本公開內(nèi)容涉及確定血液或血漿樣品中的抗凝劑的測定。背景抗凝劑是抑制、減少或消除血液或血漿凝結(jié)的能力的物質(zhì)–抗凝劑減少纖維蛋白原被轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的速率。一些抗凝劑是天然存在的、內(nèi)源的，并在限制體內(nèi)血液凝結(jié)的發(fā)作、蔓延速度和空間擴(kuò)展中起到重要的生理作用。其他抗凝劑在病理?xiàng)l件下出現(xiàn)。在蛇毒素和在蚊子、水蛭、蝙蝠和壁虱的分泌物中發(fā)現(xiàn)了抗凝劑。一個(gè)越來越多的抗凝劑的組是為了治療和預(yù)防血栓栓塞紊亂的目的產(chǎn)生的人造物質(zhì)。血液凝結(jié)是復(fù)雜的現(xiàn)象，包括在血漿中或在參與的細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的許多相互作用的分子。存在許多細(xì)胞和分子相互作用，包括可被抗凝劑的作用下調(diào)或破壞的許多酶催化反應(yīng)。直接作用的抗凝劑抑制、妨礙或消除凝血過程中關(guān)鍵酶(凝血酶(FIIa)或活化的凝血因子X(FXa))的一種或二者的酶促作用。間接作用的抗凝劑以一些其他方式起作用，其中之一是增強(qiáng)直接作用抑制劑的功效。在一般治療使用的抗凝劑之中，肝素是間接作用抗凝劑且維生素-K拮抗劑(華法林(warfarin))是凝血因子水平的一般減少者。直接作用抗凝劑是水蛭素(水蛭的一種蛋白)和最近產(chǎn)生的FIIa或FXa的抑制劑。這些新的直接作用抗凝劑，特別是可口服施用的那些，DOAC或還稱為NOAC(非維生素K口服抗凝劑)，正在導(dǎo)致臨床和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)中的顯著變化?？鼓齽┚哂胁煌饔媚Ｊ降氖聦?shí)對實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)在設(shè)計(jì)可確定抗凝劑的方法方面構(gòu)成挑戰(zhàn)。在一定程度上，這一挑戰(zhàn)被在產(chǎn)生治療血栓栓塞紊亂的新物質(zhì)方面的最近藥理學(xué)成功加劇，參見例如J.Harenburg,S.Marx和R.Determinationoftheanticoagulationeffectsoftheneworalanticoagulants:anunmetneed,ExpertReviewofHaematology,February2012,Vol.5,No.1,Pages107-113。在有許多可用的檢測和合格的人員來解釋結(jié)果的中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室，檢測和確定DOAC表現(xiàn)為相對直接-FIIa抑制劑和FXa抑制劑可分別通過凝血酶時(shí)間(TT)檢驗(yàn)或FXa檢驗(yàn)來測定。如果這些檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)變化形式不滿足要求，標(biāo)準(zhǔn)變化形式的一些修改或“稀釋”將滿足要求。在初級護(hù)理中心和在醫(yī)院內(nèi)但遠(yuǎn)離中心實(shí)驗(yàn)室的位置、場所，“場所外(off-site)”，情況是不同的。在POC場所(床邊護(hù)理(PointofCare))的實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)的特征是，不同的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的數(shù)目是有限的，因?yàn)榇祟悓?shí)驗(yàn)室場所的物理空間是有限的且因?yàn)楹细竦膶?shí)驗(yàn)室人員的可用性是有限的。在凝血中，最可用的POC檢驗(yàn)是凝血酶原檢驗(yàn)(PT-檢驗(yàn))，結(jié)果以INR(國際歸一化比率，即，樣品的PT與通過對歸一化指數(shù)(一種靈敏度指數(shù))加權(quán)而歸一化的常態(tài)PT之間的比率)表示。其他“例行”或“常見”凝血檢驗(yàn)是活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)、活化的凝血時(shí)間(ACT)和所提到的TT。凝血領(lǐng)域中理想主義專家希望，這些“例行”或“常見”凝血檢驗(yàn)可被調(diào)整、修改、“稀釋”，以滿足測定“新”抗凝劑特別是NOAC中的POC需求。此類想法/希望例如由E.J.Favaloro和G.Lippi,Theneworalanticoagulantsandthefutureofhaemostasislaboratorytesting,BiochemiaMedica2012；22(3):329-41表述。由于PT-INR是用于凝血測量的最常見可用的POC檢驗(yàn)，可藉以確定NOAC的修改的PT檢驗(yàn)或“稀釋的PT”是高度期望的。存在在此類方向的已報(bào)道的研究工作。大多數(shù)PT檢驗(yàn)對于直接FXa抑制劑諸如利伐沙班(rivaroxaban)的低靈敏度是已知的。C.Kluft在EP2405274A1中公開，被某種蛇毒RVV-V影響的PT檢驗(yàn)還顯示對利伐沙班的靈敏度，并公開了利用此類促凝血酶原激酶的PT檢驗(yàn)的使用。發(fā)現(xiàn)通過一些PT檢驗(yàn)(無論修改與否)確定NOAC的方式的希望，在近年已經(jīng)下降。在2014年1月，T.Lindahl，瑞典的凝血的外部質(zhì)量團(tuán)體(coagulationoftheexternalqualityorganizationofSweden),EQUALIS的專家組成員，報(bào)告了由專家組對一種FXa抑制物質(zhì)aprixaban進(jìn)行的研究。結(jié)論是，許多市售可得的PT或APTT檢驗(yàn)都不能用于在臨床相關(guān)濃度確定血漿中的aprixaban。另一方面，F(xiàn)Xa檢驗(yàn)針對此目的工作良好。必須提到的是，由于在用維生素K拮抗劑治療的患者的血液中發(fā)現(xiàn)的非功能性凝血因子pivka的可變抗凝作用而校正PT結(jié)果的努力。US7,767,459B2(J.Horsti)通過由任何給定PT方法的標(biāo)準(zhǔn)程序測量血漿的PT，和在用生理緩沖液諸如9g/lNaCl預(yù)稀釋血漿后測量血漿的PT，來提供此。隨后將表示為秒或INR的PT結(jié)果對最終血漿稀釋的程度繪圖并外推到零。血漿在零的最終稀釋的PT，減去正常血漿的，被作為pivka作用的量度，并用于校正原始PT結(jié)果。已經(jīng)設(shè)想了新的凝血檢驗(yàn)，目的是確定數(shù)種不同種類的抗凝劑，特別是肝素和NOAC。這些努力證明了確定這些抗凝劑的臨床重要性。參見CalatzisA,PeletzD,HaasS,SpannaglM,RudinK,WilmerM,Prothromibnase-inducedClottingTimeAssayforDeterminationoftheAnticoagulantEffectsofUFHandLMWH,Fondaparinux,andThrombinInhibitors,AmJClinPathol2008；130:446-454，和SamamaMM,MartinoliJL,LeFlemL,GuinetC,Plu-BureauG,DepasseF,Assessmentoflaboratoryassaystomeasurerivaroxaban–anoral,directfactorXainhibitor,ThrombHaemost2010；103/4:815-825。本發(fā)明的相關(guān)背景是濕化學(xué)方法和干化學(xué)方法之間的區(qū)別。濕化學(xué)定義為在血液或血漿的凝血測定中，混合一定體積的樣品和一定體積的試劑。因此，樣品在反應(yīng)混合物中被稀釋至某一程度。在干化學(xué)中，這種稀釋不發(fā)生。將樣品與干燥形式的試劑物質(zhì)混合或接觸，且無樣品的稀釋。大多數(shù)POC檢驗(yàn)是干化學(xué)檢驗(yàn)，因?yàn)樗鼈兺ǔ？梢匀菀资褂玫男问嚼鐥l帶或芯片展示。操作者通常僅需要加入小體積的樣品。干化學(xué)方法的缺點(diǎn)是，檢驗(yàn)更難以修改。濕化學(xué)程序賦予的一個(gè)自由度因素，樣品稀釋的程度的變化，對于干化學(xué)不可用。每次提到“例行”檢驗(yàn)的“稀釋”修改是以濕化學(xué)作為前提。概述本公開內(nèi)容的目的是提供確定血液或血漿樣品中的抗凝劑的測定，所述測定包括用至少兩種濕化學(xué)凝血酶原時(shí)間(PT)方法的分析，所述測定被設(shè)計(jì)以可適用于確定血液或血漿樣品中直接和間接抗凝劑二者。本發(fā)明由所附的獨(dú)立權(quán)利要求限定。在從屬權(quán)利要求、附圖和以下描述中列出了實(shí)施方案。根據(jù)第一方面，提供了一種確定血液或血漿樣品中的抗凝劑的測定，其中所述測定包括用至少兩種濕化學(xué)凝血酶原時(shí)間(PT)方法的分析。所述測定包括以下步驟：a)在用第一PT方法的第一PT分析中，在包含在第一體積的包含促凝血酶原激酶、纖維蛋白原和凝血因子V的液體試劑中稀釋的第一體積的血液或血漿的第一反應(yīng)混合物中測量PT，b)在用第二PT方法的第二PT分析中，在包含在第二體積的液體試劑中稀釋的第二體積的血液或血漿的第二反應(yīng)混合物中測量PT，其中所述第二反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度不同于所述第一反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度。所述至少兩種PT方法被校正以當(dāng)用于分析缺少該測定感興趣的抗凝劑的參考血液或血漿時(shí)給出相同或大致相同的PT結(jié)果。所述測定還包括步驟c)計(jì)算來自步驟a)和b)中的測量結(jié)果的PT差異，其中如果PT差異是1)顯著的，這指示血液或血漿樣品中抗凝劑的存在，或2)不顯著的，這指示血液或血漿樣品中不存在高于可檢測水平的抗凝劑。用至少兩種PT方法的分析在本文是指，該測定可包括用2、3、4、5或多達(dá)6種PT方法的分析。PT差異在本文是指絕對差異或相對差異。該測定中使用的至少兩種PT方法可以是基本上相同的PT方法，但具有一些可表現(xiàn)不顯著的差異。此類差異，除了由本發(fā)明提供的差異，即樣品體積和試劑體積之間的關(guān)系的差異以外，可以是進(jìn)行測量的溫度的差異和反應(yīng)混合物的離子強(qiáng)度或pH的差異。濕化學(xué)PT方法在本文是指Owren型PT方法。反應(yīng)混合物中血液或血漿的體積與液體試劑的體積之間的比率可取決于PT試劑的特征和樣品中待檢測的抗凝劑的濃度而大大變化。當(dāng)實(shí)踐測定時(shí)，不存在血液或血漿樣品可在PT試劑中如何少和如何大范圍稀釋的嚴(yán)格限制，限制是實(shí)踐性質(zhì)的。血液或血漿樣品稀釋在液體試劑中的較低水平是約1:2。在較低稀釋度，測定的一些有利的特征可能失去，例如檸檬酸化的樣品不再是可分析的。最高的可能的稀釋度將是明顯較高的，約1:200。如此高的稀釋度可以是可能的，由于反應(yīng)混合物的纖維蛋白原和FV的必需水平不必來自樣品。這是因?yàn)?，Owren類型的液體PT試劑，除了促凝血酶原激酶以外，還包含有效水平的纖維蛋白原和FV。還是對于Owren類型的液體試劑，對最終樣品稀釋的程度存在實(shí)踐限制。在反應(yīng)混合物中非常低水平的血液或血漿樣品下，F(xiàn)VII、FX和FII的水平也如此低，以至于凝血時(shí)間(PT)變得如此長，以至于檢測變得困難或不可能。因此，在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)，血液或血漿的體積與反應(yīng)混合物中液體試劑的體積之間的比率可以在1:2和1:200之間變化。優(yōu)選的比率范圍可以是在1:5和1:100之間或1:10和1:50之間。在本測定中，在至少兩種反應(yīng)混合物中分析PT，所述至少兩種反應(yīng)混合物具有在反應(yīng)混合物中不同濃度的血液或血漿。第一反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度可以比第二反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度高約1.5至100倍、1.5至50倍、1.5至25倍、1.5至10倍或1.5至5倍。1.5至5倍的濃度差異對于實(shí)現(xiàn)是實(shí)際的，并在本測定顯示允許確定在臨床相關(guān)濃度范圍中的抗凝劑。然后，第二反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度可以比可能的第三反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度高約1.5至100倍、1.5至50倍、1.5至25倍、1.5至10倍或1.5至5倍。盡管反應(yīng)混合物中血液或血漿濃度的差異，測定的所有兩種或更多種不同PT方法被用缺少感興趣的抗凝劑的相關(guān)參考血液或血漿樣品校準(zhǔn)，以給出相同或大致相同的PT結(jié)果。這一PT以使其可能的方式表示。以通常的時(shí)間單位表示將不可行，因?yàn)檫@些將在方法之間變化，并是其原樣(不能被校準(zhǔn))。具有低濃度的血液或血漿的反應(yīng)混合物顯示長的PT:s且反之亦然。表示PT的一種普通方式是以INR(國際化標(biāo)準(zhǔn)化比率)，但其他表達(dá)方式，各種合成的(synthetic)時(shí)間樣單位、或其比率，是可能的。重要的是，提供的缺少抗凝劑的相關(guān)樣品，經(jīng)兩種或更多種PT方法分析，將產(chǎn)生盡可能接近相同的結(jié)果。比較來自一種PT方法的結(jié)果與來自另一種PT方法的結(jié)果的一個(gè)普通方式是平均PT結(jié)果和比較的CV(變異系數(shù))。校準(zhǔn)是使得，缺少抗凝劑的多個(gè)相關(guān)樣品的平均PT結(jié)果對于所有的兩種或更多種PT方法應(yīng)盡可能接近地相同，且比較的CV應(yīng)盡可能低。至少兩種PT方法可被校準(zhǔn)，使得當(dāng)用于分析來自正常個(gè)體的參考血液或血漿和此類參考血液或血漿的稀釋物時(shí)，給出相同或大致相同的PT結(jié)果。來自正常個(gè)體的參考血液或血漿在本文是指來自未經(jīng)受抗凝劑處理的一個(gè)或數(shù)個(gè)表面上健康的人的血液或血漿或此類樣品的集合(pool)。至少兩種PT方法可被校準(zhǔn)，使得當(dāng)用于分析這樣的血液或血漿時(shí)給出相同或大致相同的PT結(jié)果，該血液或血漿缺少本測定感興趣的抗凝劑(來自單個(gè)或許多個(gè)體或來自不同個(gè)體的樣品的集合)且該血液或血漿通過一種或數(shù)種已建立的PT方法確定具有高于正常的PT值。在測定的步驟c)中，計(jì)算PT測量結(jié)果之間PT的絕對或相對差異。術(shù)語“顯著”和“不顯著”在本文以其常規(guī)統(tǒng)計(jì)學(xué)定義提供。然后，顯著差異是2倍CV或更多的相對差異，不顯著差異小于2倍CV。盡管表述不同，觀察到的差異如果在由測定確定缺少抗凝劑的樣品群體中具有低的發(fā)生概率，則是顯著的。這一概率可設(shè)置在不同水平。通常水平是5％(p<0.05)或1％(p<0.01)。如果在步驟c)中計(jì)算的PT差異是顯著的且已知抗凝劑的身份，則可計(jì)算血液或血漿樣品中抗凝劑的濃度。如果在步驟c)中計(jì)算的PT差異是不顯著的且已知抗凝劑的身份，則可指定抗凝劑不以高于其的水平存在于所述血液或血漿樣品中的水平。如果在步驟c)中計(jì)算的PT差異是顯著的，則在抗凝劑的不存在下血液或血漿樣品中估計(jì)的PT是可計(jì)算的。僅當(dāng)抗凝劑的身份是已知的或推測的時(shí)，可進(jìn)行血液或血漿樣品中抗凝劑濃度的計(jì)算。如果已經(jīng)進(jìn)行了用兩種PT方法的分析，使用PT結(jié)果的差異和來自具有最高樣品稀釋度的分析的PT結(jié)果用于這一計(jì)算可以是方便的。在最高稀釋度的PT結(jié)果將最接近無抗凝劑存在時(shí)的PT結(jié)果。利用INR形式體系，這一假想的PT結(jié)果稱為INRo。依據(jù)對抗凝劑水平的劑量響應(yīng)是否是線性的，INRo可通過減去差異的分?jǐn)?shù)或減去差異的函數(shù)來獲得。由于劑量響應(yīng)可依賴于這一INRo和依賴于進(jìn)行確定的溫度，差異的大小向抗凝劑濃度的轉(zhuǎn)化可要求許多所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？蛇x地，多維函數(shù)可被采用來計(jì)算INRo和抗凝劑水平。如果用多于兩種PT方法的分析已被進(jìn)行以實(shí)踐本發(fā)明的測定，可計(jì)算多于一種差異，且這些若干差異、和在最高樣品稀釋度獲得的PT值，可被用于計(jì)算INRo和可能的抗凝劑水平(取決于抗凝劑的身份)。偏好差異之一作為最有用的也是可能的，因?yàn)槠涫怯糜诖_定的有利范圍。PT測量可在17℃至45℃的范圍、優(yōu)選地在18℃至30℃的范圍、更優(yōu)選地在21℃至30℃的范圍，且最優(yōu)選地在25℃至30℃的范圍內(nèi)的環(huán)境溫度進(jìn)行。低于但不遠(yuǎn)離30℃的此類溫度區(qū)間是有利的，因?yàn)樵摐囟葞缀醪挥绊慞T，從而改進(jìn)提供的PT分析的精確度。此外，在以下實(shí)施例中，較低的溫度增加抗凝劑的測定靈敏度。在本測定中可確定的抗凝劑是包括活化的凝血因子IIa和Xa的直接作用抑制劑的組的成員，其可選自包括達(dá)比加群(dabigatran)、apixaban、rivaroxaban或水蛭素的組，或是包括活化的凝血因子IIa和Xa的間接作用抑制劑的組的成員，其可選自包括分級的或未分級的肝素的組。第一反應(yīng)混合物中液體試劑的第一體積可等于第二反應(yīng)混合物中液體試劑的第二體積。在液體試劑中稀釋的血液或血漿的體積可以是在1至20μL的范圍中?？梢杂枚藢Χ嗣?xì)管將血液或血漿的體積加入到液體試劑。反應(yīng)混合物中血液或血漿的體積與液體試劑的體積之間的比率可以是1:2至1:200、1:5至1:100或1:10至1:50。第一反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度可以比第二反應(yīng)混合物中血液或血漿的濃度高約1.5至100倍、1.5至50倍、1.5至25倍、1.5至10倍或1.5至5倍。反應(yīng)混合物可包括在10至50mM的范圍、在10至30mM的范圍或在10至24mM的范圍的最終濃度的鈣離子。反應(yīng)混合物中鈣的最終濃度在本文是指反應(yīng)混合物中的總鈣，其主要作為游離Ca2+，但還有絡(luò)合的鈣離子。對于包含所示濃度的鈣的反應(yīng)混合物，凝血抑制劑可通過測定確定的靈敏度可被增強(qiáng)。過度高的鈣水平應(yīng)被避免，由于增加的Ca2+水平將漸進(jìn)地延長凝血時(shí)間，這通常是不利的。反應(yīng)混合物的克分子滲透壓濃度可以是約0.3至0.5Osm/kg、或約0.3至0.4Osm/kg。這樣的克分子滲透壓濃度水平可通過增加PT試劑中的NaCl水平以使PT試劑高滲(比血漿和其他生理溶液更高的滲透壓)，因此也使得反應(yīng)混合物高滲，來獲得。這樣的克分子滲透壓濃度水平可增加抗凝劑測定靈敏度。然而，如果NaCl水平過高，凝血時(shí)間可變得過度長。反應(yīng)混合物中增加的克分子滲透壓濃度和增加的鈣水平的組合可增加抗凝劑測定的靈敏度以給出最有利的高靈敏度。附圖簡述圖1是顯示在正常血漿中用本測定測量的apixaban含量的圖。圖2是圖1的圖的部分的放大。圖3是顯示在正常血漿中用本測定測量的apixaban含量的圖(原始數(shù)據(jù)：PT以秒計(jì))。圖4是圖3的圖的部分的放大。圖5是顯示在正常血液中用本測定測量的apixaban含量的圖。圖6是圖5的圖的部分的放大。圖7是顯示在正常血液中用本測定測量的達(dá)比加群含量的圖。圖8是圖7的圖的部分的放大。圖9是顯示在正常血漿中用本測定測量的肝素含量的圖。圖10是圖9的圖的部分的放大。圖11是顯示，當(dāng)測量來自正常個(gè)體和用華法林治療的患者的參考樣品時(shí)，對于5μl和20μl方法，PT20c/PT5c針對平均PTc的相對差異的圖。圖12是顯示，當(dāng)測量來自正常個(gè)體和用華法林治療的患者的參考樣品時(shí)，對于5μl和20μl方法，PT20c-PT5c針對平均PTc的絕對差異的圖。圖13是顯示，當(dāng)測量來自正常個(gè)體和用華法林治療的患者的參考樣品和來自用達(dá)比加群治療的患者的樣品時(shí)，對于5μl和20μl方法，PT20c/PT5c針對平均PTc的相對差異的圖。圖14是顯示，當(dāng)測量來自正常個(gè)體和用華法林治療的患者的參考樣品和來自用達(dá)比加群治療的患者的樣品時(shí)，對于5μl和20μl方法，PT20c-PT5c針對平均PTc的絕對差異的圖。圖15是顯示，當(dāng)測量來自正常個(gè)體和用華法林治療的患者的參考樣品和來自用達(dá)比加群治療的患者的樣品時(shí)，對于5μl和20μl方法，PT20/PT5針對平均PT的相對的未校準(zhǔn)差異的圖。圖16是顯示，當(dāng)測量來自正常個(gè)體和用華法林治療的患者的參考樣品和來自用達(dá)比加群治療的患者的樣品時(shí)，對于5μl和20μl方法，PT20c/PT5c針對平均校準(zhǔn)的PT的相對的校準(zhǔn)差異的圖。詳細(xì)描述提供了以下實(shí)施例，并非限制本發(fā)明的范圍，而是進(jìn)一步解釋和描述本發(fā)明，和鼓勵在這一重要醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中的開發(fā)。實(shí)驗(yàn)工作用市售可得的環(huán)境室溫凝血儀器SimpleSimonPTZafenaAB,Sweden進(jìn)行，其功能在EP1636595B2中描述。對于每種PT方法使用一個(gè)儀器或讀取器(reader)?？蛇x地，對于所有PT方法可使用相同的儀器。在實(shí)施例1至6中，對于三種PT方法即20μL方法、10μL方法和5μL方法的每一種，使用一個(gè)特定讀取器。在與實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境室溫?zé)崞胶獾膶?shí)驗(yàn)臺上，一起使用彼此相鄰放置的三個(gè)儀器。對于給定的PT確定，每個(gè)儀器以秒展示PT，如在表2中報(bào)告的。而且，經(jīng)由每個(gè)讀取器的內(nèi)部數(shù)據(jù)處理能力，展示了對于每種PT方法，樣品INR的粗略估值。這些粗略INR估值在表1、3和4中報(bào)告。由于，在每個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)中，還分析了相關(guān)參考樣品，來自每種PT方法的結(jié)果可在完成實(shí)驗(yàn)系列后在單獨(dú)的辦公室臺階段(officedesksession)中校準(zhǔn)。無論由不同PT方法的兩種或更多種確定的原始PT數(shù)據(jù)如何表示，在利用參考樣品校準(zhǔn)后，不同的PT方法顯示盡可能接近的相同PT。在進(jìn)行研究工作的實(shí)驗(yàn)室中的環(huán)境室溫在21℃和26℃之間變化。低于但不遠(yuǎn)離30℃的溫度區(qū)間是有利的，因?yàn)樵摐囟却撕髱缀醪挥绊慞T，從而改進(jìn)提供的PT分析的精確度。此外，在以下實(shí)施例中，較低溫度增加抗凝劑的測定靈敏度。然而，在17-45℃的范圍中的溫度進(jìn)行測定是可能的。PT試劑是與SimpleSimonPT產(chǎn)品的批次N223M一起分發(fā)的PT試劑，是Owren類型的試劑，因此含有有效量的促凝血酶原激酶、纖維蛋白原和FV(兔腦來源的促凝血酶原激酶和牛血漿來源的纖維蛋白原和FV)。也可使用其他Owren類型的試劑。試劑是以200μL的份，向其加入樣品檸檬酸化的血液或檸檬酸化的血漿并混合。加入通過安裝在管狀主體一端的端對端塑料毛細(xì)管進(jìn)行，該管狀主體在另一端帶有替換機(jī)械，這是為了允許方便地混合樣品和試劑。帶有10μL毛細(xì)管的此類Mixxocaps與SimpleSimonPT產(chǎn)品一起供應(yīng)。為了進(jìn)行所描述的實(shí)驗(yàn)，對一些Mixxocaps安裝20μL毛細(xì)管或5μL毛細(xì)管，代替由制造商與其一起供應(yīng)的10μL毛細(xì)管。可選地，可使用標(biāo)準(zhǔn)移液管或類似物混合血液或血漿樣品與液體試劑。實(shí)驗(yàn)中使用的血液或血漿體積與液體試劑的體積之間的比率是1:11、1:21和1:41。可使用在1:5與1:100的范圍或在1:2與1:200的范圍中的其他比率。實(shí)驗(yàn)的測定中使用的不同反應(yīng)混合物之間血液或血漿濃度的差異是在1.5至5倍之間。然而，濃度的差異可以是約1.5倍至100倍?？鼓恼Ｑ獫{是NKP產(chǎn)品GHI-163批次10188,MediRoxAB,Sweden。包含100mg/L的達(dá)比加群(Pradaxa,Boehringer-Ingelheim)和apixaban(Eliquis,Bristol-MeyersSquibb)的儲備溶液是DepartmentofExperimentalMedicineofUniversity的TomasLindahl教授所贈。未分級肝素是HeparinLeo批次A6888B,LeoPharmaA/S,Ballerup,Denmark。實(shí)施例1apixaban是活化的凝血因子X(FXa)的直接作用抑制劑。其是抗凝血藥物Eliquis,Bristol-MeyersSquibb的活性化合物。測量血漿中在范圍50至1000μg/L中的apixaban是臨床上感興趣的。為了制備合適的樣品，將小體積的apixaban儲備溶液加入正常血漿即對照血漿NKP，以得到apixaban含量在范圍0至1000μg/L中的正常血漿。這些具有apixaban的正常血漿，包括無攙雜的正常血漿(NKP)和在9g/LNaCl中1:2稀釋的NKP(NKP1:2)，都由SimpleSimonPT來分析，該分析以在200μL試劑中20μL、10μL和5μL的樣品添加進(jìn)行，從而對于三種PT方法，使用根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)混合物中的不同樣品含量。還相關(guān)的是，根據(jù)本發(fā)明，校準(zhǔn)了所有三種PT方法，對于無攙雜的NKP顯示INR1.000和，且對于NKP1:2顯示INR1.357。所有原始INR值，即在儀器屏幕(對于每種PT方法使用一個(gè)儀器或讀板器讀取器)顯示的結(jié)果，從而通過式A*INRexp(B)轉(zhuǎn)化為校正的/校準(zhǔn)的INRc，其中a和b被選擇以分別為NKP和NKP1:2給出其期望值，分別為1.000和1.357。NKP1:2的INR值通過Lindahl等的對于對應(yīng)50％(等于INR1.000的100％的一半)的PT活性的INR的公式計(jì)算。數(shù)據(jù)處理在表1中示出。在INR校準(zhǔn)的列(INRc)上方存在上方數(shù)字(uppernumber)和下方數(shù)字(lowernumber)，這些分別是以上提到的A和B。表1顯示了正常血漿的apixaban含量的兩種測量結(jié)果：更靈敏的量度，即PT方法提供的20μL樣品和5μL樣品的INRc的差異；和較不靈敏的量度，即10μL和5μL之間的INRc差異。INRc差異在此處顯示為絕對差異，但相對INRc差異已經(jīng)可以同等良好地使用。將INRc差異對正常血漿的apixaban含量繪圖，如在圖1的圖中所示的。正方形符號是20μL方法的結(jié)果與5μL方法的結(jié)果之間的INRc差異，且圓形符號是10μL方法的結(jié)果與5μL方法的結(jié)果之間的INRc差異。指出了，在抗凝劑的不存在下估計(jì)正常血漿的INR即INRo是可能的。在以上，這以較不復(fù)雜的方式進(jìn)行。從5μL樣品方法的INRo結(jié)果減去較小INRo差異的部分(56％)，結(jié)果明顯最接近INRo。這些簡單的INRo估值令人驚訝地好，只有在最高apixaban含量(1000μg/L)的一個(gè)偏離多于十分之一的INR單位。圖1和2顯示圖，其中apixaban含量的測量值的增加速率隨著含量增加。然而，對于領(lǐng)會/偏好線性劑量響應(yīng)關(guān)系的那些許多，此類關(guān)系在本文由低1個(gè)INR單位的apixaban測量值展示，如在圖2的圖中觀察到的，其中圖2顯示圖1的圖的部分的放大。圖1和2顯示的數(shù)據(jù)處理對于不熟悉INR的環(huán)境室溫確定的人們可能是令人困惑的。代替已經(jīng)由儀器/讀取器的計(jì)算針對溫度效應(yīng)校正的原始INR結(jié)果，我們可以改為考慮以秒計(jì)的PT。進(jìn)行此以增加描述本發(fā)明的清楚性，盡管由于在進(jìn)行測定的時(shí)間段期間不嚴(yán)格恒定的溫度(溫度從22.3℃到24.2℃變化)引入誤差。盡管存在這一偏差，結(jié)果仍然是足夠好以令人信服的，并更清楚地解釋，因?yàn)槠湓试S本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的數(shù)據(jù)處理，即，通過將PT(以秒計(jì))除以正常PT，和用等價(jià)于ISI的歸一化常數(shù)對比率加權(quán)來計(jì)算INR。在表2中，顯示了對具有加入的apixaban的正常血漿(NKP)進(jìn)行的測定的結(jié)果，但原始數(shù)據(jù)在此處是以按秒計(jì)的PT計(jì)的，且數(shù)據(jù)通過除以正常血漿的PT并將比率經(jīng)受ISI的加權(quán)來轉(zhuǎn)化為INRc，上方數(shù)字和下方數(shù)字分別在INRc列的上方顯示。由于視為相關(guān)，上方數(shù)字被選擇以使NKP1:2顯示INRc1.357。在表2中，數(shù)據(jù)被從頂部的22.3℃到底部的24.2℃運(yùn)行的溫度梯度偏置。然而，這幾乎不干擾總的圖。使用的PT方法即環(huán)境溫度Owrens方法，對抑制劑比其他更靈敏，仍然明顯的是，單個(gè)選擇的PT方法在較低水平的apixaban將不會提供較有用的信息。表2假設(shè)你利用三種方法中對apixaban最靈敏的方法，具有20μL樣品的方法，且你獲得35.2秒的PT。這比正常血漿(NKP)的32.8秒要多，但PT的增加是否是由于抗凝劑，或是由于凝血因子的低含量(NKP1:2的PT是36.9秒)？你如何判斷？測定的實(shí)踐，用在反應(yīng)混合物中具有不同樣品含量的PT方法進(jìn)行兩種或更多種PT確定的測定實(shí)踐，提供了更清楚的描繪。由于被校準(zhǔn)以顯示相同PT(在本文相同的INR稱為INRc，c代表校準(zhǔn)的)的方法對于缺少待確定的抗凝劑的樣品是不同的，在具有低凝血因子含量的樣品的INRc結(jié)果之間將存在較少差異或無差異，即無顯著差異。在本實(shí)施例中，已知樣品包含抗凝劑apixaban，因?yàn)槠湟驯患尤耄页霈F(xiàn)INRc結(jié)果的差異。在本實(shí)施例中存在根據(jù)本發(fā)明使用的三種PT方法，且在INRc結(jié)果中存在可被檢查的三種差異(三種中的兩種在表2中顯示)，且對于具有50μg/Lapixaban的正常血漿的測定，所有三種差異指示抗凝劑的存在。如果抗凝劑的身份是已知的，其含量可被估計(jì)。INRc差異在此處顯示為絕對差異，但相對INRc差異已經(jīng)可以同等良好地使用。還可估計(jì)在抑制劑的不存在下樣品的預(yù)計(jì)INRc即INRo。表2顯示以秒計(jì)的PT，澄清了實(shí)踐本發(fā)明的實(shí)用性。預(yù)計(jì)表2中顯示的結(jié)果與表1中的那些接近相同，且它們相當(dāng)良好地一致。對具有最高apixaban含量的樣品注意到的差異歸咎于溫度效應(yīng)。當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)系列時(shí)，溫度升高約2℃。在報(bào)告表1中顯示的INR值之前，儀器已經(jīng)補(bǔ)償了這一溫度轉(zhuǎn)變的效應(yīng)。當(dāng)然，表2中顯示的PT值(以秒計(jì)的凝血時(shí)間)未對這一溫度效應(yīng)校正(以秒計(jì)的PT是其原樣)。因此在表1和表2中顯示INR的小差異。在圖3和4的圖中，已經(jīng)插入了來自表2的數(shù)據(jù)。將INRc差異對正常血漿的apixaban含量繪圖(由PT方法提供的20μL樣品與5μL樣品之間的INRc差異(方形)、和10μL與5μL之間的INRc差異(點(diǎn)))。圖4中的圖是圖3的圖的部分的放大。實(shí)施例2將在0至1000μg/L的范圍中的apixaban加入到正常的檸檬酸化的血液。這些血液樣品和具有INR2.3的血液樣品由SimpleSimonPT利用200μL試劑中20μL、10μL和5μL的樣品體積分析。INR的原始結(jié)果和在相關(guān)校準(zhǔn)后的INRc在表3中展示。0,870,931,010,961,101,151,5apixabanINRINRINRINRcINRcINRcΔINRcΔINRcμg/L20μL血液10μL血液5μL血液20μL血液10μL血液5μL血液20μL-5μL10μL-5μLINRo10008,763,502,216,943,692,514,431,180,747146,062,781,874,882,862,082,800,780,915004,582,271,663,732,291,811,920,481,092502,611,641,322,181,601,390,790,211,071251,751,321,131,491,261,160,320,101,02631,411,191,041,211,121,060,150,060,9601,161,060,001,001,001,000,00-0,01N-血液0,371,161,060,991,001,001,000,00-0,01C-血液2,32,762,272,052,302,302,300,000,00表3在這里對所有三種PT方法進(jìn)行了判定，無apixaban添加的正常血液顯示INRc1.00，且由中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室報(bào)告顯示INR2.3的檸檬酸化血液在這里顯示INRc2.30。如在前面的實(shí)施例中的，INRc結(jié)果的絕對差異(可選地可使用相對差異)被視為抗凝劑含量(這里是apixaban含量)的量度，并就三種可能的此類差異的兩種對已知的apixaban含量繪圖和展示在圖5和6中。PT方法提供的20μL樣品與5μL樣品之間的INRc差異顯示為方形，且10μL與5μL之間的INRc差異顯示為點(diǎn)。圖6中的圖是圖5的圖的部分的放大。本發(fā)明的抗凝劑方法的劑量響應(yīng)顯示血液中臨床上感興趣的apixaban的范圍內(nèi)的良好陽性劑量響應(yīng)特征。劑量響應(yīng)對于小于1的INRc差異也是線性的，參見圖6。實(shí)施例3達(dá)比加群是當(dāng)含達(dá)比加群酯(dabigatran-etexilate)的藥物制劑Pradaxa,Boehringer-Ingelheim經(jīng)口，即口服，施用時(shí)，體內(nèi)形成的活性化合物。感興趣的臨床水平范圍從血漿中50至1000μg/L。此類樣品通過向正常血漿NKP加入小體積的達(dá)比加群儲備溶液來產(chǎn)生。結(jié)果和數(shù)據(jù)處理與實(shí)施例1的相似，顯示在表4中。表4比較表4與實(shí)施例1中的表1時(shí)，表現(xiàn)為，本發(fā)明展示的實(shí)施方案對于血漿中的達(dá)比加群不如對于apixaban靈敏。當(dāng)比較圖7和8中的圖與實(shí)施例1的相應(yīng)圖時(shí)，這一印象被加強(qiáng)。圖(參見圖8，圖7中的圖的部分的放大)的線性部分中更靈敏的INRc差異(20μL減5μL，在圖7和8中顯示為方形)在約200μg/L達(dá)比加群達(dá)到0.5，而在約80μg/Lapixaban達(dá)到相同數(shù)目，參見圖2，即，多于兩倍的靈敏度差異。而且，50μg/L達(dá)比加群的達(dá)比加群水平表現(xiàn)為可檢測的。不令人驚訝地，確定抗凝劑的測定對不同抗凝劑顯示不同的靈敏度。此外，以不同試劑和進(jìn)行PT分析的不同溫度預(yù)計(jì)不同的靈敏度。實(shí)施例4肝素是一種抗凝劑，其難以在護(hù)理場所諸如在外科病房可靠地確定。需要更方便的方法。在這方面，本測定確定抗凝劑的實(shí)用性在以下示例。本實(shí)施例是用未分級的肝素，其通常在大量外科手術(shù)中用作抗凝血劑。樣品通過向正常血漿NKP加入小體積的肝素儲備溶液來制備。在選擇的校準(zhǔn)中，分別對NKP和NKP1∶2分配INR1.000和INR1.357，這與以上實(shí)施例1和3中選擇的相關(guān)校準(zhǔn)相同。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)與實(shí)施例1和3相同，且結(jié)果和數(shù)據(jù)處理在表5顯示。0,950,940,961,321,120,98NKPINRcINRcINRcΔINRcΔINRc0,43肝素U/ml20μL樣品10μL樣品5μL樣品20μL樣品10μL樣品5μL樣品20μL-5μL10μL-5μLINRo56,472,101,3511,172,161,299,880,870,912,52,461,401,133,121,371,082,040,290,961,21,471,191,111,581,141,060,520,081,030,61,261,121,081,291,061,030,260,031,0201,041,061,051,001,001,000,000,001,00NKP1,041,061,051,001,001,00NKP1∶21,311,391,431,361,361,36表5將正常血漿中抗凝劑含量的量度即可能的三種差異的兩種的INRc的絕對差異(可選地可使用相對差異)對肝素含量繪圖，得到圖9和10中的圖。如從表5和圖9和10觀察到的，肝素可在約0.2U/mL被檢測到和在濃度范圍0.2至5U/mL中確定，這是臨床相關(guān)的。實(shí)施例5根據(jù)本抗凝劑測定，兩種或更多種PT方法(其中一種在反應(yīng)混合物中具有比另一種更大比例的樣品)被校準(zhǔn)以對缺少感興趣的抗凝劑(即，缺少可被本測定確定的抗凝劑)的參考樣品顯示盡可能接近相同的PT。在定義上，參考樣品的PT是已知的，其作為一組參考樣品的平均值或是單獨(dú)的。在本實(shí)施例中參考樣品有兩種；來自正常個(gè)體的血漿樣品(n＝34)和來自用華法林治療的患者的血漿樣品(n＝30)。參考樣品的PT是由在UniversityHospitalofSweden的中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的參考分析已知的。正常個(gè)體和華法林患者的平均參考PT分別是23.1和51.5秒。本抗凝劑測定的兩個(gè)PT方法，一個(gè)是20μL樣品加入到200μLPT試劑(反應(yīng)混合物中較高比例的樣品)，另一個(gè)是5μL樣品加入到200μL相同試劑(反應(yīng)混合物中較低比例的樣品)。這兩種方法對于正常個(gè)體和華法林患者的參考樣品分別顯示32.8和65.3秒、以及41.8和104.3秒的平均PT。兩種PT方法即20μL方法和5μL方法然后被校準(zhǔn)以顯示相同的平均PT(以合成的(synthetic)秒計(jì))，作為用于兩組參考樣品的參考方法。這通過常數(shù)A20和B20、以及A5和B5，由表達(dá)式PTc＝A*PTexpB分別將20μL方法和5μL方法的PT轉(zhuǎn)化為校準(zhǔn)的PT值(PTc)來實(shí)現(xiàn)。計(jì)算兩種方法對每種樣品的PTc的差異，表示為比率(PT20c/PT5c)或以絕對方式(PT20c減PT5c)，并將其對兩種方法的平均PTc繪圖，參見圖11和12?；颊呓M(圖中標(biāo)為X)中兩份參考樣品顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上在由其他參考樣品(方形)定義的差異的正常分布之外的差異。這些偏離的樣品可包含抗凝劑肝素，肝素是可被本抗凝劑測定確定的抗凝劑(參見實(shí)施例4)，且其在華法林治療無效時(shí)被用于治療一些住院華法林患者。使用在測定的兩種PT方法的校準(zhǔn)的PT結(jié)果之間的相對差異(圖11)或絕對差異(圖12)是一種選擇。這里，表示為比率的相對差異由于標(biāo)準(zhǔn)偏差在正常的PT范圍中與升高的PT范圍中大致相同，分別是0.054和0.044，展示了益處，。懷疑含有肝素的患者樣品的PTc比率展示與平均值的陽性偏差為由其他28份患者樣品定義的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3.0和4.5倍。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，這兩個(gè)偏離值不太可能是由其他患者樣品定義的PTc比率的分布的部分，p<0.05。用于分析正常個(gè)體的34份參考血漿和華法林患者的30份參考血漿的相同實(shí)驗(yàn)設(shè)置也用于分析來自正在經(jīng)歷達(dá)比加群(一種抑制凝血酶的NOAC)或?qū)⒁_始此類治療的患者的血漿樣品(n＝13)。13份患者血漿樣品來自DepartmentofAcuteInternalMedicineoftheUniversityHospitalofSweden。將表示為比率或絕對數(shù)目的患者血漿(標(biāo)為X)的PT20c和PT5c的差異，引入?yún)⒖紭悠?標(biāo)為方形)的圖中，如在圖13和14中分別觀察到的。3個(gè)NOAC患者顯示的PTc差異升高在由參考樣品定義的正常分布以外。根據(jù)確定達(dá)比加群的已建立的方法，即稀釋的凝血酶時(shí)間(dTT)方法，顯示升高的PTc差異的三份樣品分別含有172、224和350μg/L達(dá)比加群。來自NOAC患者的其他10份血漿樣品，都未顯示升高的PTc差異，根據(jù)dTT方法都包含<30μg/L達(dá)比加群。有趣的是，在13份達(dá)比加群患者樣品中有數(shù)份樣品以20μL方法和5μL方法顯示升高的PTc值，但方法之間無顯著差異。該發(fā)現(xiàn)與華法林治療的作用而不是達(dá)比加群治療的作用一致。因此，公開的抗凝劑測定能夠進(jìn)行區(qū)分。因此，該測定能夠估計(jì)樣品的PT和NOAC(抗凝劑)含量二者。樣品對達(dá)比加群的不包含，即<30μg/L，由不顯著的PTc差異展示。這一發(fā)現(xiàn)由用于達(dá)比加群確定的已建立方法(dTT)證實(shí)。根據(jù)dTT確定，通過本測定13份樣品中具有不顯著的PTc差異的的所有10份，包含<30μg/L。在實(shí)踐抗凝劑測定時(shí)，兩種PT方法(一種具有反應(yīng)混合物中高樣品含量和一種具有反應(yīng)混合物中低樣品含量)被校準(zhǔn)以數(shù)字上顯示PT的參考水平。此處，在本實(shí)施例中，測定的兩種方法的PT結(jié)果被校準(zhǔn)以顯示所謂的合成時(shí)間，不是實(shí)際的秒，而是反映參考方法的以秒計(jì)的PT的數(shù)值。如果參考樣品的PT以INR表示，則本發(fā)明的方法被校準(zhǔn)以提供與這些參考樣品盡可能地接近的相同INR。如果參考樣品的參考PT以正常PT的百分比表示，則這些值被用在校準(zhǔn)中。實(shí)施例6如以上實(shí)施例5中的，本抗凝劑測定的兩種或更多種PT方法(一個(gè)具有比另一個(gè)高的反應(yīng)混合物中樣品含量)，都被校準(zhǔn)以顯示兩組參考樣品的參考PT結(jié)果；34份血漿來自正常個(gè)體且30份血漿來自華法林治療的患者。所有參考PT值由UniversityHospitalofSweden的中心實(shí)驗(yàn)室確定。如在實(shí)施例5A中的，兩種PT方法，一種是20μL樣品加入到200μLPT試劑，另一種是5μL樣品加入到相同PT試劑。未校準(zhǔn)的PT結(jié)果稱為PT20和PT5，且校準(zhǔn)的PT結(jié)果分別稱為PT20c和PT5c。還由該兩種PT方法分析了來自在DepartmentofAcuteInternalMedicineoftheUniversityHospitalofSweden的達(dá)比加群治療的患者的血漿樣品(n＝20)。根據(jù)也在實(shí)施例5中提到的已建立的dTT方法，所有20份血漿樣品具有高于34μg/L的達(dá)比加群水平。在圖15和16中，分別在校準(zhǔn)之前和之后，將測定的兩種PT結(jié)果之間的差異(以比率表示)對兩種PT結(jié)果的平均值繪圖。在圖中，方形顯示參考樣品的結(jié)果，且X顯示NOAC(達(dá)比加群)樣品的結(jié)果。校準(zhǔn)前，圖15，正常參考樣品顯示約35秒的平均PT，且華法林患者參考樣品顯示范圍從約65至110秒的平均PT。校準(zhǔn)后，圖16，正常參考樣品的平均PT(平均PTc)是23.1–不是實(shí)際的秒而是合成的–且華法林患者參考樣品的平均PTc范圍從約40至70。校準(zhǔn)后，當(dāng)然，這些平均值和范圍與通過參考方法獲得的那些非常接近相同，即，它們反映參考值。在比較圖15和圖16時(shí)，明顯的是，校準(zhǔn)導(dǎo)致本抗凝劑測定的決定性的改進(jìn)。直接統(tǒng)計(jì)分析顯示，約80％的臨床達(dá)比加群樣品(參見圖16)具有可檢測水平的抗凝劑(PTc比率高于正常參考樣品的平均值加2*SD)。在校準(zhǔn)之前，這是僅70％，參見圖15。如果未進(jìn)行校準(zhǔn)，需要設(shè)想更復(fù)雜、較不直覺的統(tǒng)計(jì)分析。校準(zhǔn)后，達(dá)比加群樣品顯示范圍更寬、更適合定量NOAC確定的PT差異(PTc差異)。并非最不重要的是測定的邏輯，如由操作者構(gòu)思的。校準(zhǔn)后，反應(yīng)混合物中較高比例樣品的一種PT方法將對具有抗凝劑的樣品顯示比利用較低比例樣品的PT方法更高的PT值-如果樣品中不存在可檢測水平的抗凝劑，兩種PT方法當(dāng)然將顯示大致相同。如果沒有校準(zhǔn)，沒有如此直接的邏輯。抗凝劑測定的兩種PT方法可被校準(zhǔn)以顯示參考樣品的參考值，無論參考值被如何表示。參考值可(如在本實(shí)施例中的)以PT(秒)表示，或它們可以INR表示或表示為正?；钚缘姆?jǐn)?shù)。在所有情形中，校準(zhǔn)是可能和有利的。實(shí)施例7實(shí)施例5和6顯示增加使用的抗凝劑測定的靈敏度的需要，因?yàn)閮H約80％的具有高于30μg/L(根據(jù)已建立的達(dá)比加群方法(dTT))的達(dá)比加群水平的臨床樣品展示高于測定的檢測限值的抗凝劑水平，參見圖16(注意，檢測限值實(shí)際上是沿著1.1的水平線)。本實(shí)施例描述目的是改進(jìn)測定的靈敏度而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。表6展示來自其中PT液體試劑(批次P161)包含4、8、16或32mM的各種水平的加入的CaCl2的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。對于每一種試劑，由抗凝劑測定的兩種PT方法即20μL方法和5μL方法分析三種樣品。兩種樣品是參考樣品即對照血漿NKP和ZAP，分別具有1.00和2.50的已建立的INR值。第三種樣品是已向其加入小體積的apixaban儲備溶液以得到500μg/L的apixaban濃度的NKP。然后校準(zhǔn)每種試劑的結(jié)果以對NKP顯示1.00的INRc和對ZAP顯示2.50的INRc。帶有500μg/Lapixaban的NKP(NKP+500)然后顯示多種INR20c和INR5c結(jié)果。針對每種試劑計(jì)算表示為比率INR20c/INR5c的差異，并展示在表6中右邊第二列中。為了獲得靈敏度的量度，從對NKP+500樣品觀察的比率INR20c/INR5c估計(jì)檢測限值。這一估計(jì)在以下假設(shè)下進(jìn)行i)對于所有試劑，正常參考血漿的比率的SD是0.052(這一值從實(shí)施例6中的數(shù)據(jù)獲得，和ii)比率減一與成比例地從零增加達(dá)比加群水平。在這些假設(shè)下，對每種試劑的檢測限值計(jì)算為比率達(dá)到一加0.104(2*SD)時(shí)的達(dá)比加群水平。計(jì)算的檢測限值在表6的最右列中展示。最高檢測限值(最低靈敏度)是約94μg/L，以包含4mMCaCl2的試劑獲得。對于包含8mMCaCl2的試劑，靈敏度更高且檢測限值是約70μg/L，且對于包含16mMCaCl2的試劑，靈敏度又更高且檢測限值是38μg/L。更高的試劑CaCl2含量(24和32mM)不進(jìn)一步增加靈敏度和檢測限值，保持在與試劑中16mMCaCl2大致相同的水平。表6表6顯示，PT試劑中范圍為約10至50mM的離子化的鈣的含量導(dǎo)致本抗凝劑測定的增加的靈敏度。這表現(xiàn)為降低的檢測限值。由于試劑僅被樣品的加入少量地稀釋，反應(yīng)混合物中離子化鈣的水平與PT試劑中的大致相同(20μL方法中稀釋約10％，且5μL方法中稀釋約3％)。結(jié)果是令人驚訝和出乎意料的，因?yàn)殡x子化鈣的水平在標(biāo)準(zhǔn)PT方法的反應(yīng)混合物中通常是約8mM。這一水平通常通過加入可溶的鈣鹽CaCl2到PT試劑來達(dá)到，但其他鈣離子來源是可能的，包括氫氧化鈣、乳酸鈣和其他包含非干擾性陰離子的可溶的鈣鹽。甚至加入金屬鈣是可能的，盡管較不實(shí)際。PT反應(yīng)混合物中離子化鈣濃度的增加導(dǎo)致達(dá)到凝血點(diǎn)所需的時(shí)間即凝血時(shí)間的逐步增加。對于5μL方法和NKP樣品(INR1.00)，對于反應(yīng)混合物中約4、8、16、24和32mM的鈣離子濃度，凝血時(shí)間分別是42.1、47.4、52.5、70.1和82.1秒。高于測定靈敏度的有利增加所需水平的離子化鈣水平的增加，由于增加凝血時(shí)間被認(rèn)為是不利的。因此，優(yōu)選的離子化鈣離子濃度水平在10和30mM之間的范圍中，或甚至在10和24mM之間的范圍中。在凝血反應(yīng)中，離子化的鎂通常可代替離子化鈣的功能。在此處也可以如此。因此，陳述的離子化鈣水平的限值可視為離子化鈣水平和離子化鎂水平的總和的限值。在目的是增加抗凝劑測定的靈敏度的另外的實(shí)驗(yàn)中，增加PT試劑中的NaCl水平以使PT試劑高滲(比血漿和其他生理溶液更高的滲透壓)，因此也使得反應(yīng)混合物高滲。這增加抗凝劑測定的靈敏度?？鼓齽y定靈敏度被增加的克分子滲透壓濃度的增加也在范圍上受限，因?yàn)槿绻鸑aCl水平過高，凝血時(shí)間可變的過度長。在實(shí)踐中，為了增加抗凝劑測定的靈敏度，反應(yīng)混合物的克分子滲透壓濃度可被增加到0.3至0.5Osm/kg的范圍，或可甚至更限于0.3至0.4Osm/kg的范圍。通常，PT方法的反應(yīng)混合物的克分子滲透壓濃度非常接近生理0.308Osm/kg，這與0.154MNaCl溶液相同?？稍O(shè)想的是，增加抗凝劑測定的靈敏度的以上描述的措施的組合可被組合以提供最有利的高靈敏度。反應(yīng)混合物可通過加入NaCl到0.3至0.4Osm/kg之間的范圍并具有在范圍12至30mM的離子化鈣水平來變得高滲。當(dāng)前第1頁1 2 3