的進展的狀態(tài)。

這些目的進一步通過一種診斷方法而實現(xiàn)，所述診斷方法用于確定對象中致病因子的存在和由所述致病因子引起的感染和/或與所述感染相關(guān)的疾病的進展的狀態(tài)，所述方法包括以下步驟：

i. 使用鹽水或蛋白質(zhì)緩沖液稀釋從對象提取的生物樣品；

ii. 將來自步驟i的稀釋溶液的等分試樣放置在包括至少一個如上所述的傳感器的診斷裝置中；

iii. 通過讀取器確定樣品中針對致病因子的抗體或與所述感染相關(guān)的病癥的標(biāo)記物抗體的存在和濃度，所述讀取器分析在電感、電流、電勢方面的電信號變化（在電導(dǎo)生物傳感器、電流生物傳感器、伏安生物傳感器的情況中）、或特定波長的光的存在（在基于熒光/化學(xué)發(fā)光的光學(xué)生物傳感器的情況中）或光散射和/或折射/衍射現(xiàn)象（在等離子光學(xué)生物傳感器的情況中），其中含有來自步驟ii的稀釋溶液的傳感器被置于被包含在所述讀取器中的殼體中，并且在生物傳感器中的輸入信號和輸出信號之間的上述變化在被包含在讀取器中的電路中被檢測，其中所述變化是存在于樣品中的抗體的存在和數(shù)量的函數(shù)，所述抗體結(jié)合至存在于傳感器表面上的納米管和/或金屬納米粒子上的抗原；

iv. 由技術(shù)人員通過被連接至步驟iii的讀取器的圖形界面獲得分析的結(jié)果。

附圖說明

圖1：根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的電極的示意圖。

圖2：本發(fā)明的傳感器的檢測系統(tǒng)的運作的示意圖。

發(fā)明詳述

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，生物傳感器是指包括生物活性的響應(yīng)元件和導(dǎo)電部件的裝置，其中該生物元件與將被分析的底物相互作用，而傳導(dǎo)系統(tǒng)（傳感器）將生物化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)換成電信號。

該轉(zhuǎn)換器可以是電位轉(zhuǎn)換器、電導(dǎo)轉(zhuǎn)換器、電容轉(zhuǎn)換器、電流轉(zhuǎn)換器、伏安轉(zhuǎn)換器、光學(xué)轉(zhuǎn)換器、基于等離子表面的光學(xué)轉(zhuǎn)換器和基于熒光的、基于化學(xué)發(fā)光的、或基于電化學(xué)發(fā)光的光學(xué)轉(zhuǎn)換器。

在本發(fā)明的生物傳感器的具體情況中，所述生物活性的元件是一種經(jīng)由共價鍵結(jié)合至一個或多個碳納米管和/或金屬納米顆粒（優(yōu)選由金銀制成）的表面的抗原，其存在于微電極表面的一部分上。所述抗原對于由對象的身體產(chǎn)生的抗體是特異的，例如響應(yīng)于HPV感染或與這種感染相關(guān)的瘤形成。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“抗原”是指能夠被對象的免疫系統(tǒng)的抗體識別的物質(zhì)。特別地，在本發(fā)明的生物傳感器和診斷方法中所使用的抗原是由特異性抗體識別的肽、天然蛋白質(zhì)、片段及其表位、或包含至少一個這種表位的重組蛋白，其優(yōu)選是對于被認為高危（即屬于被認為高危的子類（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82））的HPV病毒的那些血清型特異的，更優(yōu)選（但不排除其他）是對于亞型16和18特異的。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，“表位”是指是指被抗體（例如由VH / VL免疫球蛋白對）常規(guī)地結(jié)合的結(jié)構(gòu)的單元。表位定義了抗體的最小結(jié)合位點，并因此代表抗體的特異性靶標(biāo)。在單個可變的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的情況中，表位代表被孤立的單個可變的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)構(gòu)的單元，即結(jié)合位點是由單個可變的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域提供的。

在一個實施例中，本發(fā)明涉及一種生物傳感器，所述傳感器用于確定致病因子、或源于所述因子引起的感染的病癥的存在，其中所述生物傳感器包括轉(zhuǎn)換器，所述轉(zhuǎn)換器包括具有陽極表面（a）、陰極表面（c）和確保在所述表面之間的電絕緣的材料層的微電極，其中表面（a）和表面（c）由導(dǎo)體材料制成并且部分地或完全地涂覆有碳納米管和/或金屬納米顆粒，致病因子的至少一種抗原、或源自由所述致病因子引起的感染的病癥的特異性抗體的抗原被共價地結(jié)合至所述碳納米管和/或金屬納米顆粒。

所述致病因子可以是病毒、細菌、真菌類或原生動物。優(yōu)選地，所述致病因子是病毒。

能夠通過本發(fā)明的傳感器檢測的病毒病原體包括（以非限制性的方式）以下：腺相關(guān)的病毒（adeno-associated virus）；愛知病毒（Aichi virus）；澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒（Australian bat lyssavirus）； BK多瘤病毒（BK polyomavirus）；版納病毒（Banna virus）； 巴馬森林病毒（Barmah forest virus）；布尼奧羅病毒病毒（Bunyamwera virus）；布尼亞病毒拉克羅斯（Bunyavirus La Crosse）；布尼亞病毒雪兔（Bunyavirus snowshoe hare）；彌猴皰疹病毒（Cercopithecine herpesvirus）；金迪普拉病毒（Chandipura virus）；基孔肯雅熱（Chikungunya）；牛痘病毒（cowpox virus）；柯薩奇病毒（Coxsackievirus）；克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo haemorrhagic fever virus）；登革熱病毒（Dengue virus）；多理病毒（Dhori virus）； 道格比病毒（Dugbe virus）；杜溫哈格病毒（Duvenhage virus）；東部馬腦炎病毒（Eastern equine encephalitis virus）；埃博拉病毒（Ebola virus）；埃可病毒（Echo virus）；腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus）；EB病毒（Epstein-Barr virus）；歐洲蝙蝠狂犬病病毒（European bat lyssavirus）；庚型肝炎（GB virus C）；漢坦病毒（Hantaan virus）；亨德拉病毒（Hendra virus ）；甲型肝炎病毒（hepatitis A virus）；乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）；丙型肝炎病毒（hepatitis C virus）；戊型肝炎病毒（hepatitis E virus）；丁型肝炎病毒（hepatitis delta virus）；馬痘病毒（equine poxvirus）；人類腺病毒（human adenovirus）；人星狀病毒（human astrovirus）；人類冠狀病毒（human coronavirus）；人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus）；人類腸道68、70（human enterovirus 68, 70）；人類皰疹病毒1（human herpesvirus 1）；人類皰疹病毒2（human herpesvirus 2）；人類皰疹病毒6（human herpesvirus 6）；人類皰疹病毒7（human herpesvirus 7）；人類皰疹病毒8（human herpesvirus 8）；人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus）；高或低風(fēng)險的人乳頭狀瘤病毒（high- or low-risk human papillomavirus）；人副流感（human parainfluenza）；人類細小病毒B19（human parvovirus B19）；人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus）；人類鼻病毒（human rhinovirus）；人類SARS冠狀病毒（human SARS coronavirus）；人類spumaretrovirus（human spumaretrovirus）；人類T-淋巴細胞病毒（human T-lymphotrophyc virus）；人類torovirus（human torovirus）；甲型流感病毒（influenza A virus）； 乙型流感病毒（influenza B virus）；丙型流感病毒（influenza C virus）；伊斯法罕病毒（Isfahan virus）； JC多瘤病毒（JC poliomavirus）；日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）；胡寧沙粒病毒（Junin arenavirus）；I多瘤病毒（I Poliomavirus）；庫京病毒（Kunjin virus）；拉各斯蝙蝠病毒（Lagos bat virus）；維多利亞湖馬爾堡病毒（Lake Victoria Marburgvirus）；蘭加特病毒(Langat virus)；拉沙病毒（Lassa virus）； Lordsdale病毒（Lordsdale virus）；跳躍病病毒（Louping ill virus）；淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus）；馬丘波病毒病毒（Machupo virus）；馬亞羅病毒（Mayaro virus）； MERS冠狀病毒（MERS coronavirus）；麻疹病毒（measles virus）；腦心肌炎門戈病毒（encephalomyocarditis mengovirus）；梅克爾細胞多瘤病毒（Merkel cell polyomavirus）；莫科拉病毒（Mokola virus0；傳染性軟疣病毒（Molluscum contagiosum virus）；猴痘病毒（monkeypox virus）；腮腺炎病毒（parotitis virus）；墨累河谷腦炎病毒（Murray valley encephalitis virus）；紐約病毒（New York virus）；尼帕病毒（Nipah virus）；諾瓦克病毒（Norwalk virus）；奧-奈氏病毒（O'nyong-nyong virus）；羊痘病毒（Orf virus）；奧羅普切病毒（Oropouche virus）；皮秦德病毒（Pichinde virus）；脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）；蓬托羅白蛉病毒（Punta toro phlebo virus）；普馬拉病毒（Puumala virus）；狂犬病毒（rabies virus）；裂谷熱病毒（Rift valley fever virus）；羅斯河病毒（Ross river virus）；輪狀病毒A（Rotavirus A）；輪狀病毒B（Rotavirus B）：輪狀病毒C（Rotavirus C）；風(fēng)疹病毒（Rubella virus）；山病毒（Sagiyama virus）；白蛉熱西西里病毒（Sandfly fever Sicilian virus）；札幌病毒（Sapporo virus）；森林腦炎病毒（Semliki forest virus）；漢城病毒（Seoul virus）；猴泡沫病毒（Simian foamy virus）；猴病毒5（Simian virus 5）；辛德畢斯病毒（Sindbis virus）；南安普頓病毒（Southampton virus）；圣路易斯腦炎病毒（St. Louis encephalitis virus）；玻瓦散腦膜腦炎病毒（powassan meningoencephalitis virus）；扭矩特諾病毒（Torque teno virus）；托斯卡納病毒（Toscana virus）；尤庫尼米病毒病毒（Uukuniemi virus）；牛痘病毒（Vaccinia virus）；水痘帶狀皰疹病毒（Varicella-zoster virus）；天花病毒（Variola virus）；委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus）；水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus）；西部馬腦炎病毒（Western equine encephalitis virus）；WU多瘤病毒（WU polyomavirus）；西尼羅河病毒（West Nile virus）；雅巴猴腫瘤病毒（Yaba monkey tumour virus）；雅巴樣疾病病毒（Yaba-like disease virus）；黃熱病病毒（yellow fever virus）。

能夠通過本發(fā)明的傳感器檢測的人類致病細菌因子包括（以非限制性的方式）以下：橙弗拉托菌黃（Acetobacter aurantius）；鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）；衣氏放線菌（Actinomyces israelii）；放射形土壤桿菌（Agrobacterium radiobacter）；根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）；無形體屬（Anaplasma）；無形體吞噬細胞（Anaplasma phagocytophilum ）；固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）；棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）；炭疽桿菌（Bacillus anthracis）；芽孢桿菌（Bacillus），短芽孢桿菌（Bacillus brevis）；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；梭形芽孢桿菌（Bacillus fusiformis）；地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）；芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；擬桿菌（Bacteroides）；脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）；牙齦類桿菌（Bacteroides gingivalis）；產(chǎn)黑色素（Bacteroides melaninogenicus）；巴爾通氏體（Bartonella）；亨氏巴爾通氏體（Bartonella henselae）；五日熱巴爾通體（Bartonella quintana）；博代氏桿菌屬（Bordetella）；支氣管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）；百日咳桿菌（Bordetella pertussis）；萊姆病螺旋體（Borrelia burgdorferi）；布魯氏菌（Brucella）；牛布魯氏菌（Brucella abortus）；羊布魯氏菌（Brucella melitensis）；豬布魯氏菌（Brucella suis）；伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）；鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei）；類鼻疽霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei）；洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）；肉芽腫莢膜桿菌（Calymmatobacterium granulomatis）；彎曲桿菌（Campylobacter）；大腸彎曲桿菌（Campylobacter coli）；胎兒彎曲桿菌（Campylobacter fetus）；空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）；幽門彎曲菌（Campylobacter pylori）；衣原體（Chlamydia）；沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis），衣原體（Chlamydophila）；肺炎衣原體（Chlamydophila pneumoniae）；鸚鵡熱衣原體（Chlamydophila psittaci）；梭菌（Clostridium）；肉毒桿菌（Clostridium botulinum）；艱難梭菌（Clostridium difficile）；產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）；破傷風(fēng)桿菌（Clostridium tetani）；棒狀桿菌（Corynebacterium）；白喉棒狀桿菌（Corynebacterium diphtheriae）；羊棲菜棒狀桿菌（Corynebacterium fusiforme）；貝氏柯克斯體（Coxiella burnetii）；查菲埃立克體（Ehrlichia chaffeensis）；陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）；腸球菌（Enterococcus）；腸球菌桿菌（Enterococcus avium）；耐久腸球菌（Enterococcus durans）；糞腸球菌（Enterococcus faecalis）；屎腸球菌（Enterococcus faecium）；鶉雞腸球菌（Enterococcus galllinarum）；惡臭腸球菌（Enterococcus maloratus）；大腸桿菌（Escherichia coli）；土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）；核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum）；陰道加德納菌（Gardnerella vaginalis）；嗜血（Haemophilus）；杜克雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi）；嗜血桿菌流感（Haemophilus influenzae）；副流感嗜血桿菌（Haemophilus parainfluenzae）；百日咳嗜血桿菌（Haemophilus pertussis）；陰道嗜血桿菌（Haemophilus vaginalis）；幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）；肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）；乳酸桿菌（Lactobacillus）；嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）；乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）；嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila）；李斯特菌（Listeria monocytogenes）；甲烷細菌extroquens（Methanobacterium extroquens）；多形微桿菌（Microbacterium multiforme）；藤黃微球菌（Micrococcus luteus）；卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）；結(jié)核分枝（Mycobacterium）；鳥分枝桿菌（Mycobacterium avium）；牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）；白喉桿菌（Mycobacterium diphtheriae）；細胞內(nèi)分枝桿菌（Mycobacterium intracellular）；麻風(fēng)分枝桿菌（Mycobacterium leprae）；鼠麻風(fēng)分枝桿菌（Mycobacterium lepraemurium）；草分枝桿菌（Mycobacterium phlei），恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）；結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）；支原體（Mycoplasma）；發(fā)酵支原體（Mycoplasma fermentans）；生殖支原體（Mycoplasma genitalium）；人型支原體（Mycoplasma hominis）；穿通支原體（Mycoplasma penetrans）；肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）；奈瑟氏菌（Neisseria）；淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）；腦膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）；巴氏桿菌（Pasteurella）；多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）；土拉弗朗西斯菌巴氏桿菌（Pasteurella tularensis）；消化鏈球菌（Peptostreptococcus）；牙齦卟啉單（Porphyromonas gingivalis）；產(chǎn)黑色普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）；綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）；放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）；立克次氏體（Rickettsia）；普氏立克次氏體（Rickettsia prowazekii）；鸚鵡熱立克次氏體（Rickettsia psittaci）；五日熱立克次氏體（Rickettsia quintana）；立氏立克次氏體（Rickettsia rickettsii）；沙眼立克次氏體（Rickettsia trachomae）；羅卡利馬氏體（Rochalimaea）；亨氏羅卡利馬氏體菌（Rochalimaea henselae）；五日熱羅卡利馬氏體菌（Rochalimaea quintana）；齲齒羅菌（Rothia dentocariosa）；沙門氏菌（Salmonella）；腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）；傷寒桿菌（Salmonella typhi）；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）；粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）；痢疾桿菌（Shigella dysenteriae）；葡萄球菌（Staphylococcus）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）；嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）；鏈球菌（Streptococcus）；無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）；鏈球菌桿菌（Streptococcus avium）；牛鏈球菌（Streptococcus bovis）；倉鼠鏈球菌（Streptococcus cricetus）；糞鏈球菌（Streptococcus faecium）；糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）；野鼠鏈球菌（Streptococcus ferus）；鶉雞鏈球菌（Streptococcus gallinarum）；乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）；輕型鏈球菌（Streptococcus mitior）；緩癥鏈球菌（Streptococcus mitis）；變形鏈球菌（Streptococcus mutans）；口腔鏈球菌（Streptococcus oralis）；肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）；化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）；鏈球菌家鼠（Streptococcus rattus）；唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius）；血鏈球菌（Streptococcus sanguis）；茸毛鏈球菌（Streptococcus sobrinus）；螺旋體（Treponema）；梅毒螺旋體（Treponema pallidum）；齒垢密螺旋體（Treponema denticola）；弧菌（Vibrio）；霍亂弧菌（Vibrio cholerae）；逗號弧菌（Vibrio comma）；副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）；沃爾巴克氏體（Wolbachia）；耶爾森氏菌（Yersinia）；小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）；鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）；假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）。

能夠通過本發(fā)明的傳感器檢測的人類致病真菌因子包括（以非限制性的方式）以下：犁頭霉屬（Absidia）；支頂孢屬（Acremonium）；曲霉屬真菌（Aspergillus）；煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）；蛙生蛙糞霉（Basidiobolus ranarum）；白僵菌屬（Beauveria）；平臍蠕孢屬（Bipolaris）；離蠕孢屬（Bipolaris）；皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis）；白色念珠菌（Candida albicans）；枝孢屬（Cladosporium）；球孢子（Coccidioides）；粗球孢子菌（Coccidioides immitis）；冠耳霉（Conidiobolus coronatus）；隱球菌（Cryptococcus）；新型隱球菌（Cryptococcusneoformans）；彎孢屬（Curvularia）；彎孢霉（Curvularia）；外瓶霉屬（Exophiala）；外瓶霉（Exophiala）；外瓶微屬（Exophiala）；威尼克外瓶霉（Exophiala werneckii）；突臍蠕孢屬（Exserohilum）；明臍霉（Exserohilum）；裴氏著色瓶霉（Fonsecaea phialophora）；鐮刀菌（Fusarium）；莢膜組織胞漿菌（Histoplasma capsulatum）；組織胞漿菌屬（Hystoplasma）；羅伯菌（Loboa loboi）；馬杜拉分支菌屬（Madurella）；毛霉屬（Mucor）；根毛霉毛霉菌（Mucor Rhizomucor）；擬青霉菌（Paecilomyces）；巴西副球孢子菌（Paracoccidioides brasiliensis）；青霉菌（Penicillium）；毛干結(jié)節(jié)菌（Piedraia hortae）；肺孢子蟲（Pneumocystis）；假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）；波氏假性阿利什霉（Pseudallescheria boydii）；鼻孢子菌（Rhinosporidium seeberi）；根毛霉（Rhizomucor）；根霉屬（Rhizopus）；根霉菌（Rhizopus）；瓶霉屬（Saksenaea）；帚霉屬（Scopulariopsis）；申克孢子絲（Sporothrix schenckii）；葡萄穗霉屬（Stachybotrys）；白吉利毛孢子菌（Trichosporon beigelii）；黑酵母外瓶（Wangiella）。

能夠通過本發(fā)明的傳感器檢測的人類致病原生動物包括（以非限制性的方式）以下：巴貝西蟲（Babesia）；雙芽巴貝蟲（Babesia bigemina）；分歧焦蟲（Babesia divergens）；鄧肯巴貝西蟲（Babesia duncani）；馬巴貝西蟲（Babesia equi）；巴貝西原蟲（Babesia microfti）；狒狒巴拉姆希阿米巴（Balamuthia mandrillaris）；結(jié)腸小袋纖毛蟲（Balantidium coli）；芽囊原蟲屬（Blastocystis）；螺旋蠅（Cochliomyia hominivorax）；隱孢子蟲（Cryptosporidium）；毛囊蠕形螨（Demodex folliculorum）；脆弱雙核阿米巴（Dientamoeba fragilis）；痢疾阿米巴（Entamoeba histolytica）；賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia）；貝氏等孢球蟲（Isospora belli）；利什曼原蟲（Leishmania）；福氏納格里阿米巴原蟲（Naegleria fowleri）；頭虱（Pediculus humanus）； 人體虱（Pediculus humanus corporis）；惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）；諾氏瘧原蟲（Plasmodium knowlesi）；瘧原蟲（Plasmodium malariae）；卵形瘧原蟲（Plasmodium ovale）；間日瘧原蟲（Plasmodium vivax）；恥陰虱（Pthirus pubis）；狀溞點病（Pulex irritans）；鼻孢子菌（Rhinosporidium seeberi）；牛人肉孢子蟲（Sarcocystis bovihominis）；豬人肉孢子蟲（Sarcocystis suihominis）；疥螨（Sarcoptes scabiei）；弓形蟲（Toxoplasma gondii）；陰道毛滴蟲（Trichomonas vaginalis）；布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）；克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）。

在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明涉及一種生物傳感器，該生物傳感器用于確定HPV病毒（人類乳頭狀瘤病毒）的存在以及HPV病毒感染或源于所述感染的瘤形成的進展的狀態(tài)，其中所述生物傳感器包括轉(zhuǎn)換器，所述轉(zhuǎn)換器傳感器包括具有陽極表面（a）、陰極表面（c）和確保在所述表面之間的電絕緣的材料的層的微電極，其中表面（a）和表面（c）由導(dǎo)體材料制成并且部分地或完全地涂覆有碳納米管和/或金屬納米顆粒，HPV病毒的至少一種抗原、或由HPV病毒引起的瘤形成的特異性抗體的抗原、或HPV病毒的抗原的混合物或由HPV病毒引起的瘤形成的特異性抗體的抗原的混合物被共價地結(jié)合至所述碳納米管和/或金屬納米顆粒。

優(yōu)選地，所述生物傳感器是電容傳感器、電位傳感器、電導(dǎo)傳感器、電流傳感器、伏安傳感器、光學(xué)型傳感器、基于等離子表面的光學(xué)型傳感器、基于熒光/化學(xué)發(fā)光或基于電化學(xué)發(fā)光的光學(xué)型傳感器。

優(yōu)選地，所述金屬納米顆粒包括金或銀或由金或銀組成。

人們發(fā)現(xiàn)，利用共價結(jié)合至碳納米管的抗原提供了識別和量化HPV病毒的存在的特別有效的方法，該方法是通過分析厚生物流體而進行的，所述流體例如是粘液、尿、血液、血漿、唾液、汗、糞便提取物、組織活檢切片、皮脂腺分泌物、細胞液相和組織提取物。對于HPV檢測，特別有利的是能夠?qū)﹃幍勒骋哼M行分析，所述陰道粘液即使沒有醫(yī)務(wù)人員的介入也能夠進行采樣。由于陰道粘液的粘度和其高的比密度，目前可行的試驗不能用于陰道粘液的樣品。然而，本發(fā)明的生物傳感器允許陰道粘液的直接分析，所述陰道粘液可以由需要分析的同一個人在沒有醫(yī)務(wù)人員的特別干預(yù)下取得。此特征有利地允許“自己動手”的方法來進行測試，這可以提高了早熟階段中HPV分析的擴散，并提高由HPV引起的腫瘤的預(yù)防。

現(xiàn)有技術(shù)的生物傳感器使用底物的表面上的固定化的抗體來識別存在于生物流體中的抗原。這些系統(tǒng)顯示出幾個缺點，因為在體外產(chǎn)生的抗體很脆弱，必須始終保持在低于10℃的溫度以防止它們降解，從而損失測試的靈敏度。此外，體外產(chǎn)生的抗體更加昂貴。最終，在基線時，甚至可能不存在抗原，而抗體甚至可在感染幾年后發(fā)現(xiàn)。

另外，大分子可以顯示與支撐材料的兼容性問題，這可引起抗體從傳感器表面的分離，從而顯著降低方法的靈敏度。

抗HPV抗體的血清學(xué)鑒定尚未被常規(guī)地用于臨床診斷，這是因為由于該檢測技術(shù)的固有的特異性和靈敏度限制，其分析精確度被認為是有限的。因此，所有市售的HPV檢測被設(shè)計來檢測臨床樣品中的HPV核酸。即使許多用于HPV核酸檢測的內(nèi)部方法已在世界各地的研究實驗室中開發(fā)成功超過二十年，但是大多數(shù)這些方法都被FDA批準(zhǔn)用于臨床使用。目前可用的用于α-HPV的多重檢測的商用試驗被分為以下幾類：1）基于DNA的篩選試驗，2）基于DNA篩選的高危HPV分析，其被FDA批準(zhǔn)，使用HPV 16和HPV18的伴隨型（concomitant）或反射型（reflex）基因分型，3）基于DNA的HPV的基因分型檢測，其被FDA批準(zhǔn)，4）基于E6/E7 mRNA的高危HPV的篩選試驗，其被FDA批準(zhǔn)，以及5）原位雜交（Abreu, A.L. et al. Virology journal 2012, 9, 262.；Yang, C.Z.H. CAP today 2012, 26(1), 40）。

本發(fā)明的生物傳感器的運作的原則是通過存在于將要被分析的生物流體中的抗體來識別被共價地固定化在電極的表面上的抗原。即，它是與已知的傳感器相反的方法，在已知的傳感器中，被固定化的抗體識別存在于生物流體中的抗原。

發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的類型允許在檢測HPV病毒中獲得非常高的靈敏度、以及在時間上優(yōu)異的穩(wěn)定性和對溫度變化的抵抗。根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可在室溫（20-30℃）下保存數(shù)月而不損失靈敏度。

在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，電極的陰極（c）表面和陽極（a）表面相互獨立，它們可由以下材料制成或包括以下材料：金、鉑、銀、銅、鈀、材料、各種固體形式的碳和化合物粉末（例如氯化銀、石墨烯薄片、石墨、單壁的、雙壁的和多壁的納米管）。

優(yōu)選地，電極（a）或（c）的至少一個的表面由碳材料（如薄層石墨墨液）組成（Rao, V.K. et al. World J Microbiol Biotechnol 2006, 22, 1135-1143）。

優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，表面（a）和表面（c）包含含有碳納米管的碳材料或含有碳材料和金屬離子（Au、Ag、Pt、Pd）的組合物。

根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可具有本領(lǐng)域的專家已知的設(shè)置的一種，例如，平坦平面的、針狀的、微陣列式或玻璃電極。

優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，表面（a）和（c）包含多個針狀的微突起，所述微突起部分地或完全地涂布有碳納米管，所述碳納米管共價地衍生有HPV病毒的抗原的混合物（圖1）。此設(shè)置允許最大化與生物流體接觸的傳感器表面。這一特征使得測試的靈敏度非常高，這除了提高其可靠性和精確度之外，還允許達到特別低的生產(chǎn)成本。然后，與當(dāng)前可用的系統(tǒng)相比，對于最終用戶而言該分析裝置的成本要低得多。

根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的電極被稱為渠化電極（canalization electrode），是屬于微系統(tǒng)技術(shù)（MST）類別的裝置。它由富含凹痕和突起的陽極和陰極兩個表面組成，其被確保兩個表面之間的電絕緣的材料的層隔開。陰極和陽極之間的電流通路僅通過在被稱為“spicules”的針狀結(jié)構(gòu)之間被沉積和渠化的生物材料而發(fā)生。這種表面的針狀/刺狀的性質(zhì)允??許與生物材料接觸的區(qū)域的更大延伸。然后電極的極的幾何形狀是三維的，這進一步允許樣品的更好的滲透，確保表面和分析物之間的接觸，該分析物也在被放置在極之間的生物材料的內(nèi)部。這些特點使所述裝置具有增加在具有較好粘度的生物樣品里面的分析物和針狀結(jié)構(gòu)之間的接觸的優(yōu)點；與平面結(jié)構(gòu)電極相比，在時間上，這種類型的電極也能夠也與那些具有將其沉積限制在平面表面上的擴散系數(shù)的分析物直接接觸。

在這種渠化電極中，確保電極的陰極（c）表面和陽極（a）表面之間的電絕緣的材料的層可由以下材料制成、或包括以下材料：陶瓷材料及其衍生物、塑料材料（例如聚合物）、樹脂及其衍生物、二氧化硅、氮化硅、硅氧烷及其衍生物、聚氯乙烯及其衍生物、聚丙烯及其衍生物。

碳納米管（CNT）在1991年被S. Iijima發(fā)現(xiàn)（Iijima, S. Nature 1991, 354, 56-58）。

CNT的管狀結(jié)構(gòu)、機械阻力、和電傳導(dǎo)和光吸收特性允許采用這種材料作為生產(chǎn)生物醫(yī)學(xué)裝置（例如傳感器、用于細胞生長和分子轉(zhuǎn)運的底物）的非常好的初始基礎(chǔ)?；瘜W(xué)傳感器和生物傳感器被用于檢測許多類別的分子，這些分子從空氣污染物到生物大分子（例如蛋白質(zhì)和DNA）。當(dāng)前的生物監(jiān)測技術(shù)是相當(dāng)?shù)赜羞x擇性和特異性的，但同時難以小型化?？紤]到納米管的特有結(jié)構(gòu)和導(dǎo)電特性，基于SWNT（單壁碳納米管，即，單壁的CNT）的生物傳感器適于小型化。事實上，在對小的生物分子和蛋白質(zhì)的存在的響應(yīng)中，它們顯示出電導(dǎo)上的顯著變化，因此，它們可被認為是用于生物傳感器構(gòu)造的多功能介質(zhì)。

最近，有人建議了利用單壁（SWNT）、雙壁（DWNT）和多壁（MWNT）碳納米管的技的生物傳感器。該技術(shù)允許制造具有更小的尺寸和更高的靈敏度的生物傳感器（Kong, J. et al. Science 2000, 287, 622-625）。

由納米管制成的化學(xué)傳感器可以被官能化或改性，以成為分子特異性的傳感器（EP 1247089；Qi, P. et al. Nano Letters 2003, 3, 347-351）。

碳納米管是生物分子化學(xué)和電化學(xué)和電子領(lǐng)域之間的接口。當(dāng)然，這是可能的是由于它們的原子組成僅基于碳，該特性允許它們結(jié)合到同樣基于碳的有機和生物分子。官能化碳納米管意味著通過三個主要過程使它與其他分子雜交：π-π相互作用、共價修飾和非共價官能化。碳納米管的衍生可以通過不同類型的化學(xué)反應(yīng)和能夠加入的不同性質(zhì)的基團而進行（Chen, J. et al. Science 1998, 282, 95-98； Malingappa Pandurangappa and GunigoUahalli Kempegowda Raghu（2011）. “Chemically Modified Carbon Nanotubes: Derivatization and Their Applications, Carbon Nanotubes Applications on Electron Devices” Prof. Jose Mauricio Marulanda (editors), ISBN: 978-953-307-496-2, InTech, DOI: 10.5772/16635；Yao, B.D. et al. Applied Physics Letters 2003, 82, 281-283）。

碳納米管官能化的三種主要方法是：（a）π-π、（b）共價修飾、（c）非共價官能化。

羧酸方法和其它合成策略，例如甲亞胺葉立德的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，允許在碳納米管的sp²碳表面上引入官能團。這些雜交提供了與起始材料相比的新的化學(xué)和物理性質(zhì)（D’Este, M. et al. European Journal of Organic Chemistry 2006, 2517-2522）。

非共價籠外（exohedral）方法

這種方法例如利用CNT壁和芘衍生物之間的相互作用。其他例子基于使卟啉-環(huán)糊精衍生物（TPPCD）和碳納米管結(jié)合，以獲得在水性環(huán)境中更高的溶解度（Dirk, M.G. et al. Chemistry - A European Journal 2006, 12, 3975-3983）。

內(nèi)嵌（endohedral）方法

它包括在單壁碳納米管（SWNT）的空腔中封裝不同類型的有機分子，從富勒烯至芳香多環(huán)結(jié)構(gòu)，以獲得通常被稱為“豆莢（peapods）”的超分子衍生物。封裝通過采用溶劑或蒸汽相或使用CO₂獲得（Loi, M.A., et al. Advanced Materials, 2010, 22, 1635-1639）。

在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，納米管衍生有抗原。衍生通過抗原的修飾進行，例如通過將半胱氨酸殘基加入至與馬來酰亞胺基共價結(jié)合的肽。這些基團已在先前被引入在碳納米管上。在抗原上進行的其他主要修飾在很大程度上取決于哪一種想要錨定至納米管表面。例如，如果人們期望在納米管的端部和側(cè)壁上存在高密度的各種含氧基團（主要是羧基），處理可通過高濃度的硫酸和硝酸溶液進行，它允許通過制造酰胺或酯鍵來與分子共價結(jié)合（Chen, J. et al. Science 1998, 282, 95-98）。在某些情況中，需要氧化預(yù)處理來在納米管表面上引入負電荷，以促進電化學(xué)測量期間的電子轉(zhuǎn)移。在其他情況中，進行通過有機釩絡(luò)合物的處理，以在催化反應(yīng)中應(yīng)用，或通過甲基丙烯酸酯的聚合（Yao, B.D. et al Applied Physics Letters 2003, 82, 281-283）。

還可能的是，直接干預(yù)肽，例如，可以在C末端和N末端添加兩個賴氨酸殘基，以提高合成肽DlpepLys的溶解性，也提高其通過共價鍵結(jié)合有機和無機支撐體的能力（Scognamiglio, V. et al. Physical chemistry chemical physics PCCP 2013, 15, 13108-13115）。

然而，為了結(jié)合肽，有必要知道它們的結(jié)構(gòu)并嘗試各種類型的官能化，它們在本領(lǐng)域的專家中是已知的。

這些抗原混合物代表出現(xiàn)在粘液和生物液體中可能的抗體的錨定和結(jié)合點。每種抗原，無論是肽或蛋白質(zhì)，都能夠結(jié)合抗體的不同的類別和組合，如IgA、IgG、IgM、IgE、IgD。存在于樣本中的抗體與結(jié)合至CNT的抗原之間的相互作用，產(chǎn)生電極的兩極淺層電性能上的變化。這些參數(shù)（例如阻抗和電容的變化）可通過合適的檢測工具量化（具體而言，這取決于轉(zhuǎn)換器的類型，電位轉(zhuǎn)換器、電導(dǎo)轉(zhuǎn)換器、電容轉(zhuǎn)換器、電流轉(zhuǎn)換器、伏安轉(zhuǎn)換器、光學(xué)轉(zhuǎn)換器、基于等離子表面的光學(xué)轉(zhuǎn)換器和基于熒光、基于化學(xué)發(fā)光或基于電化學(xué)發(fā)光的光學(xué)轉(zhuǎn)換器），并且在合適的分析下能夠提供有關(guān)存在于被測試的生物底物中的分析物的劑量的信息。反過來，分析物的存在和劑量，將成為用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析的有用信息，它將識別已確定的病癥（在本例子中為由致癌的HPV血清型引起的感染）的進展的狀態(tài)。

生物傳感器上的生物分子的穩(wěn)定系統(tǒng)

目前有許多用于穩(wěn)定生物傳感器上的生物分子的技術(shù)，其包括納米顆粒的使用。最新一代創(chuàng)新的穩(wěn)定膜可在市場上得到，其基于鐵氰化鈀（PdHCF）的凝膠或TiO₂的水凝膠。與用于穩(wěn)定生物傳感器上的生物分子的傳統(tǒng)方法相比，這些穩(wěn)定技術(shù)確保了高性能。特別地，將新的方法與更經(jīng)典的固定系統(tǒng)（例如Nation、戊二醛蒸氣（GA）或使用牛血清白蛋白（BSA）的網(wǎng)狀化）進行比較，最好的結(jié)果是通過使用計時電流測試獲得的。在生物傳感器制造中使用水凝膠日益頻繁，因為它們擁有對于酶錨定的非常有趣的特點，例如水的高比例，這促進了生物相容性的環(huán)境、使得分析物和試劑具有更高的流動性、毒性溫和或無毒性、以及在化學(xué)和水解方面都具有高穩(wěn)定性。這些特性被認為會促進對于在生物傳感器的運作中涉及的可能的??酶或生物分子的生物相容性和穩(wěn)定性更適合的形式。

優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，存在于表面（a）和表面（c）上的納米管是單壁的、多壁的或雙壁的。

利用本發(fā)明的生物傳感器，可以檢測HPV病毒和/或與它相關(guān)的疾病的存在。相同的方法，通過適當(dāng)?shù)男薷?，也可以被?yīng)用來檢測由病毒（在已在上文中報道的當(dāng)中）或原核生物或真核生物引起的其它感染的存在。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，HPV病毒的抗原的混合物包括以下的至少一種：存在于HPV病毒中的天然型蛋白、包括來自HPV病毒的蛋白的一個或多個表位的肽或重組蛋白、包括來自HPV病毒的一個或多個蛋白的一個或多個表位的病毒樣顆粒、包括細胞蛋白的一個或多個表位的肽或重組蛋白，針對它能夠發(fā)現(xiàn)存粘液中的自身抗體，表征HPV感染和腫瘤轉(zhuǎn)化的階段。

體液和細胞介導(dǎo)的??免疫響應(yīng)兩者對于消除與HPV病毒相關(guān)的宮頸病變都是必不可少的。即使交叉反應(yīng)（例如HPV-6和HPV-11、HPV-31和HPV-33、HPV-18和HPV-45之間的）被證實，抗HPV或病毒樣顆粒（VLP）的體液響應(yīng)主要包括中和針對類型特異性的免疫顯性的構(gòu)象表位的抗體。在人類中，血清中存在的抗HPV抗體在時間上是穩(wěn)定，在消除病毒后也是，因此抗HPV抗體的血清學(xué)評估可用作已經(jīng)暴露于病毒的試驗。雖然血清學(xué)測試的靈敏度低（50-60％），但是其特異性高（約90％）?？笻PV抗體主要是以高效價存在，更常見于患有持續(xù)性感染的女性中（Dillner, J. et al. “Prospective seroepidemiologic study of human papillomavirus infection as a risk factor for invasive cervical cancer” Journal of the National Cancer Institute 1997, 89, 1293-1299；Ho, G.Y., Studentsov, Y.Y., Bierman, R., and Burk, R.D. (2004). Natural history of human papillomavirus type 16 virus-like particle antibodies in young women. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention: a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology 13, 110-116）。

此外，高危HPV的幾個不同基因型的血清陽性的證明與高程度的CIN相關(guān)，而不管HPV-DNA的存在（Society of Gynecologic Oncologists Education Resource Panel Writing Group, Collins, Y. et al. “Cervical cancer prevention in the era of prophylactic vaccines: a preview for gynaecologic oncologists” Gynecologic oncology 2006, 102, 552-562）。關(guān)于試驗，不存在用于確定抗HPV抗體的標(biāo)準(zhǔn)化的免疫學(xué)測試；文獻中描述的測試是免疫酶放射免疫型測試，其基于使用被吸附在微孔板上的類型特異性的VLP（Iftner, T., and Villa, L.L. Journal of the National Cancer Institute Monographs, Chapter 12: Human papillomavirus technologies 2003, 80-88）。接種后，在給藥后二年，抗HPV 18抗體和HPV 18占血清中總IgG/IgA的1-2％（Scherpenisse, M., Mollers, M., Schepp, R.M., Meijer, C.J., de Melker, H.E., Berbers, G.A., and van der Klis, F.R. Hum Vaccin Immunother. 2013, 9(2), 314-321）。

根據(jù)本發(fā)明的傳感器可以提供關(guān)于HPV感染的三種病理階段的診斷信息：1）由高危HPV血清型引起的感染； 2）生產(chǎn)性感染；和3）腫瘤的發(fā)展（Doorbar, J. J. Clin. Virol.: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology 2005, 32 Suppl l, S7-15）。

階段1：由高危HPV血清型引起的感染

蛋白LI

病毒衣殼由兩種蛋白LI和L2組成，它們在病毒周期的末期產(chǎn)生并具有包封dsDNA制成的等滲的功能。病毒衣殼是由被稱為衣殼體的蛋白LI的72個五聚體聯(lián)同蛋白L2的12個（或更多個）副本組成。后期蛋白LI的五聚體可在空隙衣殼中自動裝配，形成病毒樣顆粒（VLP，類似于電子顯微鏡上的感染性病毒，并且還能夠結(jié)合構(gòu)象特異性的單克隆抗體）。

病毒樣顆粒（VLP）

VLPs能夠產(chǎn)生對于蛋白LI的高水平的高度特異性的響應(yīng)抗體；因此，LI是患有被HPV感染的上皮病變的女性中的免疫響應(yīng)的主要靶標(biāo)之一。蛋白LI在各種HPV類型中高度保守；然而，如在由生殖道HPV引起感染的研究以及在動物模型中所報道的，存在類型特異性的抗LI抗體。

VLP的表面上的三維表位負責(zé)這種抗體的活性。HPV16 LI VLP的結(jié)構(gòu)已被解釋（Chen, X.S. et al “Structure of small virus-like particles assembled from the LI protein of human papillomavirus 16”. Molecular cell 2000, 5, 557-567）。

優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，使用了與至少一種類型的HPV的HPV病毒（HPV VLP）相似的顆粒；這種顆粒可與鋁分子混合。VPL是高免疫原性的顆粒，它們能夠誘導(dǎo)體內(nèi)抗體的產(chǎn)生并具有以高親和力結(jié)合免疫球蛋白的能力。VLP可以選自：HPV 6a、HPV 6b、HPV 11、HPV 16和HPV 18。所述VPL被用在默克公司（Merck）開發(fā)的抗HPV疫苗中（例如WO00/45841、WO2012177970以及其中引用的文獻），并且可以代表存在于根據(jù)本發(fā)明的傳感器（電容傳感器、安培傳感器、基于化學(xué)發(fā)光的安培傳感器、基于熒光的安培傳感器、基于等離子表面CNT的光免疫傳感器）上的強大的抗原表面混合物。已經(jīng)驗證，在疫苗中使用的這些VPL具有吸引構(gòu)象抗體的優(yōu)點，并可以增加根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的靈敏度和精確度?？稍诒景l(fā)明的生物傳感器中使用的VPL的非限制性例子是在WO2004056389和其中引用的參考文獻中描述的顆粒。優(yōu)選地，在本發(fā)明的生物傳感器中，使用了在WO2004056389中報道的HPV 16和HPV 18病毒的VPL。

隨后，其他三種不同的HPV類型（11、18、35）被解釋；取決于病毒類型的每種五聚體顯示出在表面中的特定差異，這進而導(dǎo)致不同的單克隆特異性抗體的發(fā)展（Bishop, B. et al. J. Biol. Chem. 2007, 282, 31803-31811）。

1）VLP和LI的表面（免疫）表位（structure and sequences in Bishop et al., Biol. Chem. 2007, 282, 31803-31811）。

蛋白LI在五聚體結(jié)構(gòu)中組裝；宏觀結(jié)構(gòu)與各種HPV類型（至少為6、35、11和18型）相似。

五聚體以對稱的方式進行組裝，建立中心通道。該結(jié)構(gòu)表面顯示出各種單體的相交的結(jié)構(gòu)。

暴露在五聚體表面上的、并可被識別為免疫響應(yīng)中的HPV的構(gòu)象（和線性）表位的環(huán)有5種。

1）BC

2）DE

3）EF

4）FG

5）HI

FG和HI環(huán)在HPV16中是免疫顯性的，而BC、DE和HI環(huán)對于HPV6和HPV11是免疫顯性的。

即使核心結(jié)構(gòu)在HPV6、11、35、18之間是相似的，但這些環(huán)結(jié)構(gòu)在構(gòu)象水平上顯示出顯著差異。

表面環(huán)上的少數(shù)氨基酸的取代可引起不同的特異性抗體的產(chǎn)生；這意味著，即使是具有稍微不同的表位的HPV的亞型也可引起結(jié)構(gòu)上的修飾，使得它不再被另一種HPV亞型的特異性抗體識別。小至1-2埃的差異就可以破壞抗體和表位之間的相互作用。這意味著，抗體在檢測不同HPV的亞型中極度精確。

總的來說，盡管蛋白LI具有高同源性，但是在各種HPV類型之間，沒有具有相同的抗原性的共同的表位，這是因為插入/缺失/突變的存在引起組合物和表位的構(gòu)象的變化，從而引起抗原性的變化。

例如，比較HPV11和HPV16，環(huán)BC短了3.5埃（氨基酸消除），而環(huán)HI短了2.0埃（氨基酸消除）；環(huán)DE上的甘氨酸（Glyl33、Glyl34和Prol36）在HPV16中全是丙氨酸；這導(dǎo)致局部結(jié)構(gòu)的擾動。環(huán)EF在兩種HPV之間是相似的。至于HPV18和HP16，它們表現(xiàn)出實質(zhì)性的差異；環(huán)BC具有13埃的差異，因此環(huán)EF多轉(zhuǎn)移4埃與環(huán)BC接觸。環(huán)HI是非常不同的，這是由于氨基酸插入和Pro351和Pro353的存在；環(huán)DE朝著通道轉(zhuǎn)移，在HPV18中產(chǎn)生更小的直徑（10埃對比HPV16的18埃）。最終，參照HPV35和HPV16，環(huán)FG是不同的，這是由于與HPV16、11和18相比較缺少2個殘基，并且環(huán)HI、DE、BC和EF也是不同的。

2）肽16L1

肽16L1（IHSMNSTIL，SEQ ID N. 1）是對于高危HPV的常見的表位，能夠誘導(dǎo)被高危HPV感染和患有宮頸癌的患者中交叉反應(yīng)的抗體的產(chǎn)生。與此相反，被低危HPV感染的對象中的抗體不能夠識別這樣的表位。

這種肽對于以下同時檢測是良好的候選者：

1）由高危HPV引起而非由低危HPV引起的感染（階段1）的存在的同時檢測

2）宮頸癌的發(fā)展（第3階段）的同時檢測。在該階段，在90-95％（取決于HPV的類型）的病例中，抗肽16L1的抗體與LSIL程度的宮頸癌（低度鱗狀上皮內(nèi)病變，Low grade squamous intraepithelial lesion, CN1）相關(guān)。相反，在60%的病例中，它們與HSIL程度的癌癥（高度鱗狀上皮內(nèi)病變，High grade squamous intraepithelial lesion, CIN2/CIN3）相關(guān)；

抗16L1而產(chǎn)生的IgG的量在由高危HPV引起的感染（但沒有癌癥）期間較高，但它在早期階段減少（LSIL，其中它無論如何占了90-95%的靈敏度），并在晚期癌癥的病例（HSIL）中進一步減小至60％（點2）。

這可能是由于隨著時間流逝抗體滴度會自然下降（Rocha-Zavaleta et al., J. Gen. Virol. 2004, 85, 2643-2650），或者缺乏抗原表達。事實上，基因LI的轉(zhuǎn)錄受到終末分化的角質(zhì)形成細胞的局限，以及在瘤形成的進展過程中，已知細胞分化的水平會降低；因此蛋白LI的水平在晚期的病變中顯著降低。

檢測出的抗這種肽16L1的抗體是血清中的IgG和宮頸分泌物（粘液）中的IgA。

在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，碳納米管衍生有肽的混合物、或衍生有顯示各種表位的重組蛋白、或衍生有具有作為序列免疫原性表位的VLP，其對于階段1是顯著的，例如是下文中報道的，特別是參照肽16L1。

階段2：生產(chǎn)性感染的病毒標(biāo)記物：蛋白E4

蛋白E4 在E2的ORF內(nèi)具有的ORF，且其大小根據(jù)HPV類型而變化。主要轉(zhuǎn)錄物是剪接的mRNA，其被稱為E1^{^}E4，因為在開始時，它包括起始密碼子和E1基因的第一個氨基酸。

通常情況下，E1^{^}E4轉(zhuǎn)錄在生產(chǎn)性病變中是最豐富的。該豐富度被反映在蛋白水平上：蛋白E4表示病變中總蛋白的高達30％。

總之，所有HPV在生產(chǎn)性感染期間的中間皮層和上層皮層中產(chǎn)生大量的E4積累。

從歷史上看，E4被歸類為早期基因，即早熟；然而，沒有證據(jù)表明它具有早期功能。已知它既不涉及細胞轉(zhuǎn)化，也不涉及細胞感染；通過結(jié)合至細胞角蛋白，它可能具有促進從一個人傳遞到另一個人的作用（Doorbar, J. Virology 2013, 445, 80-98）。

不同HPV類型的E4之間的主要區(qū)別在于它們在受感染的細胞中所形成的結(jié)構(gòu)、以及這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的時間。許多皮膚的HPV類型的特點是上層皮層到中間皮層中的細胞質(zhì)內(nèi)含顆粒（HPV1、63、4、65、5、8）；它們具有細胞病變效應(yīng)。

關(guān)于結(jié)構(gòu)，如果考慮單個元件，則它在不同的HPV類型之間非常相似。

最相似的區(qū)域是N末端和C末端，后者包含用于E4多聚化的重要序列（淀粉樣蛋白形成的潛在序列）。C末端的損失防止細胞質(zhì)中的E4積累并將其在細胞核中重新分配。

被富含Pro的區(qū)域包圍的中心區(qū)域包括帶正電的區(qū)域、環(huán)區(qū)域和帶負電的區(qū)域；這些結(jié)構(gòu)元件在不同的HPV之間非常相似。

環(huán)包含主要的免疫顯性表位，并且是大多數(shù)單克隆抗體結(jié)合的位點。該區(qū)域很可能可用于在整個蛋白的情況下與細胞靶標(biāo)的相互作用（Doorbar, J. Virology 2013, 445, 80-98；Griffin et al., 2012, PloS one 7, e49974）。

特別地，各種免疫原性表位被定位在在不同的HPV中的E4序列上。

特別地，針對E4（和在較小程度上針對E6和E7）的抗體在被HPV16感染的患者的血清中被發(fā)現(xiàn)（Muller et al. J. Invest. Dermatol. .1995, 104, 138-141）。反應(yīng)表位被描述和定位（MuUer et al., J. Gen. Virol. 1990, 71, 2709）中且對應(yīng)于E4的氨基酸序列33-47。合成肽是使用患者的血清測試的ELISA。

該肽，平均而言是氨基酸33-47，它被儲存在高危HPV的各種類型中，但在某些類型中它不存在：

。

Suchankova等人（Suchankova et al, J. Gen. Virol. 1992, 73 (Pt. 2), 429-432）識別了針對E4的另一個免疫活性肽。針對E4的合成肽（氨基酸51-70）在患有HPV16+和處于浸潤性癌的狀態(tài)、以及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的各種患者的血清中表現(xiàn)出最強的免疫活性。同樣的 E4陽性血清對于E7肽也不總是陽性。在ELISA中進行的測試顯示出相當(dāng)溫和的反應(yīng)性患者的百分比（30-40％的癌癥病例對于這種染色是陽性的）。然而，即便如此，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

該肽在各種類型的高危HPV中也顯示了低序列同源性。

以上報道的所有表位都可用于根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器。

可以被使用的其它表位被定位在（Doorbar et al. Virology 1996, 218, 1 14-126）中并都位于E4序列的中央?yún)^(qū)域；其他表位則在（Doorbar et al. Virology 1996, 218, 1 14-126）進行了描述。

階段3：癌癥。如在先前的兩個階段中，在評估向著負責(zé)病理狀態(tài)的“非自身”抗原的免疫響應(yīng)時，將特異性抗體識別為特定病理狀態(tài)的“標(biāo)簽”是非常有效的。

至于階段3，這更加復(fù)雜。確定了三種方法，根據(jù)這些方法本發(fā)明能夠診斷宮頸癌。

方法1

癌癥具有細胞周期失調(diào)和基因組完整性控制的病理特征。腫瘤細胞顯示出突變和染色體畸變，其隨著腫瘤的發(fā)展，即使在早期階段，也可引起細胞蛋白的過表達或失調(diào)、或產(chǎn)生異常蛋白，例如急性髓性白血病中的PML-RARalpha、慢性髓性白血病中的-CIT HUGHE De THE-或Bcr-Abl（Insinga et al. Cell cycle 2005, 4, 67-69）。有時，免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生針對這種蛋白的免疫響應(yīng)，并產(chǎn)生針對“自身”蛋白（由機體自身產(chǎn)生）的特異性抗體（后續(xù)被定義為自身抗體）。因此，這些蛋白中的某些和相關(guān)的抗體在診斷水平上構(gòu)成了重要的腫瘤標(biāo)記物。同樣得益于本發(fā)明的高靈敏度，可檢測出自身特異性的自身抗體（Nolen et al. J. Immunol. Methods 2009, 344, 116-120； Zaenker, P.；Ziman, M.R. Oncology 2013, 22, 2161-2181）。

卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和滋養(yǎng)層細胞瘤的特異性抗原被報道于下文中。

宮頸癌的細胞生物標(biāo)記物（蛋白）：

。

卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和滋養(yǎng)細胞瘤的細胞生物標(biāo)記物（蛋白）。蛋白和相關(guān)抗原的該列表包含在女性生殖道的典型癌癥中發(fā)生的一般生物標(biāo)記物：

癌抗原125（CA-125）

β-人絨毛膜促性腺激素（β- hCG）

尿促性腺激素片段

α-胎蛋白（AFP）

抑制素

雌二醇

癌胚抗原（CEA）

鱗狀細胞癌（SCC）抗原

血清苗勒抑制物質(zhì)（MIS）

拓撲異構(gòu)酶II

糖鏈抗原19-9

癌抗原27-29

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）

鐵蛋白

其他潛在的腫瘤標(biāo)記物包括如下：

溶血磷脂酸

MIB 1-決定的腫瘤生長分數(shù)

LI（CAM）

間皮素[2]

人附睪蛋白4（HE4）

骨橋蛋白

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）

白細胞介素8（第8介素）

巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）

胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3

腫瘤相關(guān)的胰蛋白酶抑制因子

細胞周期蛋白E

OVX1。

在下表中報道了特定的抗原，對于這些抗原的與腫瘤相關(guān)的自身抗體（腫瘤相關(guān)的抗原TAA）在血漿和身體粘液中被發(fā)現(xiàn)。該表列出了針對在不同類型的腫瘤的腫瘤細胞所開發(fā)的人類自身抗體的所有最新數(shù)據(jù)。下表只收集了源于在患者上進行的分析的數(shù)據(jù)。自身抗體的檢測利用不同的方法進行，例如SERPA、SEREX、ELISA、Western印跡、噬菌體展示（單獨或組合）（Nolen et al. J. Immunol. Methods 2009, 344, 116-120； Zaenker, P.； Ziman, M.R. Oncology 2013, 22, 2161-2181）。

。

方法2

關(guān)于階段3，也可以檢測其它標(biāo)記物，作為替代或附加的方法來驗證抗腫瘤抗體的存在。特別地，在該階段中被改變的一些核酸可以被使用。如它從Ma, D.等人的出版物（Chin. Med. J-Peking 2012, 125, 4270-4276）上出現(xiàn)的，hsa-miR-l5a、hsa-miR-20b、hsa-miR-21和hsa-miR-224在患有宮頸癌的患者中增加。

方法3

最終，根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可以突出針對在腫瘤發(fā)展的后續(xù)階段期間產(chǎn)生的病毒蛋白的抗體的存在；例如，受到HPV16感染并已經(jīng)發(fā)展出口咽癌的患者，具有針對病毒蛋白E1、E2和E7的高抗體滴度（Anderson, K.S. et al., Brit. J. Cancer 2011, 104, 1896）。

優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器中，在HPV病毒的抗原的混合物中，天然型蛋白和/或存在于HPV病毒中的蛋白（重組蛋白或病毒樣顆粒的表位衍生自其中），是蛋白LI、蛋白E4、E1、E6、E7、E2、pl6ink4A、存活蛋白（存活素）、MCM2、CDC6、SCC、PCNA、ki-67、TOP2A、細胞周期蛋白X、CDCA1、聯(lián)會蛋白（Geminin）、Stathmin蛋白（STMN）、DKK1、TGF-β（減少）、HLE、β-CF NADPH和黃素、UCHL1中的至少一種（Nolen et al. J. Immunol. Methods 2009, 344, 116-120；Zaenker, P.；Ziman, M.R. Oncology 2013, 22, 2161-2181）。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包括至少一個如上所述的生物傳感器的診斷裝置。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的診斷裝置包括所述傳感器的至少一個、兩個或三個不同的單元，其選自：

i. 如上所述的傳感器，其中所述抗原是HPV的蛋白LI、具有序列IHSMNSTIL（IleHisSerMetAsnSerThrlleLeu，SEQ ID N. 1）的表位16L1或具有至少一種免疫原性表位的HPV的蛋白LI的片段中的至少一種；

ii. 如上所述的傳感器，其中所述抗原是HPV的蛋白E4、或具有至少一個免疫原性表位的HPV的蛋白E4的片段中的至少一種；以及

iii. 如上所述的傳感器，其中所述抗原是宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌或滋養(yǎng)層細胞瘤的細胞生物標(biāo)記物、或作為腫瘤發(fā)展的結(jié)果而產(chǎn)生的病毒抗原這樣的蛋白中的至少一種。

優(yōu)選地，具有免疫原性表位的蛋白片段選自下表中列出的至少一種。

優(yōu)選地，所述診斷裝置包括如上所述的類型i傳感器和類型ii傳感器。

優(yōu)選地，所述診斷裝置包括如上所述的類型i傳感器、類型ii傳感器和類型iii傳感器。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的診斷裝置還包括信號放大系統(tǒng)，在過氧化氫和氫醌的存在下，任選地通過與辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的抗人免疫球蛋白抗體（Ahammad, S. J. Biosens. Bioelectron. 2013, S:9）進行信號放大。

根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的信號放大系統(tǒng)允許獲得更高的靈敏度。這種系統(tǒng)可額外地代表對實驗室規(guī)模的試驗的可能補充。事實上，信號放大通常包括使得分析更加復(fù)雜和答案不直接的步驟，這些特征不適合“自己動手”的測試。作為非限制性的例子，信號放大可以包括以下元件：與辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的抗人免疫球蛋白抗體、H₂O₂和化學(xué)介質(zhì)（例如氫醌）。信號放大的階段被被分為在合適的溶液中進行的電極的洗滌的不同周期，該溶液包含表面活性劑和鹽（0.05% Tween-20，50mM Tris-Cl，150mM NaCl，pH 7.6）。

第一次清洗用于從電極的表面除去粘液和被包含在其中的所有有機分子。

在這一點，加入與辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的第二抗體，其與已經(jīng)對存在于電極上的抗原混合物表現(xiàn)出親和性的所有人免疫球蛋白結(jié)合。在抗體-抗體結(jié)合之后，進行其它洗滌步驟，從而除去多余的抗體和隨后除去可能的非特異性信號。

最后的階段包括添加用于酶HRP的底物、H₂O₂和氧化還原反應(yīng)介質(zhì)、氫醌。然后，生成對苯醌的氫醌這一氧化還原電對表示結(jié)合有第二抗-人免疫球蛋白抗體的酶HRP的底物。氫醌/苯醌這兩個種類之間的轉(zhuǎn)換可通過電流型傳感器來檢測（Ahammad,S. J. Biosens. Bioelectron. 2013, S:9）。該反應(yīng)是高度可逆的且苯醌具有特別低的還原電位，該特征減少了可能的干擾的風(fēng)險。

然后，氫醌/苯醌這一氧化還原電對和過氧化氫表示表示結(jié)合有第二抗-人免疫球蛋白抗體的酶HRP的底物。氫醌/苯醌這兩個種類之間的轉(zhuǎn)換可通過電流型傳感器來檢測。

電流測試的版本使用根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器的抗原，其被暴露在酶（例如GOD（葡萄糖氧化酶））上，其反過來被錨定至CNT或辣根過氧化物酶（HRP）。特別地，葡萄糖氧化酶已經(jīng)被用在糖尿病患者的電流測試中并且已經(jīng)存在于市場上不昂貴的傳感器上（Chen, C. et al. RSC Advances 2013 3, 4473-4491）。

可以制造酶（例如辣根過氧化物酶（HRP），優(yōu)選GOD），從而創(chuàng)造嵌合（chimerical）蛋白。這些融合蛋白將如上引用的抗原暴露于它們的催化位點附近。如果抗體（例如HPV感染的不同階段的生物標(biāo)記物）存在于粘液中，則它們將能夠結(jié)合存在于所制造的酶（例如GOD和辣根過氧化物酶）上的其各自的抗原。

被結(jié)合在酶（例如GOD或HRP）的催化位點附近的抗體的空間位阻，將影響酶-底物相互作用現(xiàn)象，如圖2（A）。

在GOD的情況中，這將涉及酶活性的抑制，因為該抗體將限制葡萄糖進入酶的活性位點。然后，被錨定至碳納米管或碳材料或石墨墨液的GOD/抗原特異性抗體復(fù)合物的形成，會造成可由安培（電流）測量的變化。

替代地，結(jié)合有比色底物（例如TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）、DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）、ABTS（2,2'-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）））的辣根過氧化物酶的使用，將允許抗體抗原結(jié)合物的相互作用狀態(tài)與沒有顏色變化相關(guān)聯(lián)，因為相互作用會影響酶-底物相互作用現(xiàn)象?；贖RP的使用的方法，會將檢測系統(tǒng)的選擇引導(dǎo)至光學(xué)和電流生物傳感器，因為酶的活性可以根據(jù)電流而被測量。

上述技術(shù)是酶倍增免疫測定技術(shù)（EMIT）的變體（Reisfield et al., Ann. Cli. Lab. Sci. 2007, 37, 301-314）（David Wild "The Immunoassay Handbook", 4th Ed., Elsevier Science, 2005 page 221）。

在圖2中示出了酶（例如GOD或HRP），其被制造從而顯示靠近催化位點的特異性抗原。B）被結(jié)合在酶的催化位點附近的抗體的空間位阻會影響酶-底物相互作用現(xiàn)象，這可用安培-計時電流傳感器檢測。

光學(xué)版本：

傳感器的光學(xué)改變包括利用表面等離子共振現(xiàn)象的裝置的使用。近年來，基于表面等離子共振（SPR）的技術(shù)的這些裝置的特定類別已被越來越多地擴散。特別地，這些代表了能夠利用等離子共振現(xiàn)象的測量的無標(biāo)簽的生物傳感器的最新前沿。

抗原-抗體結(jié)合可由光學(xué)型傳感器來揭示。此類傳感器的優(yōu)點是非常敏感，它們給出直接的結(jié)果，并且不需要信號放大步驟。等離子共振是由電磁輻射（光、激光等）激發(fā)的表面等離子體的相干振蕩。已經(jīng)證實，顯示出具有負實部和正虛部的介電常數(shù)的所有材料都支持這種物理現(xiàn)象。在某些情況中，輻射波可通過漸逝場結(jié)合，所述漸逝場通過在金屬和電介質(zhì)之間的等離子表面在內(nèi)部的重新發(fā)射點產(chǎn)生。當(dāng)且僅當(dāng)矢量波的分向量平行于界面表面時，這種情況發(fā)生。這種結(jié)合可被誘發(fā)，使折射和衍射現(xiàn)象幾乎全部衰減。

SPR技術(shù)傳感器是一種光學(xué)裝置。當(dāng)被置于金屬薄膜和電介質(zhì)之間的等離子表面被激發(fā)時，通過插入分析物改變界面，折射率會改變，并發(fā)生波傳播常數(shù)的變化。這反過來修改了光波和表面自身之間的結(jié)合條件。

然后，這種傳感器對折射率變化非常敏感（參考：Maier, S. A. "Plasmonics: Fundamentals and Applications" 2007, Springer）。

這些光學(xué)生物傳感器允許測量傳出的折射光或反射光的不同參數(shù)

- 角

- 波長

- 相

- 強度

- 極化

SPR技術(shù)生物傳感器是這樣的裝置，其中結(jié)合了能夠識別和與特定的分析物相互作用的生物識別元件。識別元件被固定在與等離子表面緊密接觸的金屬膜表面上。制造金屬膜的最常用的材料是金和銀。當(dāng)含有特定的分析物的樣品溶液與傳感器相互作用時，分析物分子開始結(jié)合至識別元件，從而確定傳感器的測量表面的折射率的變化。這反過來引起了等離子表面的傳播常數(shù)的變化。

石墨烯混合光學(xué)生物傳感器

根據(jù)本發(fā)明的生物傳感器可以是使用最新一代SPR技術(shù)光學(xué)傳感器的裝置，所述傳感器涉及石墨烯片的使用，這是由單個碳原子片形成的平面結(jié)構(gòu)組成的材料。

使用被置于已知的SPR傳感器的接口處的石墨烯片，放大了傳感器性能并顯著地降低了制造成本，因為它減少或消除了貴金屬（例如金和銀）的含量。事實上，金屬可以被置于石墨烯片之間，后者是三維且高度有序的結(jié)構(gòu)。石墨烯具有有趣的光學(xué)性質(zhì)，它是可透光的，并且是優(yōu)異的電導(dǎo)體（Szunerits, S. et al. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 1435-1443）。

表面磁等離子體共振版本

存在涉及研究和使用磁表面等離子體的分析方法。它們需要具有極大的負磁導(dǎo)率的材料，該特性只在最近才被實現(xiàn)，這得益于能夠根據(jù)接收的刺激的類型而給出不同的響應(yīng)輸出的復(fù)合和結(jié)構(gòu)高度組織化的材料這樣的超材料的制造。這類技術(shù)可被用在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備中（Thongrattanasiri, S.; Garcia de Abajo, FJ. Physical review letters 2013, 110, 187401）。

在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種診斷方法，其用于確定對象中致病因子的存在以及由所述致病因子引起的感染和/或與所述感染相關(guān)的疾病的進展的狀態(tài)，所述方法包括以下步驟：

i. 使用鹽水或蛋白質(zhì)緩沖液稀釋從對象提取的生物樣品；

ii. 將來自步驟i的稀釋溶液的等分試樣放置在包括至少一個根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一項所述的傳感器的診斷裝置中；

iii. 通過分析電感、電流、電勢方面的電信號變化（在電導(dǎo)生物傳感器、電流生物傳感器、伏安生物傳感器的情況中）、或特定波長的光的存在（在基于熒光/化學(xué)發(fā)光的光學(xué)生物傳感器的情況中）或光散射和/或折射/衍射現(xiàn)象（在等離子光學(xué)生物傳感器的情況中）的讀取器，確定樣品中針對致病因子的抗體或與所述感染相關(guān)的病癥的標(biāo)記物抗體的存在和濃度，其中含有來自步驟ii的稀釋溶液的傳感器被置于被包含在所述讀取器中的殼體中，并且在生物傳感器中的輸入信號和輸出信號之間的上述變化在被包含在讀取器中的電路中被檢測，其中所述變化是與傳感器表面上的納米管和/或金屬納米粒子上的抗原結(jié)合的存在于樣品中的抗體的存在和數(shù)量的函數(shù)；

iv. 由技術(shù)人員通過被連接至步驟iii的讀取器的圖形界面獲得分析的結(jié)果。

在優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明提供了一種診斷方法，其用于確定對象中HPV病毒的存在和HPV病毒感染和/或與由HPV病毒引起的感染相關(guān)的瘤形成的進展的狀態(tài)，所述方法包括以下步驟：

i. 使用鹽水或蛋白質(zhì)緩沖液稀釋包含宮頸粘液（也包含源自子宮的頸部的細胞和細胞碎片）的生物樣品，其通過合適的拭子（swab）從對象提取；

ii. 將來自步驟i的稀釋溶液的等分試樣放置在包括至少一個上述傳感器的診斷裝置中；

iii. 通過分析電感、電流、電勢方面的電信號的化（在電導(dǎo)生物傳感器、電流生物傳感器、伏安生物傳感器的情況中）、或特定波長的光的存在（在基于熒光/化學(xué)發(fā)光的光學(xué)生物傳感器的情況中）或光散射和/或折射/衍射現(xiàn)象（在等離子光學(xué)生物傳感器的情況中）的讀取器，確定樣品中針對HPV病毒的抗體或?qū)m頸腫瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌或滋養(yǎng)層細胞瘤的標(biāo)記物抗體的存在和濃度，其中所述讀取器包含殼體，含有來自步驟ii的稀釋溶液的傳感器被置于其中，以及檢測在生物傳感器中的輸入信號和輸出信號之間的上述變化的電路，其中所述變化是結(jié)合至存在于傳感器表面上的納米管和/或金屬納米粒子上的抗原的存在于樣品中的抗體的存在和數(shù)量的函數(shù)；

iv. 由技術(shù)人員通過被連接至步驟iii的讀取器的圖形界面獲得分析的結(jié)果。

在步驟i中被用于稀釋的溶液可以包括鹽水磷酸緩沖液、飽和劑（例如牛血清白蛋白）、防腐劑（例如疊氮化鈉）、pH值穩(wěn)定劑、蛋白酶抑制劑，如在Ji, H. "Lysis of cultured cells for immunoprecipitation" Cold Spring Harbor protocols 2010, pdb prot5466中的報道。

稀釋率可以根據(jù)起始樣品的濃度、根據(jù)在本領(lǐng)域中的專家已知的標(biāo)準(zhǔn)實踐來確定。

通過說明和非限制性的方式，下文在一個實施例中描述了本發(fā)明的一個實施方式。

本發(fā)明的一個可能的實施方式是一種用于檢測由乳頭瘤病毒（HPV）引起的感染和可能的相關(guān)的癌發(fā)生的的階段的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)由以下組成：

i. 提取裝置，其由以下部件組成：適于提取和收集生物材料（宮頸粘液）的部件以及用來通過合適溶液的特定劑量來稀釋樣品的部件；

ii. 由3個或更多個收集區(qū)域組成的盒狀物，其適于接收將被放置在特定的生物傳感器上的生物樣品；

iii. 讀取器，其包括用于接收所述盒狀物的接口、適于檢測第一信號的一個電路和用于檢測作為第一個信號的放大的第二信號的一個可選電路。所述讀取器具有傳遞分析的結(jié)果的圖形界面。

所述提取裝置將被用于提取和任選地稀釋生物樣品。一旦被提取，宮頸粘液必須被轉(zhuǎn)移至所述盒狀物。所述盒狀物隨后將被引入進所述讀取器，得益于圖形界面，所述讀取器將分析的結(jié)果傳遞至技術(shù)人員。

Patentin SEQ ID N.1

序列表

<110> 布魯納·馬里尼

魯?shù)稀ひ敛ǖ侠镏Z

<120> HPV

<130> P04822PCT

<160> 1

<170> Patentin 3.5版

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 16型人乳頭瘤病毒

<400> 1

Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu

1 5

序列表

<110> 布魯納·馬里尼

魯?shù)稀ひ敛ǖ侠镏Z

<120> HPV

<130> P04822PCT

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 16型人乳頭瘤病毒

<400> 1

Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu

1 5