本申請要求2014年2月11日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/938,556的權益，其整體內容在此處通過提述并入。

技術領域

本發(fā)明涉及用于檢測樣品中抗藥物抗體的存在的方法和試劑盒，且更具體地涉及樣品中藥物存在下的用于檢測抗藥物抗體的方法和試劑盒。

背景

生物治療劑(例如生物劑如蛋白、肽、核苷酸等)的引入已為疾病如炎性腸疾病、強直性脊柱炎、多發(fā)性硬化和類風濕性關節(jié)炎的治療給出了主要推動。在很多情況中，已證明這些生物劑在臨床實踐中十分成功。已知生物劑包括治療性抗體具有免疫原性的潛力，而對患者施用治療性蛋白可誘導免疫響應，導致形成抗藥物抗體(“ADA”)。這種ADA可減少治療性蛋白的有效性。例如，其可結合或/和中和治療性蛋白，導致藥物藥代動力學或藥效動力學的改變，其改變藥物效力。ADA可引起嚴重的副作用，包括過敏反應、通過中和抗體(NAb)的針對內源性蛋白的交叉反應性和補體激活。對于數種可用于治療類風濕性關節(jié)炎(阿達木單抗和英利昔單抗)、克羅恩病(英利昔單抗)、多發(fā)性硬化(那他珠單抗和阿侖單抗)和斑塊狀銀屑病(阿達木單抗)的單克隆抗體，已描述了ADA的產生。在一些患者中，由這些治療性蛋白提供的臨床效益因為ADA的形成而隨時間減少。免疫原性風險評估對于理解藥物誘導的ADA的頻率和嚴重性至關重要。已報導Nab與引起耗竭綜合征的內源性蛋白具有交叉反應(促紅細胞生成素)。

隨著批準用于臨床使用的治療性蛋白數量的增加，這些產品的免疫原性對于臨床醫(yī)生、制造商和監(jiān)管機構已變得翔實。已明確了解一些底物會影響免疫測定(或配體結合測定)中分析物的檢測或量化。這些干擾因素包括但不限于消極影響測定的特異性、精確性和敏感性的循環(huán)的藥物。將減少ADA測定“藥物耐性”的“藥物干擾”認作是對于免疫原性評估(以監(jiān)測ADA作為患者藥物臨床安全性和效力的監(jiān)測的一部分)的主要技術挑戰(zhàn)。

盡管上述方法證明了藥物耐性的一定改善，但相比無藥物的ADA檢測，其不能維持敏感性和相對的精確性，因此具有假陰性的風險且低報在治療的患者中ADA的發(fā)生率和效價。盡管工業(yè)監(jiān)管指導文件和白皮書推薦的敏感性為250-500ng/mL[Shankar G,Devanarayan V,Amaravadi L等:Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 48(5),1267-1281(2008)；Mire-Sluis AR,Barrett YC,Devanarayan V等:Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in the detection of host antibodies against biotechnology products.Journal of Immunological Methods 289(1-2),1-16(2004)]，藥物耐性有時在無任何接受標準下進行評估，然后寫出臨床規(guī)程來指示抗體測量前的長洗出期以允許藥物清除并避免由于藥物干擾導致的假陰性結果。該方法并不合意，這是由于在早期的時間點尤其是在具有長半衰期藥物和/或多次給藥方案的情況中，將存在錯過ADA評估的風險且洗出期方案并不可行。一些基于非配體結合的方法如質譜已在ADA干擾存在下用于PK評估，預期的測定敏感性是不能接受的且需要基于配體的結合來富集分析物，這造成相似的挑戰(zhàn)。

多種測定形式已成功用于檢測ADA，包括ELISA(直接的、間接的和橋接的)、放射免疫測定，電化學發(fā)光和表面等離子體共振。然而這些測定的開發(fā)經常由于藥物存在引起的干擾而復雜化。長久以來已認識到在配體結合測定中分析干擾的挑戰(zhàn)。隨著長效單克隆抗體療法的到來，對于在藥物存在下檢測ADA的特定技術的需求引起了特別關注。目前使用的最廣泛采用的方式仍具有時間、敏感性和精確性的限制。因此，本領域對于更精確和可重復地檢測樣品如生物樣品中ADA存在的方法和試劑盒存在需求。

概述

本發(fā)明至少部分基于新的測定方法的發(fā)現(xiàn)，所述方法可有效用于減少或消除由ADA檢測中的藥物或靶的干擾所引起的問題。具體地，本發(fā)明是基于新的ADA測定的建立，所述測定包括下列示例性的步驟。首先，將過量的藥物材料添加至包含潛在ADA(游離的ADA和ADA/藥物復合物)的樣品以結合全部殘留的游離ADA，形成藥物/ADA復合物。第二，使用聚乙二醇沉淀這些復合物。第三，系列洗滌以去除血清蛋白和免疫球蛋白后，用溶液重構最終沉淀(藥物/ADA復合物)以解離所述復合物然后以足夠允許涂覆全部解離的游離藥物和游離ADA的時間涂覆在大的表面(在保持藥物和ADA分離的條件下)或基質(例如具有高涂覆容量的高結合碳板)上。第四，隨后使用標記的藥物實施總ADA水平的特定檢測。因此，本發(fā)明涉及用于確定樣品(例如生物樣品)中ADA存在或ADA的量的方法、組合物和試劑盒。

在一個實施方案中，用酸溶液重構最終沉淀(藥物/ADA復合物)以解離所述復合物然后以足夠允許涂覆全部解離的游離藥物和游離ADA的時間涂覆在大的表面(在保持藥物和ADA分離的酸性條件下)或基質(例如具有高涂覆容量的高結合碳板)上。所述酸性環(huán)境防止所述復合物在固定至基質表面上時再次形成。當使用酸性溶液解離復合物時，可將測定稱為PandA(PEG和Acid(酸))測定。

在另一實施方案中，用堿溶液重構最終沉淀(藥物/ADA復合物)以解離所述復合物然后以足夠允許涂覆全部解離的游離藥物和游離ADA的時間涂覆在大的表面(在保持藥物和ADA分離的堿性條件下)或基質(例如具有高涂覆容量的高結合碳板)上。所述堿性環(huán)境防止所述復合物在固定至基質表面上時再次形成。

酸性或堿性溶液的選擇將取決于藥物(例如生物藥物)的參數，如pI，或一些共軛鍵的存在，且所述選擇對藥物的完整性和結構會具有最小的影響。

在一些實施方案中，最初的酸或堿添加后的溫育步驟可在22℃、23℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、39℃或更高實施。

在一些實施方案中，最終的沉淀步驟后，可將每個樣品進一步稀釋至例如1:20、1:25、1:30、1:40、1:50或1:60的最終樣品稀釋度。

一方面，本公開內容提供了用于確定樣品中ADA存在或不存在的方法，所述方法包括使所述樣品與結合ADA以形成藥物/ADA復合物的過量的藥物接觸；使所述藥物/ADA復合物與聚乙二醇(PEG)接觸以形成包含藥物/ADA復合物的沉淀；使所述沉淀與溶液接觸以解離所述藥物/ADA復合物；將所述解離的ADA固定于表面和/或基質上；和確定所述ADA的存在或量。另一方面，所述確定步驟包括：使所述固定的ADA與綴合有可檢測的標記物的藥物接觸；和確定所述可檢測的標記物的存在或量，以由此確定所述樣品中ADA的存在或量(效價)。

在一些實施方案中，用于確定樣品中ADA的存在或不存在的方法進一步包括在所述確定步驟的部分之前、之后確定樣品中ADA的量。

在一些實施方案中，用于確定生物樣品中ADA的存在或不存在的方法進一步包括在所述固定步驟后處理(例如洗滌)所述支持物以去除未結合的藥物。

在其他實施方案中，用于確定生物樣品中ADA存在或不存在的方法進一步包括在將樣品與PEG接觸后洗滌沉淀。

在其他實施方案中，所述方法進一步包括在將ADA固定在基質上的步驟之前、之后或在其間將所述藥物固定在基質上。

另一方面，本文提供了用于減少藥物測定(例如藥物PK測定、藥物定量測定或藥物效力測定)中由于樣品中ADA的存在導致的干擾，所述方法包括使樣品與過量的ADA接觸以飽和游離的藥物并形成藥物/ADA復合物，使所述藥物/ADA復合物與聚乙二醇(PEG)接觸，以由此形成包含藥物/ADA復合物的沉淀，使所述沉淀與溶液接觸以解離所述藥物/ADA復合物，在酸性條件下將所述解離的藥物固定在基質上，和使用用于藥物的特定檢測劑實施藥物測定，以由此減少來自所述ADA的干擾。所述藥物測定可以是例如藥物量化測定、藥物PK測定或藥物效力測定。

在一些實施方案中，用于減少藥物測定中由于ADA的存在所致的干擾的方法進一步包括使用以可檢測的標記物標記的抗獨特型抗體確定所述樣品中所述藥物的存在或不存在或量。

在一些實施方案中，本文公開的方法進一步包括在樣品與過量的藥物接觸前將其稀釋。例如，在樣品與過量的藥物接觸前將樣品稀釋1:2、1:5、1:10、1:20倍。

在其他實施方案中，樣品包括生物樣品，其中所述生物樣品包括選自下組的材料：體液、粘液分泌物、唾液、血液、全血、血漿或血清。在一些實施方案中，所述樣品包含藥物。

在其他實施方案中，藥物包含抗體或其片段，雙親和性抗體、雙抗體、多域生物劑(如抗體藥物綴合物)、核酸(siRNA、反義寡核苷酸、基因療法藥物)、肽或多肽(天然的或修飾的)、肽模擬物、糖、脂質，或有機或無機小分子化合物，或其任意組合。在一些實施方案中，藥物包含治療性抗體、蛋白治療劑、酶、工程化的結合蛋白、工程化的抗體樣蛋白、融合蛋白、支架蛋白或其任意組合。當藥物包含抗體或其片段時，抗體可以是鼠抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在一些實施方案中，藥物是經修飾以與未經修飾形式的相同藥物相比呈現(xiàn)較少免疫原性的藥物(即藥物已經修飾以具有較少免疫原性)。

在一些實施方案中，基質包含碳表面、玻璃表面、二氧化硅表面、金屬表面、聚合材料、含有金屬或化學涂層的表面、膜、珠(例如微珠)、多孔聚合物基質或包含纖維素纖維的基質，或其任意組合。所述基質可包含聚合材料，其中所述聚合材料選自下組：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚酰胺和聚碳酸酯。

在一些實施方案中，基質包含多孔碳表面。在一個實施方案中，基質是高結合碳板。

在一些實施方案中，基質包含具有高涂覆容量的大表面。包含具有高涂覆容量的大表面的基質包括例如高結合碳板(例如MSD(Meso ScaleRockville Maryland)。

在一些實施方案中，提供的方法包括使藥物/ADA復合物與聚乙二醇(PEG)接觸以形成包含藥物/ADA復合物的沉淀。PEG包含至少一種具有1,000-40,000道爾頓的PEG化合物，包括例如至少一種選自下組的PEG化合物：PEG1000、PEG1450、PEG3000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG15000、PEG20000、PEG250000、PEG30000、PEG35000和PEG40000。

在一個或多個實施方案中，所述樣品與下述濃度的PEG接觸：約0.1％至約10.0％、約0.2％至約7.0％，約0.5％至約6.0％，約0.5％至約5.0％，約1.5％至約5.5％，約2.0％至約5.0％，約3.0％至約4.5％，約3.5％至約4.0％，約1.0％至約2.5％，約1.2％至約1.5％，或約0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、1.2％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或約10.0％PEG。

在其他實施方案中，所述方法包括使包含ADA和/或ADA/藥物復合物的沉淀與酸溶液接觸。所述酸溶液可包含有機酸、無機酸或其混合物。一些方面，所述酸溶液包含選自下組的酸：檸檬酸、異檸檬酸、谷氨酸、乙酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸、三氟乙酸、苯磺酸、氨基甲磺酸、樟腦-10-磺酸、氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、丙酸、丁酸、甘油酸、琥珀酸、蘋果酸、天冬氨酸、鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、硼酸、氫氟酸、氫溴酸，及其任意組合。在示例性的實施方案中，所述酸溶液包含乙酸。對于包括使含有ADA和/或ADA/藥物復合物的沉淀與酸溶液接觸的方法，將所述沉淀與約0.1M至約5M的濃度的酸接觸。

在其他實施方案中，所述方法包括使含有ADA和/或ADA/藥物復合物的沉淀與堿溶液接觸。所述堿溶液可包括有機堿、無機堿或其混合物。一些方面，所述堿溶液包含選自下組的堿：尿素、氫氧化鈉、氫氧化銣、氫氧化銫、氫氧化鈣、氫氧化鍶、氫氧化鋇、氫氧化鋅、氫氧化鋰、丙酮、甲胺和氨。對于包括使含有ADA和/或ADA/藥物復合物的沉淀與堿溶液接觸的方法，將所述沉淀與約0.1M至約1M的濃度的堿接觸。

一些方面，本公開內容提供抗體、抗藥物抗體和用可檢測的標記物標記(即與其綴合)的藥物。可檢測的標記物包括選自下組的標記物：半抗原、放射性同位素、酶、熒光標記物、化學發(fā)光標記物和電化學發(fā)光標記物、結合對的第一成員，及用于酶檢測反應的底物。在一個實施方案中，可檢測的標記物包括含有標記的電化學發(fā)光標記物。

在一些實施方案中，可檢測的標記物包含熒光團，其中所述熒光團選自下組：綠色熒光蛋白，藍色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素、熒光素5-異硫氰酸酯(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹磺酰氯(DNS-C1)、5-(碘乙酰胺)熒光素(5-IAF、6-丙烯酰-2-二甲氨基萘(Acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧雜-1,3,-二唑-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙錠、螢光黃、羅丹明染料(5-羧基羅丹明6G氫氯化物、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明-B-異硫氰酸酯(RITC(羅丹明-B-異硫氰酸酯)、羅丹明800)；四甲基羅丹明5-(和6-)異硫氰酸酯(TRITC))、Texas Red^TM、磺酰氯、萘磺酸包括但不限于1-苯胺萘-8-磺酸(ANS)和6-(對-甲苯胺基)萘-e-2-磺酸(TNS)、氨茴酰脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、Texas紅-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰膽堿、芴基-磷脂酰膽堿、部花青540、苯乙烯基萘、3,3'二丙基硫代二碳青色素(diS-C3-(5))、4-(對二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶鹽(di-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羥基琥珀酰亞胺、Cy-7-異硫氰酸酯、IR-125、噻唑橙、天青B、尼羅藍、鋁酞菁、噁嗪1,4',6-二脒-2-苯基吲哚。(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙錠同型二聚體、N(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、呋喃-2、鈣綠、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、Phytofiuors和Coronene(暈苯)。

在一些實施方案中，可檢測的標記物包括催化顏色改變反應的酶，其包括選自下組的酶：堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、脲酶和β-內酰胺酶和葡萄糖氧化酶。

在一些實施方案中，可檢測的標記物包括結合對的第一成員或結合對的第二成員，其中所述結合對選自下組：生物素/鏈霉親和素、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/凱普親和素、表位/抗體、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His-標簽/鎳、抗原/抗體、FLAG/M1抗體、麥芽糖結合蛋白/麥芽糖、鈣調蛋白結合蛋白/鈣調蛋白、酶-酶底物和受體-配體結合對。

在一些實施方案中，可檢測的標記物包括結合對的第一成員；且結合對的第二成員與酶、抗體表位、抗原、熒光團、放射性同位素、納米顆粒、第二結合對的成員和金屬螯合物綴合。

在其他實施方案中，可檢測的標記物包括結合對的第一成員，其中所述結合對的第一成員是生物素且所述結合對的第二成員選自下組：鏈霉親和素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和凱普親和素，且結合對的第二成員與酶綴合。

取決于待檢測的樣品數目，本文提供的方法可在人工或自動化的儀器平臺上實施。

“抗藥物抗體”或“ADA”是特異性地與藥物的任何區(qū)結合的抗體。例如，抗藥物抗體可以是抗體或其片段，所述抗體或其片段可針對藥物抗體的任何區(qū)，例如可變域、恒定域或抗體的糖結構。這種抗藥物抗體可在藥物療法過程中由于患者的免疫原性反應發(fā)生。ADA可以是任何人免疫球蛋白同種型(例如IgM、IgE、IgA、IgG、IgD)或IgG亞類(IgG1、2、3和4)之一。ADA包括來自任何動物來源的ADA，包括例如人或非人動物(例如獸醫(yī))來源。

就本說明書而言，術語“NAb”或“中和抗體”指與內源性產生的分子結合的抗體，例如抗體、核酸、肽、多肽、肽模擬物、糖或脂質。例如Nab可以是內源性產生的蛋白，如例如促紅細胞生成素或胰島素。Nab可以或可以不減少(例如中和)內源性產生的分子的至少一種生物活性。

例如，在一些方面，本公開內容提供了用于確定樣品中Nab存在或不存在的方法，所述方法包括使樣品與結合NAb以形成抗原/NAb復合物的過量的抗原接觸；使抗原/NAb復合物與聚乙二醇(PEG)接觸以形成包含抗原/NAb復合物的沉淀，使所述沉淀與溶液接觸以解離抗原/NAb復合物，將解離的Nab固定在表面和/或基質上，并確定所述Nab的存在或量。在另一方面，確定步驟包括使固定的Nab與結合Nab并綴合有可檢測的標記物的抗原接觸，并確定所述可檢測的標記物的存在或量以由此確定樣品中Nab的存在或量(效價)。

在本發(fā)明的上下文中，術語“患者”指任何具有疾病或疑似具有疾病的受試者，優(yōu)選哺乳動物，且更優(yōu)選人。如本文使用的術語“受試者”指任何動物(例如人或非人動物受試者)。在一些實例中，受試者是哺乳動物。在一些實例中，如本文使用的術語“受試者”指人(例如男性、女性或兒童)。在一些實例中，如本文使用的術語“受試者”指動物模型研究的實驗室動物。

如本文使用的術語“生物樣品”或“樣品”指獲得自或源自患者的樣品，所述樣品包含源自患者的免疫球蛋白且可因此可稱作免疫球蛋白樣品。舉例來說，生物樣品包含選自下組的材料：體液、血液、全血、血漿、血清、粘液分泌物、唾液、腦脊液(CSF)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、眼部流體(例如玻璃體液、房水)、淋巴液、淋巴結組織、脾組織、骨髓和源自一種或多種這些組織的免疫球蛋白富集組分。在一些實施方案中，樣品是或包含血清或為源自血清或血液的免疫球蛋白富含級分。樣品是或可源自(獲得自)體液或身體組織。在一些實施方案中，樣品獲得自已暴露至(如反復暴露至相同藥物)藥物的受試者。在其他實施方案中，所述樣品獲得自近期未暴露至藥物的受試者，或獲得自計劃施用藥物前的受試者。

如本文使用的術語“基質”指可結合任何ADA或藥物材料(例如抗體、核酸、肽、多肽、肽模擬物、糖、脂質或有機或無機小分子化合物)的材料或大分子復合物。基質的組成或表面應允許ADA或藥物材料在酸性條件(或堿性條件)下的結合，所述條件允許ADA/藥物復合物的解離。在一些實施方案中，這些基質具有高裝載容量，其改進敏感性，因此允許檢測以相對低的濃度存在的ADA和/或藥物材料。通常使用的基質的實例包括但不限于碳表面(例如多孔或高結合碳板)、玻璃表面、二氧化硅表面、塑料表面、金屬表面、含有金屬或化學涂層的表面、膜(例如尼龍、聚砜、二氧化硅)、微珠(例如膠乳、聚苯乙烯，或其他聚合物)、多孔聚合物基質(例如聚丙烯酰胺凝膠、多糖、聚甲基丙烯酸酯)和包含纖維素纖維的基質(例如纖維素海綿、纖維素紙)。在一方面，多孔或高結合碳板是MSD(Meso Scale)高結合板。基質可以是能夠感應靶分子的生物傳感器芯片、微陣列或芯片上實驗室(lab-on-chip)?？蓱媚軌蚋袘c生物傳感器的特異性結合的任何種類的生物傳感器，包括市售的生物傳感器，如由Biacore生產的生物傳感器。

如本文使用，通過術語“標記”修飾的實體(例如抗體、抗藥物抗體、藥物、蛋白、酶、抗體、抗體片段、多域生物治療劑(例如抗體藥物綴合物)或相關物質)包括與另一憑經驗可檢測的分子或化學實體(例如“可檢測的標記物”)綴合的任何實體。適于作為標記物用于標記的實體的化學物質包括但不限于酶、熒光染料、量子點；光染料；發(fā)光染料；和放射性核素。

如本文使用的術語“一種或多種”包括至少一種，更適當地，“一種或多種”指一、二、三、四、五、十、二十、五十、一百、五百種等。

本文公開的方式已顯示可消除ADA測定中的藥物干擾。在實踐中，該方法原理可用于減少/消除任何類型的免疫測定中的干擾。該方法原理還可用于任何針對ADA、PK和生物標記物的配體結合測定。本文所述的方法可用于配體結合測定以測試中和抗體(NAb)。配體結合測定可包括與藥物靶標結合的藥物的競爭性抑制。在PK和生物標記物測定中，可添加過量的抗體用于復合物的形成且沉淀和酸解離后，使用標記的檢測抗體進行檢測。在全部的情況中，在測定中優(yōu)化PEG的濃度以平衡敏感性和特異性是重要的。PEG的濃度越高，分子量越低的蛋白將沉淀。因此，為特異性沉淀包含靶分析物的合意的復合物(如抗體藥物復合物沉淀)，技術人員需要最小化待沉淀的未結合的非特異性蛋白的量(如血清IgM和IgG)。本研究中由于MSD高結合板的碳和多孔結構對其進行利用。基于測定設計原理，其他大容量涂覆表面也將發(fā)揮作用。

除非另外表明，本文使用的全部的技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域的技術人員通常理解具有相同的含義。本文描述了用于本發(fā)明的方法和材料；還可使用本領域已知的其他適當的方法和材料。所述材料、方法和實例僅是說明性地而非意欲限制。全部出版物、專利申請、專利、序列、數據庫登錄項和本文提及的其他參考文獻在本文通過提述以其整體并入。在沖突的情況中，以本說明書包括定義為主。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢從下文詳述和附圖和從權利要求將顯而易見。

附圖說明

圖1是根據本發(fā)明的ADA測定的實施方案的示意圖。

圖2A和2B的圖描述了檢測8μg/mL-125ng/mL水平的親和純化的兔抗體與多種濃度的藥物A(0、1、10和100μg/mL)的示例性橋接測定形式的結果，其在無酸解離的MSD橋接測定形式中測試。A.針對ADA濃度繪制觀察到的S/B以評估與無藥物的基線相比具有不同水平的藥物的抗體的回收。B.相對基線的百分比回收。ADA：MSD橋接測定：Meso Scale橋接；S/B：信號比背景。

圖3A和3B的圖描述了檢測8μg/mL-125ng/mL水平的親和純化的兔抗體與多種濃度的藥物A(0、1、10和100μg/mL)的示例性橋接測定形式的結果，其在具有酸解離的MSD橋接測定形式中測試。A.針對ADA濃度繪制觀察到的S/B以評估與無藥物的基線相比具有不同水平的藥物的抗體的回收。B.相對基線的百分比回收。S/B：信號比背景。

圖4A和4B的圖描述了檢測8μg/mL-125ng/mL水平的親和純化的兔抗體與多種濃度的藥物A(0、1、10和100μg/mL)的示例性橋接測定形式的結果，其在使用聚乙二醇沉淀的MSD橋接測定和本發(fā)明的酸解離測定形式(即PandA測定形式)中測試。A.針對ADA濃度繪制觀察到的S/B以評估與無藥物的基線相比具有不同水平的藥物的抗體的回收。B.相對基線的百分比回收。S/B：信號比背景。

圖5的圖描述了檢測無藥物的親和純化的兔抗藥物A抗體的示例性橋接測定形式的結果，其在PEG和酸(PandA)測定形式中使用MSD高結合板的三個不同批次測試。針對ADA濃度繪制觀察到的S/B。ADA：抗藥物抗體；S/B：信號比背景。

圖6的圖描述了在收集的正常血清樣品(n＝32)中檢測藥物B ADA的示例性橋接測定形式的結果，其在有和無酸解離的MSDB測定形式中評估。正常群體分布(藥物B橋接測定)。無處理＝無解離，酸處理＝具有酸解離。S/B：信號比背景。

圖7的圖描述了在收集的疾病基線血清樣品(n＝16)中檢測藥物B ADA的示例性橋接測定形式的結果，其在有和無酸解離的MSD橋接測定形式，以及PandA測定中評估以確定群體分布。

圖8A和8B的圖描述了檢測4μg/mL-31.3ng/mL水平的親和純化的兔抗體與多種濃度的藥物B(0、10、50和250μg/mL)的示例性橋接測定形式的結果，其在無酸解離的MSD橋接測定形式中檢測。A.針對ADA濃度繪制觀察到的S/B以評估與無藥物的基線相比具有不同水平的藥物的抗體的回收。B.相對基線的百分比回收。S/B：信號比背景。

圖9A和9B的圖描述了檢測4μg/mL-31.3ng/mL水平的親和純化的兔抗體與多種濃度的藥物B(0、10、50和250μg/mL)的示例性橋接測定形式的結果，其在使用PandA測定形式的MSD橋接測定中測試。A.針對ADA濃度繪制觀察到的S/B以評估與無藥物的基線相比具有不同水平的藥物的抗體的回收。B.相對基線的百分比回收。S/B：信號比背景。

圖10A和10B的圖描述了檢測8μg/mL-125ng/mL水平的親和純化的兔抗體與多種濃度的藥物C(0、2.5、25和250μg/mL)的示例性橋接測定形式的結果，其在具有酸解離的MSD橋接測定形式中檢測。A.針對ADA濃度繪制觀察到的S/B以評估與無藥物的基線相比具有不同水平的藥物的抗體的回收。B.相對基線的百分比回收。S/B：信號比背景。

圖11A和11B的圖描述了檢測8μg/mL-125ng/mL水平的親和純化的兔抗體與多種濃度的藥物C(0、2.5、25和250μg/mL)的示例性橋接測定形式的結果，其在使用PandA測定形式的MSD橋接測定中評估。A.針對ADA濃度繪制觀察到的S/B以評估與無藥物的基線相比具有不同水平的藥物的抗體的回收。B.相對基線的百分比回收。S/B：信號比背景。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了用于定性和/或定量檢測來自樣品中的ADA的新的方法，所述方法可有效減少并消除由ADA檢測中的藥物或靶引起的干擾問題。使用PEG沉淀、酸解離、在酸性條件下高容量表面上的涂覆的原理，本文所述的方法允許ADA的特異性檢測以及允許使用特異性檢測試劑的藥物或藥物靶標的檢測。所述方法可用于更廣泛的應用中，以用于減少或消除下述中的干擾：用于ADA、PK/TK的免疫測定和生物標記物(如藥物靶標)測定，以及用于檢測中和抗體的配體結合測定。

對于具有長半衰期和/或以高劑量或重復劑量施用的藥物，如基于抗體的療法，ADA通常與藥物形成循環(huán)的免疫復合物，通常使ADA不能檢測。例如，循環(huán)的藥物可干擾ADA和藥物靶標的檢測，或ADA可干擾藥代動力學(“PK”)研究和/或毒代動力學(“TK”)研究中藥物水平的檢測和/或精確定量。單克隆抗體藥物干擾，特別是來自人IgG4藥物的干擾由于其較長的半衰期和較高的劑量提出了對于ADA分析的額外挑戰(zhàn)。這種干擾的影響特異性針對免疫測定方法和平臺且可依賴于在每次各測定中使用的試劑。當藥物本身是人源化抗體治療劑時，耐藥免疫原性測定的開發(fā)變得更具挑戰(zhàn)性。

目前的使用中最廣泛使用的方法具有時間、敏感性或精確性的限制，這由與配體測定中結合伴侶相同或相似的干擾因素的存在所導致。這些干擾包括但不限于ADA測定中的藥物干擾、PK測定中的ADA和/或藥物靶標干擾、藥物靶標生物標記物測定中的藥物干擾等。通用的ADA方法是橋接測定，其中捕獲藥物(未標記或生物素標記的)和標記的檢測藥物間以多價ADA橋接。該形式對內源藥物干擾(假陰性ADA)和/或藥物靶標干擾(假陽性ADA)易感。作為分析方法開發(fā)領域中的主要挑戰(zhàn)之一，許多方法已用于減輕該問題如酸或堿解離，第三方結合伴侶競爭性抑制和/或干擾因素的去除、固相提取(SPEAD)、ACE和許多其他方法。樣品處理中酸解離配合橋接測定的使用允許藥物存在下ADA檢測的一定改進，所述測定具有改進的測定敏感性和ADA回收。使用通常允許藥物耐性中的一定改進的SPEAD和ACE一般觀察到相同的結果，但不能完全維持敏感性和相對精確性。盡管酸(或堿)解離ADA/藥物免疫復合物，一旦混合物在測定條件下中和，免疫復合物重新形成。在目前使用的ADA測定中，僅當由于ADA-藥物復合物的形成導致ADA的產生超過存在于患者血清中的藥物的量時可能檢測ADA。這種藥物干擾導致產生ADA的患者的患者數目的低估。

藥物產品特別是治療性蛋白的免疫原性是臨床和臨床前研究中的主要問題，這是由于其可導致潛在的嚴重副作用、效力的喪失和藥物暴露的改變，這使毒性、藥代動力學(PK)和藥效動力學(PD)數據復雜化。由于具有長半衰期的藥物產品如單克隆抗體數目增加，ADA測定中的藥物耐性進一步受到關注。為評估藥物的整體免疫原性潛力，對ADA的總量特別感興趣。廣泛用于檢測血清和血漿中的ADA的多種技術依賴于ADA與其靶藥物經由抗原結合位點的特異性結合。例如，橋接測定形式依賴于ADA上抗原結合位點的可用性。由于多種這樣的測定形式依賴于ADA上抗原結合位點的可用性，僅可檢測到無藥物或無部分藥物的ADA。由于特定測定材料的信號和時間的緊迫，用于在生物樣品中檢測ADA的具有改善藥物耐性的測定形式是高度需要的。

藥物耐性一般定義為仍導致可檢測的ADA信號的樣品中的游離藥物的最大量。樣品的酸處理已用于在ADA測定中改進游離藥物的耐性。減弱且最終由低pH破壞的抗體-抗原(或藥物)結合使從部分或完全藥物結合的ADA解離的游離ADA的檢測在多種免疫原性測定形式(即橋接測定形式)中成為可能，由此改善藥物耐性。然而，如在本文提供的實施例中所證明，酸處理本身不消除ADA測定中的藥物耐性。

在一些實施方案中，抗體-抗原(或藥物)結合減弱且最終由高pH破壞，使從部分或完全藥物結合的ADA解離，隨后用堿溶液處理的游離ADA的檢測在多種免疫原性測定形式中成為可能。生物藥物的結構特征如pI或一些偶共軛鍵的存在將主宰酸溶液或堿溶液是否更適于破壞ADA/藥物結合。為增加藥物耐性并提供改善的ADA測定形式，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了用于確定具有改善的藥物耐性的樣品中ADA存在或不存在的方法。預期本文所述方法包括聚乙二醇沉淀步驟和酸解離步驟。

如本文公開，本發(fā)明涉及用于確定樣品(例如生物樣品)中ADA存在或不存在的方法，所述方法包括使樣品和結合ADA以形成藥物/ADA復合物的過量的藥物接觸，使所述藥物/ADA復合物與聚乙二醇(PEG)接觸以形成包含藥物/ADA復合物的沉淀，使所述沉淀與溶液接觸以解離所述藥物/ADA復合物，將所述解離的ADA固定于基質上，和確定所述ADA的存在或量。另一方面，確定步驟包括：使所述固定的ADA與綴合有可檢測的標記物的藥物接觸；和確定所述可檢測的標記物存在或量，以由此確定所述樣品中ADA存在或不存在。

在一個實施方案中，使沉淀(藥物/ADA復合物)與酸溶液接觸以解離復合物然后以足以允許全部解離的游離藥物和游離ADA涂覆的時間涂覆在大表面(在酸性條件下以保持藥物和ADA分開)或基質(例如具有高涂覆容量的高結合碳板)上。當固定至基質表面上時酸性環(huán)境防止復合物重新形成。當將酸溶液用于解離復合物時，可將測定稱作PandA(PEG和酸)測定。

在另一實施方案中，最終沉淀(藥物/ADA復合物)用堿溶液重構以解離復合物然后以足以允許全部解離的游離藥物和游離ADA涂覆的時間涂覆至大表面(在堿性條件下以保持藥物和ADA分開)或基質(例如具有高涂覆容量的高結合碳板)上。當固定至基質表面上時堿性環(huán)境防止復合物重新形成。

酸性或堿性溶液的選擇將依賴于藥物(例如生物藥物)的參數如pI或一些共軛鍵的存在，且選擇將對藥物的完整性和結構具有最小影響。

本發(fā)明還涉及用于減少藥物PK/TK測定中由于生物樣品中ADA的存在導致的干擾的方法，所述方法包括使樣品與過量的ADA接觸以形成藥物/ADA復合物，使藥物/ADA復合物與聚乙二醇(PEG)接觸以由此形成包含藥物/ADA復合物的沉淀，使所述沉淀與酸溶液接觸由此解離藥物/ADA復合物，將解離的游離藥物和游離ADA固定至表面和/或基質上，并使用針對藥物的特定檢測試劑實施藥物PK/TK測定以由此減少來自ADA的干擾。藥物測定可以是例如藥物定量測定、藥物PK/TK測定或藥物效力測定。可將相似的原理應用于定量藥物靶標的方法作為在藥物干擾存在下用于藥物安全性和效力(PD)的生物標記物測定。將過量的藥物添加至樣品以形成藥物靶標/藥物復合物。使用PEG沉淀和酸解離(或堿解離)步驟然后使用特定藥物靶標檢測試劑。

在一些方面，本公開內容提供用于確定針對藥物的ADA的存在或不存在的方法。當引入人或其他動物的身體時，如本文使用的術語“藥物”或“藥物材料”指具有藥用、性能增強和/或興奮作用的化學物質。例如，藥物可以是有機的或無機的小分子化合物或生物治療劑(例如抗體(例如藥物抗體)或其片段，多重域生物治療劑、核酸、肽、多肽、肽模擬物、糖或脂質)，只要藥物是免疫原性的且能夠誘發(fā)免疫響應。術語“藥物抗體”指可施用至個體用于治療疾病的抗體，且如本文使用的這些抗體與ADA不同。藥物抗體的非限制性實例包括例如選自下組的抗體：muromomab-CD3、阿昔單抗、利妥昔單抗、達克珠單抗、巴利昔單抗、帕利珠單抗、英利昔單抗、曲妥珠單抗、依那西普、吉姆單抗、fresolimumab、阿侖單抗、ibritomomab、阿達木單抗、阿來塞普、奧馬珠單抗、tofacitinib、托西莫單抗、依法利珠單抗、西妥昔單抗、貝伐珠單抗、那他珠單抗、蘭尼單抗、帕尼單抗、依庫珠單抗、美泊利單抗、necitumumab、blinatumomab、nivolumab、dinutuximab、secukinumab、evolocumab、pembrolizumab、ramucirumab、vedoluzumab、siltuximab、opinutuzumab、adotrastuzumab、emtansine、raxibacumab、帕妥珠單抗、brentuximab、貝利單抗、易普利姆瑪、地諾單抗、托珠單抗、ofatumumab、canakinumab、戈利木單抗、ustekinumab、catumaxomab和賽妥珠單抗。

本文公開的方法可包括聚乙二醇(“PEG”)介導的沉淀步驟，所述步驟包括使樣品與PEG化合物接觸。所述PEG化合物可以是具有1,000-40,000道爾頓的分子量的PEG化合物。例如，所述PEG化合物包括至少一種選自下組的PEG：PEG1000、PEG1450、PEG3000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG15000、PEG20000、PEG250000、PEG30000、PEG35000和PEG40000。

選自PEG的具體濃度以最大平衡特異性和選擇性。與樣品接觸的PEG的量可對應如下濃度：約0.1％-約10.0％、約0.2％-約7.0％、約0.5％-約6.0％、約0.5％-約5.0％、約1.5％-約5.5％、約2.0％-約5.0％、約3.0％-約4.5％、約3.5％-約4.0％、約1.0％-約2.5％、約1.2％-約1.5％或約0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、1.2％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或約10.0％PEG。

所述方法可包括酸解離步驟，所述步驟包括使沉淀與酸接觸。酸可以是或包括有機酸?？商鎿Q地或此外，酸可以是或包括無機酸。在解離步驟中使用的酸可包括有機酸和無機酸的混合物。有機酸的非限制性實例包括例如檸檬酸、異檸檬酸、谷氨酸、乙酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸、三氟乙酸、苯磺酸、氨基甲磺酸、樟腦-10-磺酸、氯乙酸、溴乙酸、碘乙酸、丙酸、丁酸、甘油酸、琥珀酸、蘋果酸、天冬氨酸及其組合。無機酸的非限制性實例包括例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、硼酸、氫氟酸、氫溴酸及其混合物。

酸的量可對應下述濃度：約0.01M至約10M、約0.1M至約5M、約0.1M至約2M、約0.2M至約1M或約0.25M至約0.75M的酸或酸的混合物。在一些實例中，酸的量對應大于或等于下述的濃度：約0.01M、0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M或10M的酸或酸的混合物。酸的pH可以是例如約0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。

所述方法可包括堿解離步驟，所述步驟包括使沉淀與堿接觸。堿可以是或包括有機堿?？商鎿Q地或此外，堿可以是或包括無機堿。在解離步驟中使用的堿可以包括有機堿和無機堿的混合物。堿的非限制性實例包括例如尿素、氫氧化鈉、氫氧化銣、氫氧化銫、氫氧化鈣、氫氧化鍶、氫氧化鋇、氫氧化鋅、氫氧化鋰、丙酮、甲胺和氨，及其混合物。

當將堿溶液用于破壞ADA/藥物相互作用時，堿的量可對應下述濃度：約0.01M至約5M、約0.1M至約5M、約0.1M至約1M、約0.2M至約1M或約0.25M至約0.75M的堿或堿的混合物。在一些實例中，堿的量對應大于或等于下述濃度：約0.01M、0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M或10M的堿或堿的混合物。堿的pH可以是例如約8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5和13.0。

在一些實施方案中，使樣品與酸或堿以足以解離預先形成的藥物/ADA復合物的時間量接觸。在一些實例中，使樣品與酸或堿以下述時間段接觸(例如溫育)：約0.1小時至約24小時，例如約0.2小時至約16小時、約0.5小時至約10小時、約0.5小時至約5小時或約0.5小時至約2小時。在另外的實例中，使樣品與酸或堿以大于或等于下述的時間段接觸(例如溫育)：約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10小時。所述樣品可與酸或堿以在任何一般與所述方法兼容的溫度接觸，例如4℃、室溫(RT)或37℃。RT可以是例如22℃-26℃，例如23℃、24℃或25℃。

所述方法可包括將解離的ADA和/或藥物固定至表面和/或基質上?；|可包括碳表面、玻璃表面、二氧化硅表面、金屬表面、用聚合材料涂覆的表面、含有金屬或化學涂層的表面、膜、微珠、多孔聚合物基質。基質可包括多孔碳表面。在示例性的實施方案中，基質是具有大表面和高涂覆容量的高結合碳板。

所述方法可進一步包括確定樣品中ADA的存在或量，或藥物的存在或量。因此，本文提供了抗體、抗藥物抗體或用可檢測的標記物標記的藥物。用于本發(fā)明任何方法的可檢測的標記物的非限制性實例包括半抗原、酶、酶底物、酶抑制劑、熒光團、發(fā)色團、發(fā)光標記物、放射性同位素(包括放射性核素)和結合對的成員。可檢測標記物的強度可使用本領域的技術人員已知的儀器和設備測量，包括例如可攜帶或臺式熒光計(例如手持式熒光計)或可攜帶或臺式比色計(例如手持式比色計)。

在一些實施方案中，可檢測的標記物是電化學發(fā)光標記物，包括例如標記物。

可檢測的標記物可以是結合對的特定成員(第一成員或第二成員)。用于在本文提供的方法中使用的結合對包括例如生物素/鏈霉親和素、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/凱普親和素、表位/抗體、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His-標簽/鎳、抗原/抗體、FLAG/M1抗體、麥芽糖結合蛋白/麥芽糖、鈣調蛋白結合蛋白/鈣調蛋白、酶-酶底物和受體-配體結合對。在一些實施方案中，GlcNac結合蛋白綴合至結合對的第一成員(例如生物素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、凱普親和素、抗體、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L、GST、His-標簽、FLAG、MBP、鈣調蛋白結合蛋白、酶、受體或配體)。

如本文使用的術語“熒光標記物”和“熒光團”可互換使用且指當物質通過不同的波長激發(fā)(激發(fā)波長)發(fā)光時，發(fā)射電磁能量如一定波長的光(發(fā)射波長)的任何物質，且意在涵蓋能夠與在樣品中的感興趣的分析物相互作用或特異性反應以提供一種或多種光信號的化學物質或生化分子或其片段。

用于在本文提供的方法中的代表性熒光團包括例如綠色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素、熒光素5-異硫氰酸酯(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹磺酰氯(DNS-Cl)、5-(碘乙酰胺)熒光素(5-IAF、6-丙烯酰-2-二甲氨基萘(Acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧雜-1,3,-二唑-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙錠、螢光黃、羅丹明染料(5-羧基羅丹明6G氫氯化物、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明-B-異硫氰酸酯(RITC(羅丹明-B-異硫氰酸酯)、羅丹明800)；四甲基羅丹明5-(和6-)異硫氰酸酯(TRITC))、Texas Red^TM,磺酰氯、萘磺酸，包括但不限于1-苯胺萘-8-磺酸(ANS)和6-(對-甲苯胺基)萘-e-2-磺酸(TNS)、氨茴酰脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、Texas紅-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰膽堿、芴基-磷脂酰膽堿、部花青540、苯乙烯基萘、3,3'二丙基硫代二碳青色素(diS-C3-(5))、4-(對二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶鹽(di-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羥基琥珀酰亞胺、Cy-7-異硫氰酸酯、IR-125、噻唑橙、天青B、尼羅藍、鋁酞菁、噁嗪1,4',6-二脒-2-苯基吲哚.(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙錠同型二聚體、N(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、呋喃-2、鈣綠、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、Phytofiuors、Coronene(暈苯)和金屬配體復合物。

可用于在本文提供的方法中使用的半抗原包括例如地高辛和生物素。

在本文提供的方法中使用的酶包括例如堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶(HRP)、大豆過氧化物酶(SBP)、尿素酶、β-內酰胺酶和葡萄糖氧化酶。

一些方面，本文提供適用于確定生物樣品中ADA的存在或不存在的試劑盒。所述試劑盒可包括說明和在容器中用于使藥物/ADA復合物與聚乙二醇(PEG)接觸以形成包含藥物/ADA復合物的沉淀的試劑和用于使沉淀與酸溶液接觸以解離藥物/ADA復合物的試劑；和適于將解離的ADA或藥物固定用于進一步分析的基質。

實施例

本發(fā)明進一步以下述實施例進行描述，所述實施例不限制權利要求中所述的本發(fā)明的保護范圍。

下文的實施例描述了新型ADA測定方法，其中盡管存在高水平的抗體治療劑，抗體的完全回收以定量極限獲得。具體地，提供了三例研究以證明對于單克隆抗體治療劑(藥物A、B和C)ADA測定中藥物干擾的消除。

1.1測定形式

為改善常規(guī)免疫原性測定的藥物耐性(或消除藥物干擾)，發(fā)明人力求開發(fā)新的用于確定樣品(例如生物樣品)中ADA的存在或量的方法。發(fā)明人已成功地開發(fā)了新的方法，其中盡管存在高水平的藥物(抗體治療劑)，抗藥物抗體的完全回收以定量極限獲得。所述方法示例性實施方案的示意圖在圖1中顯示。

如圖1中所示，將過量的藥物材料添加至樣品(例如生物樣品)以允許藥物/ADA復合物形成。初始溫育后，將PEG添加至每個樣品并溫育以允許復合物沉淀。系列洗滌(例如一次或多次)后，用酸溶液重構沉淀以解離藥物/ADA復合物。將解離的藥物/ADA復合物涂覆在基質上(即涂覆在高結合MSD板的孔上)。溫育后，封閉基質然后使用以可檢測的標記物(允許通過ECL(“電化學發(fā)光”)或“增強的化學發(fā)光”的ADA檢測)標記的藥物實施檢測。

一方面，圖1中所述的方法包括將過量的藥物材料添加至樣品以飽和游離的抗體因此形成藥物/ADA復合物。復合物隨后使用PEG沉淀。將PEG以優(yōu)化的濃度添加至樣品以在維持特異性的同時實現(xiàn)合意的敏感性。系列洗滌后，用酸溶液重構最終沉淀并涂覆在高結合碳板上。酸性環(huán)境在復合物吸附至MSD高結合板的多孔碳表面上的同時防止其重新形成。總ADA水平的檢測隨后使用標記物綴合的藥物實施，隨后在Meso ScaleSector 2400電化學發(fā)光讀取器上讀取。

1.2實驗材料

治療性單克隆抗體、藥物和親和純化的兔抗藥物由Genzyme,a Sanofi Company(Framingham,MA)開發(fā)。來自健康個體的天然人血清匯集物購自Bioreclamation Inc.。疾病基線血清樣品從參與產品相關的臨床試驗的未經治療的受試者獲得。高結合96孔Meso Scale板、Sulfo Tag、Read Buffer T,Sector 2400讀取器獲得自Meso Scale(“MSD”)。PEG8000獲得自TekNova。冰乙酸由J.T Baker提供。吐溫20和脫脂干奶粉Sigma從Aldrich獲得。ELx405板洗滌劑由Biotek提供。板洗滌緩沖劑來自PerkinElmer。透明聚丙烯96孔微孔板購自Corning。牛血清白蛋白獲得自Seracare。硼酸鹽可由Sigma Aldrich，目錄號B0394獲得。

藥物A是人源化IgG1消耗抗體，其與自身免疫性疾病的淋巴細胞表面靶標結合。藥物B是全長的人IgG4，其中和在纖維化適應癥的靶組織中結合于其細胞表面受體的可溶性細胞因子。藥物C是人源化IgG4，其識別細胞表面粘附分子并阻斷其與可溶性配體的結合。

1.3無酸解離步驟的橋接免疫測定

MSD橋接測定形式需要藥物以生物素標記和以標記。根據MSD測定形式，生物素化的藥物將作為捕獲分子發(fā)揮作用且標記的藥物在橋接測定中將為報道物。

樣品最初在測定緩沖劑中1:10稀釋((300mM乙酸，2％BSA)。將樣品添加至聚丙烯板的重復的孔中并添加在測定緩沖劑中的包含等摩爾濃度的生物素-藥物和Sulfo-TAG-藥物的溶液。隨后在22-26℃、450rpm的搖床中溫育平板2小時。鏈霉親和素涂覆的MSD平板用測定緩沖劑封閉最少1小時。溫育后，洗滌MSD板3次并將50μL溫育的混合物從聚丙烯板轉至MSD板并在22-26℃的搖床上溫育2小時。溫育后，洗滌平板并添加包含三丙胺的MSD讀取緩沖劑T的溶液，并在MSD Sector成像儀2400上讀取平板。

在儀器內，施加電壓。在三丙胺存在下，在電化學發(fā)光(ECL)反應中沉淀?？贵w橋接與鏈霉親和素表面結合的Sulfo-TAG-藥物和生物素-藥物將導致ECL信號。最終溫育后，用在PBS中的0.05％吐溫洗滌平板。隨后添加讀取緩沖劑T 2x并在Sector PR2400讀取平板。電化學發(fā)光信號與每個樣品中的抗藥物抗體是成比例的。樣品的結果通過用來自個體樣品的平均ECL信號除以陰性對照的平均ECL信號轉化為信號比背景的比率(S/B)。

1.4具有酸解離步驟的橋接免疫測定

樣品最初在測定緩沖劑(300mM乙酸，2％BSA)中1:10稀釋，在22-26℃溫育45分鐘。隨后將樣品添加至聚丙烯平板的重復的孔中，并以有效中和pH至7.0的比率添加在測定緩沖劑中的包含等摩爾濃度的生物素-藥物和Sulfo-TAG-藥物以及Tris HCL的溶液。隨后在22-26℃的搖床以450rpm溫育平板2小時。將鏈霉親和素涂覆的MSD平板用測定緩沖劑封閉最少1小時。溫育后，洗滌MSD平板3次隨后將溫育的混合物從聚丙烯平板轉移至MSD平板并在22-26℃搖床上溫育2小時。溫育后，洗滌平板并添加包含三丙胺的MSD讀取緩沖劑T的溶液并在MSD Sector成像儀2400上讀取平板。

在儀器內，施加電壓。在三丙胺存在下，在電化學發(fā)光(ECL)反應中沉淀?？贵w橋接與鏈霉親和素表面結合的Sulfo-TAG-藥物和生物素-藥物將導致ECL信號。最終溫育后，用在PBS中的0.05％吐溫洗滌平板。隨后添加讀取緩沖劑T 2x并在Sector PR2400讀取平板。電化學發(fā)光信號與每個樣品中的抗藥物抗體是成比例的。樣品的結果通過用來自個體樣品的平均ECL信號除以陰性對照的平均ECL信號轉化為信號比背景的比率(S/B)。

1.5PEG和酸(PandA)步驟1

樣品最初在包含過量藥物(10-50μg/mL)的測定緩沖劑(300mM乙酸，2％BSA)中1/5稀釋并在聚丙烯平板中于37℃以450rpm溫育1小時以允許藥物和樣品中任何殘留的游離抗體之間的復合。隨后添加pH 8.0硼酸鹽中的3％PEG至每個樣品并在2-8℃溫育過夜。每個樣品中PEG緩沖液的最終濃度為1.5％。

下一天，將平板在4000rpm離心20分鐘以將復合物沉淀成丸。所述丸隨后用硼酸鹽pH 8.0中的1.5％PEG重懸并在4000rpm第二次離心20分鐘。將洗滌循環(huán)重復三次。最終濃縮后，每個樣品在100μl的300mM乙酸中懸浮并進一步1/10稀釋(20μl樣品+180μl乙酸)，使最終樣品稀釋為1/50。隨后通過添加25μl的一式兩份至MSD高結合平板的孔涂覆稀釋的樣品，并在24℃以450rpm振蕩1小時。溫育后，用1x平板洗滌緩沖劑洗滌平板，并在24℃振蕩用PBS中的3％奶封閉1小時，其后，洗滌平板并將100ng/ml的Sulfo-TAG-藥物添加至樣品并在24℃振蕩中溫育1小時。最終溫育后，用在PBS中的0.05％吐溫洗滌平板。隨后添加讀取緩沖劑T 2x并在Sector PR2400上讀取平板。電化學發(fā)光信號與每個樣品中的抗藥物抗體成比例。

在一些實施方案中，初始酸添加后的溫育步驟可在23℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、39℃或更高實施。

在一些實施方案中，最終沉淀步驟后，每個樣品可進一步稀釋至例如1:5、1:10、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50或1:60、1:80、1:100或1:200的最終樣品稀釋度。一般的最終樣品稀釋度可為<1:100，其為食品和藥物監(jiān)督管理局(FDA)設定的最低所需稀釋度(MRD)。

1.5PEG和酸(PandA)步驟2

樣品最初在包含過量藥物(10-50μg/mL)的測定緩沖劑(300mM乙酸，2％BSA)中1/5稀釋并在聚丙烯平板中于37℃以450rpm溫育1小時以允許藥物和樣品中任何殘留的游離抗體之間的復合。隨后以1:1的PEG:樣品比例將PEG溶液添加至每個樣品并在2-8℃溫育過夜。對于每個產品優(yōu)化PEG的最終濃度以使特定復合物最佳沉淀，并實現(xiàn)合意的特異性和敏感性同時最小化未復合的分子如非特異性IgG的作用。添加至樣品的PEG濃度為3％-6％(以1:1的比率添加至稀釋樣品的藥物A為3％且藥物B和C為6％)。

下一天，將平板在4000rpm離心30分鐘以將復合物沉淀成丸。所述丸隨后用PBS中的PEG重懸并在4000rpm第二次離心20分鐘。將洗滌循環(huán)額外重復一次。最終離心后，每個樣品在300mM乙酸中重懸并稀釋以實現(xiàn)對于特定測定合意的最終MRD(藥物A和C為1/50且藥物B為1/25)。隨后將樣品涂覆在MSD高結合平板的重復的孔中。隨后在24℃以450rpm振蕩溫育平板1小時。溫育后，用1x平板洗滌緩沖劑洗滌平板并在24℃振蕩用PBS中的3％奶封閉1小時。隨后，洗滌平板并將含有Sulfo-TAG-藥物的溶液添加至樣品并在24℃振蕩溫育1小時。最終溫育后，用1x平板洗滌緩沖劑洗滌平板。隨后添加讀取緩沖劑T 2x并在Sector PR2400上讀取平板。電化學發(fā)光信號與每個樣品中的抗藥物抗體成比例。

在一些實施方案中，初始酸添加后的溫育步驟可在23℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、39℃或更高實施。

在一些實施方案中，最終沉淀步驟后，每個樣品可進一步稀釋至例如1:5、1:10、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50或1:60、1:80、1:100或1:200的最終樣品稀釋度。一般的最終樣品稀釋度可為<1:100，其為食品和藥物監(jiān)督管理局(FDA)設定的最低要求稀釋度(MRD)。

2.1藥物A

敏感性藥物耐性評估

對于藥物A，比較PandA方法和具有或不具有酸解離的常規(guī)MSD橋接測定以改善藥物耐性。測定敏感性和藥物耐性使用8μg/mL-125ng/mL濃度的親和純化的兔抗藥物確定，其在MSD橋接測定形式中，具有或不具有多種濃度(0、0.1、10和100μg/mL)藥物(藥物A)、具有(圖2A-B)和不具有(圖3A-B)酸解離。包含ADA和藥物的樣品在匯集的正常人血清中制備并在37℃溫育至少1小時允許藥物/ADA復合物在測定前形成。

通過評價40個正常人血清樣品、計算樣品的均值和標準偏差并計算1.645倍標準偏差的第95百分位的因子并將其添加至均值來確定切割點(cut point)，如通常所建議的。對于藥物A，將新的方法與具有或不具有酸解離的常規(guī)橋接測定進行比較用于藥物耐性。

圖2是比較無酸解離的MSD橋接測定的數據總結。結果指示藥物不存在下對于ADA檢測的強劑量響應，且用1μg/mL的藥物看到抑制(圖2A)。圖2B指示抗體檢測的低回收率，在所檢測的1μg/mL最低藥物濃度在125ng/mL的ADA為約10％。(圖2B)藥物不存在下，用1μg/mL的藥物，測定敏感性從15ng/mL減少至342ng/mL。100μg/mL的藥物存在下，敏感性減少至5143ng/mL或5.1μg/mL。

圖3是來自具有酸解離的MSD橋接測定形式的數據總結。藥物不存在下對于ADA檢測，結果指示對無酸的橋接測定的相似的劑量響應，且用1μg/mL的藥物看到抑制。(圖3A)1μg/mL藥物的百分比回收率仍是可接受的，但在低于藥物Cmax的10μg/mL藥物，在125ng/mL的ADA回收率減少至35％。(圖3B)測定檢測敏感性對于1和10μg/mL的藥物維持在約15ng/mL，而100μg/mL藥物存在下，發(fā)現(xiàn)為262ng/mL。盡管測定的敏感性滿足該方法中提出的250-500ng/mL的準則，該發(fā)現(xiàn)對該產物和抗體組合是特異性的且對于其他產物或以不同抗體對照是不可接受的。

圖4A和4B是來自PandA(步驟2)沉淀形式的數據的總結。結果指示藥物不存在下的可接受的劑量響應，且由于在樣品中存在藥物而未看到顯著抑制。(圖4A)當與不具有藥物作為參照的樣品結果進行比較時，百分比回收率保持為可接受的大多為80-120％而無論樣品中存在的藥物的量。(圖4B)相似地，盡管藥物以100μg/mL存在(比藥物A的預期Cmax高3-4倍)但測定檢測敏感性維持在9-14ng/mL。

表1是每種測試的方法中，在測試的藥物A的多種濃度對于ADA檢測的測定敏感性的總結。測定敏感性濃度通過從圖2A、3A和4A所示的每個抗體曲線回擬合S/B切割點而獲得。ADA：抗藥物抗體；S/B：信號比背景。

表1.

如表1所示，盡管存在100μg/mL的藥物，PandA方法不僅改進藥物耐性還將測定敏感性維持在9-14ng/mL?？贵w檢測回收率保持在大多80-120％而無論存在于樣品中藥物的量，其優(yōu)于具有酸解離的橋接免疫測定。

效價結果比較

PandA方法還可用于精確報告藥物存在下的抗體效價。為確定終點效價是否在僅包含抗體的樣品(0μg/ml藥物)和包含等量抗體和高藥物濃度(100μg/mL藥物)的其他樣品之間相關，在其中兩種不同滴定方案后實施滴定稀釋的方法中分析測試樣品。第一方案在PEG沉淀前并入滴定且第二方案在涂覆于高結合平板前并入滴定。終點效價在相同抗體水平的無藥物和包含藥物的樣品之間以及在基于測定效價切割點值(1.2的S/B)的滴定方案之間相同。終點效價數據總結與表2。

表2.

3.1.MSD高結合平板(批對批(lot to lot))和整體精確性

為確定MSD高結合平板是否有助于測定變化性，樣品的涂覆在三個不同批次上實施。繪制數據并使用ANOVA對等價性進行分析。

為確定MSD高結合平板是否有助于測定變化性，樣品的涂覆在三個不同批次上實施。樣品包含了具有多種濃度的藥物的親和純化的兔抗體。如圖5所示，針對平板的三個批次的每一個的ADA濃度繪制觀察到的S/B。平板批次間的精確性發(fā)現(xiàn)是可接受的，其中CV小于20％(表3)且ANOVA在三個批次間未顯示顯著差異，其中p值為0.1776。

4.1藥物B

具有酸解離的MSD橋接測定中的靶干擾

對于藥物B，在具有酸解離的MSD橋接測定中看到特定的挑戰(zhàn)，這是由于藥物B的靶標在低pH從單體變?yōu)槎垠w引起假陽性結果。在具有酸解離的MSD橋接測定中，在100％正常血清樣品和疾病基線樣品中看到二聚化效應。該現(xiàn)象與Dai等[Dai S,Schantz A,Clements-Egan A,Cannon M,Shankar G:Development of a method that eliminates false-positive results due to nerve growth factor interference in the assessment of fulranumab immunogenicity.AAPS J.16(3),464-477(2014)]所報導的相似，其中發(fā)現(xiàn)了抗藥物抗體(ADA)在階段1研究中的明顯高的發(fā)生率是同二聚體藥物靶標檢測的結果，這是由于其橋接藥物分子的能力。Dai等發(fā)現(xiàn)用于緩解藥物干擾的樣品的基于酸解離的預處理顯著增加了藥物靶標干擾。

為證明測定中由于酸解離和假陽性結果導致的藥物靶標的內源性靶標二聚化效應，正常的(n＝32)和基線疾病(n＝16)血清樣品在具有或不具有酸解離的橋接測定中分析以突出測定中由于酸解離和假陽性結果導致的內源性靶標二聚化的效應。

圖6是在具有或不具有酸解離的MSD橋接測定中檢測的正常血清樣品的代表。在無酸處理組中觀察到測定背景或其附近的正常分布(左側群體)，而當將酸解離應用至橋接測定時以大于20的S/B觀察到一些陽性結果。

圖7是當在無或有酸解離的MSD橋接測定以及PEG和酸(PandA)方法中分析時，疾病基線血清樣品的代表。在無酸處理的MSD橋接和PandA方法之間結果是可比較的，而酸處理導致大量測試樣品的更高S/B水平，指示由于在低pH的二聚化效應所致的來自藥物靶標的干擾。

如圖6和7所示，對于藥物B，具有酸解離的橋接測定在正?；蚣膊∪后w中是不可行的，這是由于在較低pH藥物靶標的二聚化引起全部樣品的假陽性結果，其中結果與內源性靶標的量成比例。由于該原因，藥物B的測定敏感性和藥物耐性僅在PandA方法和現(xiàn)有的無酸解離的MSD橋接測定之間是可比較的。

圖8A-B和9A-B是比較無酸解離的橋接測定形式與PEG和酸方法(PandA)的藥物B的數據總結。

圖8A中，MSD橋接測定形式導致藥物不存在下ADA檢測的可接受的劑量響應，且用10μg/mL看到完全抑制且敏感性從不存在藥物下的47ng/mL減少至具有10μg/mL藥物的2μg/mL抗體。

對于藥物B，無酸解離的橋接測定敏感性在50ng/mL驗證，其中藥物耐性不良。250ng/mL的藥物水平抑制250ng/mL的抗-藥物B抗體的檢測且1μg/mL的藥物水平抑制500ng/mL的抗體檢測。

圖9A-B是來自PandA沉淀形式的數據的總結。結果指示藥物不存在下可接受的劑量響應且未看到由于樣品中藥物存在所致的抑制。當與無藥物作為參照的樣品結果相比時，百分比回收率保持為可接受的大多為80-120％而無論樣品中存在的藥物量。測定檢測敏感性維持在39-63ng/mL，盡管藥物以高于預期Cmax的250μg/mL存在。

5.1藥物C

敏感性和藥物耐性評估

對于藥物C，在新方法和其中不能實現(xiàn)預期藥物耐性的現(xiàn)有的具有酸解離的MSD橋接測定之間，比較了測定敏感性和藥物耐性。

圖10A-B和11A-B是比較具有酸解離的橋接測定形式與PEG和酸方法(PandA)的藥物C的數據總結。

在圖10A-B中，MSD橋接測定形式導致藥物不存在下可接受的敏感性，但盡管橋接免疫測定中進行酸處理，以少至2.5μg/mL的藥物可見抑制。25μg/mL存在下測定的敏感性從227ng/mL變?yōu)?788ng/mL且在250μg/mL的藥物(在一些臨床樣品中預期的水平)存在下抗體完全是不可檢測的

圖11A-B顯示PandA結果優(yōu)于具有酸解離的橋接免疫測定，其中即使存在250μg/mL的藥物，抗體檢測以完全的回收維持。當與無藥物作為參照的樣品結果相比時，觀察到百分比回收率大多為80-120％無論樣品中存在的藥物量。盡管藥物以250μg/mL(高于臨床樣品中所預期的)存在，測定檢測敏感性維持在129-175ng/mL。

上文實施例描述了三種人源化單克隆抗體A-C(IgG1和2種IgG4藥物)的病例研究。

相比MSD橋接測定中通常使用的測定解離方法，三種藥物特異性PandAADA測定導致包含超過患者中所預期的藥物水平的樣品中ADA的完全回收。該突破性的新方法顯示超越現(xiàn)有方法的顯著改進。事實上，在全部三種情況中藥物干擾或ADA的低檢測完全消除，且該測定原理可不僅用于ADA測定還可用于干擾因素存在下的PK和生物標記物(藥物靶標)分析。

本文所述的PandA ADA測定方法顯示可有效改進包含超過臨床相關的干擾水平的樣品中ADA的檢測和回收。所述方法還報告一致的抗體效價，而無論藥物的存在量。該方法顯示優(yōu)于基于具有酸解離的橋接測定的常規(guī)方案，其在超過預期臨床Cmax水平的藥物水平維持ADA檢測敏感性且無顯著抑制。

PandA方法還可應用至PK測定，其中ADA或藥物靶標是干擾性的。簡單地說，添加過量的抗體(抗獨特型)或靶標以形成復合物且將使用特異性針對藥物的標記的抗獨特型進行檢測。此外，所述方法可應用于具有潛在藥物干擾的藥物靶標生物標記物的測定?？傊l(fā)明人已描述了復合物PEG沉淀的新應用，其分解藥物并可能靶向ADA免疫測定中的干擾。

多種不同的方法和平臺已以有限的成功用于解決檢測ADA的免疫測定中的循環(huán)藥物干擾。本文公開了采用PEG和酸(PandA)的新方法，其消除ADA免疫測定中藥物和可能的靶標干擾。新方法顯示在高藥物濃度的藥物干擾的完全消除并證明了相對于基于無或甚至具有酸解離的MSD橋接測定的常規(guī)方案維持測定敏感性。通過采用下列測定組分，PandA測定已證明其在藥物和/或藥物靶標存在下選擇性和特異性地檢測ADA的意欲用途：添加過濾藥物材料以形成藥物/ADA復合物；使用聚乙二醇沉淀以得到總ADA；酸解離并在酸性溶液中在具有高容量的高結合碳板上涂覆重構的沉淀物以允許結合解離的ADA；并用ECL輸出特異性地檢測總ADA水平綴合藥物。

此外，該方法還報導一致的抗體效價，而無論存在于樣品中的藥物量，其顯示測定精確性。還報導的是，方法有效解決了由于在具有酸解離的MSD橋接免疫測定中的靶二聚化引起假陽性結果的靶干擾。

總之，所述方法優(yōu)于具有酸解離的常規(guī)橋接方法，如通過上述報告的三項主要研究證據所證明的，其中用樣品中的高藥物量實現(xiàn)了樣品中ADA的完全回收和檢測。根據目前的監(jiān)管預期和測試的臨床樣品成功驗證了該方法。

本文所述的PandA方法已顯示在過量藥物存在下對于ADA檢測的顯著改善。基于原理其具有廣泛應用：(1)飽和游離的分析物以形成復合物中全結合的分析物和(2)沉淀復合物(3)酸解離以游離分析物而無中和，從而在酸性條件下將游離的分析物涂覆至大涂覆表面上來固定游離的分析物時減少分析物的再結合，和(4)使用特定的試劑檢測游離的分析物。在上述實施例中，發(fā)明人已提供了三種免疫原性病例研究以證明該新技術的效用。

其他實施方案

應該理解的是盡管本發(fā)明已結合其發(fā)明詳述進行了描述，上文的描述意欲說明而非限制本發(fā)明的范圍，所述范圍通過所附的權利要求書定義。其他方面、優(yōu)勢和修飾都在下述權利要求書的范圍內。