本專利申請以申請?zhí)枮?2/009,126在2014年6月6日申請的美國專利申請作為優(yōu)先權(quán)。上述專利申請的所有內(nèi)容和公開都結(jié)合在本申請中。在本專利申請中所引用的各參考文獻(xiàn)和公開都在此合并到本專利申請中從而更全面地描述本發(fā)明從屬的
技術(shù)領(lǐng)域：
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技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒(viruses)、病毒顆粒(viralparticles)、病毒樣顆粒(virus-likeparticle,“VLPs”)和重組病毒載體(recombinantviralvectors)的量化和分析。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防由包膜或無包膜病毒引起的感染性疾病的產(chǎn)品的開發(fā)以及含有包膜或無包膜病毒或病毒樣顆粒的產(chǎn)品的評估。本發(fā)明還涉及用于基因治療應(yīng)用的產(chǎn)品的開發(fā)以及含有用于基因治療的重組病毒載體的產(chǎn)品的評估。
背景技術(shù)：
：病毒的復(fù)制與繁殖需要依靠原核或真核細(xì)胞來進(jìn)行。當(dāng)病毒接觸到易感細(xì)胞時，它會附著于該細(xì)胞，然后進(jìn)入其中。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，病毒就會劫持細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)器并命令其生成所需的成分來組裝更多的病毒拷貝。經(jīng)過一段時間后，病毒拷貝會通過使細(xì)胞破裂或通過細(xì)胞膜出芽的方式離開細(xì)胞。病毒可根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，其中是否具有或缺乏磷脂雙層包膜是進(jìn)行分類最關(guān)鍵的標(biāo)準(zhǔn)。在人類和獸類病原體中均可找到包膜和無包膜病毒?？谔阋卟《?FootandMouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV)引起的口蹄疫(FootandMouthDisease,FMD)，是由無包膜病毒引起的最重要的獸類疾病之一。牛輪狀病毒(Rotaviruses)可導(dǎo)致新生牛犢腹瀉，是另一個無包膜病毒的例子，對牲畜生產(chǎn)力引致重大的影響。一些引起獸類疾病的包膜病毒的例子包括：牛皰疹病毒-1型(BovineHerpesviruses1，BoHV-1或BHV-1)和牛皰疹病毒-5型(BovineHerpesviruses5，BoHV-5或BHV-5)，為可分別導(dǎo)致傳染性牛鼻氣管炎和牛皰疹性腦炎的病原體；與牛呼吸道疾病綜合癥(Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRD)相關(guān)的牛副流感病毒-3型(BovineParainfluenzaVirus3，PI3或BPIV-3)；可在動物和人類中引起致死性腦炎的狂犬病病毒(RabiesVirus)。口蹄疫是一種嚴(yán)重且高度傳染性的疾病，可影響內(nèi)偶蹄類動物包括：牛、豬、綿羊、山羊和鹿?？谔阋叩陌Y狀包括發(fā)熱，位于口中、腳上和乳頭上的水泡，產(chǎn)奶量下降，食欲不振，體重下降，以及跛行?？谔阋咴谌蚨鄠€地方流行，但并不被認(rèn)為是人畜共患病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)定期發(fā)布疾病分布和爆發(fā)圖。由于世界動物衛(wèi)生組織制定的市場限制,該組織所發(fā)布的衛(wèi)生狀況對肉類貿(mào)易依賴型經(jīng)濟(jì)的國家(特別是受口蹄疫影響的國家)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)影響?？谔阋卟《?FMDV)是一種無脂質(zhì)包膜的單鏈核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)病毒，呈二十面體對稱，直徑大小為28-40nm。該病毒屬于小核糖核酸病毒科的口瘡病毒屬。整個病毒的顆粒在體外極度不穩(wěn)定，在溫度高于56℃和pH值小于6時會分離成單分子?，F(xiàn)已知的口蹄疫病毒血清型有7種，分別為O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型。大多數(shù)發(fā)達(dá)國家通過有效的疫苗和嚴(yán)格的監(jiān)控計劃成功根除了口蹄疫，但即使制定了嚴(yán)格的國際貿(mào)易政策，口蹄疫最近在歐洲(2000及2001年)和日本(2000及2010年)仍發(fā)生了大規(guī)模爆發(fā)。制造這些疫苗的廠房需符合OIE的NBS生物安全等級4的要求。估計每年全球生產(chǎn)的口蹄疫疫苗數(shù)量為25至30億劑。輪狀病毒是導(dǎo)致新生牛犢腹瀉的最常見病因。輪狀病毒性腹瀉通常影響四天至三周齡的牛犢，導(dǎo)致它們反應(yīng)遲鈍，不愿飲水。疾病過程通常持續(xù)4至8天，受感染牛犢極有可能出現(xiàn)抑郁、脫水和繼發(fā)感染的癥狀。受感染牛犢還會有食欲下降甚至流口水的癥狀。若無任何治療，輪狀病毒致死率可高達(dá)50％。牛犢腹瀉對畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)影響是非常巨大且深遠(yuǎn)的：除了額外的勞動力、藥物經(jīng)費和牛犢死亡有關(guān)的成本，還會有受感染牛犢長期表現(xiàn)不佳所造成的潛在經(jīng)濟(jì)影響。據(jù)研究表明，在從出生到第21天的牛犢中，80％的牛犢發(fā)病率與腹瀉有關(guān)。牛輪狀病毒是一種屬于呼腸孤病毒科的無包膜雙鏈RNA病毒。該病毒體呈二十面體狀并且具有三重蛋白質(zhì)衣殼結(jié)構(gòu)，直徑約為80nm。對母牛進(jìn)行輪狀病毒疫苗接種是對抗疾病和防止新生牛犢腹瀉的有效方法。用一般在產(chǎn)犢前1-3月為母牛接種輪狀病毒疫苗，然后用該母牛的初乳喂養(yǎng)新生牛犢。感染牛皰疹病毒的?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的疾病。傳染性牛鼻氣管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)是由牛皰疹病毒-1型(BHV-1或BoHV-1)引起的高度傳染性的呼吸道疾病。牛皰疹病毒-5型(BHV-5或BoHV-5)與牛皰疹病毒-1型的向性不同：牛皰疹病毒-5型是幼牛中腦膜炎的病原體。牛皰疹病毒-1型和牛皰疹病毒-5型是包膜雙鏈DNA病毒，屬于水痘病毒屬和皰疹病毒科。它們具有從球形到多形態(tài)的形狀，其直徑為150-200nm。它們內(nèi)部的蛋白衣殼由162個殼體組成，被無定型膜包圍。傳染性牛鼻氣管炎(IBR)可以影響幼牛和老牛。除了引起呼吸道疾病，這種病毒還會引起結(jié)膜炎、流產(chǎn)、腦炎和廣泛的全身性感染。傳染性牛鼻氣管炎的特征在于上呼吸道的急性炎癥。第一次感染后，病毒永遠(yuǎn)不會完全清除。病毒會終身潛伏(隱藏)在被感染動物的大腦神經(jīng)細(xì)胞。然而，在壓力影響下，病毒會再次開始繁殖，通常在鼻子和眼睛重新分泌。因此，被感染的動物絕不安全。購買已被感染的動物是新感染的主要來源。由于病毒引起的疾病十分嚴(yán)重，以致構(gòu)成了國際貿(mào)易的障礙。由于牛皰疹病毒-1型是廣泛存在的高度傳染性的病毒，因此一旦牛的被動免疫消失時接種疫苗，通常建議在出生后4至6個月。目前可用于傳染性牛鼻氣管炎的疫苗包括改造活毒(Modified-live-virus，MLV)疫苗和滅活或非活性病毒(killed-virus，KV)疫苗。牛副流感-3(PI3)是牛群中廣泛存在的高度傳染性呼吸道疾病。該疾病與牛呼吸道疾病綜合癥(bovinerespiratorydiseasecomplex，BRD)相關(guān)。單獨感染牛副流感病毒-3(PIV-3)只會引起輕度疾病。臨床癥狀包括發(fā)燒、咳嗽、水狀鼻腔和淚腺排出物、以及呼吸速率增加和呼吸聲增強。感染會增加其他病毒疾病的發(fā)病率，例如牛病毒性腹瀉和感染性牛鼻氣管炎。當(dāng)同時感染繼發(fā)細(xì)菌性肺炎時，會導(dǎo)致牛副流感-3型(PI-3)的影響更顯著。副流感病毒-3型(PIV-3)是負(fù)鏈RNA包膜病毒，屬于副粘病毒科的呼吸道病毒屬。該病毒具有球形形狀并且直徑約為150nm。接種疫苗是防止副流感-3影響的最佳方式。大多數(shù)副流感-3疫苗會與其他呼吸道病毒進(jìn)行組合，例如牛皰疹病毒-1型(BHV-1)。該病毒的疫苗現(xiàn)有改造活毒或滅活兩種形式?？袢∈且环N由狂犬病病毒引起的人畜共患病，可由動物傳染至人類。該病毒屬于彈狀病毒科的狂犬病病毒屬?？袢〔《臼穷愃谱訌棤畹陌へ?fù)鏈RNA病毒，長約180nm，橫截面直徑約為75nm。所有哺乳動物都有可能被狂犬病病毒感染。家犬是該病毒最主要的攜帶者，95％因狂犬病而死亡的人類是通過狗而受感染的?？袢〉穆楸孕耘R床癥狀在牛、豬和馬中最為普遍。盡管狂犬病可由熱帶和亞熱帶地區(qū)的蝙蝠(即吸血蝙蝠)傳播，牛感染狂犬病的最常見的傳播途徑是被受感染的野生動物(例如狐貍或浣熊)咬傷。每年損失數(shù)以千計的牛及因正常飼養(yǎng)操作期間人與感染狂犬病的牛接觸，而此引起的人類健康問題，均對動物生產(chǎn)行業(yè)造成嚴(yán)重威脅。除了南極洲，所有大陸都流行狂犬病。每年有數(shù)以萬計的狂犬病死亡病例，當(dāng)中有多于95％發(fā)生在亞洲和非洲。狂犬病是一種100％可通過疫苗預(yù)防的疾?。喊踩陀行У臏缁畈《疽呙缈捎糜诠?、牛和人。沒有先前免疫的個體必須接受暴露后的預(yù)防性接種。過去數(shù)十年間，人類和動物健康相關(guān)的行業(yè)見證了政府對制備藥物和生物制藥產(chǎn)品的生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GoodManufacturingPractice,GMP)的規(guī)管愈來愈嚴(yán)格。這期間出現(xiàn)了新的規(guī)管概念，例如過程分析技術(shù)(ProcessAnalyticalTechnology,PAT)。根據(jù)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)的定義，PAT是一個通過測量影響關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)(CriticalQualityAttributes,CQA)的關(guān)鍵工序參數(shù)(CriticalProcessParameters,CPP)，進(jìn)而設(shè)計﹑分析和控制藥品生產(chǎn)過程的體系。PAT對疫苗產(chǎn)業(yè)的中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的的質(zhì)量控制非常有效。事實上，常被用在根除計劃中或緊急情況下的滅活病毒疫苗，其功效主要取決于配制每個劑量的抗原有效載荷和病毒的完整性。到目前為止，在生產(chǎn)完整病毒抗原中間工藝流程的制程質(zhì)量控制主要依賴于活毒(病毒滅活工序前)的滴定測定、免疫化學(xué)方法(例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA))，或單徑向免疫擴(kuò)散(singleradialimmunodiffusion，SRID)檢測，以及在病毒滅活后的某些情況下使用實時定量PCR的效果。ELISA檢測試劑盒通常用于檢測人類和動物體液中的致病病原體。ELISA檢測試劑盒通常被設(shè)計來檢測與病原體相應(yīng)的抗體而不是病原體本身。盡管ELISA檢測試驗是在制造過程中在某些情況下對病毒抗原的監(jiān)測和質(zhì)量控制中使用的，這種試驗必須按個案進(jìn)行，不能標(biāo)準(zhǔn)化適用于不同病毒，因為該試驗主要依賴于測試工具中所使用的檢測試劑，例如單克隆或多克隆抗體。SRID檢測同樣需要上述要求。此外，ELISA測試法只能對基于抗體－抗原反應(yīng)的比色滴定法進(jìn)行病毒顆粒的常規(guī)定量測定，其結(jié)果很大程度上會受到樣品的稀釋因子和樣品基質(zhì)的影響。因此，ELISA測定法必須根據(jù)不同生產(chǎn)步驟的樣品進(jìn)行調(diào)整，并不是PAT的有效工具。除此之外，由于ELISA測定法和定量PCR不能區(qū)分完整或破裂的病毒抗原，這兩種測試方法并不能測定病毒顆粒的尺寸或完整性。然而，獲得病毒顆粒的尺寸和結(jié)構(gòu)完整性對于確保疫苗的免疫功效極為重要。對于口蹄疫病毒而言，一般推薦使用140S(146S)量化蔗糖密度梯度分析方法以量化病毒抗原。該方法由Barteling和Meloen建立(BartelingSJ,MeloenRH.Asimplemethodforthequantificationof140Sparticlesoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV).ArchGesamteVirusforsch,1974；45(4):362–4)。146S分析方法的原理是口蹄疫病毒顆粒會根據(jù)其沉降系數(shù)在相應(yīng)的蔗糖梯度中分布，從而將不同的口蹄疫病毒的顆粒分離。因此，該方法只能間接地檢測病毒顆粒的完整性。盡管國際間致力于將口蹄疫病毒的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化，但至今仍未有一個普遍認(rèn)可的方案或國際標(biāo)準(zhǔn)。這可能是由于檢測方法涉及復(fù)雜的技術(shù)以及需要特殊的設(shè)備所致(BartelingSJ.Needforfurtherstandardizationofthe146-Stestasthebasisforfinal-Foot-and-MouthDisease(FMD)Vaccineformulation.EUFMDResearchGroupMeeting1999-Appendix17)。缺乏檢測口蹄疫疫苗中活性成分的標(biāo)準(zhǔn)方法是導(dǎo)致臨床試驗繁瑣且費用高昂的主要原因。臨床試驗中一般需要使用大型動物(目標(biāo)物種)或?qū)嶒瀯游镆赃M(jìn)行口蹄疫疫苗登記和疫苗發(fā)放。在狂犬病疫苗的研究實例中，美國衛(wèi)生研究院(NIH)的效力測試作為疫苗批次的效力測試的基準(zhǔn)測定已經(jīng)使用了數(shù)十年。這種殘酷且高度復(fù)雜的體內(nèi)試驗，每個批次需要使用150只小鼠，并包括對具有狂犬病病原病株的小鼠進(jìn)行顱內(nèi)試驗。目前國際間對疫苗和生物藥物分子的效力控制方法的協(xié)調(diào)的工作重點是基于3R原則：減少(Reduction)使用動物的數(shù)量，使用其他技術(shù)替代(Replacement)對動物的使用，以及改良(Refinement)試驗方法，以確保動物在實驗中盡量少受傷害。對疫苗工業(yè)，特別是基于完整抗原制備的疫苗(例如滅活病毒疫苗或經(jīng)減毒的活性病毒疫苗)來說，需要能在納米范圍內(nèi)可靠地量化和測定顆粒大小的方法和設(shè)備以監(jiān)控生產(chǎn)疫苗的過程。監(jiān)控生產(chǎn)過程能確保生產(chǎn)過程每個步驟中的病毒抗原合符所需的質(zhì)量,因此十分重要。然而，涉及病毒顆粒的生產(chǎn)流程復(fù)雜，因此相比普通重組蛋白(例如單克隆抗體，mAbs)的分析困難很多。其中一個挑戰(zhàn)就是當(dāng)前許多疫苗的生產(chǎn)方法都是開發(fā)于數(shù)十年前，當(dāng)時仍未有開發(fā)出無血清培養(yǎng)基的技術(shù)。因此，制備疫苗過程中通常需要使用的血清培養(yǎng)基，包含了大量的蛋白質(zhì)。另外，通過感染細(xì)胞培養(yǎng)物而獲得的病毒顆粒其產(chǎn)量通常每公升只有數(shù)毫克，這與重組蛋白例如單克隆抗體的表達(dá)相比小若干個數(shù)級。另一個要點是，一些病毒例如口蹄疫病毒會出現(xiàn)裂解性復(fù)制周期。此時，細(xì)胞會被摧毀,細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的所有物質(zhì)(包括遺傳物質(zhì)如核酸以及來自細(xì)胞膜的殘留脂質(zhì))會釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液，這些物質(zhì)的存在使分析變得更加困難。尺寸排阻層析法(sizeexclusionchromatography)是根據(jù)分子的流體力學(xué)體積(hydrodynamicvolume)將不同的分子分開。因此,即使分子量不同,具有相近流體力學(xué)體積的不同分子一般在分子排阻層析柱內(nèi)的流動性相近。非常復(fù)雜的生產(chǎn)流程一般涉及大分子量的DNA及脂質(zhì),由于這些物質(zhì)的流體動力學(xué)體積與病毒相近,因此分子排阻層析法通常不能將病毒與這些物質(zhì)分開。以蛋白或病毒為主的疫苗是常用的疫苗模型,用于將抗原運送到目標(biāo)受體以進(jìn)行免疫。疫苗的成效大大取決于所運送的抗原是否具有正確或天然的構(gòu)象,因為只有正確或天然的構(gòu)象才能呈現(xiàn)適當(dāng)?shù)目乖砦唬瑥亩T導(dǎo)特異并有效的免疫反應(yīng)。因此，錯誤折迭﹑降解或聚集的抗原都可能降低甚至不能引起特異性的免疫反應(yīng)。動態(tài)光散射法(DynamicLightScattering,DLS)有助于評估蛋白性或病毒性疫苗的完整性和穩(wěn)定性,從而評估其效力。通過分析DLS圖譜，可以檢查抗原在一段時間后或在特定緩沖器或溫度下存儲是否已出現(xiàn)降級或聚集,從而確保疫苗的效力。分離方法例如分子排阻層析法只考慮顆粒的流動性，僅能粗略地估計顆粒的大小,因此不能靈敏地偵測到抗原尺寸上的細(xì)微分別。DLS可以靈敏和準(zhǔn)確地檢測和估計的顆粒的大小，因此可以偵測到顆粒尺寸上的細(xì)微差別。然而，DLS只能估計高度純化的顆粒的完整性和大小。由于牲畜疾病與全球的經(jīng)濟(jì)相關(guān)，因此必需不斷地改進(jìn)預(yù)防疾病的措施，特別是改進(jìn)疫苗和/或制備疫苗的方法。本發(fā)明提供了一種能高通量和準(zhǔn)確地對病毒(包括包膜和無包膜病毒、基于DNA和RNA的病毒)及相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行量化和分析的方法。本發(fā)明提供一個有效且劃算﹑用于監(jiān)控獸用病毒疫苗質(zhì)量的工具，可以滿足獸用病毒疫苗數(shù)量和質(zhì)量上不斷增長的需求。在口蹄疫方面，中國作為世界上最大的疫苗市場，每年需要17億劑量(每劑量為2毫升)。以現(xiàn)時的工業(yè)規(guī)模為例，每一批次可達(dá)500萬劑(即每一批次達(dá)一萬公升)，即每年需要由不同廠商生產(chǎn)將近340批疫苗以應(yīng)付中國市場的需要。由于龐大的生產(chǎn)量，截至今日，中國獸醫(yī)管理局已不再監(jiān)控每一批的口蹄疫疫苗的質(zhì)量，僅信賴各疫苗生產(chǎn)商在質(zhì)量監(jiān)控上的表現(xiàn)?？谔阋咭呙绲馁|(zhì)量監(jiān)控通常利用體內(nèi)效能測試來進(jìn)行。雖然這些體內(nèi)效能測試可以大量地評估疫苗的質(zhì)量，但涉及復(fù)雜和繁瑣的程序。目前仍未有開發(fā)出可以大量及快捷地對疫苗進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控的體外技術(shù)。本發(fā)明首次開發(fā)一種體外系統(tǒng)能夠大量地量化每劑量的抗原負(fù)載和測定病毒抗原的大小和完整性，無論抗原是源自減毒活病毒或滅活的病毒。本發(fā)明提供了一個相比體內(nèi)效力測試系統(tǒng)更簡化的系統(tǒng)以監(jiān)控病毒疫苗的質(zhì)量，從而提高產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明估計可以在短短幾天內(nèi)完成340個批次疫苗的質(zhì)量監(jiān)控。因此,本發(fā)明可以提高疫苗的質(zhì)量，并為動物和人類帶來更好的保護(hù)以對抗動物疾病。
技術(shù)領(lǐng)域：
為了改善目前預(yù)防病毒性疾病(包括但不限于口蹄疫、輪狀病毒腹瀉、傳染性牛鼻氣管炎、牛皰疹性腦炎、牛呼吸道疾病綜合癥(BRD)和狂犬病)的方法和產(chǎn)品，本發(fā)明開發(fā)了一個結(jié)合使用分子排阻層析法和同軸動態(tài)光散射(in-linedynamiclightscatteringdetection)檢測的方法以量化及分析病毒。本發(fā)明所描述的方法可以大量地并且精準(zhǔn)地量化和分析所有病毒。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種方法用來量化和分析脂質(zhì)包膜和無脂質(zhì)包膜病毒的大小和完整性。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種用來量化和分析具有核糖核酸作為遺傳物質(zhì)(RNA病毒)或脫氧核糖核酸作為遺傳物質(zhì)(DNA病毒)的病毒的大小和完整性的方法。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種方法用來量化病毒顆粒以及分析它們的大小和完整性，這些病毒顆粒來自復(fù)雜的生產(chǎn)流程，單單通過分子排阻層析法不能將流程中的污染物與病毒顆粒分開。在一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括一個或多個在進(jìn)行分子排阻層析法和動態(tài)光散射分析之前的樣本預(yù)備步驟。所述樣本預(yù)備步驟可以包括使用溶劑如氯仿進(jìn)行溶劑萃取的步驟，以及使用內(nèi)切酶如或TurboTMDNase酶進(jìn)行內(nèi)切核酸的步驟。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于從含有病毒顆粒的產(chǎn)品中分離和純化病毒顆粒的方法。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種用于設(shè)計和制備防止病毒性或動物疾病(例如口蹄疫、輪狀病毒腹瀉、傳染性牛鼻氣管炎、牛皰疹性腦炎、牛呼吸道疾病綜合癥(BRD)和狂犬病)的制劑產(chǎn)品的方法。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用來評估含有病毒顆粒的產(chǎn)品的方法,用作評估的參數(shù)可以是抗原的數(shù)量和穩(wěn)定性。這些產(chǎn)品包括但不限于含有上述病毒的抗原庫存和疫苗。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種方法用來在線監(jiān)控疫苗生產(chǎn)過程期間的中間產(chǎn)品的質(zhì)量，所述方法測量中間產(chǎn)品當(dāng)中的病毒抗原數(shù)量以及測試當(dāng)中的病毒抗原的完整性和大小。附圖說明圖1A-1B所示的是純化口蹄疫病毒O1Campos的色譜圖的一個實施例。圖1A是254nm下的色譜圖，圖1B是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。圖2A-2B所示的是純化口蹄疫病毒O1Campos經(jīng)過1小時56℃的加熱及使用核酸酶內(nèi)切核酸后所得的色譜圖的一個實施例。圖2A是254nm下的色譜圖，圖2B是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。圖3A-3C所示的是量化濃縮物當(dāng)中的口蹄疫O1Campos病毒顆粒的一個實施例,濃縮物由PEG沉淀所得并在進(jìn)行層析前經(jīng)氯仿萃取及處理。圖3A比較經(jīng)氯仿萃取及處理的樣本以及未經(jīng)任何處理的樣本的254nm色譜圖。圖3b比較兩個經(jīng)氯仿萃取的樣本的254nm色譜圖,其中一個樣本進(jìn)一步以處理,另一個樣本沒有進(jìn)行處理。圖3C比較兩個經(jīng)處理的樣本的254nm色譜圖,其中一個樣本進(jìn)一步以氯仿萃取,另一個樣本沒有進(jìn)行氯仿萃取。圖4A-4D所示的是量化口蹄疫病毒株O1Campos抗原的一個實施例,其中的樣本為經(jīng)超濾濃縮(ultrafiltrationconcentration,UF)獲得的抗原濃縮物的連續(xù)稀釋。圖4A是經(jīng)超濾濃縮(UF)獲得的口蹄疫病毒株O1Campos抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖4B顯示5個口蹄疫病毒株O1Campos樣本重迭的色譜圖。圖4C顯示一個口蹄疫病毒株O1Campos樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。圖4D是口蹄疫病毒株O1Campos的病毒濃度(μg/mL),病毒顆粒大小(nm)與稀釋百分比的關(guān)係圖及回歸線。圖5A-5D所示的是量化牛輪狀病毒G6血清型抗原的一個實施例,其中的樣本為經(jīng)超濾濃縮(ultrafiltrationconcentration,UF)獲得的抗原濃縮物的連續(xù)稀釋。圖5A是經(jīng)超濾濃縮(UF)獲得的牛輪狀病毒G6血清型抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖5B顯示5個牛輪狀病毒G6血清型樣本重迭的色譜圖。圖5C顯示一個牛輪狀病毒G6血清型樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。圖5D是牛輪狀病毒G6血清型的病毒峰值面積(mAu.mL),病毒顆粒大小(nm)與稀釋百分比的關(guān)係圖及回歸線。圖6A-6D所示的是量化牛皰疹病毒-5型抗原的一個實施例,其中的樣本為經(jīng)超濾濃縮(ultrafiltrationconcentration,UF)獲得的抗原濃縮物的連續(xù)稀釋。圖6A是經(jīng)超濾濃縮(UF)獲得的牛皰疹病毒-5型抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖6B顯示5個牛皰疹病毒-5型樣本重迭的色譜圖。圖6C顯示一個牛皰疹病毒-5型樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。圖6D是牛皰疹病毒-5型的病毒峰值面積(mAu.mL),病毒顆粒大小(nm)與稀釋百分比的關(guān)係圖及回歸線。圖7A-7D所示的是量化副流感病毒-3型抗原的一個實施例,其中的樣本為經(jīng)超濾濃縮(ultrafiltrationconcentration,UF)獲得的抗原濃縮物的連續(xù)稀釋。圖7A是經(jīng)超濾濃縮(UF)獲得的副流感病毒-3型抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖7B顯示5個副流感病毒-3型樣本重迭的色譜圖。圖7C顯示一個副流感病毒-3型樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。圖7D是副流感病毒-3型的病毒峰值面積(mAu.mL),病毒顆粒大小(nm)與稀釋百分比的關(guān)係圖及回歸線。圖8A-8D所示的是量化狂犬病病毒抗原的一個實施例,其中的樣本為經(jīng)超濾濃縮(ultrafiltrationconcentration,UF)獲得的抗原濃縮物的連續(xù)稀釋。圖8A是經(jīng)超濾濃縮(UF)獲得的狂犬病病毒抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖8B顯示5個狂犬病病毒樣本重迭的色譜圖。圖8C顯示一個狂犬病病毒樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。圖8D是狂犬病病毒的病毒峰值面積(mAu.mL),病毒顆粒大小(nm)與稀釋百分比的關(guān)係圖及回歸線。圖9是一個2000公升細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中口蹄疫病毒O1Campos感染的時間進(jìn)程圖。其中顯示了感染后首個8小時內(nèi)病毒的濃度(μg/mL)、細(xì)胞數(shù)量(106細(xì)胞/mL)和病毒顆粒大小的變化。圖10是層析柱切換系統(tǒng)的一個實施例，該系統(tǒng)并行操作兩個分子排阻層析柱和一個動態(tài)光散射(DLS)檢測器。圖左和圖右的設(shè)置可以互相切換。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的方法可以大量地并精準(zhǔn)地量化和分析病毒。在一個實施例中，本發(fā)明的方法可以用來量化和分析脂質(zhì)包膜和無脂質(zhì)包膜病毒的大小和完整性。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法可以用來量化和分析具有核糖核酸作為遺傳物質(zhì)的病毒(核糖核酸病毒，RNA病毒)或脫氧核糖核酸作為遺傳物質(zhì)的病毒(脫氧核糖核酸病毒，DNA病毒)的大小和完整性。在一個實施例中，本發(fā)明的方法可以用來量化及分析的病毒，包括但不限于，口蹄疫病毒(FMDV，全部血清型：O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、牛皰疹病毒-1型(BoHV-1)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒(例如G6血清型和G10血清型)、狂犬病病毒、牛病毒性腹瀉病毒-1型和2型(BVDV-1andBVDV-2)、牛呼吸道合胞病毒(BovineRespiratorySyncytialVirus，BRSV)、豬圓環(huán)病毒-2型(PorcineCircovirus2，PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PorcineParvovirus，PPV)和藍(lán)舌病病毒(Bluetongueviruses，BTV)。在一個實施例中，本發(fā)明的方法可適用于所有文獻(xiàn)、公共領(lǐng)域或網(wǎng)站上(例如國際病毒分類委員會(ICTV)發(fā)布的《病毒分類學(xué)》或報告)列出的任何病毒。這些出版物的內(nèi)容都通過引用的方式結(jié)合到本申請中。本發(fā)明的方法結(jié)合使用兩個樣本準(zhǔn)備步驟包括可選擇性地使用溶劑萃取和核酸內(nèi)切酶的消化，及分子排阻層析法，隨后使用偵測250-280nm的紫外線檢測器及動態(tài)光散射檢測器作色譜分析。本發(fā)明提供了一個突破性的改進(jìn)方法，用于量化及分析在疫苗生產(chǎn)流程中每個步驟所得到的包膜和無包膜病毒的病毒顆粒。樣本準(zhǔn)備步驟的選擇取決于病毒的類型。在一個實施例中，對于無包膜病毒而言，如口蹄疫病毒和牛輪狀病毒，溶劑萃取步驟可以有效清除大脂質(zhì)殘基的污染物。在另一個實施例中，對于包膜病毒而言，如牛皰疹病毒-5型、副流感病毒-3型和狂犬病病毒，不能使用溶劑萃取步驟，因為溶劑萃取會破壞這些病毒的包膜脂質(zhì)進(jìn)而破壞病毒顆粒。兩個樣本預(yù)備步驟有助將分子分開,使本發(fā)明可以高通量地量化及分析不同來源包括來自非常復(fù)雜的生產(chǎn)流程的病毒顆粒。復(fù)雜的生產(chǎn)流程一般涉及如大分子量的DNA或脂質(zhì)殘基的污染物,由于這些污染物的流體動力學(xué)體積與病毒顆粒相似，因此單單使用分子排阻層析法(SEC)通常不能將病毒與這些物質(zhì)分開。并且,分子排阻色譜法僅考慮分子從層析柱洗脫出來的洗脫體積,因此只能間接地及粗略地估計分子的大小。本發(fā)明使用動態(tài)光散射法(DLS)則可以準(zhǔn)確地計算分子的大小。本發(fā)明的方法可以快速并準(zhǔn)確地評估病毒顆粒的濃度及品質(zhì)如病毒顆粒的結(jié)構(gòu)完整性和大小。由于本發(fā)明采用的動態(tài)光散射法(DLS)的測量非常精細(xì)和準(zhǔn)確,因此可以準(zhǔn)確地估計及直接監(jiān)測病毒抗原的完整性和大小。經(jīng)校準(zhǔn)的分子排阻層析柱裝有層析介質(zhì)，其介質(zhì)的孔徑需要有一定大小以允許部分蛋白分子、蛋白片段和蛋白聚集體進(jìn)入介質(zhì)的內(nèi)部，進(jìn)而評估生物制藥制劑和產(chǎn)品中的高度純化的蛋白質(zhì)或肽有否出現(xiàn)聚集或分子碎裂。然而，DLS只能用來分析具有高純度的顆粒的完整性和大小。DLS一般不適用于大量分析復(fù)雜的蛋白溶液或在生產(chǎn)流程期間并未經(jīng)純化的中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物通常包含其他污染物如DNA或脂質(zhì)分子。由于分子排阻層析(SEC)的分辨率較低,此方法不能完全分開溶液中不同分子的蛋白峰,因此不能充分地評估不同分子的大小。本發(fā)明的方法則可以成功地應(yīng)用于整個生產(chǎn)病毒顆粒或疫苗過程中所有類型的樣本以及來自其他來源或過程的樣本，包括但不限于：a)培養(yǎng)在生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞的病毒感染(見實施例7)，其中的病毒濃度非常低但污染物(如牛血清中的蛋白質(zhì)、裂解細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、因細(xì)胞膜被破壞而釋放的細(xì)胞DNA及脂質(zhì)殘基)的水平非常高；b)抗原被濃縮至高達(dá)150倍或更高的濃度(見實施例5-6)；c)在制備疫苗最終的制劑前，確定每劑疫苗的適當(dāng)?shù)挠行лd荷，以及d)最終制劑產(chǎn)物包括配制成水包油乳劑(W/O)或水包油包水雙重乳劑(W/O/W)的疫苗。不論是取自非常復(fù)雜和初步程序的中間樣本，還是高度純化的病毒參考標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明的方法都可以高效地、準(zhǔn)確地和大量地進(jìn)行定量和分析。在一個實施例中，本發(fā)明的方法每天可以分析約60至70個病毒顆粒樣本的數(shù)量和質(zhì)量(例如完整性和大小)，這數(shù)量遠(yuǎn)比其他技術(shù)的處理量高。例如快速蛋白液相層析法(FastProteinLiquidChromatography，F(xiàn)PLC)，由于運行FPLC所需的設(shè)備要求較長的運行時間(如3個小時)，因此限制了該方法每個工作天最多只能處理4個樣本。另一方面，以口蹄疫病毒測量為例，傳統(tǒng)的146S技術(shù)每個工作日最多只能分析12個樣本。本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的技術(shù)非常不同，因為本發(fā)明的方法可以成功地應(yīng)用到取自所有種類過程步驟的樣本，包括未經(jīng)純化的中間產(chǎn)物和已純化的病毒樣本。這是由于本發(fā)明的方法采用的同軸DLS檢測器可以大量并直接地測量病毒顆粒的完整性和大小。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一個可與本發(fā)明的方法或其他適用的方法相結(jié)合來進(jìn)一步增加樣本處理量的多柱切換系統(tǒng)(見實施例8)。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一個柱切換系統(tǒng)，它能夠同時運行多個柱和DLS檢測器以大量地分析樣本。相反地，大部分層析技術(shù)如快速蛋白液相層析法(FPLC)的運行時間都較長(如3小時/每次)，因此多柱切換系統(tǒng)并不適用于這些技術(shù)?？乖娜S結(jié)構(gòu)的任何改變，特別是抗原的重要表位的結(jié)構(gòu)的改變，可降低抗原的免疫原性。由于本發(fā)明的分析方法具有高靈敏度，可以檢測在病毒抗原顆粒直徑的微小變化?，F(xiàn)有的傳統(tǒng)檢測技術(shù)，如ELISA或SRID、146S蔗糖梯度技術(shù)、定量PCR或?qū)游龇?，不能檢測如此細(xì)微的變化。因此，本發(fā)明能夠檢測抗原大小的微小變化，而且能夠大大改進(jìn)抗原質(zhì)量的分析方法。在一個實施例中，本發(fā)明的方法使用了高效液相層析法(HPLC)來量化及分析整個病毒，包括但不限于口蹄疫病毒(FMDV)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒和狂犬病病毒。在一個實施例中，本發(fā)明的方法包含以下步驟：將包含病毒(例如口蹄疫病毒(FMDV)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒或狂犬病病毒)的樣本注入到層析柱內(nèi)，洗脫樣本，分析預(yù)定洗脫時間范圍內(nèi)的色譜圖，并確定病毒顆粒的數(shù)量、完整性和大小。在一個實施例中，本發(fā)明的層析柱是分子排阻層析柱。在一個實施例中，本發(fā)明的層析柱可以分開直徑為10-200nm或更寬的范圍內(nèi)、分子量在105-109Da或更大的范圍內(nèi)的顆粒。在一個實施例中，預(yù)定的目標(biāo)病毒的洗脫時間范圍是由純化病毒顆粒的參考或標(biāo)準(zhǔn)樣本的層析色譜所決定的。在一個實施例中，本發(fā)明的方法可以量化濃度范圍為5-70微克/毫升或3-300微克/毫升的病毒抗原或顆粒，這遠(yuǎn)比現(xiàn)有技術(shù)覆蓋的濃度范圍更廣泛。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法可以量化濃度范圍為1.2-750微克/毫升的病毒抗原或顆粒。在另一個實施例中，本發(fā)明方法可以量化濃度高于750微克/毫升的病毒抗原或顆粒。在一個實施例中，本發(fā)明的方法不受病毒顆粒的濃度影響，可以非常準(zhǔn)確地分析病毒抗原或顆粒的大小和完整性。在一個使用了同軸DLS技術(shù)的實施例中，本發(fā)明的方法精確地測量了濃度范圍為1.2-750微克/毫升的口蹄疫病毒樣本的大小，而且不受其抗原濃度的影響(見實施例5和7)。本發(fā)明的實驗結(jié)果首次顯示同軸DLS可以涵蓋廣闊的病毒濃度范圍并能準(zhǔn)確地分析口蹄疫病毒的大小及完整性。如下述實施例所示，本發(fā)明的方法經(jīng)實驗証實可針對無包膜病毒、口蹄疫病毒檢測其再現(xiàn)性、特異性、線性、準(zhǔn)確性、精準(zhǔn)性和強健性(見實施例5和7)。此方法是首個通過驗證的體外技術(shù)，能夠量化病毒顆粒并且同時分析經(jīng)量化的病毒顆粒的完整性和大小。由于病毒與完成純化或粗略純化樣本中的大多數(shù)組分相比的尺寸較大,因此傳統(tǒng)的分子排阻層析技術(shù)或可將病毒及這些低分子量的組分分開,并于層析柱的排阻體積(即空隙體積)或接近的體積洗脫出病毒，但取決于分子層析柱的類型?？墒?，高分子量的組分如大分子量的DNA及脂質(zhì)殘留具有與病毒顆粒相似的流體動力學(xué)體積,因此分子排阻層析法通常不能將病毒及這些物質(zhì)分開。此外，大多數(shù)病毒不能進(jìn)入分子排阻層析柱的孔隙,只能直接穿過層析柱。不同大小的病毒會在接近的洗脫體積被排出層析柱。因此分子排阻層析法或其他類似技術(shù)不能分別大小有輕微改變的病毒。離線DLS極受分子分散性的影響,假若樣本中同時有大及小的顆粒,其結(jié)果會有很大的偏差。因此,離線DLS只能應(yīng)用于某些樣本以準(zhǔn)確地測量其中病毒的大小。反之，本發(fā)明結(jié)合使用DLS和SEC-HPLC,可以從樣本高度純化出蛋白峰并隨后利用所得的純化物以直接測量病毒的大小,而不受樣本中其他組分的影響。單純考慮色譜遷移(如分子排阻層析法)是不可以直接及準(zhǔn)確地測量病毒的大小。在一個實施例中，本發(fā)明的層析或色譜圖分析是通過偵測波長為250-280nm的紫外線和動態(tài)光散射(DLS)檢測器進(jìn)行。在另一個實施例中，層析或色譜圖分析是通過同軸動態(tài)光散射(DLS)檢測器進(jìn)行。本方法采用的同軸動態(tài)光散射檢測器可以實時分析地分析整個分子排阻色譜圖,以快速和準(zhǔn)確地評估病毒抗原的濃度及質(zhì)量。在一個實施例中，病毒樣本的層析分析是通過比較完整病毒顆粒其預(yù)定尺寸分布來進(jìn)行的。含有純化病毒的參考或標(biāo)準(zhǔn)樣本先通過層析法和同軸DLS分析以測量出每個病毒菌株的大小,從而確定病毒顆粒的預(yù)定尺寸分布。在一個實施例中，分析純化樣本的色譜圖可以分辨出完整病毒顆粒及病毒解體后的片段。例如檢測口蹄疫病毒，本發(fā)明的方法可以分辨完整的口蹄疫病毒和解體片段如12S顆?；虿《練ち?capsomers)。在另一個實施例中，本發(fā)明的層析分析方法通過比較一個或多個病毒的參考樣本(例如口蹄疫病毒(FMDV)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒和狂犬病病毒)，能夠檢測樣本中相同病毒菌株的尺寸偏差。在一個實施例中，本發(fā)明的層析分析方法每天可以量化多達(dá)57個病毒樣本(例如口蹄疫病毒(FMDV)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒和狂犬病病毒)及分析其大小和完整性。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法每天可以量化多達(dá)72個病毒樣品(例如口蹄疫病毒(FMDV)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒和狂犬病病毒)及分析其大小和完整性。在一個實施例中，本發(fā)明的口蹄疫病毒樣本包括但不限于:源自受口蹄疫病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液﹑制造疫苗過程的中間產(chǎn)物﹑抗原﹑抗原庫存﹑疫苗﹑一價疫苗或多價疫苗。在一個實施例中，牛輪狀病毒樣本的來源包括但不限于：受輪狀病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液、制造疫苗過程的中間產(chǎn)物、抗原批次或抗原庫存、疫苗、一價疫苗批次或多價疫苗批次。在一個實施例中，牛皰疹病毒-5型樣本的來源包括但不限于：受牛皰疹病毒-5型感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液、制造疫苗過程的中間產(chǎn)物、抗原批次或抗原庫存、疫苗、一價疫苗批次或多價疫苗批次。在一個實施例中，副流感病毒-3型樣本的來源包括但不限于：受副流感病毒-3型感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液、制造疫苗過程的中間產(chǎn)物、抗原批次或抗原庫存、疫苗、一價疫苗批次或多價疫苗批次。在一個實施例中，狂犬病病毒樣本的來源包括但不限于：受狂犬病病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液、制造疫苗過程的中間產(chǎn)物、抗原批次或抗原庫存、疫苗、一價疫苗批次或多價疫苗批次。在一個實施例中，可以選擇在使用層析柱前使用溶劑預(yù)先處理包膜或無包膜病毒，如口蹄疫病毒和牛輪狀病毒，的樣本。在一個實施例中，本發(fā)明所用的溶劑是一種非極性或脂溶性溶劑，包括但不限于：氯仿、苯、甲苯、己烷、戊烷和辛烷。在一個實施例中，本發(fā)明所用的溶劑是極性有機(jī)溶劑，包括但不限于：甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、丙酮和乙腈。在一個實施例中，可以共同使用一種或多種類型的溶劑來預(yù)先處理樣本。在一個實施例中，可以在使用層析柱前使用一種或多種酶預(yù)先處理包膜或無包膜病毒樣本。在一個實施例中，所用的酶是核酸酶，包括但不限于：脫氧核糖核酸酶(DNase酶)、核糖核酸酶(RNase酶)、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和限制性內(nèi)切酶。在一個實施例中，所用的酶是TURBOTMDNase酶、T7核酸內(nèi)切酶、S1核酸酶、P1核酸酶和核酸內(nèi)切酶I。在一個實施例中，核酸酶將大分子量的DNA(脫氧核糖核酸)切割成較小分子的DNA，然后可通過層析柱將較小分子的DNA分離。在另一個實施例中，可以預(yù)先處理單價疫苗或多價疫苗，以除去核酸酶程序中的佐劑。在一個實施例中，可以通過以下方法制備每個類型或菌株的純化病毒參考或標(biāo)準(zhǔn)樣本:使哺乳動物的細(xì)胞培養(yǎng)物感染病毒，使用化學(xué)試劑滅活病毒，以及一個或多個以下步驟:對蔗糖梯度進(jìn)行超速離心﹑超濾﹑離子交換層析法或分子排阻層析法。在另一個實施例中，純化的病毒參考樣本或標(biāo)準(zhǔn)樣本可以通過除去含有相同病毒的疫苗的佐劑而制備。在一個實施例中，本發(fā)明的方法可以從包含病毒顆粒的產(chǎn)品分離出及純化病毒顆粒。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法用于確定生產(chǎn)病毒疫苗過程中每個步驟的病毒抗原的數(shù)量及分析其完整性和大小,從而監(jiān)控生產(chǎn)過程的質(zhì)量，所述病毒抗原包括但不限于：口蹄疫病毒(FMDV)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒和狂犬病病毒。本發(fā)明結(jié)合使用DLS和分子排阻層析法,以監(jiān)測用來生產(chǎn)病毒抗原的感染流程的動力學(xué)(見實施例7)。通過檢查存活病毒的數(shù)量和質(zhì)量(例如完整性和大小)，本發(fā)明大大提高了監(jiān)控過程的水平，使之符合生產(chǎn)獸用疫苗最高的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),即過程分析技術(shù)(PAT)的國際準(zhǔn)則。在一個實施例中，本發(fā)明的方法是能夠檢測特定的病毒產(chǎn)物是否被其它病毒污染。有時,用于生產(chǎn)包膜或無包膜病毒的細(xì)胞或會受其他不同的病毒或病原體污染,這些病毒或病原體隨后亦會在細(xì)胞培養(yǎng)基的基質(zhì)中繁殖。由于大多數(shù)病毒的分子量大，特定的目標(biāo)病毒和其他病毒污染物多會在分子排阻層析柱的排阻體積被洗脫,因此單單使用分子排阻層析柱并不能夠去除甚至檢測樣本中的其他病毒。反之，本發(fā)明通過分析DLS數(shù)據(jù)能夠檢測與特定目標(biāo)病毒大小不同的其他病毒或病原體的存在。例如，如樣本存在比特定目標(biāo)病毒較大的病毒，蛋白峰的分散光強度(dispersedlightintensity)和/或Z-平均(Z-average)讀數(shù)會上升。本發(fā)明的方法通過比較受污染和不受污染的樣本的DLS數(shù)據(jù),可以快速地評估污染的程度。如圖4-8中所示，五個病毒檢測都擁有其獨特的紫外線和DLS色譜圖，這表明了本發(fā)明的方法可以敏銳地區(qū)分不同的病毒或病原體。因此，本發(fā)明可以確定一個樣本是否已經(jīng)被其他分子，例如其他病毒、病原體或其他污染物，污染而導(dǎo)致色譜圖或讀數(shù)偏離。在一個實施例中，本發(fā)明的方法通過比較不同批次的病毒疫苗或產(chǎn)品的紫外線和DLS圖譜,可以用來評估不同批次的疫苗或產(chǎn)品是否存在顯著不同。假如紫外線和DLS圖譜恆常不變,表示疫苗或產(chǎn)品的生產(chǎn)過程正常以及產(chǎn)品的質(zhì)量得以保持。假如紫外線和DLS圖譜出現(xiàn)任何可檢測的差異,則表示生產(chǎn)過程可能有問題或有偏差,或表示當(dāng)中可能有污染。因此,本發(fā)明的方法可以提供更好的質(zhì)量監(jiān)控，以確保產(chǎn)品的質(zhì)量和療效一致。在另一個實施例中，本發(fā)明用于評估含有病毒抗原的產(chǎn)品中抗原的穩(wěn)定性。本發(fā)明的評估方法包括量化兩個不同時間點取得的樣本中病毒顆粒以及分析其完整性和大小,再量化病毒顆粒在兩個時間點其數(shù)量﹑大小和/或完整性的分別,從而估計病毒抗原的穩(wěn)定性。本發(fā)明的方法還可以用于分析存儲在不同溫度或在不同的緩沖液,或以不同佐劑配制的病毒顆粒。在另一個實施例中，本發(fā)明用來評估并制備病毒的單價疫苗或多價疫苗以抵御不同的疾病，例如由口蹄疫病毒導(dǎo)致的口蹄疫、由牛輪狀病毒G6型或G10型導(dǎo)致的新生牛犢腹瀉、由牛皰疹病毒-1型導(dǎo)致的傳染性牛鼻氣管炎、由牛皰疹病毒-5型導(dǎo)致的牛皰疹性腦炎、由副流感病毒-3型導(dǎo)致的呼吸道疾病以及由狂犬病病毒導(dǎo)致的狂犬病。本發(fā)明的方法可以量化每劑量的疫苗中抗原的有效載荷，并分析疫苗中抗原的完整性和大小。值得注意的是，無論是已知的或未知的病毒，或是已純化或被其他分子污染的病毒，本發(fā)明的所有方法和系統(tǒng)均適用于所有類型、分類型或菌株的病毒。本發(fā)明申請中提供的五種病毒實施例僅為展示本發(fā)明的效果及突出果效，并不代表本發(fā)明只適用于這五種病毒。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以調(diào)整本發(fā)明的方法和系統(tǒng)來滿足不同的量化和分析的需求。在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于量化和分析一種或多種病毒或病毒顆粒的方法，方法包括以下步驟:(a)使用一種或多種酶處理包含病毒或病毒顆粒的原始樣本,以獲得多個病毒樣本；(b)將第一個病毒樣本置于一個層析系統(tǒng)內(nèi),所述層析系統(tǒng)包括多個泵和多個層析柱，其中：(i)第一個泵通過第一個閥門連接到第一個層析柱，所述第一個層析柱進(jìn)一步通過第二個閥門連接到一個檢測系統(tǒng),所述檢測系統(tǒng)包含一個動態(tài)光散射檢測器和一個紫外線檢測器；以及(ii)第二個泵通過第一個閥門連接到第二個層析柱，所述第二個層析柱進(jìn)一步通過第二個閥門連接到廢物收集匣,其中所述第一個病毒樣本在第一個層析柱中運行，清洗緩沖液在第二個層析柱中運行；(c)從所述第一個層析柱洗脫所述第一個病毒樣本，并從所述檢測系統(tǒng)獲得層析圖譜，所述層析圖譜用于量化及分析所述第一個病毒樣本；(d)切換上述第一個泵和第二個泵的連接，現(xiàn)在：(i)所述第一個泵通過所述第一個閥門連接到所述第二個層析柱，所述第二個層析柱進(jìn)一步通過所述第二個閥門連接到所述檢測系統(tǒng)；以及(ii)所述第二個泵通過所述第一個閥門連接到所述第一個層析柱，所述第一個層析柱進(jìn)一步通過所述第二個閥門連接到所述廢物收集匣；(e)將第二個病毒樣本注入所述第二個層析柱，并將清洗緩沖液注入所述第一個層析柱；(f)從所述第二個層析柱洗脫所述第二個病毒樣本，并從所述檢測系統(tǒng)獲得層析圖譜，所述層析圖譜用于量化及分析所述第二個病毒樣本；以及(g)重復(fù)步驟(b)至(f)，以量化和分析所述多個病毒樣本。在一個實施例中，本發(fā)明所用的病毒或病毒顆粒是包膜病毒、無包膜病毒、脫氧核糖核酸病毒(DNA病毒)、核糖核酸病毒(RNA病毒)、活病毒、減毒活病毒、滅毒病毒、重組病毒、病毒載體或病毒樣顆粒。在一個實施例中，本發(fā)明所用的病毒是口蹄疫病毒(FMDV)、牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)、牛皰疹病毒-1型(BoHV-1)、副流感病毒-3型(PIV-3)、牛輪狀病毒、狂犬病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、豬圓環(huán)病毒-2型(PCV-2)、豬生殖和呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)或藍(lán)舌病病毒(BTV)。在一個實施例中，第一個和第二個病毒樣本包含相同類型的病毒或病毒顆粒。在另一個實施例中，第一個和第二個病毒樣本包含不同類型的病毒或病毒顆粒。在一個實施例中，本發(fā)明方法中的原始樣本是源自受病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液﹑制造疫苗過程的中間產(chǎn)物﹑抗原批次﹑抗原庫存﹑疫苗﹑一價疫苗或多價疫苗。在一個實施例中，本發(fā)明所用的酶是內(nèi)切酶﹑核酸外切酶﹑限制性內(nèi)切酶﹑脫氧核糖核酸酶(DNase酶)或核糖核酸酶(RNase酶)。在一個實施例中，本發(fā)明方法中步驟(a)使用的一種或多種酶處理原始樣本的過程可以清除影響對目標(biāo)病毒量化并分析的分子。在另一個實施例中，原始樣本在進(jìn)行一種或多種酶處理的前或后使用溶劑處理。上述溶劑為非極性溶劑，例如氯仿、苯、甲苯、己烷、戊烷或辛烷。在一個實施例中，本發(fā)明的層析系統(tǒng)包含兩個層析柱。在另一個實施例中，本發(fā)明的層析系統(tǒng)包含三個層析柱。在一個實施例中，本發(fā)明的層析系統(tǒng)還包括一個自動進(jìn)樣器，所述自動進(jìn)樣器將所述病毒樣本注入層析柱。在另一個實施例中，本發(fā)明的層析系統(tǒng)還包括一個或多個系統(tǒng)用來集成和控制層析系統(tǒng)的多個部件的功能。在一個實施例中，本發(fā)明用來量化及分析病毒的方法包括確定樣本中病毒或病毒顆粒的大小及完整性。在一個實施例中，樣本的層析圖譜與純化病毒參考樣本的層析圖譜比較,或與完整的病毒顆粒的層析圖譜比較,從而分辨完整的病毒顆粒和分解的病毒片段。在一個實施例中，本發(fā)明的層析柱可以分開直徑為10-200nm或更闊的范圍內(nèi)及分子量為105-109Da或更闊的范圍內(nèi)的顆粒。在一個實施例中，本發(fā)明的方法可以每天進(jìn)行分析的層析圖譜多達(dá)60-70個樣本。在一個實施例中，本發(fā)明的方法可以分開與病毒具有相似洗脫體積的大分子量DNA或脂質(zhì)分子。在一個實施例中，病毒量化與所述病毒樣品中病毒的濃度無關(guān)。在一個實施例中，本發(fā)明方法可以量化濃度范圍為1.2-750微克/毫升的口蹄疫病毒顆粒。在一個實施例中，本發(fā)明提供一個用于高通量量化及分析包含病毒顆粒樣本的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含以下部件:用于注入樣本的自動進(jìn)樣器﹑兩個或多個用于分離病毒顆粒的層析柱,層析柱可以是不同或相同類型﹑兩個或多個用于驅(qū)動層析柱的泵﹑至少一個紫外線檢測器,用于制備洗脫病毒顆粒的層析或色譜圖及量化病毒顆粒﹑至少一個動態(tài)光散射(DLS)檢測器，用于確定洗脫病毒顆粒的尺寸和完整性﹑一個廢物收集匣,用于收集從層析柱洗脫出來的液體；以及多個閥門陣列,當(dāng)中包括兩個或更多個閥門以連接多個系統(tǒng)部件。在一個實施例中，本發(fā)明的系統(tǒng)兩個或更多的層析柱順序地洗脫包膜或無包膜病毒顆粒。系統(tǒng)可以順序地分析這些病毒顆粒的色譜圖,因此可以即時并高通量地確定病病毒顆粒的數(shù)量﹑大小和完整性。在另一個實施例中，本發(fā)明的系統(tǒng)進(jìn)一步包括一個或多個控制系統(tǒng),用于整合和控制多個系統(tǒng)部件的功能。通過引用以下的實驗細(xì)節(jié)，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解所提供的實施例僅作為說明作用，而非限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍將由隨后的權(quán)利要求所界定。在本申請中的，引用了不同的參考文獻(xiàn)或出版物。這些參考或出版物的全文和公開都結(jié)合到本申請中,從而更全面地描述本發(fā)明的情況。應(yīng)當(dāng)指出的是，過渡語“包含”與‘包括’﹑‘含有’或‘以…為特征’是同義的，是包括性或開放式的，當(dāng)中并不排除有另外未列舉的元素或方法步驟。實施例1口蹄疫病毒參考樣本的制備本實施例描述了制備口蹄疫病毒參考樣本的步驟，從而獲得口蹄疫病毒顆粒預(yù)定的洗脫體積(或時間)以及預(yù)定的大小分布。使用的溶液：透析膜調(diào)節(jié)緩沖液：體積：1升組分：10mMNaHCO3；1mMEDTA透析緩沖液：體積：5升組分：100mMNaCl；50mMTrisBase；pH＝8三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液：體積：5升組分：200mMNaCl；20mMTrisBase；pH＝8病毒懸液：體積：200毫升組分：口蹄疫病毒株O1Campos步驟:第一步：透析本步驟用來降低病毒懸浮液的離子強度以與隨后的酶消化相容,因此不需稀釋樣本及增加樣本體積。1.將透析袋放入裝有透析膜調(diào)節(jié)緩沖液的玻璃燒杯中，沸騰至少30分鐘。用水沖洗5次，在4℃下儲存?zhèn)溆谩?.封閉透析袋下端，裝入樣本。3.在4℃下以800亳升透析液中對病毒懸浮液樣本透析4次,每次2小時。4.在1800毫升透析液中透析病毒懸浮液樣本，在4℃下放置過夜。第二步：酶消化本步驟用來消除樣本中對核酸酶敏感的雜質(zhì)。1.酶制劑：使用時，在10亳升37℃預(yù)熱的透析緩沖液中加入25微升(250U/微升)的核酸酶酶稀釋液的最后濃度為：25微升x250U/微升＝6250U/10亳升＝625U/亳升。2.酶消化：將透析過的病毒懸浮液裝入50亳升離心管中進(jìn)行分離，每支體積為24亳升。每支管中加入1亳升酶稀釋液。蓋緊離心管蓋，將其水平放入37℃預(yù)熱的搖床中。3.充分?jǐn)嚢铇颖?小時，避免起沫。第三步：凝膠滲透層析法進(jìn)行脫鹽程序本步驟用來更換參考樣本的緩沖液，從而除去參考樣本中的低分子量成分物質(zhì)。1.用500毫升Tris緩沖液沖洗葡聚糖凝膠S-300樹脂(SephacrylS-300)兩次作平衡程序，調(diào)整樹脂的體積至最終230毫升。樹脂壓緊后的總體積為150毫升，柱的總體積為250毫升。2.用平衡后的葡聚糖S-300樹脂制備層析柱：a.向柱子加入230毫升的懸浮液。b.靜置樹脂過夜。c.將金屬網(wǎng)篩盤放置在凝膠上。d.在金屬網(wǎng)上加入25毫升的Tris緩沖液。e.連接Tris緩沖液到貯液器。f.向貯液器注入200毫升的Tris緩沖液。g.截斷Tris緩沖液與貯液器的連接。h.打開柱子開關(guān)，直到緩沖液剛剛達(dá)到金屬網(wǎng)面位置，然后關(guān)閉開關(guān)。脫鹽/消除低分子量組分：a.在凝膠上加入43毫升的樣本。b.打開開關(guān)，使樣本進(jìn)入凝膠。c.在柱子中加入60毫升Tris緩沖液。打開開關(guān)，收集含有病毒的洗脫物。在4℃儲存洗脫物。d.用300毫升Tris緩沖液平衡柱子。e.重復(fù)以上步驟，直到完成所有樣本。如果加入柱子中最終樣本體積小于43毫升，在加入柱子前用Tris緩沖液將樣本體積調(diào)配到43毫升。f.結(jié)合洗脫所得的樣本。g.用300毫升Tris緩沖液清洗柱子。卸載柱子，用20％乙醇沖洗樹脂兩次，每次500毫升。第四步：評估參考樣本對從第三步獲得的洗脫物進(jìn)行蔗糖梯度離心、紫外線分光光度滴定和分子排阻層析法等，來評估獲得口蹄疫病毒顆粒樣本是否純化。實施例2口蹄疫病毒顆粒的量化和分析本實施例描述了本發(fā)明如何使用動態(tài)光散射(DLS)對生產(chǎn)流程的中間樣本和最終產(chǎn)品,以及對口蹄疫病毒疫苗中的口蹄疫病毒顆粒進(jìn)行量化及分析其完整性和大小。其中，量化及分析與樣本的純度無關(guān)。在一個實施例中，紫外線用于確定峰面積，從而計算病毒濃度，而DLS則用于分析病毒顆粒的尺寸和完整性。設(shè)備及操作條件：·InfinityAgilent1260層析系統(tǒng)：配備有泵，在線脫氣系統(tǒng)，自動進(jìn)樣器，樣本冷卻模塊，柱調(diào)溫箱，可調(diào)節(jié)波長的紫外線探測器和PC版OpenlabCDSChemstation軟件?！游鲋篢OSOHBioscience的TSKgelG4000PWXL(內(nèi)徑：7.8毫米，長：30.0厘米)或其他類似層析柱?？蛇x配保護(hù)柱TSKgelPWXLGuardcol(內(nèi)徑：6.0毫米，長：4.0厘米)或類似保護(hù)柱以及選配PhenomenexSecurityGuard保護(hù)柱芯GFCAJO-4489-4000?！は嗳萦?4x1.5毫升組塊的Eppendorf恒溫混勻器互換組塊(ThermomixerInterchangeableblock)?！PC1流動相液(30mMTris,400mMNaCl,pH＝8)?！igmaE1014-25KU-≥250units/μL,≥90％(SDS-PAGE)?！は♂尵彌_液(50mMTris,20mMNaCl,2mMMgCl2)?！すぷ饕簼舛?1.25U/μL)?！は♂尵彌_液：30mMTris,pH＝8?！alvernZetasizerNanoS動態(tài)光散射(DLS)ZEN1600分析儀，配置7.02版Zetasizer軟件?！ち鲃酉嗖僮髟噭┖校溆蠬ellmaAnalytics176.751-QSZEN0116流動池。分析過程：a)樣本的預(yù)先處理i)氯仿萃取(1)受感染細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液、制備乳劑前及超濾濃縮物的水溶相液將5毫升的樣品分裝至15亳升的離心管中，然后向離心管中加入5亳升氯仿，猛烈震蕩2分鐘將之混勻，再在4℃以4500RPM離心15分鐘。將離心樣本的上層水溶液分離并轉(zhuǎn)移至另一個15亳升離心管。重復(fù)進(jìn)行氯仿萃取并將離心樣本的上層水溶液分離并轉(zhuǎn)移至另一個離心管。對于超濾病毒濃縮物,進(jìn)行上述步驟后向每2毫升的萃取水溶液加入1毫升的30mMTris，pH＝8的溶液以稀釋樣本,這樣可以在進(jìn)行酶消化前減低樣本的離子強度。(2)使用PEG沉淀制備病毒濃縮物使用磁力攪拌器不斷攪拌樣本以防止沉淀物沉降。抽取10毫升濃縮病毒并將之轉(zhuǎn)移到250毫升的燒杯中。使用30mMTris,100mMNaCl,pH＝8的溶液稀釋樣本至最終100毫升的體積。在4℃攪拌過夜。抽取5毫升的稀釋濃縮物并如前面段落中描述進(jìn)行氯仿萃取。(3)水包油乳劑口蹄疫病毒樣本將20亳升市售的油脂性疫苗分裝至50亳升的離心管中，然后向離心管中加入20亳升氯仿，猛烈震蕩5分鐘將之混勻，再在4℃以4500RPM離心15分鐘。將分離的水溶相液轉(zhuǎn)移至另一個50亳升的離心管，再次加入20亳升氯仿，猛烈震蕩5分鐘將之混勻，再次在4℃以4500RPM離心15分鐘，再次將的水溶相液分離并轉(zhuǎn)移至另一個50亳升離心管，所得的水溶相液為用來分析水包油乳劑口蹄疫疫苗的樣本。ii)酶消化上述水溶相液樣本可直接使用或在適當(dāng)時候采用本發(fā)明前述的方法進(jìn)行預(yù)先處理。將在步驟i.獲得的1亳升樣本轉(zhuǎn)移至1.5亳升Eppendorf離心管。加入20微升酶稀釋液(1.25U/微升)，即是將25U加入到離心管中，用Eppendorf恒溫混勻器以1400RPM轉(zhuǎn)速(高速)在37℃下震動混勻60分鐘。將樣本管從恒溫混勻器中取出，置于4℃，在離心力16000g下離心10分鐘。收集上清液，小心勿碰到沉淀物，將收集的上清液轉(zhuǎn)移至HPLC管中，再蓋上HPLC蓋子?？梢灾苯邮褂脤嵤├?中準(zhǔn)備的參考樣本或校準(zhǔn)樣本，也可在進(jìn)行層析分析前采用與處理測試樣本同樣的方法進(jìn)行預(yù)先處理。本發(fā)明使用的Eppendorf高速恒溫混勻器以微處理器控制,能夠同時處理24個樣本管。因此,可以同時對24個樣本進(jìn)行消化程序并能減少樣本體積與HPLC更相容。b)層析分析依據(jù)樣本類型安排樣本的次序。連接好層析系統(tǒng)的洗脫線路：樣本首先進(jìn)入層析柱，流經(jīng)紫外線檢測器，再進(jìn)入ZEN1600DLS分析器的Hellma流動池。在DLS分析器的Zetasizer軟件上作適當(dāng)?shù)脑O(shè)置。對應(yīng)病毒的峰在層析柱的停留時間大約為15-16分鐘(或?qū)?yīng)的洗脫體積)，但實際的停留時間取決于層析的洗脫條件。整合對應(yīng)病毒的峰，并根據(jù)下列公式計算對照樣本中口蹄疫病毒(FMDV)的濃度：FMDV[μg/mL]＝(面積×10×1.02)/(Ft×72×b×Volinj)其中：面積：曲線下面積，其單位為mAU*s,mAU*min或mAU*mL10：單位轉(zhuǎn)換系數(shù)1.02：Benzonase溶液的稀釋校正系數(shù)(如適用)72：口蹄疫病毒(FMDV)在254E1％的質(zhì)量吸收系數(shù)Ft：流量-時間系數(shù)，0.5mL/min的層析流速下，面積的單位為mAU*s,mAU*min和mAU*mL時，F(xiàn)t分別等于120，2和1b：UV流動池的光程長度，單位為cmVolinj：樣本體積，單位為mL對于超濾病毒濃縮物，由于樣本在酶消化前被稀釋2/3倍，因此需要將其結(jié)果乘以1.5倍。DLSZetasizer軟件產(chǎn)生流量蹤跡(FlowTrace)與體積/時間(Volume/Time)圖。通過記錄的峰的洗脫時間/體積和Z-平均(Z-average)直徑(d.nm)以取得口蹄疫病毒峰信號。采用以下參數(shù)以確認(rèn)分析程序的有效性：a)對照樣本的校準(zhǔn)曲線的斜率為86.4(mAU*s)/(mg/mL)±8.64，b)X-軸上截距的絕對值小于對照樣本的平均濃度的10％，c)FMDV峰的Z-平均(Z-average)直徑介于28-40nm。在一個實施例中，本發(fā)明的方法參考從相同口蹄疫病毒株的參考或標(biāo)準(zhǔn)樣本獲得的實驗參數(shù)以驗證測試結(jié)果。所考慮的參數(shù)包括選擇性﹑峰純度﹑準(zhǔn)確度﹑反應(yīng)的線性﹑重復(fù)性﹑中間精密度﹑檢測限度和量化限度。在一個實施例中，本發(fā)明使用分別涵蓋高及低量的口蹄疫病毒的兩個參考或標(biāo)準(zhǔn)樣本以驗證測試結(jié)果。在一個實施例中，本發(fā)明的方法包括一個或多個無病毒的陰性對照以驗證測試結(jié)果。陰性對照可以是通過冷凍/解凍被裂解的哺乳動物細(xì)胞樣本，而且被本發(fā)明所描述的預(yù)先處理程序預(yù)先處理。當(dāng)確認(rèn)了分析程序有效后，就可以直接計算樣本中病毒的數(shù)量，或通過對照樣本的校準(zhǔn)曲線計算出的曲線面積，進(jìn)而計算測試樣本中病毒的數(shù)量。在一個實施例中，本發(fā)明使用的層析柱的長度是30厘米。在一般情況下，較短的層析柱需要較短的運行時間，但其解析度較低(特別是對具有相近流體動力學(xué)體積的顆粒而言)。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以根據(jù)樣品類型調(diào)整層析柱的長度。在一個實施例中，可使用TOSOHBioscienceTSKgelG4000PWXL分子排阻層析柱以在很短的運行時間內(nèi)充分地將口蹄疫病毒顆粒及污染物分開。取決于樣品的性質(zhì)，其它的孔尺寸或以其它形式或材料制造的樹脂亦可用于制備本發(fā)明的分子排阻層析柱。但是，應(yīng)該注意的是，樹脂的孔徑不僅影響層析柱的解析度，亦影響層析的運行時間。例如，如果樹脂的孔大得足以讓病毒進(jìn)入樹脂內(nèi)，或需更長的時間來洗脫口蹄疫病毒，因此延長了整個分離過程。結(jié)果分析分析未經(jīng)加熱和加熱后純化口蹄疫病毒O1Campos的參考樣本(口蹄疫病毒分解)本實施例描述本發(fā)明的方法如何量化口蹄疫病毒病毒顆粒以及分析其完整性及大小。本實施例亦証明了本發(fā)明的方法可以檢測純化O1CamposFMD病毒參考樣本經(jīng)加熱及核酸酶消化后所產(chǎn)生的病毒顆粒片段(12S或衣殼蛋白)圖1A是純化口蹄疫病毒O1Campos在U.V.254nm的色譜圖，色譜圖僅顯示一個單峰,其洗脫體積是6.33mL。采用公式FMDV[μg/mL]＝(面積[mAU*mL]X10)/(1X72X0.5[cm]X0.1[mL])計算曲線下的面積。計算出病毒的濃度為421.7μg/mL。表1列出了洗脫樣本(峰)其UV色譜分析的參數(shù)。表1–純化口蹄疫病毒O1Campos的色譜分析參數(shù)峰洗脫體積(ml)面積(mAU*ml)高度(mAU)16.33147.1057217.037圖1B是由DLS檢測器記錄的光散射強度蹤跡圖(Intensity,實線)，在同樣的體積范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個輕微向左傾斜的單峰。Z-平均蹤跡(Z-average,點)顯示此峰對應(yīng)平均直徑為29.28nm的顆粒。該尺寸與已知的口蹄疫病毒顆粒的直徑一致。表2列出了洗脫樣本(峰)其DLS分析的參數(shù)結(jié)果。表2–純化口蹄疫病毒O1Campos的DLS分析參數(shù)圖2A是純化口蹄疫病毒O1Campos經(jīng)過1小時56℃的加熱及使用核酸酶內(nèi)切核酸后所得的色譜圖。56℃可使病毒分解成12S顆粒和/或衣殼蛋白，并使病毒RNA露出從而被核酸酶降解。表3列出了洗脫樣本(峰)其UV色譜分析的參數(shù)。表3–純化口蹄疫病毒O1Campos經(jīng)過加熱及核酸處理后的色譜分析參數(shù)峰洗脫體積(ml)面積(mAU*ml)高度(mAU)17.542.68465.94629.83172.3857265.774經(jīng)熱和酶處理后的純化口蹄疫病毒O1Campos在U.V.254nm的色譜圖中出現(xiàn)了兩個峰，小峰出現(xiàn)于7.54mL，大峰出現(xiàn)于9.83mL。未經(jīng)加熱處理和酶處理的O1Campos參考樣本的色譜圖中所觀察到單峰在此色譜圖中完全消失。圖2B中DLS檢測器記錄的光散射強度蹤跡圖(Intensity,實線)出現(xiàn)了雙峰，表4列出了洗脫樣本(峰)的DLS分析的參數(shù)結(jié)果。表4–純化口蹄疫病毒O1Campos經(jīng)過加熱及核酸處理后的DLS分析參數(shù)第一個峰(于6.27mL至6.6mL之間)，只有散射光強度的6.2％，并且與U.V.檢測結(jié)果不對應(yīng)。此峰的Zaverage蹤跡顯示了該顆粒的大小在20到60nm之間，Z平均值為33.42nm。使用抗口蹄疫病毒蛋白抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析得出，該峰對應(yīng)未因加熱及酶處理而分解的病毒顆粒(未顯示數(shù)據(jù))。第二個峰(于7.21至9.48mL之間)，Z平均值直徑為13.03nm，并且與U.V.254nm色譜圖中出現(xiàn)于7.54mL處的小峰相對應(yīng)。該峰在蛋白質(zhì)印跡分析中有強烈信號(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)所測定的大小及蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果，該峰代表口蹄疫病毒分解后的片段(12S和/或衣殼蛋白)，由于這些分解成分完全由蛋白質(zhì)組成，所以在UV254nm的吸收低(見圖2A中7.54ml處的峰值)。在UV色譜圖(圖2A)中9.83mL洗脫體積處，DLS檢測器(圖2B)未檢測到洗脫峰?？谔阋卟《綬NA基因組經(jīng)消化后降解為核苷酸和/或寡核糖核苷酸，DLS檢測結(jié)果與所得的核苷酸的結(jié)果相一致。實施例3氯仿萃取和對量化由PEG沉淀所得的病毒濃縮物中的無包膜病毒顆粒的影響本實施例描述了合并使用核酸酶及氯仿萃取的效果。在一個實施例中,使用去除細(xì)胞DNA污染物以及使用氯仿萃取去除脂質(zhì)污染物。設(shè)備及操作條件：本實施例的所用的設(shè)備﹑試劑和溶液與實施例2相同,除下列差別之外：-層析系統(tǒng):通用電氣(GeneralElectric)的凈化系統(tǒng)UPC-10，配有254/280nm固定UV波長和電導(dǎo)率檢測器與Unicorn控制軟件-PEG濃縮病毒的稀釋緩沖液：30mMTris,100mMNaCl,pH＝8分析步驟：受口蹄疫病毒O1Campos感染的幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液經(jīng)化學(xué)滅活后,對樣本加入PEG6000的濃溶液至最終5.5％的PEG濃度以沉淀病毒。沉淀72小時后，棄去上清液及收集口蹄疫病毒濃縮物。濃縮物達(dá)至50倍(50X)的濃縮水平。隨后以稀釋緩沖液(30mMTris，100mMNaCl，pH＝8)將所收集的病毒濃縮物稀釋10倍，置于4℃以磁力攪拌過夜降低PEG濃度并使病毒顆?；貜?fù)其可溶形態(tài)。a)樣本的預(yù)先處理從稀釋的口蹄疫病毒的濃縮物抽取四個樣本，并在進(jìn)行層析分析之前分別對四個樣本進(jìn)行以下預(yù)先處理程序：i)將5mL氯仿加入到5mL的樣本中，猛烈震蕩將之混勻。用離心機(jī)將混合物消除形成的乳液，并使用吸管收集上層的水溶液。ii)如實施例2中所述對2mL的樣本使用進(jìn)行酶消化。iii)如實施例2中所述對2mL從步驟i)收集的水溶液使用進(jìn)行酶消化。iv)2mL的樣品，既不使用氯仿萃取，也不進(jìn)行酶消化處理。在進(jìn)行層析分析前，先在離心力16000g下對四個樣本進(jìn)行離心以消除任何非溶性物質(zhì)，在不干擾沉淀物的情況下將樣本的上清液轉(zhuǎn)移至新容器中。b)層析分析如實施例2中所述,對四個樣本進(jìn)行層析分析。注射體積為100μL，在254nm下進(jìn)行監(jiān)測。結(jié)果分析圖3顯示本實施例的結(jié)果。圖3A比較了未經(jīng)處理的和充分處理的樣本。在未經(jīng)處理的樣本中,對應(yīng)病毒及核酸峰以肩峰的形式出現(xiàn),顯示層析柱不能將兩者分開。在此情況下，由于樣本存在核酸污染物,病毒峰的積分分析并不準(zhǔn)確。相反，在經(jīng)處理的樣本中，病毒峰以對稱的高斯鐘形曲線(Gaussianbell)形式出現(xiàn)，其信號隨后能重回基線水平。圖3B顯示省略酶處理對氯仿萃取樣本的效果，該圖顯示造成不同病毒峰形狀的原因是酶消化這步驟。圖3C顯示了即使在酶消化后，樣本中仍存在高分子的脂質(zhì)物，這些脂質(zhì)物在層析柱的排除體積中洗脫。這些脂質(zhì)污染物可以通過氯仿萃取除去。省略氯仿萃取或會導(dǎo)致過度估計樣品中的病毒含量。實施例4含有包膜和無包膜病毒的疫苗的穩(wěn)定性測試本實施例描述了本發(fā)明被應(yīng)用于測試病毒疫苗的穩(wěn)定性。如以上實施例所述的方法,對在4℃儲存前及后的疫苗中的病毒顆粒進(jìn)行分析。通過分析U.V.色譜圖和DLS蹤跡圖可計算出病毒顆粒的數(shù)量和大小。病毒顆粒儲存前后的數(shù)量變化可以通過相比儲存前的病毒顆粒數(shù)量的百分比來計算。也可通過比較圖譜分析病毒顆粒的完整性。實施例5高濃度無包膜病毒顆粒的量化和分析本實施例描述了本發(fā)明被應(yīng)用于通過超濾技術(shù)獲得高濃度無包膜病毒樣本。在一個實施例中，描述了本發(fā)明被應(yīng)用于通過超濾技術(shù)獲得高濃度的口蹄疫病毒樣本。在另一個實施例中，描述了本發(fā)明被應(yīng)用于通過超濾技術(shù)獲得高濃度的輪狀病毒樣本。在一個實施例中，還描述了通過超濾技術(shù)獲得的高濃度的口蹄疫病毒抗原的連續(xù)稀釋物，并進(jìn)行量化和分析。在另一個實施例中，還描述了通過超濾技術(shù)獲得的高濃度的輪狀病毒抗原的連續(xù)稀釋物，并進(jìn)行量化和分析。I–高度濃縮的口蹄疫病毒樣本分析設(shè)備與操作條件：本實施例所需的設(shè)備與操作條件與實施例2中的相同。分析步驟：BHK細(xì)胞在生物反應(yīng)器培養(yǎng)時被口蹄疫病毒O1Campos菌株感染后會產(chǎn)生低濃度的病毒材料，這些材料會立即通過乙烯亞胺溶液進(jìn)行化學(xué)滅活。然后再用超濾技術(shù)將O1Campos病毒懸浮液高度濃縮至150倍(150X)。在濃縮過程期間，需要密切監(jiān)測病毒的濃度和質(zhì)量以評估濃縮過抗原的產(chǎn)率和完整性。結(jié)合病毒懸浮液的初始體積﹑體積縮小比率以及超濾過程期間進(jìn)行的HPLC檢定的結(jié)果,估計出病毒懸浮液的病毒濃度約為700-800微克/毫升。根據(jù)表5的稀釋方案在三個不同的日子各自制備一組連續(xù)稀釋物。隨后該三組連續(xù)稀釋物進(jìn)行如實施例2中描述的方法預(yù)先處理,及使用Agilent1260色譜儀分析樣本。重復(fù)注射每個樣本到Agilent1200色譜儀,一共獲得兩組數(shù)據(jù)。本實施例亦分析了口蹄疫病毒濃縮物及稀釋緩沖液兩個樣本。所述稀釋緩沖液具有以下組分：300mMNaCl；20mMTrisbase；pH＝8。表5–使用口蹄疫病毒的濃縮物制備樣本的稀釋方案分析所得的紫外線峰面積并計算各樣本中口蹄疫病毒顆粒的濃度。計算三組連續(xù)稀釋物中每個重復(fù)注射樣本的結(jié)果平均值。計算每組連續(xù)稀釋物中每個重復(fù)注射樣本的結(jié)果平均值。列圖表示計算出的病毒濃度及濃度百分比的關(guān)係。計算三組連續(xù)稀釋物的病毒濃度的平均值并進(jìn)行回歸分析。使用與HPLC直接連接的MalvernNanoSDLS儀器每10秒一次收集動態(tài)光散射數(shù)據(jù)。使用MalvernZetasizer軟件7.02版本分析對應(yīng)病毒峰的數(shù)據(jù)。結(jié)果圖4A為經(jīng)超濾過程(UF)后獲得的口蹄疫病毒抗原濃縮物在254nm下的色譜圖。圖4B為5個口蹄疫病毒樣本(涵蓋20％至80％的口蹄疫病毒濃縮物)重迭的色譜圖。圖4C為同一個樣本在254nm下的紫外線色譜圖和DLS色譜圖的重迭。紫外線色譜圖和DLS色譜圖的重迭清晰地顯示了，通過紫外線跟蹤標(biāo)記的口蹄疫病毒峰是在用DLS跟蹤時唯一生成強度顯著的分散光的峰。這一結(jié)果表示，在這一樣本中的口蹄疫病毒顆粒是唯一足以實際分散強光及強度足以被DLS檢測器探測到的大分子。如圖4D所示，系數(shù)R2的數(shù)值高達(dá)0.9984，顯示所估計的病毒濃度和樣品的實際病毒濃度之間的關(guān)聯(lián)恒定和健壯，這表明本發(fā)明能夠精確地估計廣闊范圍內(nèi)的病毒濃度。同軸DLS測定出有關(guān)病毒峰的大小為29.9至34.2納米,這與在不同濃度下測定的口蹄疫病毒顆粒的大小相符(見圖4D和表6)。表6總結(jié)了所有從紫外線和DLS圖譜分析所得的結(jié)果。表6–三組口蹄疫病毒的連續(xù)稀釋物的紫外線和DLS圖譜的分析結(jié)果II–高度濃縮的G6血清型牛輪狀病毒樣本分析本實施例的所用的設(shè)備﹑試劑和溶液與實施例2相同,除下列差別之外：設(shè)備與操作條件：-層析系統(tǒng)：通用電氣(GeneralElectric)的Healthcare凈化系統(tǒng)UPC-10色譜儀，配有二元泵、254/280nm固定UV波長檢測器、電導(dǎo)率檢測器與Unicorn控制軟件和數(shù)據(jù)采集軟件-層析柱：TOSOHBioscience的TSKgelG4000PWXL(內(nèi)徑：7.8毫米，長：30.0厘米)或其他類似層析柱無選配保護(hù)柱或柱芯。-適用于不同離心管的Eppendorf恒溫混勻器互換組塊(ThermomixerInterchangeableblock)。-生命科技(LifeTechnologies)的TURBOTMDNase酶(2U/μL)(目錄號#AM2238)。-生命科技(LifeTechnologies)原廠出廠的TURBOTMDNase酶十倍(10X)緩沖液。-MalvernZetasizerNanoS動態(tài)光散射(DLS)ZEN1600分析儀，配置7.11版Zetasizer軟件。分析過程將取自非洲綠猴(Cercophitecusaethiops)的腎的MA104細(xì)胞的培養(yǎng)物受牛輪狀病毒G6血清型感染。細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液經(jīng)化學(xué)滅活后,通過超濾濃縮以達(dá)到13.4倍濃度倍數(shù)。通過重復(fù)冷凍和解凍細(xì)胞培養(yǎng)來制備無效對照劑(陰性對照)。稀釋物樣本：使用無效對照液作為稀釋劑制備連續(xù)稀釋物樣品。表7–制備不同輪狀病毒樣本的牛輪狀病毒G6血清型濃縮物的稀釋方案樣本的預(yù)先處理：a)氯仿萃取i)根據(jù)實施例3a)(i)中所述的方法，前一步驟的各稀釋樣本用氯仿萃取，然后回收上層水溶液。b)酶消化i)前一步驟的各4.5mL樣本中加入500μLTURBOTMDNase酶的10倍(10X)緩沖液和5μLTURBOTMDNase酶(2U/μL)。ii)使用配有適用于15mL管的加熱模塊的Eppendorf恒溫混勻器以750RPM轉(zhuǎn)速在37℃下孵育60分鐘。iii)獲得的1亳升樣本轉(zhuǎn)移至1.5亳升Eppendorf離心管，置于4℃，在離心力16000g下離心10分鐘。通過吸移將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，注意不要干擾沉淀以避免堵塞層析柱。層析分析：i)每個已離心及消化過的樣品，通過自動注射閥中的測量回路注射100μL至層析系統(tǒng)。ii)GPC1流動相以0.5mL/分鐘的恒定速流等度運行，使用紫外線檢測器以254nm監(jiān)測獲得紫外線色譜圖，并串聯(lián)配置MalvernZetasizer檢測器獲得DLS散射光強度和Z-平均值。iii)使用Unicorn軟件收集和分析紫外線色譜圖；使用7.11版的MalvernZetasizer軟件收集和分析散射光強度和顆粒直徑的Z-平均值。結(jié)果：圖5A顯示經(jīng)超濾濃縮獲得的牛輪狀病毒抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖5B顯示5個濃度范圍在20％至100％之間的輪狀病毒樣本通過檢測獲得重迭的色譜圖。圖5C顯示一個樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。紫外線色譜圖和DLS色譜圖的重迭清晰地顯示了，通過紫外線跟蹤標(biāo)記的輪狀病毒峰是在用DLS跟蹤時唯一生成強度顯著的分散光的峰。這一結(jié)果表示，在這一樣本中的輪狀病毒顆粒是唯一足以實際分散強光及強度足以被DLS檢測器探測到的大分子。如圖5D所示，所得的R2決定系數(shù)非常高(0.997)，這表明估算的病毒濃度和實際樣本的病毒濃度之間存在恒定且強大的關(guān)聯(lián)，顯示了本發(fā)明能夠在寬廣的范圍內(nèi)準(zhǔn)確地估算輪狀病毒的濃度。同軸DLS測定出有關(guān)病毒峰的大小恒定在63.2至72.8nm之間，這與在不同濃度下測定的輪狀病毒顆粒的大小相符(見圖5D和表8)。表8總結(jié)了所有紫外線和DLS圖譜分析所得的結(jié)果。表8–輪狀病毒濃縮物及其連續(xù)稀釋物的紫外線和DLS圖譜的分析結(jié)果III–結(jié)果分析III–Interpretationofresults.本實施例說明了本發(fā)明能夠在寬廣的病毒濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確地測量無包膜病毒。在一個實施例中，本發(fā)明的能夠在寬廣的病毒濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確地測量病毒顆粒，如口蹄疫病毒和牛輪狀病毒，這與通過從稀釋高濃度病毒濃縮物而測定不同濃度的病毒樣本所得的高線性度相符。本實施例亦証明本發(fā)明能一致并準(zhǔn)確地分析口蹄疫病毒抗原或牛輪狀病毒抗原的大小而不受病毒濃度的影響。本實施例證明了不論是低濃度取自細(xì)胞感染物的上清液,還是高濃度的口蹄疫病毒顆粒濃縮物,本發(fā)明都可以非常精確地計算出病毒濃度。本實施例測試了高達(dá)150X的濃度(對應(yīng)本實施例的727μg/mL濃度)。另外，同軸DLS可以靈敏和準(zhǔn)確地在寬闊的濃度范圍內(nèi)檢測到顆粒尺寸和完整性。改變濃縮過程的條件例如溫度﹑pH值﹑剪切速率或會顯著地影響病毒顆粒的完整性,因此需要使用能涵蓋寬闊的濃度范圍的方法以監(jiān)察濃縮過程。本發(fā)明可以應(yīng)用于不同濃度的抗原樣本,并可以用于確定生產(chǎn)抗原流程中的濃縮步驟是否成功及質(zhì)量。因此，本發(fā)明可以作為過程分析技術(shù)(PAT)的最終工具，并保証所得的抗原濃縮物符合質(zhì)量。在100mAU至1500mAU的范圍內(nèi),測光誤差一般是相當(dāng)?shù)偷?。從此可以合理地推算本發(fā)明可以準(zhǔn)確地量化比本實施例所測量的病毒濃度高于2-3倍的病毒濃度,即可以測量高達(dá)約2250μg/mL的濃度。另外，如需要測定高濃度的病毒樣本,亦可以注入較小的樣本體積(例如50微升而非100微升),或簡單地根據(jù)所需濃度稀釋樣本并使用稀釋倍數(shù)校正所獲得的結(jié)果。因此，本方法可以應(yīng)用于遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出現(xiàn)時任何實際生產(chǎn)過程所需要的濃度范圍。動態(tài)光散射檢測器一般能應(yīng)用于2mg/mL或更高濃度的蛋白樣本。因此,本發(fā)明的同軸DLS檢測方法可以準(zhǔn)確地測定如本實施例所示﹑具有更高濃度的蛋白樣本?？谔阋咭呙缟a(chǎn)流程一般需要將從細(xì)胞培養(yǎng)的感染步驟中得到的病毒濃縮10至60倍。然而，如需要制備濃度非常高的口蹄疫毒抗原存庫時,或需要將樣本濃縮至150甚至200倍。本實施例所用的高度濃縮病毒材料濃度為727μg/mL,即對應(yīng)于150倍的濃度倍數(shù)。盡管不同口蹄疫病毒的濃度上限值或有不同且需要個別地確定,可以合理地估計口蹄疫病毒抗原可以濃縮至高達(dá)1250μg/mL(即1.25mg/mL)或更高的濃度，而不會對對口蹄疫病毒顆粒的溶解度有負(fù)面影響。本實施例証明本發(fā)明的方法非常適合用于濃度十分高的樣本以量化及分析無包膜病毒顆粒，因此可以應(yīng)用于高度濃縮的口蹄疫病毒抗原存庫或牛輪狀病毒抗原存庫。疫苗的常規(guī)病毒濃度通常會根據(jù)不同病毒株、國際管理機(jī)構(gòu)的要求和疫苗的藥學(xué)技術(shù)性質(zhì)而變化?？谔阋咭呙缱畛Ｒ姷氖撬腿橐夯蛩桶p乳液兩種類型。用于制備乳液的水溶相液的病毒濃度約為2μg/mL至60μg/mL。實施例6高濃度包膜病毒顆粒的量化和分析本實施例描述了本發(fā)明被應(yīng)用于通過超濾技術(shù)獲得高濃度的包膜病毒樣品。在一個實施方案中，描述了本發(fā)明被應(yīng)用于通過超濾技術(shù)獲得高濃度的牛皰疹病毒-5型樣本。在另一個實施方案中，描述了本發(fā)明被應(yīng)用于通過超濾技術(shù)獲得高濃度的副流感病毒-3型樣本。在另一個實施方案中，描述了本發(fā)明被應(yīng)用于通過超濾技術(shù)獲得高濃度的狂犬病病毒樣本。在一個實施例中，描述了通過超濾技術(shù)獲得的高濃度的牛皰疹病毒-5型抗原、副流感病毒-3型抗原和狂犬病病毒抗原的連續(xù)稀釋物，并進(jìn)行量化和分析。I–高度濃縮的牛皰疹病毒-5型樣本分析本實施例的所用的設(shè)備﹑試劑和溶液與實施例2相同,除下列差別之外：設(shè)備與操作條件：-層析系統(tǒng)：通用電氣(GeneralElectric)的Healthcare凈化系統(tǒng)UPC-10色譜儀，配有二元泵、254/280nm固定UV波長檢測器、電導(dǎo)率檢測器與Unicorn控制軟件和數(shù)據(jù)采集軟件-層析柱：根據(jù)制造商的說明書用GEHealtcareLifeSciencesSephacrylS-400SEC/GPC色譜介質(zhì)裝填的GeneralElectricHealthcareXK16/40硼硅酸鹽玻璃柱(內(nèi)徑：16毫米，長：40.0厘米)-適用于不同離心管的Eppendorf恒溫混勻器互換組塊(ThermomixerInterchangeableblock)-生命科技(LifeTechnologies)的TURBOTMDNase酶(2U/μL)(目錄號#AM2238)-生命科技(LifeTechnologies)原廠出廠的TURBOTMDNase酶十倍(10X)緩沖液-MalvernZetasizerNanoS動態(tài)光散射(DLS)ZEN1600分析儀，配置7.11版Zetasizer軟件分析程序：用牛皰疹病毒-5型(BoHV-5)菌株A663感染Madin-Darby牛腎細(xì)胞(MDBK)的培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液經(jīng)化學(xué)滅活后,通過超濾濃縮以達(dá)到6.4倍濃度倍數(shù)。通過重復(fù)冷凍和解凍細(xì)胞培養(yǎng)物來制備無效對照劑(陰性對照)。稀釋物樣本：使用無效對照液作為稀釋劑制備樣品的連續(xù)稀釋物。表9–制備不同牛皰疹病毒-5型樣本的牛輪狀病毒G6血清型濃縮物的稀釋方案樣本的預(yù)先處理：a)酶消化i)前一步驟的各4.5mL樣本中加入500μLTURBOTMDNase酶的10倍(10X)緩沖液和20μLTURBOTMDNase酶(2U/μL)。ii)使用配有適用于15mL管的加熱模塊的Eppendorf恒溫混勻器以750RPM轉(zhuǎn)速在37℃下孵育60分鐘。iii)獲得的1亳升樣本轉(zhuǎn)移至1.5亳升Eppendorf離心管，置于4℃，在離心力16000g下離心10分鐘。通過吸移將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，注意不要干擾沉淀以避免堵塞層析柱。層析分析：i)每個已離心及消化過的樣品，通過自動注射閥中的測量回路注射940μL至層析系統(tǒng)。ii)GPC1流動相以1mL/分鐘的恒定速流等度運行，使用紫外線檢測器以254nm監(jiān)測獲得紫外線色譜圖，并串聯(lián)配置MalvernZetasizer檢測器獲得DLS散射光強度和Z-平均值。iii)使用Unicorn軟件收集和分析紫外線色譜圖；使用7.11版的MalvernZetasizer軟件收集和分析散射光強度和顆粒直徑的Z-平均值。結(jié)果：圖6A顯示經(jīng)超濾濃縮獲得的牛皰疹病毒-5型抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖6B顯示5個濃度范圍在20％至100％之間的牛皰疹病毒-5型樣本通過檢測獲得重迭的色譜圖。圖6C顯示一個樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。紫外線色譜圖和DLS色譜圖的重迭清晰地顯示了，通過紫外線跟蹤標(biāo)記的牛皰疹病毒-5型毒峰是在用DLS跟蹤時唯一生成強度顯著的分散光的峰。這一結(jié)果表示，在這一樣本中的牛皰疹病毒-5型顆粒是唯一足以實際分散強光及強度足以被DLS檢測器探測到的大分子。如圖6D所示，所得的R2決定系數(shù)非常高(0.9987)，這表明估算的病毒濃度和實際樣本的病毒濃度之間存在恒定且強大的關(guān)聯(lián)，顯示了本發(fā)明能夠在寬廣的范圍內(nèi)準(zhǔn)確地估算牛皰疹病毒-5型的濃度。同軸DLS測定出有關(guān)病毒峰的大小恒定在137.1至151.7nm之間，這與在不同濃度下測定的牛皰疹病毒-5型顆粒的大小相符(見圖6D和表10)。表10總結(jié)了所有紫外線和DLS圖譜分析所得的結(jié)果。表10–牛皰疹病毒-5型濃縮物及其連續(xù)稀釋物的紫外線和DLS圖譜的分析結(jié)果II–副流感病毒-3型濃縮樣本分析本實施例的所用的設(shè)備﹑試劑和溶液與實施例2相同,除下列差別之外：設(shè)備與操作條件：-層析系統(tǒng)：通用電氣(GeneralElectric)的Healthcare凈化系統(tǒng)UPC-10色譜儀，配有二元泵、254/280nm固定UV波長檢測器、電導(dǎo)率檢測器與Unicorn控制軟件和數(shù)據(jù)采集軟件-層析柱：TOSOHBioscience的TSKgelG4000PWXL(內(nèi)徑：7.8毫米，長：30.0厘米)或其他類似層析柱無選配保護(hù)柱或柱芯-適用于不同離心管的Eppendorf恒溫混勻器互換組塊(ThermomixerInterchangeableblock)-生命科技(LifeTechnologies)的TURBOTMDNase酶(2U/μL)(目錄號#AM2238)-生命科技(LifeTechnologies)原廠出廠的TURBOTMDNase酶十倍(10X)緩沖液-MalvernZetasizerNanoS動態(tài)光散射(DLS)ZEN1600分析儀，配置7.11版Zetasizer軟件分析過程用副流感病毒-3型(PIV-3)感染Madin-Darby牛腎細(xì)胞(MDBK)的培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液經(jīng)化學(xué)滅活后,通過超濾濃縮以達(dá)到19.4倍濃度倍數(shù)。通過重復(fù)冷凍和解凍細(xì)胞培養(yǎng)物來制備無效對照劑(陰性對照)。稀釋物樣本：使用無效對照液作為稀釋劑制備樣品的連續(xù)稀釋物。表11-用于制備不同副流感病毒-3樣本的副流感病毒-3濃縮物的稀釋方案樣本的預(yù)先處理：a)酶消化i)前一步驟的各4.5mL樣本中加入500μLTURBOTMDNase酶的10倍(10X)緩沖液和5μLTURBOTMDNase酶(2U/μL)。ii)使用配有適用于15mL管的加熱模塊的Eppendorf恒溫混勻器以750RPM轉(zhuǎn)速在37℃下孵育60分鐘。iii)獲得的1亳升樣本轉(zhuǎn)移至1.5亳升Eppendorf離心管，置于4℃，在離心力16000g下離心10分鐘。通過吸移將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，注意不要干擾沉淀以避免堵塞層析柱。層析分析：i)每個已離心及消化過的樣品，通過自動注射閥中的測量回路注射100μL至層析系統(tǒng)。ii)GPC1流動相以0.5mL/分鐘的恒定速流等度運行，使用紫外線檢測器以254nm監(jiān)測獲得紫外線色譜圖，并串聯(lián)配置MalvernZetasizer檢測器獲得DLS散射光強度和Z-平均值。iii)使用Unicorn軟件收集和分析紫外線色譜圖；使用7.11版的MalvernZetasizer軟件收集和分析散射光強度和顆粒直徑的Z-平均值。結(jié)果：圖7A顯示經(jīng)超濾濃縮獲得的副流感病毒-3型抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖7B顯示5個濃度范圍在20％至100％之間的副流感病毒-3型樣本通過檢測獲得重迭的色譜圖圖7C顯示一個樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。紫外線色譜圖和DLS色譜圖的重迭清晰地顯示了，通過紫外線跟蹤標(biāo)記的副流感病毒-3型毒峰是在用DLS跟蹤時唯一生成強度顯著的分散光的峰。這一結(jié)果表示，在這一樣本中的副流感病毒-3型顆粒是唯一足以實際分散強光及強度足以被DLS檢測器探測到的大分子。如圖7D所示，所得的R2決定系數(shù)非常高(0.9993)，這表明估算的病毒濃度和實際樣本的病毒濃度之間存在恒定且強大的關(guān)聯(lián)，顯示了本發(fā)明能夠在寬廣的范圍內(nèi)準(zhǔn)確地估算副流感病毒-3型的濃度。同軸DLS測定出有關(guān)病毒峰的大小恒定在123至138nm之間，這與在不同濃度下測定的副流感病毒-3型顆粒的大小相符(見圖7D和表12)。表12總結(jié)了所有紫外線和DLS圖譜分析所得的結(jié)果。表12–副流感病毒-3濃縮物及其連續(xù)稀釋物的紫外線和DLS圖譜的分析結(jié)果III–高濃度的狂犬病病毒樣本的分析本實施例的所用的設(shè)備﹑試劑和溶液與實施例2相同,除下列差別之外。設(shè)備與操作條件：-層析系統(tǒng)：通用電氣(GeneralElectric)的Healthcare凈化系統(tǒng)UPC-10色譜儀，配有二元泵、254/280nm固定UV波長檢測器、電導(dǎo)率檢測器與Unicorn控制軟件和數(shù)據(jù)采集軟件-層析柱：TOSOHBioscience的TSKgelG4000PWXL(內(nèi)徑：7.8毫米，長：30.0厘米)或其他類似層析柱無選配保護(hù)柱或柱芯-適用于不同離心管的Eppendorf恒溫混勻器互換組塊(ThermomixerInterchangeableblock)-生命科技(LifeTechnologies)的TURBOTMDNase酶(2U/μL)(目錄號#AM2238)-生命科技(LifeTechnologies)原廠出廠的TURBOTMDNase酶十倍(10X)緩沖液-MalvernZetasizerNanoS動態(tài)光散射(DLS)ZEN1600分析儀，配置7.11版Zetasizer軟件分析程序：用狂犬病病毒(巴斯德疫苗株/PV)感染幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK21)的培養(yǎng)物。細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液經(jīng)化學(xué)滅活后,通過超濾濃縮以達(dá)到10.2倍濃度倍數(shù)。通過重復(fù)冷凍和解凍細(xì)胞培養(yǎng)物來制備無效對照劑(陰性對照)。其中未感染的細(xì)胞培養(yǎng)物與收獲的已感染的細(xì)胞培養(yǎng)物具有相同的生長周期。稀釋物樣本：使用無效對照液作為稀釋劑制備樣品的連續(xù)稀釋物。表13–制備不同狂犬病毒樣本的狂犬病毒濃縮物的稀釋方案樣本的預(yù)先處理：a)酶消化i)前一步驟的各4.5mL樣本中加入500μLTURBOTMDNase酶的10倍(10X)緩沖液和5μLTURBOTMDNase酶(2U/μL)。ii)使用配有適用于15mL管的加熱模塊的Eppendorf恒溫混勻器以750RPM轉(zhuǎn)速在37℃下孵育60分鐘。iii)獲得的1亳升樣本轉(zhuǎn)移至1.5亳升Eppendorf離心管，置于4℃，在離心力16000g下離心10分鐘。通過吸移將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，注意不要干擾沉淀以避免堵塞層析柱。層析分析：i)每個已離心及消化過的樣品，通過自動注射閥中的測量回路注射100μL至層析系統(tǒng)。ii)GPC1流動相以0.5mL/分鐘的恒定速流等度運行，使用紫外線檢測器以254nm監(jiān)測獲得紫外線色譜圖，并串聯(lián)配置MalvernZetasizer檢測器獲得DLS散射光強度和Z-平均值。iii)使用Unicorn軟件收集和分析紫外線色譜圖；使用7.11版的MalvernZetasizer軟件收集和分析散射光強度和顆粒直徑的Z-平均值。結(jié)果：圖8A顯示經(jīng)超濾濃縮獲得的狂犬病病毒抗原濃縮液在254nm下的色譜圖。圖8B顯示5個濃度范圍在20％至100％之間的狂犬病病毒樣本通過檢測獲得重迭的色譜圖。圖8C顯示一個樣本的兩個色譜圖的重迭：一個是254nm下的色譜圖，另一個是動態(tài)光散射(DLS)的色譜圖。紫外線色譜圖和DLS色譜圖的重迭清晰地顯示了，通過紫外線跟蹤標(biāo)記的狂犬病病毒峰是在用DLS跟蹤時唯一生成強度顯著的分散光的峰。這一結(jié)果表示，在這一樣本中的狂犬病病毒顆粒是唯一足以實際分散強光及強度足以被DLS檢測器探測到的大分子。如圖8D所示，所得的R2決定系數(shù)非常高(0.9972)，這表明估算的病毒濃度和實際樣本的病毒濃度之間存在恒定且強大的關(guān)聯(lián)，顯示了本發(fā)明能夠在寬廣的范圍內(nèi)準(zhǔn)確地估算狂犬病病毒的濃度。同軸DLS測定出有關(guān)病毒峰的大小恒定在106至112nm之間，這與在不同濃度下測定的狂犬病病毒顆粒的大小相符(見圖8D和表14)。事實上，狂犬病病毒是一種類似子彈狀的病毒，長約180nm、橫截面直徑約為75nm的。由于DLS檢測器計算每個顆粒的流體動力學(xué)半徑，因此DLS檢測器會認(rèn)為所有的顆粒都是球形的，所以這個實驗中獲得的尺寸測量范圍在75至180nm之間非常合乎邏輯。表14總結(jié)了所有紫外線和DLS圖譜分析所得的結(jié)果。表14–狂犬病病毒濃縮物及其連續(xù)稀釋物的紫外線和DLS圖譜的分析結(jié)果分析這個實施例說明了本發(fā)明能夠在寬廣的病毒濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確地測量包膜病毒。這個實施例能夠在寬廣的病毒濃度范圍內(nèi)準(zhǔn)確地測量包膜病毒顆粒(如牛皰疹病毒-5型、副流感病毒-3型和狂犬病病毒)，且與通過從不同的高濃度病毒濃縮物稀釋而來的病毒樣本測定所得的病毒濃度的高線性度相符。這個實施例顯示了本發(fā)明能夠持續(xù)準(zhǔn)確地表征牛皰疹病毒-5型抗原、副流感病毒-3型或狂犬病病毒抗原的大小以及完整性，不依賴于病毒濃度。如本實施例所示，本發(fā)明方法非常適合于濃縮樣本中包膜病毒分子的量化和表征，因此可以適用超濃縮的牛皰疹病毒-5型抗原存庫、副流感病毒-3型抗原存庫或狂犬病病毒抗原存庫。實施例7監(jiān)測工業(yè)用細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中感染口蹄疫病毒的情況本實施例描述本發(fā)明用于監(jiān)測在2000公升細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中的感染過程。以下為感染病毒的步驟:將2000公升的幼倉鼠腎(BabyHamsterKidney,BHK)細(xì)胞在補充有12％(以體積計)的成年牛血清的GMEM(GlasgowMinimalEssentialMedium)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至2.4×106/mL的細(xì)胞濃度。一旦達(dá)到所需細(xì)胞濃度，使細(xì)胞沉降，去掉含血清的培養(yǎng)基并用不含血清的GMEM取代。在培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞，并在細(xì)胞培養(yǎng)物中接種口蹄疫病毒O1Campos的培養(yǎng)種(seedculture)。該病毒培養(yǎng)種的感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI),即感染一個細(xì)胞所需的細(xì)菌數(shù)量,為0.001至0.05。感染前后的溫度都是恒定地保持在37℃。培養(yǎng)樣品1小時到4小時，4小時后以每30分鐘的間隔抽取樣本。使用改進(jìn)的Neubauer血細(xì)胞計數(shù)器在顯微鏡下計算細(xì)胞的數(shù)量。將剩余的樣本離心并收集上清液。再用本發(fā)明的方法直接測量病毒濃度和分析病毒的大小和完整性。圖9和表15總結(jié)了實施例7的結(jié)果。表15–感染后首個8小時內(nèi)病毒濃度、病毒大小和細(xì)胞數(shù)量變化*病毒濃度低于現(xiàn)有驗證技術(shù)的檢測限制，因此不能視為與背景信號具有顯著分別。細(xì)胞在感染后4小時持續(xù)生長，但樣本沒有檢測到病毒或只檢測到很少的病毒。從4至6.5小時期間，UV檢測器可以檢測出病毒，但所得的信號太低并不足以獲取準(zhǔn)確的DLS讀數(shù)。從6.5小時起，UV和DLS探測器都很容易地探測到病毒。同軸DLS檢測器計算出的尺寸為31-35納米，這讀數(shù)符合已知口蹄疫病毒的直徑。本實施例說明本發(fā)明可以在極低的口蹄疫病毒顆粒的濃度范圍內(nèi)量化及分析病毒顆粒。紫外線檢測器在感染后6小時開始提供可靠的254nm讀數(shù)(可測量1μg/mL或以上的濃度,對應(yīng)現(xiàn)時經(jīng)驗證的檢測限值(limitofdetection,LOD)。意想不到的是，DLS檢測器在1.2μg/mL的起始濃度開始可以可靠地和一致地測量口蹄疫病毒顆粒的大小。這是本發(fā)明的其中一個重要特征。DLS檢測器在正常操作下一般適用于0.5至2mg/mL的蛋白濃度,這相比本實施例所述的病毒濃度高出幾個數(shù)量級。本實施例證明，本發(fā)明的技術(shù)可以應(yīng)用于存活的口蹄疫病毒顆粒。本實施例以及本發(fā)明的其他數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了本發(fā)明的技術(shù)可以應(yīng)用于制造口蹄帶疫苗過程中每一個步驟,不管病毒是仍然活著，或者已經(jīng)被滅活。同樣地，本發(fā)明的技術(shù)還可以應(yīng)用于制造其他種類的活病毒顆粒(例如牛輪狀病毒、牛皰疹病毒-5型、副流感病毒-3型和狂犬病病毒)過程中的每一個步驟。最后，可以合理地預(yù)期當(dāng)使用更現(xiàn)代的紫外線探測器時，例如具有更大光徑或更低背景信號的檢測器，可進(jìn)一步降低本發(fā)明的檢測限值(limitofdetection,LOD)及定量限值(limitofquantification,LOQ)，例如0.1μg/mL的檢測限值和0.3μg/mL的定量限值。實施例8層析柱切換系統(tǒng)在一個實施例中，本發(fā)明提供了一個可以高通量量化及分析所有包膜和無包膜病毒的方法。受限於分子排阻層析法的性質(zhì)，通常需要從層析柱洗脫先前樣本所有的峰才可以開始對另一個樣本進(jìn)行新一輪的層析。因此，即使高分子量病毒抗原可以於層析過程的上半部被洗脫及分析,但由於樣本中低分子量的成分未完全從柱上洗脫出來,因此不能對另一個樣本進(jìn)行分析。否則，下一個樣本的病毒峰或會與先前層析尾隨的峰疊加，造成病毒樣本污染。因此,這段時間所收集的數(shù)據(jù)對量化病毒及確定抗原完整性是沒有用的。從層析柱洗脫所有的低分子量組分所需的時間浪費了設(shè)備和操作者的時間，井最終降低了分析實驗室的整體效率。雖然可以通過設(shè)置另一個包括紫外線檢測器和DLS檢測器的完整HPLC系統(tǒng)以提高效率,但整套設(shè)備昂貴而且需要佔用實驗室狹小的空間,因此為疫苗的質(zhì)量監(jiān)控實驗室?guī)聿槐恪１景l(fā)明提供了一種層析柱切換系統(tǒng)，能夠省卻重復(fù)設(shè)置紫外線檢測器和DLS檢測器的費用，并使整套設(shè)備僅需佔用與運行一個層析柱相若的空間就可以運作。在一個實施例中，本發(fā)明的層析柱切換系統(tǒng)包括兩個閥門陣列﹑兩個HPLC泵﹑兩個分子排阻層析柱﹑一個UV探測器和一個DLS檢測器。在另一個實施例中，如圖10所示，該系統(tǒng)還包括其他組件，如自動進(jìn)樣器和廢物收集匣。這種設(shè)置可以削減一半的層析運行時間，因此能有效地加倍生產(chǎn)力。應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明的層析柱切換系統(tǒng)可以根據(jù)量化和分析的需要采取任何適當(dāng)?shù)男问揭约芭渲闷渌卣骱筒考?。例如，可以將三個HPLC泵﹑三分子排阻層析柱和一個DLS檢測器連接在一起，以同時對三個不同的樣本進(jìn)行層析分析。如圖10所示，兩個閥門陣列包括閥1和閥2，用來連接不同的系統(tǒng)部件如泵﹑自動進(jìn)樣器﹑不同類型的柱﹑紫外線檢測器和廢液收集匣。本發(fā)明的系統(tǒng)可以獨立控制或一起操作兩個閥門。在進(jìn)行層析前，將需要分析的樣品放入自動進(jìn)樣器中，然后將適當(dāng)?shù)木彌_液例如平衡緩沖液和洗滌緩沖液連接至兩個泵。如圖10的左部所示，當(dāng)樣本在泵B控制下的層析柱1內(nèi)運行時，泵A使用適當(dāng)?shù)钠胶饩彌_液洗滌層析柱2。當(dāng)層析柱1洗脫出病毒峰，經(jīng)過紫外線檢測器量化病毒，并且由DLS檢測器評估所得病毒的大小和完整性后，閥門陣列由圖10左部所示的設(shè)置切換成圖10右部所示的設(shè)置。排列在自動進(jìn)樣器的下一個樣本可以立即注入到層析柱2以進(jìn)行分析。同時，在泵A的帶動下，使用平衡緩沖液直接將殘留在層析柱1內(nèi)的低分子量組分沖到廢液收集匣。隨后，不斷來回切換兩個閥門陣列以分析輪流從層析柱1及層析柱2洗脫出來的樣本，直至對所有在自動進(jìn)樣器內(nèi)樣本的完成分析。在一個實施例中，本層析柱轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中的層析柱可裝載相同的病毒。在另一個實施例中，本層析柱轉(zhuǎn)換系統(tǒng)中的層析柱可裝載不同種類的病毒。在任何情況下，都可使用紫外線和DLS探測器依批次量化和分析從柱中洗脫出來的病毒峰來實現(xiàn)高通量分析。充分洗滌導(dǎo)管、層析柱和檢測系統(tǒng)后，交叉污染的可能性就會非常低，因此分析的準(zhǔn)確性可以得到保證。在一個實施例中，可以使用用于控制及調(diào)節(jié)各個系統(tǒng)部件(例如泵和自動進(jìn)樣器)的軟件,或是用于收集UV和DLS檢測器的數(shù)據(jù)的軟件來控制閥門。在一個實施例中，可使用用來控制Agilent1200色譜儀的AgilentChemStation軟件以控制本發(fā)明的整個系統(tǒng)。另外，亦可以預(yù)先設(shè)定程序?qū)⒄麄€過程完全自動化，程序包括但不限于以下步驟：平衡和洗滌層析柱﹑將樣品注入到層析柱中﹑在紫外線監(jiān)察下進(jìn)行分子排阻層析﹑使用UV檢測器和DLS檢測器量化及分析洗脫峰,以及和從層析柱去除廢物。亦可以使用其他自動化或機(jī)械人系統(tǒng)以進(jìn)行樣本預(yù)先處理步驟例如溶劑(如氯仿)萃取和酶消化,以進(jìn)一步提高量化和分析的效率。在一個實施例中，本發(fā)明的系統(tǒng)受到適用軟件和系統(tǒng)的緊密控制。例如，用于生成、合并和分析紫外線圖譜和DLS圖譜的軟件和系統(tǒng)可以用來把各洗脫部分的層析數(shù)據(jù)實時轉(zhuǎn)換為分析數(shù)據(jù)以便進(jìn)一步解析。常見錯誤情況(例如泄露、過壓)的警告系統(tǒng)和遠(yuǎn)程控制系統(tǒng)也包含在本發(fā)明的系統(tǒng)中。本實施例清楚地表明，本發(fā)明的多柱切換系統(tǒng)進(jìn)一步增強本發(fā)明分析方法的處理量。整個系統(tǒng)具有許多有利技術(shù)特徵,大大提高了分析口蹄疫病毒抗原的效率。本發(fā)明的有利技術(shù)特徵包括通過內(nèi)切酶消化去除大分子量的DNA，通過溶劑(如氯仿)萃取去除大分子量的脂質(zhì)，通過分子排阻層析柱去除低分子量的分子,在排除體積(或接近排斥體積)從分子排阻層析柱的洗脫出病毒顆粒,同時使用兩個或兩個以上的分子排阻層析柱,和實時DLS分析。本發(fā)明能夠產(chǎn)生高度純化的包膜及無包膜病毒峰，并可以在開始層析程序20分鐘后使用紫外線和DLS檢測器分析洗脫出來的病毒峰。本發(fā)明不僅實現(xiàn)了高處理量，而且提供一個更具成本效益分析病毒抗原的方法。本發(fā)明的層析柱切換系統(tǒng)不需要多個DLS檢測器，并大大減少所需的工作空間。在一個實施例中，本發(fā)明的方法配合層析柱切換系統(tǒng)使用時，可以在注入第一個樣本的20分鐘之后洗脫出病毒，整個層析過程大約在50分鐘就能將所有低及高分子量的分子洗脫出來。因此,可以每隔50分鐘向?qū)游鲋⑷胄聵颖疽赃M(jìn)分新一輪的層析。在一個實施例中，本發(fā)明的方法配合層析柱切換系統(tǒng)使用時，可以在注入第一個樣本的20分鐘之后對下一個樣本進(jìn)行層析及分析，因此可以盡量利用設(shè)備和時間。據(jù)估計，本發(fā)明每天可以完成至少57個樣本的純化﹑量化和分析。在一個實施例中，本發(fā)明的層析柱切換系統(tǒng)配有兩個分子排阻層析柱。每隔50分鐘向每個層析柱注入新樣本，因此兩個層析柱每24小時可以處理大約57個樣本。在一個實施例中，本發(fā)明的層析柱切換系統(tǒng)包括三個HPLC泵﹑三個分子排阻層析柱﹑一個紫外線檢測器和一個DLS檢測器。由于在注射樣本后約20分鐘內(nèi)可以洗脫出病毒峰，結(jié)合使用三個層析柱﹑一個紫外線檢測器和一個DLS檢測器每小時可以處理3個樣本。因此，可以每隔60分鐘向每個層析柱注入新樣本。紫外線檢測器和DLS檢測器先記錄并分析從首個層析柱洗脫出來的病毒的信號，然后記錄并分析從第二個層析柱洗脫出來的病毒的信號，最后記錄并分析從第三個層析柱洗脫出來的病毒的信號。當(dāng)?shù)谌齻€層析柱洗脫出病毒峰后，系統(tǒng)會切換以重新連接層析柱1并向?qū)游鲋?注入下一個樣品。因此，本系統(tǒng)每24小時可以處理和分析72個樣品。加上能夠處理各類型樣本(如粗略純化樣本﹑高度純化樣本及高度濃縮樣本)的能力，本發(fā)明的提供了一個更廣泛﹑更靈敏的高通量分析方法，這是現(xiàn)有技術(shù)如ELISA、SRID、實時PCR、FPLC及146S蔗糖梯度技術(shù)是不能比擬的?？傃远?，本發(fā)明提供的方法和系統(tǒng)，可以分離出所有種類的病毒(包括包膜、無包膜、DNA和RNA病毒、以及這些病毒的高度純化的抗原)并在非常短的時間內(nèi)靈敏地、精確地量化和分析這些產(chǎn)品。根據(jù)實施例4-6和圖4-9中的數(shù)據(jù)所示，毫無疑問的是，本發(fā)明的方法可高重復(fù)性、高線性、高準(zhǔn)確性、敏感且不受病毒濃度的影響量化不同種類的病毒。上述實施例提供的數(shù)據(jù)亦證明了本發(fā)明可以高度敏感且準(zhǔn)確地確定不同種類病毒的大小和完整性。更重要的是，本發(fā)明可以應(yīng)用于所有種類的樣品，無論是高度純化的樣品還是從疫苗生產(chǎn)過程的任一步驟所獲得的未純化樣品。本發(fā)明可以在不影響顆粒完整性的前提下，以高通量的方式確定病毒顆粒的數(shù)量、大小和完整性。因此，本發(fā)明提供了真實反映病毒顆粒在原始樣本中的特征的分析。顯然，本發(fā)明為病毒產(chǎn)品提供了一個非常高通量的分析方法，可以滿足病毒疫苗在高產(chǎn)量及高質(zhì)量上的需求。當(dāng)前第1頁1 2 3