本發(fā)明涉及篩選抗嗜肝DNA病毒物質(zhì)的方法和用途，其中物質(zhì)是乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制劑，所述抑制劑在本發(fā)明中所述的細(xì)胞系中優(yōu)勢地為共價(jià)閉合環(huán)狀(ccc)DNA依賴性并且可能充當(dāng)cccDNA的替代標(biāo)記，其中對所述替代標(biāo)記篩選抑制嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒(HBV))ccc DNA的能力。所述方法和用途利用包含核酸序列的細(xì)胞，所述核酸序列編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原，如乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。另外，本發(fā)明提供了編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列和因此編碼的蛋白質(zhì)。還提供用于篩選方法中的試劑盒。

慢性乙型肝炎目前是重大公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，全球侵襲大約35000萬個(gè)體并且在美國侵襲至少120萬個(gè)體。這些患者具有升高的肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)和其他嚴(yán)重臨床后遺癥風(fēng)險(xiǎn)(1,2,12,14)。每年，全球存在約1百萬例因HBV相關(guān)肝病所致的死亡。因此，全球健康優(yōu)先事項(xiàng)是治愈慢性HBV感染并阻止其可怕結(jié)果。

乙型肝炎病毒(HBV)是屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的非細(xì)胞病變性、嗜肝DNA病毒。嗜肝DNA病毒是可以在人類和動(dòng)物中造成肝感染的有包膜雙鏈病毒科。嗜肝DNA病毒共有相似的基因組結(jié)構(gòu)。它們具有部分為雙鏈環(huán)狀DNA的小基因組?；蚪M由兩條DNA鏈組成，一條鏈具有負(fù)義方向，另一條鏈具有正義方向。復(fù)制涉及稱作前基因組RNA的RNA中間體逆轉(zhuǎn)錄(15,19)。編碼三個(gè)主要可讀框(ORF)并且病毒具有五種已知的mRNA(18,19)。

一旦感染，則病毒基因組松弛型環(huán)狀(rc)DNA運(yùn)輸入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)化成附加體性共價(jià)閉合環(huán)狀(ccc)DNA，其充當(dāng)病毒全部mRNA的轉(zhuǎn)錄模板，尤其是3.5-3.6kb編碼作為HBeAg前體的前核心蛋白的前核心蛋白mRNA；3.5kb編碼核心蛋白和病毒聚合酶的前基因組(pg)RNA；2.4kb/2.1kb編碼病毒包膜蛋白(大抗原(L)、中等抗原(M)和小(S)抗原)的表面mRNA；和0.7kb編碼X蛋白的X mRNA(18,19)。通過移除前核心蛋白N端信號(hào)肽和C末端精氨酸豐富序列的兩個(gè)蛋白酶解性事件產(chǎn)生HBeAg(Wang(1991)J Virol 65(9),5080(10,21)。在轉(zhuǎn)錄和核輸出后，胞質(zhì)病毒pgRNA隨HBV聚合酶和衣殼蛋白一起裝配以形成核衣殼，其內(nèi)部聚合酶催化的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負(fù)鏈DNA，后者隨后拷貝成正鏈DNA以形成后代rcDNA基因組。新合成的成熟核衣殼將用病毒包膜蛋白包裝并移出作為病毒粒粒子，或返回胞核以通過胞內(nèi)cccDNA擴(kuò)增途徑放大cccDNA儲(chǔ)備(19)。因此，慢性乙型肝炎分子基礎(chǔ)是病毒cccDNA在感染的肝細(xì)胞的胞核中持續(xù)存在。

不存在確定的慢性乙型肝炎治愈。目前批準(zhǔn)的HBV治療藥物是干擾素-α(IFN-α)和5種核苷(酸)類似物(拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替比夫定和替諾福韋)。Xu(2010)J Virol(84)9332-9340公開了用小鼠干擾素治療小鼠肝細(xì)胞。在48周標(biāo)準(zhǔn)治療后IFN-α僅在少量患者組中實(shí)現(xiàn)持久的病毒學(xué)反應(yīng)，并且存在明顯的不良作用(9)。五種核苷(酸)類似物(NA)均充當(dāng)病毒聚合酶抑制劑，但是幾乎未治愈HBV感染(6)，并且耐藥性的出現(xiàn)大幅度限制其長期效力(16,24)?，F(xiàn)在熟知，當(dāng)前療法的主要局限是無法消除事先存在的cccDNA池和/或阻止cccDNA從痕量水平的野生型或耐藥性病毒形成。因此，對于開發(fā)直接靶cccDNA形成和維持的新治療藥存在未滿足的迫切需求。

Cai(2013)Methods in Mol Biol 1030(151-161)公開了從細(xì)胞培養(yǎng)物檢出HBV ccc(共價(jià)閉合環(huán)狀)DNA的DNA印跡測定法。然而，迄今，抗cccDNA物質(zhì)的篩選已經(jīng)因缺少有效體外HBV感染模型受限，并且以高通量至中等通量模式測量cccDNA的實(shí)用方案不可得。備選地，可以在組成型或條件性復(fù)制HBV基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HBV細(xì)胞培養(yǎng)物(如HepG2.2.15細(xì)胞和HepAD38細(xì)胞所代表)中通過胞內(nèi)擴(kuò)增途徑實(shí)現(xiàn)cccDNA形成(7,11,20)。

但是，通過DNA印跡雜交或?qū)崟r(shí)PCR測定法從HBV細(xì)胞系直接檢出cccDNA將經(jīng)不住篩選檢驗(yàn)，原因分別在于靈敏度問題和特異性問題。在另一方面，HepG2.2.15細(xì)胞中不存在合適的cccDNA替代標(biāo)記，因?yàn)榻^大部分病毒產(chǎn)物衍生自整合的病毒轉(zhuǎn)基因，其無法與cccDNA的貢獻(xiàn)區(qū)分。先前已經(jīng)報(bào)告，分泌型HBeAg的產(chǎn)生在HepAD38細(xì)胞中優(yōu)勢地為cccDNA依賴性斌并且可能充當(dāng)cccDNA的替代標(biāo)記(11,23)。最近，Cai等人將改進(jìn)形式的唯一依賴cccDNA產(chǎn)生HBeAg的細(xì)胞系(命名為HepDE19細(xì)胞(7))應(yīng)用成篩選cccDNA抑制劑的96孔模式測定法并且鑒定到抑制cccDNA形成的兩種小分子化合物(3)。這種工作因此提供了以下的堅(jiān)實(shí)“概念驗(yàn)證”展示：可以通過化學(xué)分子直接靶向cccDNA生物合成，并且可以從高通量篩選計(jì)劃鑒定cccDNA抑制劑。然而，現(xiàn)存HepDE19測定體系的某些缺點(diǎn)令篩選較大文庫不切實(shí)際。例如，目前用于HBeAg的傳統(tǒng)ELISA測定法需要多重操作，因氨基酸序列同源性而與病毒核心蛋白顯示出某種程度的交叉反應(yīng)，并且不適于較大模式基于細(xì)胞的測定法。

因此，作為本發(fā)明基礎(chǔ)的技術(shù)問題是提供手段和方法以可靠篩選嗜肝DNA病毒cccDNA的抑制劑。

這個(gè)技術(shù)問題通過提供在權(quán)利要求書中表征的實(shí)施方案加以解決。

因此，本發(fā)明涉及一種用于評估候選分子抑制嗜肝DNA病毒ccc(共價(jià)閉合環(huán)狀)DNA的能力的方法，包括步驟

(a)使包含核酸分子的細(xì)胞與所述候選分子接觸，所述核酸分子包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；

(b)評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且

(c)當(dāng)加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平與對照相比降低時(shí)選擇候選分子。

這些方法總體上適用于與乙型肝炎病毒(HBV)共有相似基因構(gòu)造和復(fù)制策略的其他哺乳動(dòng)物及鳥類嗜肝DNA病毒，如代表性土撥鼠肝炎病毒(WHV)和鴨乙型肝炎病毒(DHBV)。本文中就乙型肝炎病毒提供的解釋和實(shí)驗(yàn)因此同樣地適用于其他嗜肝DNA病毒。然而，本文中提供的教導(dǎo)內(nèi)容在優(yōu)選的實(shí)施方案中涉及“乙型肝炎病毒”/HBV。術(shù)語“嗜肝DNA病毒”、“乙型肝炎病毒”、“鴨乙型肝炎病毒”、“土撥鼠肝炎病毒(WHV)”是本領(lǐng)域熟知的并且因此用于本文中。縮寫“HBV”、“DHBV”或“WHV”在本文中分別與完整術(shù)語“乙型肝炎病毒”、“鴨乙型肝炎病毒”和“土撥鼠肝炎病毒”互換使用。

本文優(yōu)選的嗜肝DNA病毒優(yōu)選地是乙型肝炎病毒(HBV)。乙型肝炎病毒(HBV)是屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的非細(xì)胞病變性、嗜肝DNA病毒，即，HBV是一種嗜肝DNA病毒。HBV基因組的示例性核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中顯示。

本文優(yōu)選的嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。術(shù)語“乙型肝炎病毒e抗原”和“HBeAg”在本文中互換地使用。HBeAg的示例性核酸序列和氨基酸序列分別在SEQ ID NO:16和18中顯示。如本文所用，“嗜肝DNA病毒e抗原”(并且同樣地“乙型肝炎病毒e抗原”)主要指蛋白質(zhì)/多肽，例如具有如SEQ ID NO:18中所顯示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)/多肽。

一旦感染，可以如下產(chǎn)生HBeAg：一旦感染，HBV病毒基因組松弛型環(huán)狀(rc)DNA運(yùn)輸入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)化成附加體性cccDNA，其充當(dāng)病毒全部mRNA的轉(zhuǎn)錄模板，包括3.5-3.6kb編碼作為HBeAg前體的前核心蛋白的前核心蛋白mRNA。術(shù)語“ccc DNA”和“共價(jià)閉合環(huán)狀DNA”在本文中互換地使用。

HBV前核心蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列分別在SEQ IDNO:15和17中顯示。HBV前核心蛋白具有一個(gè)N末端19氨基酸信號(hào)肽、一個(gè)10-氨基酸接頭、一個(gè)中央氨基酸段和一個(gè)C末端34氨基酸精氨酸豐富結(jié)構(gòu)域。

HBV核心蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列分別在SEQ ID NO:23和24中顯示。核心蛋白對應(yīng)于前核心蛋白(參見SEQ ID NO:17)，在于它包含前核心蛋白的C末端精氨酸豐富序列；然而，核心蛋白不包含前核心蛋白的N端信號(hào)肽和10氨基酸接頭序列。

通過移除前核心蛋白N端信號(hào)肽和C末端精氨酸豐富序列的兩個(gè)蛋白酶解性事件產(chǎn)生HBeAg(Wang(1991)J Virol 65(9),5080(21)。因此，乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)對應(yīng)于前核心蛋白(參見SEQ ID NO:17)，在于它包含前核心蛋白的N末端10-aa接頭肽；然而，HBeAg不包含前核心蛋白的C末端精氨酸豐富序列。

慢性乙型肝炎分子基礎(chǔ)是病毒cccDNA在感染的肝細(xì)胞的胞核中持續(xù)存在。

術(shù)語“共價(jià)閉合環(huán)狀DNA”和“cccDNA”在本文中互換地使用。術(shù)語“共價(jià)閉合環(huán)狀DNA”/“cccDNA”是本領(lǐng)域熟知的并且因此用于本文中。通常，如本文所用的“共價(jià)閉合環(huán)狀DNA”/“cccDNA”指充當(dāng)嗜肝DNA病毒mRNA的可靠附加體性轉(zhuǎn)錄模板的DNA。

乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是接受的HBV嗜肝DNA病毒cccDNA替代標(biāo)記，所述替代標(biāo)記轉(zhuǎn)而反映慢性嗜肝DNA病毒感染。然而，使用HBeAg的基于細(xì)胞的已知測定法具有缺點(diǎn)，如與病毒核心蛋白交叉反應(yīng)。

為了改善cccDNA報(bào)道分子檢測法的特異性和靈敏度，本文中建立了這樣的細(xì)胞系，它們支持具有標(biāo)簽(如N末端嵌入的血凝素(HA)表位標(biāo)簽)的重組HBeAg的cccDNA依賴性產(chǎn)生。另外，開發(fā)了檢測加(HA-)標(biāo)簽的HBeAg的化學(xué)發(fā)光ELISA(CLIA)和AlphaLISA測定法。該測定體是適應(yīng)于高通量篩選模式和完全自動(dòng)化。

本文提供的方法利用建立的標(biāo)簽(如可以替代HA標(biāo)簽使用或除HA標(biāo)簽之外使用的HA標(biāo)簽、或His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽或C9標(biāo)簽)的用途。這些標(biāo)簽可以用于純化和檢測加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。通過使用與標(biāo)簽特異性結(jié)合的抗體(例如通過ELISA測定法，如化學(xué)發(fā)光-ELISA(CLIA)和AlphaLISA)，可以可靠地及快速地評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且可以避免與核心蛋白的交叉反應(yīng)。

本文提供的方法利用包含核酸分子的細(xì)胞，所述核酸分子包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。該核酸分子可以包含編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的序列或甚至嗜肝DNA病毒基因組以反映嗜肝DNA病毒的cccDNA形成并且令其成為可能。本領(lǐng)域已知，HBV基因組具有顯示重疊ORF和多個(gè)順式元件的高度緊湊型基因構(gòu)造。因此，認(rèn)為基因插入/缺失或序列替換將很可能影響病毒DNA復(fù)制(13,22)。(Liu等人,J Virol.2004；78(2):642-9)(Wang等人.PLoS One.2013 2；8(4):e60306)。先前的工作已經(jīng)通過GFP替換HBV序列，如在大多數(shù)情況下pol/包膜蛋白編碼區(qū)，以產(chǎn)生重組HBV基因組，但是需要病毒蛋白的反式互補(bǔ)以支持病毒復(fù)制和病毒粒裝配(17)(Protzer等人,PNAS(1999),96:10818-23)。另外，這種報(bào)告的重組HBV基因組僅可以產(chǎn)生第一輪cccDNA合成，如果用來感染容許性細(xì)胞，則cccDNA的胞內(nèi)擴(kuò)增被阻斷，原因是缺陷型病毒DNA復(fù)制。

嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA中的5’莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(ε)是病毒復(fù)制的必需順式元件。它充當(dāng)pgRNA包裝信號(hào)和DNA引發(fā)位點(diǎn)。ε與前核心蛋白ORF的5’部分重疊并含有衣殼(核心)蛋白ORF的起始密碼子。為了在不改變HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的完整性的情況下，在前核心蛋白ORF中的N端信號(hào)肽序列下游插入編碼標(biāo)簽的核酸序列，將一個(gè)三氨基酸接頭序列(GTG GAC ATC)在(HA-)標(biāo)簽5'末端引入其中，以替代如HBV基因組編碼的ε的底部處右臂的原始病毒序列(ATGGAC ATC)。因而，維持如HBV基因組編碼的ε的堿基配對并且將核心蛋白ORF的起始密碼子移動(dòng)到HBV基因組編碼的ε下游的位置。此外，原始GGC序列安置在HA標(biāo)簽序列和核心蛋白AUG之間，以保持核心蛋白起始密碼子的可靠Kozak基序(圖1)。圖1顯示HBV基因組的編碼ε結(jié)構(gòu)的部分，其中根據(jù)本發(fā)明插入編碼標(biāo)簽的核酸序列。

本文中構(gòu)思了以上修飾對HBV pgRNA依賴性核心蛋白表達(dá)和pgRNA衣殼化造成最小影響，因?yàn)楸Ａ袅甩藕秃诵牡鞍妆磉_(dá)盒，不過核心蛋白的翻譯起始位點(diǎn)在pgRNA模板中進(jìn)一步向下游移動(dòng)39-nt。實(shí)際上，重組HBV基因組支持幾乎野生型水平的病毒DNA復(fù)制，并且一旦前核心蛋白ORF在cccDNA分子中重構(gòu)，則成功產(chǎn)生加HA標(biāo)簽的HBeAg。

插入編碼標(biāo)簽的寡聚物的確不影響病毒DNA應(yīng)用，從而本文提供的方法允許產(chǎn)生cccDNA并且因此允許通過確定替代標(biāo)記“加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原”的量，評估物質(zhì)/候選分子抑制cccDNA形成的能力。本文提供的手段和方法主要可用于篩選及鑒定可以在與嗜肝DNA病毒相關(guān)的慢性病如(慢性)肝炎和尤其慢性乙型肝炎感染的療法中使用的候選分子。

將編碼標(biāo)簽(如HA標(biāo)簽)的核酸序列插入嗜肝DNA病毒(如HBV)前核心蛋白ORF中導(dǎo)致嗜肝DNA病毒(如HBV)可用于改善抗原檢測特異性的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HBeAg)的cccDNA依賴性產(chǎn)生。在支持本發(fā)明時(shí)，本文中證實(shí)，(HA-)標(biāo)簽插入不影響前核心蛋白的表達(dá)及其后續(xù)翻譯后加工(N端信號(hào)肽切割和C末端結(jié)構(gòu)域切割)和成熟的HBeAg分泌(圖2)。更重要地，本文中顯示，嗜肝DNA病毒(如HBV)基因組中的這種修飾不妨礙病毒pgRNA衣殼化和逆轉(zhuǎn)錄，這是通過胞內(nèi)擴(kuò)增途徑形成cccDNA的前提(圖4、圖6-8、圖12)。

本發(fā)明涉及篩選藥理學(xué)物質(zhì)及評估其對抗嗜肝DNA病毒的活性。特別地，本發(fā)明描述了設(shè)計(jì)和構(gòu)建用于誘導(dǎo)型表達(dá)HBV cccDNA依賴性表位(例如加人流感血凝素(HA)標(biāo)簽的HBV e抗原(HBeAg)的重組乙型肝炎病毒(HBV)基因組和新細(xì)胞系?？梢远康販y量分泌入培養(yǎng)液的加標(biāo)簽的HBeAg，例如通過化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLIA)和/或AlphaLISA。本發(fā)明提供基于細(xì)胞的有效HBV報(bào)道分子系統(tǒng)以篩選化合物的抗嗜肝DNA病毒活性，尤其抑制cccDNA形成、維持和/或其轉(zhuǎn)錄活性的那些化合物。

本發(fā)明進(jìn)一步由圖10說明。這里，顯示3TC處理消除了HepBHAe13細(xì)胞中的HA-HBeAg信號(hào)，不過這是一種其中3TC阻斷病毒DNA復(fù)制并且因此無cccDNA合成的極端情況。另外，作為原理的證據(jù)，在HepBHAe13細(xì)胞中檢驗(yàn)了兩種cccDNA形成抑制劑(CCC-0975和CCC-0346)。兩種化合物均劑量依賴地降低HA-HBeAg水平；參見圖11。

例如，以下非限制性抗嗜肝DNA病毒測定法可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行：

1.使用HepBHAe細(xì)胞系篩選調(diào)節(jié)cccDNA穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)錄活性的化合物/候選分子。

根據(jù)本發(fā)明，體外測定方法可以用來篩選/評價(jià)化合物/候選分子調(diào)節(jié)胞核中cccDNA穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄活性的效力。化合物/候選分子因而改變培養(yǎng)上清液中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的水平。為了進(jìn)行該測定法，細(xì)胞可以首先在含有四環(huán)素的培養(yǎng)板中接種，并且在細(xì)胞達(dá)到匯合后，培養(yǎng)基將更換為無四環(huán)素的培養(yǎng)基以誘導(dǎo)嗜肝DNA病毒(如HBV)DNA復(fù)制和cccDNA形成，這在正常情況下耗時(shí)6-8天。此后，可以再添加四環(huán)素以關(guān)閉病毒DNA從整合型HBV基因組從頭復(fù)制，同時(shí)添加3TC(或其他HBV聚合酶抑制劑)以阻斷cccDNA的胞內(nèi)擴(kuò)增途徑。在相同的時(shí)間，可以將測試化合物加入培養(yǎng)基持續(xù)某個(gè)時(shí)間段。培養(yǎng)基隨后可以用于加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的ELISA測量。來自不含有測試化合物的孔的培養(yǎng)基可以用作對照。降低培養(yǎng)基中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)水平的有效化合物可以具有促進(jìn)cccDNA翻轉(zhuǎn)(turnover)或沉默cccDNA轉(zhuǎn)錄的活性。短語“有效的或有效地”可以在本文中用來顯示，化合物在某個(gè)檢驗(yàn)濃度足以阻止并且優(yōu)選地減少本發(fā)明基于細(xì)胞的測定體系中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的產(chǎn)生至少50％、最優(yōu)選至少90％。通過qPCR或雜交直接測量cccDNA和前核心蛋白mRNA的穩(wěn)態(tài)水平可以用來區(qū)分測試化合物/候選化合物/候選分子是否分別減少cccDNA穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄。

2.使用HepBHAe細(xì)胞系篩選抑制嗜肝DNA病毒(如HBV)cccDNA形成的化合物/候選分子。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，體外測定方法可以用來評價(jià)抑制cccDNA形成的化合物/候選分子。簡而言之，細(xì)胞可以接種在培養(yǎng)孔中并且四環(huán)素可以在細(xì)胞單層變得匯合的當(dāng)日省略。同時(shí)，可以添加測試化合物并且可以在處理結(jié)束時(shí)通過ELISA測量培養(yǎng)基中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)(大約6天)。導(dǎo)致加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)減少的任何化合物表示它可以有效地阻斷cccDNA的形成。作為這種體外測定方法的擴(kuò)展方面，值得指出的是，在這種測定法中減少加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)還可以顯示化合物具有抑制嗜肝DNA病毒(如HBV)DNA復(fù)制的潛力?？梢酝ㄟ^DNA印跡和/或qPCR直接測量病毒核心蛋白DNA，研究這種可能性。從上文描述的測定法浮現(xiàn)的“命中”還可以包括影響cccDNA穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)錄的化合物。在誘導(dǎo)時(shí)間段期間，早期產(chǎn)生的cccDNA的穩(wěn)定性和/或轉(zhuǎn)錄活性可以被檢驗(yàn)性化合物靶向。

3.HepHA-HBe細(xì)胞系起到反篩選系統(tǒng)的作用。

理論上，來自前述測定法的化合物“命中”可以直接抑制加HA標(biāo)簽的前核心蛋白翻譯、或翻譯后加工、或加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)分泌。為了排除這類非cccDNA抑制劑，“命中”可以在HepHA-HBe細(xì)胞中反篩選，所述HepHA-HBe細(xì)胞使用轉(zhuǎn)基因作為模板產(chǎn)生加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(如加HA標(biāo)簽的HBeAg)。在另一方面，HepHA-HBe細(xì)胞還可能用來篩選HBeAg抑制劑。

術(shù)語“抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA”及其語法形式可以指抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的穩(wěn)定性(即指降低的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA穩(wěn)定性)、指抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的轉(zhuǎn)錄活性(即指使用共價(jià)閉合環(huán)狀DNA作為轉(zhuǎn)錄模板的嗜肝DNA病毒mRNA轉(zhuǎn)錄減少)或指抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的形成(即無或更少cccDNA形成)。

術(shù)語“抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA”的這些示例性解釋和定義不是互斥的。例如，抑制的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA形成可以導(dǎo)致使用共價(jià)閉合環(huán)狀DNA作為轉(zhuǎn)錄模板的嗜肝DNA病毒mRNA轉(zhuǎn)錄減少/與之相關(guān)(即抑制共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的轉(zhuǎn)錄活性)。抑制的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA穩(wěn)定性可以導(dǎo)致使用共價(jià)閉合環(huán)狀DNA作為轉(zhuǎn)錄模板的嗜肝DNA病毒mRNA轉(zhuǎn)錄減少/與之相關(guān)。

加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原可以在本文中作為嗜肝DNA病毒cccDNA的任何這類抑制作用的替代標(biāo)記使用。

根據(jù)上文，本文提供的方法可以用于評估候選分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA形成的能力。在這種情況下，細(xì)胞可以在cccDNA已經(jīng)形成之前與候選分子接觸。

本文提供的方法可以用于評估候選分子降低嗜肝DNA病毒cccDNA的穩(wěn)定性(例如cccDNA的量或數(shù)目)的能力。這里，細(xì)胞可以在cccDNA已經(jīng)形成之后與候選分子接觸。

本文提供的方法可以用于評估候選分子降低嗜肝DNA病毒cccDNA轉(zhuǎn)錄(活性)的能力。這里，細(xì)胞可以在cccDNA已經(jīng)形成之后與候選分子接觸。

根據(jù)本發(fā)明待評估其水平的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽。如本文中顯示，可以通過使用僅一個(gè)標(biāo)簽，例如通過使用與該標(biāo)簽特異性結(jié)合的抗體，實(shí)現(xiàn)對加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的可靠評估。因此，本文中構(gòu)思和優(yōu)選加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原僅含有一個(gè)標(biāo)簽。

以下涉及一種或多種在本文待用的標(biāo)簽。

如本文所用的術(shù)語“標(biāo)簽”指可用作標(biāo)志物的任何化學(xué)結(jié)構(gòu)。主要地，術(shù)語“標(biāo)簽”指“蛋白質(zhì)標(biāo)簽”。術(shù)語“標(biāo)簽”和“蛋白質(zhì)標(biāo)簽”是本領(lǐng)域已知的；尤其參見Fritze CE,Anderson TR.“Epitope tagging:general method for tracking recombinant proteins”.Methods Enzymol.2000；327:3-16；Brizzard B,Chubet R.Epitope tagging of recombinant proteins.Curr Protoc Neurosci.2001年5月；第5章：第5.8單元；和/或Terpe K.Overview of tag protein fusions:from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.Appl Microbiol Biotechnol.2003Jan；60(5):523-33。

一般，本文待用的標(biāo)簽是與嗜肝DNA病毒e抗原融合的蛋白質(zhì)標(biāo)簽。例如，編碼標(biāo)簽的核酸可以與編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸融合，從而表達(dá)包含標(biāo)簽和嗜肝DNA病毒e抗原的融合蛋白。標(biāo)簽可以融合于編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的5'末端、插入編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸內(nèi)部和/或融合于編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的3'末端。因此，所產(chǎn)生的融合蛋白可以在N末端、內(nèi)部(即在嗜肝DNA病毒e抗原內(nèi)部/作為內(nèi)部表位)、和/或在C末端包含標(biāo)簽。如本文中顯示，內(nèi)部表位標(biāo)簽可以用于可靠評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且因此是優(yōu)選的。

各種標(biāo)簽是本領(lǐng)域已知的并且可以根據(jù)本發(fā)明使用。通常，本文待用的標(biāo)簽具有約1-3kDa、優(yōu)選地約1kDa的低分子量。示例性非限制的低分子量標(biāo)簽是HA標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽或C9標(biāo)簽。本文中優(yōu)選使用HA標(biāo)簽。本文待用的Flag標(biāo)簽可以是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

低分子量以標(biāo)簽長度(即組成標(biāo)簽的氨基酸殘基數(shù))反映。例如，可以在本文中使用His標(biāo)簽(6個(gè)氨基酸)、HA標(biāo)簽(9個(gè)氨基酸)、FLAG-標(biāo)簽(8個(gè)氨基酸)、或3XFLAG標(biāo)簽(22個(gè)氨基酸)。這些示例性標(biāo)簽支持接近野生型水平的HBV DNA復(fù)制并且因此可用于實(shí)施本發(fā)明。

因此，本文待用的標(biāo)簽可以由6至22個(gè)氨基酸，例如6個(gè)氨基酸、7個(gè)氨基酸、8個(gè)氨基酸、9個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸、11個(gè)氨基酸、12個(gè)氨基酸、13個(gè)氨基酸、14個(gè)氨基酸、15個(gè)氨基酸、16個(gè)氨基酸、17個(gè)氨基酸、18個(gè)氨基酸、19個(gè)氨基酸、20個(gè)氨基酸、21個(gè)氨基酸、或22個(gè)氨基酸組成。

編碼本文待用標(biāo)簽的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的編碼HA標(biāo)簽的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的編碼His標(biāo)簽的核酸序列、如SEQ ID NO:4中所示的編碼c-myc標(biāo)簽的核酸序列、如SEQ ID NO:5中所示的編碼V5標(biāo)簽的核酸序列、或如SEQ ID NO:6中所示的編碼C9標(biāo)簽的核酸序列。本文中優(yōu)選使用由SEQ ID NO:1編碼或如SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列組成的HA標(biāo)簽。

編碼本文待用的Flag標(biāo)簽的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所顯示的編碼1×Flag標(biāo)簽的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所顯示的編碼3×Flag標(biāo)簽的核酸序列。

本文待用的標(biāo)簽的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:9中所示的His標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所示的V5標(biāo)簽的氨基酸序列或如SEQ ID NO:13中所示的C9標(biāo)簽的氨基酸序列。

本文待用的Flag標(biāo)簽的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所顯示的1×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所顯示的3×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列。

本文中主要構(gòu)思使用多種表位標(biāo)簽，如血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和/或C9標(biāo)簽。表位標(biāo)簽是因?yàn)榭梢栽谠S多不同物種中可靠產(chǎn)生高親和力抗體而選擇的短肽序列。這些標(biāo)簽經(jīng)常衍生自病毒基因，這解釋了它們的高度免疫反應(yīng)性。這些標(biāo)簽特別可用于蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光法、免疫組織化學(xué)、免疫親和色譜及免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。它們還用于抗體純化。這類表位標(biāo)簽特別有用，因?yàn)榭梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用與這些標(biāo)簽特異性結(jié)合的已知和市售抗體。

將親和標(biāo)簽附加至蛋白質(zhì)，從而使用親和技術(shù)，可以從粗制生物學(xué)來源中純化所述蛋白質(zhì)。這些包括殼多糖結(jié)合蛋白(CBP)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。聚(His)標(biāo)簽是一種廣泛使用的蛋白質(zhì)標(biāo)簽；它與金屬基質(zhì)結(jié)合。

色譜標(biāo)簽用來改變蛋白質(zhì)的色譜特性以提供跨越特定分離技術(shù)的不同分離度。經(jīng)常，這些標(biāo)簽由聚陰離子氨基酸組成，如FLAG-標(biāo)簽。

基本上可以在本文中使用任何標(biāo)簽。如包含于本文待用的核酸分子中的編碼標(biāo)簽的核酸應(yīng)當(dāng)能夠支持嗜肝DNA病毒DNA復(fù)制、cccDNA形成和cccDNA依賴性加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒抗原e產(chǎn)生和分泌?？梢允褂帽疚闹刑峁┑臏y定法例如實(shí)驗(yàn)中所提供的測定法，容易地驗(yàn)證這種能力。例如，已經(jīng)在本文中展示，HA標(biāo)簽插入導(dǎo)致在穩(wěn)定細(xì)胞系中野生型水平的HBV DNA復(fù)制和從cccDNA產(chǎn)生加HA標(biāo)簽的HBeAg?？梢詫ζ渌麡?biāo)簽容易證實(shí)和檢驗(yàn)這些能力。例如，插入His標(biāo)簽和Flag標(biāo)簽的確在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測定法中不影響病毒DNA復(fù)制。

其他標(biāo)簽可以在不背離本發(fā)明精神的情況下使用。

例如，報(bào)道蛋白可以用作本文中的標(biāo)簽，如螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶、長腹水蚤(Gaussia)螢光素酶、等)、綠色熒光蛋白(GFP)等。這些報(bào)道蛋白允許容易評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒的水平，例如通過視檢、熒光測量等。熒光標(biāo)簽用來給出蛋白質(zhì)的視覺讀出結(jié)果。GFP和其變體是最常使用的熒光標(biāo)簽。

可以在本發(fā)明篩選方法中使用的示例性報(bào)道蛋白尤其是螢光素酶、(綠色/紅色)熒光蛋白及其變體、EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)、RFP(紅色熒光蛋白，如DsRed或DsRed2)、CFP(青色熒光蛋白)、BFP(藍(lán)綠色熒光蛋白)、YFP(黃色熒光蛋白)、β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。

螢光素酶是熟知的報(bào)道分子；參見，例如，Jeffrey(1987)Mol.Cell.Biol.7(2),725-737。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地從相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫和標(biāo)準(zhǔn)教材/綜述推斷出在本發(fā)明的上下文中待使用的其他螢光素酶核酸序列和氨基酸序列。

報(bào)道蛋白可以通過引起可檢測信號(hào)的信號(hào)強(qiáng)度變化，允許檢測/評估抑制cccDNA的候選分子。所述可檢測信號(hào)可以是熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)、熒光偏振(FP)信號(hào)或閃爍臨近(SP)信號(hào)?？蓹z測信號(hào)可以與如上文定義的報(bào)道蛋白相關(guān)。例如，GFP可以衍生自維多利亞多管發(fā)光水母(Aequorea victoria)(US5,491,084)。編碼維多利亞多管發(fā)光水母GFP的質(zhì)粒從ATCC登錄號(hào)87451可獲得。這種GFP的其他突變形式，包括但不限于pRSGFP、EGFP、RFP/DsRed、DSRed2、和EYFP、BFP、YFP連同其他，尤其從Clontech Laboratories,Inc.(Palo Alto,California)可商業(yè)獲得。

可以監(jiān)測包含核酸分子的培養(yǎng)的細(xì)胞/組織，所述核酸分子包含編碼與報(bào)道基因(如螢光素酶、GFP等)融合的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，用于報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄隨培養(yǎng)基中測試化合物/候選分子濃度變化的證據(jù)。報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄水平隨測試化合物濃度變化而變動(dòng)顯示了測試化合物/候選分子抑制cccDNA的能力。

報(bào)道蛋白通常大于上文所述的低分子量標(biāo)簽，如表位標(biāo)簽。歸因于例如包含編碼螢光素酶的核酸序列的核酸分子與編碼更小(表位)標(biāo)簽(如HA標(biāo)簽)的核酸序列相比插入更長，下游病毒核心蛋白和pol從重組前基因組RNA中的表達(dá)可能減少，從而可能需要核心蛋白/pol的反式互補(bǔ)物以恢復(fù)病毒復(fù)制。例如，在這種情況下尤其可以根據(jù)本發(fā)明使用組成型表達(dá)嗜肝DNA病毒核心蛋白和嗜肝DNA病毒聚合酶(核心蛋白/pol)的細(xì)胞/細(xì)胞系。

本文中構(gòu)思了使用含有兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。使用兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽可以允許甚至更可靠和因此有利地評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。例如，如果兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是不同的標(biāo)簽(例如一個(gè)標(biāo)簽是HA標(biāo)簽，第二個(gè)標(biāo)簽是His標(biāo)簽)，則可以使用與兩個(gè)標(biāo)簽均特異性結(jié)合的抗體。這種測定法可以因此使用例如兩個(gè)表位抗體例如用于ELISA檢測，以進(jìn)一步增加分析特異性。

本文中發(fā)現(xiàn)，插入一個(gè)22氨基酸的3×FLAG標(biāo)簽插入物支持有效的HBV復(fù)制。因此，認(rèn)為也可以在本文中使用例如串聯(lián)嵌合表位標(biāo)簽，如HA-接頭-FLAG。

根據(jù)上文，當(dāng)使用兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽(例如兩個(gè)或更多個(gè)不同標(biāo)簽)時(shí)，一個(gè)標(biāo)簽可以由6至22個(gè)氨基酸組成。本文中特別地構(gòu)思，本文待用的標(biāo)簽的總長度(即兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸殘基總和)不超過最大約22個(gè)氨基酸，因?yàn)橄掠尾《竞诵牡鞍缀蚿ol從重組前基因組RNA中的表達(dá)可能降低，如上文報(bào)道蛋白(如螢光素酶)的上下文中所述。如果這種下游病毒核心蛋白和pol表達(dá)減少出現(xiàn)，例如當(dāng)兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的總長度超過約22個(gè)氨基酸時(shí)，可能需要核心蛋白/pol的反式互補(bǔ)物以恢復(fù)病毒復(fù)制。例如，在這種情況下尤其可以根據(jù)本發(fā)明使用組成型表達(dá)嗜肝DNA病毒核心蛋白和嗜肝DNA病毒聚合酶(核心蛋白/pol)的細(xì)胞/細(xì)胞系。

如同編碼僅一個(gè)標(biāo)簽的核酸、編碼兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的核酸可以融合于編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的5'末端、插入編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸內(nèi)部和/或融合于編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的3'末端。標(biāo)簽可以由標(biāo)簽分隔：如果使用兩個(gè)標(biāo)簽，則標(biāo)簽-接頭標(biāo)簽，如果使用三個(gè)標(biāo)簽，則標(biāo)簽-接頭-標(biāo)簽-接頭-標(biāo)簽等。

因此，所產(chǎn)生的融合蛋白可以在N末端、內(nèi)部(即在嗜肝DNA病毒e抗原內(nèi)部/作為內(nèi)部表位)、和/或在C末端包含兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽。如本文中顯示，內(nèi)部表位標(biāo)簽可以用于可靠評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且因此是優(yōu)選的。本文中構(gòu)思了使用例如在N末端具有一個(gè)標(biāo)簽和例如具有第二內(nèi)部標(biāo)簽和/或例如在C末端具有第三標(biāo)簽的所得融合蛋白。在不背離本發(fā)明精神的情況下，其他組合容易地顯見和涵蓋的。

兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽可以是以下兩者或更多者：血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和/或C9標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽可以是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

在下文，更詳細(xì)地描述根據(jù)本發(fā)明待使用的核酸分子。

核酸分子可以包含編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白(如HBV前核心蛋白)的核酸序列。編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中顯示并且嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:17中顯示。

核酸分子可以包含如上文限定和解釋的編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列。編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列可以在編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信號(hào)肽和接頭的核酸序列的3'下游(插入)。

相對于乙型肝炎病毒，N端信號(hào)肽和接頭構(gòu)成例如SEQ ID NO:17中所示的前核心蛋白的N末端29個(gè)氨基酸。因此，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在編碼乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29個(gè)氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。換而言之，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在構(gòu)成從編碼HBV前核心蛋白的核酸(編碼HBV前核心蛋白的核酸例如在SEQ ID NO:15中顯示)的5'末端起87個(gè)核酸殘基的核酸序列的3’下游(插入)。在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在與乙型肝炎病毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中顯示)的位置29相對應(yīng)的氨基酸殘基的C末端插入。

相對于HBeAg，接頭構(gòu)成例如SEQ ID NO:18中所示的HBeAg的N末端10個(gè)氨基酸。就HBeAg而言，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在編碼HBeAg N端10個(gè)氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。換而言之，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在構(gòu)成從編碼HBV HBeAg的核酸(編碼HBeAg的核酸例如在SEQ ID NO:16中顯示)的5'末端起30個(gè)核酸殘基的核酸序列的3’下游(插入)。在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在與HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中顯示)的位置10相對應(yīng)的氨基酸殘基的C末端插入。

更精確地，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在與編碼HBV前核心蛋白的核酸序列(編碼HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中顯示)的位置87和88相對應(yīng)的核苷酸之間(插入)。這些位置在嗜肝DNA病毒的pgRNA的ε結(jié)構(gòu)中或如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε中界定了接頭的編碼性序列和編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密碼子。相對于HBV，位置87是編碼接頭的序列的最末3’核苷酸并且位置88是編碼核心蛋白的序列的第一個(gè)核苷酸。

在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在與乙型肝炎病毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中顯示)的位置29和30相對應(yīng)的氨基酸殘基之間插入。

同樣地，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在與編碼HBeAg的核酸序列(編碼HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中顯示)的位置30和31相對應(yīng)的核苷酸之間(插入)。在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在與HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中顯示)的位置10和11相對應(yīng)的氨基酸殘基之間插入。

編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸可以在編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白(如HBV核心蛋白)的核酸的5’上游(插入)。編碼HBV核心蛋白的示例性核酸在SEQ ID NO:23中顯示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中顯示。

編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列的上文限定的插入位點(diǎn)也可以由嗜肝DNA病毒基因組中核苷酸的位置限定。相對于HBV基因組，根據(jù)上文，包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子可以插入與HBV基因組的位置C1902和位置A1903相對應(yīng)的核苷酸之間。這些位置可以根據(jù)例如Galibert,F.等人(1979),Nature 281:646-650中所述的命名法確定。

顯而易見，如本文中使用的核苷酸(位置)“C1902”和“A1903”分別指前核心蛋白區(qū)域編碼性序列的最末核苷酸和核心蛋白AUG的第一個(gè)核苷酸。它們在不同HBV基因型(A-H)序列(還如本文中提供及在SEQ IDNO:27-34中顯示)之間保守。因此，本文待用的HBV基因組的示例性非限制核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中顯示。然而，核苷酸“C”，而非核心AUG中的“A”，或它們的位置可以在序列上不同于一些罕見(臨床)分離株。這類序列也包含于本發(fā)明中。

根據(jù)本發(fā)明，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以插入除HBV基因組之外的嗜肝DNA病毒基因組的位置C1902和位置A1903相對應(yīng)的核苷酸之間?？梢匀菀椎卮_定嗜肝DNA病毒基因組中這些相應(yīng)的位置(即嗜肝DNA病毒基因組中與HBV基因組的位置C1902和位置A1903對應(yīng)的位置)。換而言之，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在嗜肝DNA病毒pgRNA的、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)或嗜肝DNA病毒基因組(優(yōu)選地，HBV基因組)編碼的ε和編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密碼子之間插入。

例如，如果核酸分子包含編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列，則編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列可以在編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信號(hào)肽和接頭的核酸序列的3'下游(插入)?？梢砸匀菀椎卮_定編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信號(hào)肽和接頭的核酸序列。該序列始于(并因此包含)編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列的ORF起始密碼子并止于編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密碼子之前(即排除核心蛋白的編碼性序列)。在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在與接頭(N端信號(hào)肽后的接頭)C末端最末氨基酸相對應(yīng)的氨基酸殘基的C末端插入。

因此，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在編碼嗜肝DNA病毒e抗原的N端氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。這些N端氨基酸構(gòu)成嗜肝DNA病毒前核心蛋白中的“接頭”。在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在接頭的最末C端氨基酸殘基的C末端插入。

更精確地，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在與編碼HBV前核心蛋白的核酸序列(編碼HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中顯示)的位置87和88相對應(yīng)的核苷酸之間(插入)。在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在與乙型肝炎病毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中顯示)的位置29和30相對應(yīng)的氨基酸殘基之間插入。這些位置在嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)中或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)中界定了接頭的編碼性序列和編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密碼子。相對于HBV，位置87是編碼接頭的序列的最末3’核苷酸并且位置88是編碼核心蛋白的序列的第一個(gè)核苷酸。可以容易確定嗜肝DNA病毒HBV前核心蛋白中的相應(yīng)位置(即嗜肝DNA病毒基因組中與編碼HBV前核心蛋白的核酸序列的位置87和88對應(yīng)的位置)。

同樣地，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信號(hào)肽和接頭的核酸序列和編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列之間(插入)。

例如，該核酸序列可以在與編碼HBeAg的核酸序列(編碼HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中顯示)的位置30和31相對應(yīng)的核苷酸之間(插入)。在蛋白質(zhì)水平，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽可以在與HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中顯示)的位置10和11相對應(yīng)的氨基酸殘基之間插入。這些位置界定了前核心蛋白中嗜肝DNA病毒N末端接頭的編碼性序列(或嗜肝DNA病毒e抗原中嗜肝DNA病毒N末端接頭的編碼性序列)和編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密碼子。相對于HBV，位置30是編碼HBeAg的核酸序列中編碼接頭的序列的最末3’核苷酸。位置31是編碼核心蛋白的序列的第一個(gè)核苷酸。可以容易確定編碼嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列中的相應(yīng)位置(即嗜肝DNA病毒e抗原中與編碼HBeAg的核酸序列的位置30和31對應(yīng)的位置)。

編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸可以在編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白、優(yōu)選地HBV核心蛋白的核酸的5’上游(插入)。編碼HBV核心蛋白的示例性核酸在SEQ ID NO:23中顯示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中顯示。換而言之，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在嗜肝DNA病毒pgRNA的、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)或如嗜肝DNA病毒基因組(優(yōu)選地，HBV基因組)編碼的ε結(jié)構(gòu)和編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白、優(yōu)選地HBV核心蛋白的核酸序列的ORF起始密碼子之間插入。

如上文提到，本文中待使用/提供的核酸分子可以包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列，其中所述序列插入嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBVpgRNA的ε結(jié)構(gòu)，或插入如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)。圖1中顯示HBV基因組編碼的示例性ε結(jié)構(gòu)。相對于HBV，如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)始于(并且包括)HBV基因組的位置T1849并止于(并且包括)其位置A1909。HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中顯示。

如上文所述，包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子可以插入嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖中。如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的示例性下部莖在SEQ ID NO:1中顯示。例如，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以插入與編碼HBV前核心蛋白的核酸序列(編碼HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中顯示)的位置87和88相對應(yīng)的核苷酸之間、或與編碼HBeAg的核酸序列(編碼HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中顯示)的位置30和31相對應(yīng)的核苷酸之間或與HBV基因組的位置C1902和位置A1903相對應(yīng)的核苷酸之間。全部這些位置均在嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖中或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖中。

本文中構(gòu)思和優(yōu)選，核酸分子在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的5’包含能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列。認(rèn)為本文中相對于乙型肝炎病毒/加標(biāo)簽的乙型肝炎病毒e抗原描述和提供的實(shí)驗(yàn)和教導(dǎo)內(nèi)容總體上適用于嗜肝DNA病毒/加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。對于每種具體的嗜肝DNA病毒、優(yōu)選地HBV，對用于HBV的插入序列的唯一修飾可以涉及修飾編碼(表位)標(biāo)簽的核酸序列的5’側(cè)翼序列以維持嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε、或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε的堿基配對。基于本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地設(shè)計(jì)并制備編碼標(biāo)簽的核酸序列的5’的核酸序列以維持與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的堿基配對。特別地就鴨乙型肝炎病毒(DHBV)而言，由于其核心蛋白ORF的起始密碼子位于ε的下游，因此甚至不需要引入編碼(表位)標(biāo)簽的核酸序列的5’側(cè)翼序列以維持DHBV的ε的堿基配對。

如圖1中所示，核酸序列插入與HBV基因組的位置C1902和A1903相對應(yīng)的核苷酸之間，其中所述核酸序列含有9個(gè)核苷酸的5’-側(cè)翼區(qū)(即編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列的5’)，所述5’側(cè)翼區(qū)與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖(例如與對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至T1855的核苷酸)形成堿基對。

本發(fā)明的一個(gè)重要和優(yōu)選方面是，如本文定義和/或如上文所述待插入的編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列還包含這樣的核酸序列，其能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)形成堿基對，尤其與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對。通過使用能夠與ε結(jié)構(gòu)形成堿基對的核酸序列，目的在于保留嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)而，認(rèn)為ε結(jié)構(gòu)對復(fù)制、產(chǎn)生cccDNA和表達(dá)/產(chǎn)生(加標(biāo)簽的)嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地HBVe抗原重要。

優(yōu)選地，能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列能夠與優(yōu)選地對應(yīng)于位置T1849至A1854或任選地對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至T1855的核苷酸形成堿基對。一般，pgRNA中的堿基對形成在匹配的核糖核苷酸如A-U、G-C和搖擺堿基對G-U之間發(fā)生。如果維持ε結(jié)構(gòu)，則復(fù)制、產(chǎn)生cccDNA和/或表達(dá)/產(chǎn)生(加標(biāo)簽的)嗜肝DNA病毒e抗原在本文中待使用/提供的核酸分子中不受阻礙。

應(yīng)當(dāng)指出，ε結(jié)構(gòu)的左臂是編碼嗜肝DNA病毒e抗原(如HBeAg)信號(hào)肽的核酸序列的組成部分并且因此應(yīng)當(dāng)是保持不變。如所述那樣在ε的右臂處設(shè)計(jì)的插入不應(yīng)當(dāng)改變下部莖的堿基配對。在圖1中顯示的例舉插入中，唯一核苷酸變化與A1903G相關(guān)(即在HBV基因組位置1903處A替換為G)。在位置1903處的點(diǎn)突變從嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε移出核心蛋白ORF、因而允許維持ε結(jié)構(gòu)和在核心蛋白AUG前方插入標(biāo)簽。核心蛋白從前核心蛋白ORF的起始密碼子后轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA翻譯，從而標(biāo)簽將不并入核心蛋白。

能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)(的下部莖)或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)(的下部莖)、嗜肝DNA病毒基因組的ε結(jié)構(gòu)(的下部莖)形成堿基對的表位標(biāo)簽5’側(cè)翼序列由至多3、6或9個(gè)核苷酸、一般9個(gè)核苷酸組成。

能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的示例性序列由SEQ ID NO:26中所示的序列組成。能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的示例性序列編碼如SEQ ID NO:40中所示的多肽。

本文中待使用/提供的核酸分子還可以在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的3’包含編碼接頭的核酸序列。接頭可以由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。優(yōu)選地，接頭僅由一個(gè)氨基酸殘基如甘氨酸殘基組成。

例如，編碼接頭的核酸序列由序列GGC組成；或核酸序列編碼甘氨酸殘基。GGC從核心蛋白ORF的AUG前方的原始3個(gè)核苷酸拷貝而來、所述3個(gè)核苷酸與AUG一起裝配成用于最佳翻譯起始的常見Kozak基序。因此，可以使用/插入的接頭優(yōu)選地并適當(dāng)?shù)剡x擇，從而保持核心蛋白起始密碼子的可靠Kozak基序。

例如，包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列。例如，包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含編碼如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。如SEQ ID NO:41中所示的示例性核酸序列由能夠與ε結(jié)構(gòu)(的下部莖)形成堿基對的核酸序列(GTGGACATC；尤其核苷酸GTGGACAT與對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至T1855的核苷酸形成堿基對)、編碼HA標(biāo)簽的核酸序列和編碼甘氨酸殘基作為接頭的核酸序列(后一種核酸序列主要用來保持核心蛋白起始密碼子的可靠Kozak基序)組成。

本文中構(gòu)思了一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽符合可讀框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。同樣地，本文中構(gòu)思了，編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列(連同能夠與ε結(jié)構(gòu)(的下部莖)形成堿基對的潛在5’側(cè)翼核酸序列和/或連同保持核心蛋白起始密碼子的可靠Kozak基序或編碼接頭的潛在3’核酸序列)符合可讀框地融合于編碼嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核酸序列。

本發(fā)明中待使用和提供的核酸分子可以包含嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地乙型肝炎病毒(HBV)基因組。例如，HBV基因組是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因組。本文待用的HBV基因組的示例性非限制核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中顯示。HBV基因組可以是HBV基因型D的基因組，尤其HBV亞基因型ayw的基因組(如SEQ ID NO:27中所示的HBV基因組)。

根據(jù)本發(fā)明，僅允許(大量)表達(dá)/產(chǎn)生(加標(biāo)簽的)嗜肝DNA病毒e抗原的那些核酸分子，如嗜肝DNA病毒基因組才會(huì)使用。例如，已知不允許大量表達(dá)/產(chǎn)生嗜肝DNA病毒e抗原的一些臨床HBV變體。在一些臨床HBV變體中，HBeAg陰性歸因于基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子(BCP)雙突變(基因型D中A1764T/G1766A)或前核心蛋白(pC)突變(基因型D中G1898A)。在BCP突變通過下調(diào)前核心蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄減少HBeAg的同時(shí)，pC突變引入過早終止密碼子以阻礙前核心蛋白翻譯。這類嗜肝DNA病毒變體較不適用于本文提供的方法。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，加標(biāo)簽的HBeAg包含如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或由其組成。編碼加標(biāo)簽的HBeAg的相應(yīng)核酸序列在SEQ ID NO:20中顯示。這些序列在本發(fā)明的背景下特別有用，但是僅為優(yōu)選實(shí)施方案的例子。

編碼加HA標(biāo)簽的前核心蛋白(即加標(biāo)簽的HBeAg的前體)的核酸序列在SEQ ID NO:19中顯示。因?yàn)檫@種核酸序列編碼加標(biāo)簽的HBeAg的前體，它可以視為編碼加標(biāo)簽的HBeAg的核酸序列。相應(yīng)的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中顯示。

下文更詳細(xì)地涉及產(chǎn)生加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原及其評估候選分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的用途。

文中待使用/提供的核酸可以轉(zhuǎn)錄成前基因組(pg)嗜肝DNA病毒RNA、尤其前基因組(pg)HBV RNA。

本文中構(gòu)思了所述核酸可以設(shè)計(jì)成阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。例如，核酸不含有在編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG。相對于HBV，編碼前核心蛋白的核酸的起始密碼子可以缺失或突變。例如，這種(待缺失/突變的)起始密碼子可以對應(yīng)在(并包括)HBV基因組位置1816至(并包括)位置1818處的核苷酸；參見例如圖1。

避免翻譯加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原可能是有利的，目的是避免其在測定法開始時(shí)產(chǎn)生/表達(dá)。本發(fā)明的目的是使用加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原作為cccDNA的替代標(biāo)記。如果加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原在全部時(shí)間均產(chǎn)生，則其表達(dá)/產(chǎn)生并必然地與產(chǎn)生cccDNA相關(guān)。如圖5中所示，起始密碼子可以在cccDNA形成時(shí)/之后在測定法的后期恢復(fù)，從而加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的表達(dá)/產(chǎn)生(即水平)真實(shí)反映嗜肝DNA病毒cccDNA的產(chǎn)生/水平。因此，為了甚至更可靠地評估候選分子抑制cccDNA的能力，以下情況是有利：在測定法開始時(shí)抑制加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的產(chǎn)生/表達(dá)，例如通過移除編碼該抗原的相應(yīng)核酸的起始密碼子/使其突變，以及允許稍后產(chǎn)生/表達(dá)加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原以反映嗜肝DNA病毒cccDNA的產(chǎn)生/水平。

例如，在如上文限定和描述的編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG可以由核酸TG替換。因此，本文中待使用和提供的核酸分子可以例如通過點(diǎn)突變修飾，以阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。

根據(jù)本發(fā)明待使用的方法的步驟(a)還可以包含步驟(aa)，所述驟(aa)包括在以下條件培養(yǎng)包含核酸分子的細(xì)胞，所述核酸分子包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述條件允許

(i)合成嗜肝DNA病毒前基因組(pg)RNA；

(ii)逆轉(zhuǎn)錄所述合成的pgRNA成為負(fù)鏈DNA；

(iii)合成第二正鏈DNA，從而所述負(fù)鏈DNA和所述正鏈DNA形成雙鏈松弛型環(huán)狀DNA；

(iv)從所述松弛型環(huán)狀雙鏈DNA形成cccDNA；

(v)恢復(fù)允許翻譯加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的條件；

(vi)轉(zhuǎn)錄編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；

(vii)翻譯加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原；

恢復(fù)允許翻譯加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的條件可以涉及或是恢復(fù)如上文定義和解釋的起始密碼子。

包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含于載體、尤其表達(dá)載體中。

載體可以例如包含如SEQ ID NO:35中所顯示的序列。

包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核酸序列的核酸分子可以在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。本文待用的示例性非限制誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、抗生素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、銅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、或除草劑誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在本文提供的實(shí)驗(yàn)中使用的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(從例如Clontech可商業(yè)獲得)以tet-off方式工作。認(rèn)為以tet-on方式工作的四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以同樣地在本文中使用。tet-on/off系統(tǒng)例如從Clontech和Invitrogen可獲得或者在質(zhì)?；虿《?逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒)主鏈中。除了四環(huán)素/強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子外，如上文所述的例如響應(yīng)于抗生素、銅、醇、類固醇、或除草劑連同其他化合物的其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也是合適的。例如，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以是tet-EF-1α啟動(dòng)子。

另外，可以將一個(gè)或多個(gè)終止密碼子引入一種或多種嗜肝DNA病毒包膜蛋白的編碼區(qū)，如一種或多種嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一種或多種HBV包膜蛋白。一種或多種嗜肝DNA病毒(HBV)包膜蛋白可以是表面大蛋白(L)、表面中等蛋白(M)和表面小蛋白(S)的一者或多者。在一個(gè)實(shí)施方案中，HBV包膜蛋白是表面小蛋白(S)。一種或多種HBV包膜蛋白的示例性編碼區(qū)在SEQ ID NO:36(L)、SEQ ID NO:37(M)和/或SEQ ID NO:38(S)中顯示。在HBV中，可以將SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)突變成例如TAGTAG以阻止包膜蛋白的表達(dá)。

如果cccDNA的替代標(biāo)記即加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的(表達(dá))水平與對照相比降低，則確定候選分子能夠抑制嗜肝DNA病毒cccDNA。

應(yīng)當(dāng)理解加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的評估(表達(dá))水平與對照比較，如加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的評估(表達(dá))水平的標(biāo)準(zhǔn)或參比值?？梢栽谏形磁c候選分子接觸的如本文定義的細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物中評估對照(標(biāo)準(zhǔn)/參比值)。備選地，可以在上述接觸步驟之前在如本文定義的細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物中評估對照(標(biāo)準(zhǔn)/參比值)。與候選分子接觸時(shí)加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的(表達(dá))水平下降也可以是與常規(guī)使用的參比化合物(如已知不能抑制cccDNA的化合物)誘導(dǎo)的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的(表達(dá))水平下降比較。技術(shù)人員容易地處于確定/評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的(表達(dá))水平是否降低的地位。

反之和在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以使用陽性對照，例如，參比化合物，如已知能夠抑制cccDNA的化合物。如果與這種(陽性)對照相比，cccDNA的替代標(biāo)記即加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的(表達(dá))水平等同或甚至增加，則確定候選分子能夠抑制嗜肝DNA病毒cccDNA。

根據(jù)本發(fā)明，尤其本文所述的篩選或確定方法，細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物將與包含核酸分子的候選分子接觸，其中所述核酸分子包含編碼如本文定義的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。

例如，所述細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物可以能夠表達(dá)如本文定義的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。如本文中解釋，可以因此通過測量編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的這類基因產(chǎn)物的表達(dá)水平、尤其蛋白質(zhì)表達(dá)水平，檢測候選分子抑制/拮抗cccDNA的能力。(與對照(標(biāo)準(zhǔn)或參比值)相比的)(較)低(蛋白質(zhì))表達(dá)水平指示了候選分子充當(dāng)抑制劑/拮抗劑的能力。

歸因于降低的轉(zhuǎn)錄物/表達(dá)水平，翻譯的基因產(chǎn)物(即蛋白質(zhì)水平)的水平也將降低。上述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白的(蛋白質(zhì))水平一般與加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白相關(guān)的可檢測信號(hào)的信號(hào)強(qiáng)度相關(guān)。示例性加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白包含可以包含如上文所述的報(bào)道分子(例如螢光素酶、(綠色/紅色)熒光蛋白及其變體、EGFP(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)等)。

因此，細(xì)胞/組織/非人類動(dòng)物與候選分子接觸時(shí)報(bào)道分子信號(hào)下降將顯示候選分子的確是cccDNA抑制劑/拮抗劑并且因此能夠抑制cccDNA。從測試的候選分子選出降低如上文定義的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平的候選分子，其中優(yōu)選地選擇強(qiáng)烈降低加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平的那些分子(例如以報(bào)道分子信號(hào)下降反映)。

在本發(fā)明的上下文(尤其，本文所公開的篩選/鑒定方法)中構(gòu)思，還可以接觸細(xì)胞提取物(例如包含核酸分子的細(xì)胞提取物，所述核酸分子包含編碼如本文中描述和定義的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列)。例如，這些細(xì)胞提取物可以從本文待用、尤其待接觸候選分子的(轉(zhuǎn)基因/基因工程化)細(xì)胞、組織和/或非人類動(dòng)物獲得。

使用這類細(xì)胞提取物是特別有利的，因?yàn)樗试S在體外評估候選分子的活性。利用這類(細(xì)胞)提取物的評估/篩選方法可以例如用于預(yù)篩選候選分子，其中，在這種預(yù)篩選中選出的分子隨后接受后續(xù)篩選，例如在本文所公開的基于細(xì)胞的方法、尤其在(轉(zhuǎn)基因)細(xì)胞、組織和/或非人類動(dòng)物與候選分子接觸的方法中接受后續(xù)篩選。在這種情況下，因此優(yōu)選已經(jīng)在上文和下文所述的體外預(yù)篩選方法中選出候選分子。

因此，如本文所用的術(shù)語“細(xì)胞”涵蓋(轉(zhuǎn)基因/基因工程化)細(xì)胞、(轉(zhuǎn)基因/基因工程化)組織和/或(轉(zhuǎn)基因/基因工程化)非人類動(dòng)物并且還涵蓋從中衍生的細(xì)胞提取物。

應(yīng)當(dāng)理解常規(guī)地在高通量篩選中，同時(shí)篩選許多(經(jīng)常數(shù)千種)候選分子。因此，在(第一)次篩選中，選出降低加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平的候選分子。

也可以通過添加含有所述候選分子或多種候選分子(即各種不同候選分子)的(生物)樣品或組合物至待分析的細(xì)胞(包含核酸分子的細(xì)胞/組織/非人類動(dòng)物，所述核酸分子包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列)，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明篩選方法的步驟(a)，即“接觸步驟”。

通常，候選分子或包含/含有候選分子的組合物可以例如添加至包含核酸分子的(轉(zhuǎn)染的)細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物，所述核酸分子包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。如本文定義和公開、術(shù)語“包含了包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子”暗示使用報(bào)道分子。還可以在本文中使用包含啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域的報(bào)道分子構(gòu)建體。

在本發(fā)明中、尤其在篩選/鑒定方法的上下文中待使用或提供的細(xì)胞、組織和/或非人類動(dòng)物可以用包含編碼本文公開的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子穩(wěn)定或瞬時(shí)染。

能夠抑制cccDNA(如反映為加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平降低)的化合物/分子預(yù)計(jì)作為本文公開的藥物背景下的物質(zhì)有益并且用于醫(yī)學(xué)目的，尤其用于治療與嗜肝DNA病毒相關(guān)的疾病、尤其與嗜肝DNA病毒相關(guān)的慢性病，如慢性肝炎和尤其慢性乙型肝炎。

可以作為嗜肝DNA病毒cccDNA的特異性“拮抗劑”或“抑制劑”發(fā)揮作用的候選分子/化合物可以是小結(jié)合分子如小分子(有機(jī))化合物。

在藥物發(fā)現(xiàn)背景下，術(shù)語“小分子”是本領(lǐng)域已知的并且指具有小于2,500道爾頓、優(yōu)選地小于1,000道爾頓、更優(yōu)選地50和350道爾頓之間分子量的醫(yī)用化合物。(小)結(jié)合分子包含天然化合物以及合成性化合物。術(shù)語“化合物”(或同樣地“分子”)在本發(fā)明的背景下包括單一物質(zhì)或多種物質(zhì)。所述化合物/分子可以例如包含于樣品(例如來自植物、動(dòng)物或微生物的細(xì)胞提取物)中。另外，所述化合物可以是本領(lǐng)域已知的，但是迄今未知能夠(不利)影響嗜肝DNA病毒cccDNA。可以將多種化合物例如在體外添加至樣品、添加至培養(yǎng)基或注入細(xì)胞。

候選物質(zhì)還可以包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性相互作用必需的官能團(tuán)、尤其氫鍵，并且一般包含至少胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選地至少兩種功能性化學(xué)基團(tuán)。候選物質(zhì)經(jīng)常包含經(jīng)一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的碳環(huán)結(jié)構(gòu)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族或多芳族結(jié)構(gòu)。

示例類別的候選物質(zhì)可以包括雜環(huán)、肽、糖、類固醇等?？梢孕揎椈衔镆蕴岣咝Я?、穩(wěn)定性、藥物相容性等。物質(zhì)的結(jié)構(gòu)性鑒定可以用來鑒定、產(chǎn)生或篩選額外的物質(zhì)。例如，在鑒定到肽物質(zhì)的情況下，可以將它們按多種方式修飾以增強(qiáng)其穩(wěn)定性，如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸、尤其L-丙氨酸，通過使氨基末端或羧基末端官能化，例如對于氨基，?；蛲榛?、并且對于羧基，酯化或酸化等，進(jìn)行修飾。其他穩(wěn)定方法可以包括囊化，例如，在脂質(zhì)體中囊化等。

如上文提到，候選物質(zhì)還存在其他生物分子中，所述其他生物分子包括氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、核酸和衍生物、其結(jié)構(gòu)類似物或組合。候選物質(zhì)從多種來源獲得，所述來源包括合成或天然化合物文庫。例如，多種手段可用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子，所述手段包括表達(dá)隨機(jī)化的寡核苷酸和寡肽。可選地，處于細(xì)菌提取物、真菌提取物、植物提取物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物文庫是可獲得的或容易地產(chǎn)生。額外地，通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)手段容易修飾天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物，并且它們可以用來產(chǎn)生組合文庫。已知的藥理學(xué)物質(zhì)可以經(jīng)歷定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，如?；?、烷基化、酯化、酸化等，以便產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。

本發(fā)明中還構(gòu)思，可以評估化合物/分子抑制cccDNA的能力，所述化合物/分子尤其包括肽、蛋白質(zhì)、核酸(包括cDNA表達(dá)文庫)、小分子有機(jī)化合物、配體、PNA等。所述化合物也可以是功能性衍生物或類似物。

用于制備化學(xué)衍生物和類似物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且在例如Beilstein,"Handbook of Organic Chemistry",Springer Edition New York或在"Organic Synthesis",Wiley,New York中描述。另外，可以根據(jù)本發(fā)明檢驗(yàn)所述衍生物和類似物的作用，即它們對cccDNA的拮抗作用。

另外，可以使用適宜的cccDNA拮抗劑或抑制劑的肽模擬物和/或計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。本領(lǐng)域中描述了用于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)例如蛋白質(zhì)和肽的適宜計(jì)算機(jī)系統(tǒng)述，例如，在Berry(1994)Biochem.Soc.Trans.22:1033-1036；Wodak(1987),Ann.N.Y.Acad.Sci.501:1-13；Pabo(1986),Biochemistry 25:5987-5991中描述。從上述計(jì)算機(jī)分析獲得的結(jié)果可以與本發(fā)明的方法組合用于例如優(yōu)化已知的化合物、物質(zhì)或分子。也可以通過連續(xù)化學(xué)修飾法合成肽模似物組合文庫并(例如，根據(jù)本文所述的方法)檢驗(yàn)所產(chǎn)生的化合物，鑒定適宜的化合物?，F(xiàn)有技術(shù)中描述了用于生成和使用肽模似物組合文庫的方法，例如在Ostresh(1996)Methods in Enzymology 267:220-234和Dorner(1996)Bioorg.Med.Chem.4:709-715中描述。另外，cccDNA拮抗劑的三維和/或結(jié)晶學(xué)結(jié)構(gòu)可以用于設(shè)計(jì)cccDNA的(肽模擬物)拮抗劑(Rose(1996)Biochemistry35:12933-12944；Rutenber(1996)Bioorg.Med.Chem.4:1545-1558)。

尤其可以通過用包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)染適宜的宿主并使所述宿主與候選分子接觸，鑒定/評估能夠抑制cccDNA的候選分子。

本文待用的細(xì)胞/宿主優(yōu)選地是真核細(xì)胞、尤其是肝細(xì)胞來源的真核細(xì)胞。真核細(xì)胞優(yōu)選地是肝瘤細(xì)胞或肝細(xì)胞。真核細(xì)胞也可以衍生自肝瘤細(xì)胞或肝細(xì)胞。本文待用的優(yōu)選細(xì)胞是真核細(xì)胞HepG2(ATCC#HB-8065)。HepG2細(xì)胞已知支持功能性HBV cccDNA形成和轉(zhuǎn)錄。本文中構(gòu)思使用其他細(xì)胞，如肝細(xì)胞衍生的細(xì)胞(例如Huh7)。也可以根據(jù)本發(fā)明使用非肝細(xì)胞/宿主，前提是它們支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或在更廣意義下，嗜肝DNA病毒DNA復(fù)制)。例如，如果將病毒前基因組RNA引入細(xì)胞或通過外源啟動(dòng)子從DNA模板轉(zhuǎn)錄，則可以修飾這種非肝細(xì)胞/宿主以支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或嗜肝DNA病毒DNA復(fù)制)。如果在這類非肝細(xì)胞中反式補(bǔ)足肝特異性轉(zhuǎn)錄因子，則cccDNA轉(zhuǎn)錄可以進(jìn)行。本發(fā)明的核酸分子或包含前者的載體可以穩(wěn)定整合在細(xì)胞的基因組中。

根據(jù)本發(fā)明待使用的核酸分子(即包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子)或包含前者的載體優(yōu)選地基本上由DNA組成。

上文就“細(xì)胞”方面給出的解釋還適用于并涵蓋包含或衍生自這些細(xì)胞的組織/非人類動(dòng)物。本文待用的細(xì)胞可以包含于樣品(例如，生物學(xué)樣品、醫(yī)學(xué)樣品或病理學(xué)樣品)中。例如，構(gòu)思了使用包含細(xì)胞、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物的流體。這種流體可以是體液或還可以是分泌物并也可以是培養(yǎng)物樣品。體液可以包括但不限于血清、血漿、尿、唾液、滑液、脊液、腦脊液、淚、糞便等。

同樣地，候選分子可以包含于(生物)樣品或組合物中。(多種)候選分子經(jīng)常接受第一次篩選。在第一次篩選中測試呈陽性的樣品/組合物可以接受后續(xù)篩選，以驗(yàn)證此前結(jié)果并選出最強(qiáng)力的抑制劑/拮抗劑。依賴于多個(gè)篩選和選擇輪次，可以選出顯示明顯的如本文定義和公開的抑制/拮抗cccDNA的能力的那些候選分子。例如，含有多種候選分子的批次(即組合物/樣品)將復(fù)篩并且無候選分子抑制活性或候選分子抑制活性不足的批次在不復(fù)篩的情況下棄去。

例如，如果檢驗(yàn)具有有多種候選分子的(生物)樣品或組合物并且一個(gè)(生物)樣品或組合物檢驗(yàn)呈陽性，則隨后可能在第二次篩選中篩選、優(yōu)選地在純化后篩選(生物)樣品或組合物的各個(gè)分子。也可以是在后續(xù)篩選中篩選第一次篩選的(生物)樣品或組合物的亞組。篩選具有此前篩選輪次中檢驗(yàn)過的那些候選分子亞組的組合物將因此縮小潛在強(qiáng)力cccDNA抑制劑的范圍。這可以促進(jìn)并加速篩選過程，尤其當(dāng)篩選眾多分子時(shí)。因此，與第一次(和后續(xù))篩選中檢驗(yàn)每種和每個(gè)單個(gè)候選分子(這當(dāng)然也還是可能的)相比，篩選輪次的循環(huán)次數(shù)減少。因此，取決于候選分子的復(fù)雜性或數(shù)目，本文所述的篩選方法的步驟可以進(jìn)行幾次直至待篩選的(生物)樣品或組合物包含有限的數(shù)目、優(yōu)選地僅一種物質(zhì)，所述物質(zhì)指示所篩選的分子降低加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原水平的能力。

本文中構(gòu)思使用允許在單個(gè)細(xì)胞水平或某組織的單個(gè)細(xì)胞水平(例如在亞細(xì)胞水平)解析例如熒光的光學(xué)測量技術(shù)。這些技術(shù)可以涉及熒光，例如共聚焦顯微術(shù)、數(shù)字圖像記錄，如CCD照相機(jī)和合適的圖像分析軟件。例如，通過執(zhí)行對照在測量標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)后實(shí)驗(yàn)實(shí)施步驟(b)。例如，在第一次篩選中在不接觸候選分子情況下確定包含加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。在第二次篩選中，在接觸候選分子后，測量/評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。水平的差異顯示檢驗(yàn)的候選分子是否的確為cccDNA的拮抗劑/抑制劑。

可以通過本文中所述的任何方法、尤其蛋白質(zhì)測量/檢測/評估技術(shù)測量例如基因產(chǎn)物的水平(尤其加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的蛋白質(zhì)水平)，定量加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。

例如，可以通過利用免疫凝集、免疫沉淀法(例如免疫擴(kuò)散、免疫電泳、免疫固定)、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(例如(原位)免疫組織化學(xué)、(原位)免疫細(xì)胞化學(xué)、親和色譜、酶免疫測定法)等在蛋白質(zhì)水平確定表達(dá)?？梢酝ㄟ^物理方法例如光度法確定溶液中已純化多肽的量。定量混合物中特定多肽的方法依賴于(例如抗體的)特異性結(jié)合作用。利用抗體特異性的特異性檢測和定量方法包含例如免疫組織化學(xué)(原位)。例如，可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)確定細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白水平的濃度/量。

本文中構(gòu)思了根據(jù)步驟(b)評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平可以通過ELISA、CLIA或AlphaLISA進(jìn)行。

本文提供的方法利用建立的標(biāo)簽(如可以替代HA標(biāo)簽使用或除HA標(biāo)簽之外使用的HA標(biāo)簽、或His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽或C9標(biāo)簽)的用途。這些標(biāo)簽可以用于純化和檢測加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。通過使用與標(biāo)簽特異性結(jié)合的抗體(例如通過ELISA測定法，如化學(xué)發(fā)光-ELISA(CLIA)和AlphaLISA)，可以可靠地及快速地評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且可以避免與核心蛋白的交叉反應(yīng)。

根據(jù)本文所提供方法的步驟(b)評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平可以包括使用特異性識(shí)別所述嗜肝DNA病毒e抗原的抗體、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(如，但不限于抗HBe：克隆29，批號(hào)20110305，Autobio Diagnostics)的抗體和特異性識(shí)別一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的一種或多種抗體(如，但不限于抗HA：目錄號(hào)A01244-100，Genscript)。

以下抗體特異性識(shí)別乙型肝炎病毒e抗原并且可以根據(jù)本發(fā)明使用：

Imai等人,Demonstration of two distinct antigenic determinants on hepatitis B e antigen by monoclonal antibodies.J Immunol.1982Jan；128(1):69-72。

Ferns和Tedder.Monoclonal antibodies to hepatitis B antigen(HBeAg)derived from hepatitis B core antigen(HBcAg):their use in characterization and detection of HBeAg.J Gen Virol.1984May；65(Pt5):899-908。

Mondelli等人,Differential distribution of hepatitis B core and E antigens in hepatocytes:analysis by monoclonal antibodies.Hepatology.1986 6(2):199-204。

Stuckmann和Mushahwar.Re-examination and further characterization of a monoclonal antibody to hepatitis B e antigen(anti-HBe).J Virol Methods.1986Jul；13(4):351-62。

Korec等人,Monoclonal antibodies against hepatitis B e antigen:production,characterization,and use for diagnosis.J Virol Methods.1990May；28(2):165-9。

Usuda等人,A monoclonal antibody against a hepatitis B e antigen epitope borne by six amino acids encoded by the precore region.J Virol Methods.1997Nov；68(2):207-15。

Sogut等人,Monoclonal antibodies specific for hepatitis B e antigen and hepatitis B core antigen.Hybridoma(Larchmt).2011Oct；30(5):475-9。

備選地，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析或免疫組織化學(xué)染色。蛋白質(zhì)印跡法組合了通過電泳法分離蛋白質(zhì)混合物和用抗體特異性檢測。電泳可以是多維的如2D電泳。通常，多肽在2D電泳中依照其表觀分子量沿一個(gè)維度分離并且依照其等電點(diǎn)沿另一個(gè)方向分離。

技術(shù)人員能夠通過利用檢測信號(hào)強(qiáng)度和待確定的例如多肽/蛋白質(zhì)的量之間的相關(guān)性、優(yōu)選地線性相關(guān)性，確定上文所述的多肽/蛋白質(zhì)、尤其基因產(chǎn)物的量。因此，加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平可以基于加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的蛋白質(zhì)水平定量。技術(shù)人員是知曉待用于確定樣品中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白表達(dá)產(chǎn)物水平的量/濃度的標(biāo)準(zhǔn)方法或可以從標(biāo)準(zhǔn)教材(例如Sambrook，2001)推導(dǎo)出相應(yīng)方法。

如果加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(或相應(yīng)報(bào)道分子信號(hào))的水平強(qiáng)烈地降低、優(yōu)選地很低或不可檢出，則選出候選分子。例如，與(對照)標(biāo)準(zhǔn)值相比，加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(或相應(yīng)報(bào)道分子信號(hào))的水平可以降低至少50％、60％、70％、80％、更優(yōu)選地至少90％。

用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織的方法是本領(lǐng)域已知的。因此，磷酸鈣處理或電穿孔法可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織以表達(dá)所述報(bào)道分子構(gòu)建體(參見Sambrook(2001)，見上述引文)。另外，表達(dá)所述報(bào)道分子構(gòu)建體的核酸分子可以重構(gòu)入脂質(zhì)體以遞送至靶細(xì)胞。作為又一種備選，可以使用基因工程病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以表達(dá)特定報(bào)道分子構(gòu)建體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含用于檢測cccDNA抑制作用的所述報(bào)道分子構(gòu)建體的非人類動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物。所描述的篩選分析法中待使用的非人類生物可以選自秀麗隱桿線蟲(C.elegans)、酵母、果蠅、斑馬魚、豚鼠、大鼠和小鼠。產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物處于技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。相應(yīng)的技術(shù)尤其在“Current Protocols in Neuroscience”(2001),John Wiley&Sons,第3.16章中描述。

因此，本發(fā)明還涉及一種用于產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，所述方法包括步驟：將包含編碼如本文中公開的加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子引入ES-細(xì)胞或生殖細(xì)胞中。本文提供和描述的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別可用于上文所述的篩選方法和藥理學(xué)試驗(yàn)中。本文所述的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于藥物篩選分析法中以及用于其中追蹤、選擇和/或分離治療嗜肝DNA病毒相關(guān)疾病的cccDNA拮抗劑/抑制劑的科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究中。

在本發(fā)明背景、尤其篩選/鑒定方法下待使用的轉(zhuǎn)基因/基因工程細(xì)胞、組織和/或非人類動(dòng)物包含本文描述和定義的包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子。

本發(fā)明涉及使用細(xì)胞、組織或非人類動(dòng)物篩選和/或驗(yàn)證疑似作為嗜肝DNA病毒cccDNA的抑制劑的化合物。

如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物”、“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)基因組織”，指不是人類的包含相應(yīng)野生型動(dòng)物、組織或細(xì)胞的不同遺傳物質(zhì)的非人類動(dòng)物、組織或細(xì)胞。術(shù)語“遺傳物質(zhì)”在這種背景下可以是任何種類的核酸分子或其類似物，例如如本文定義的核酸分子或其類似物。術(shù)語“不同”意指與野生型動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞的基因組相比附加或較少的遺傳物質(zhì)。待用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞/動(dòng)物的不同表達(dá)系統(tǒng)的概述例如參見Methods in Enzymology 153(1987),385-516、Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987),516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)、Griffiths等人,(Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)。

本發(fā)明涉及如上文定義的核酸分子，即包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子。上文給出的解釋和定義在已作必要修正的情況下適用于此處。嗜肝DNA病毒e抗原優(yōu)選地是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有僅一個(gè)標(biāo)簽。標(biāo)簽可以由6至22個(gè)氨基酸組成。常見的和本文中優(yōu)選的(表位)標(biāo)簽由8、9、10或11個(gè)氨基酸組成。6xHis是可以在本文中使用的最小表位標(biāo)簽?？赡艿氖牵儆?個(gè)氨基酸的插入可以與毗鄰的HBeAg氨基酸一起裝配成新表位，從而這種插入還產(chǎn)生加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒。標(biāo)簽可以是血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽或C9標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽可以是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽。兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽優(yōu)選地是不同的標(biāo)簽。所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的整個(gè)長度可以是約12個(gè)至約31個(gè)氨基酸。例如，兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的整個(gè)長度可以是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31個(gè)氨基酸。兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽可以是以下兩者或更多者：HA標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和/或C9標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽可以是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

編碼標(biāo)簽的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的編碼HA標(biāo)簽的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的編碼His標(biāo)簽的核酸序列；如SEQ ID NO:4中所示的編碼c-myc標(biāo)簽的核酸序列、如SEQ ID NO:5中所示的編碼V5標(biāo)簽的核酸序列、和/或如SEQ ID NO:6中所示的編碼C9標(biāo)簽的核酸序列。

編碼Flag標(biāo)簽的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所顯示的編碼1×Flag標(biāo)簽的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所顯示的編碼3×Flag標(biāo)簽的核酸序列。

標(biāo)簽的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:9中所示的His標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所示的V5標(biāo)簽的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:13中所示的C9標(biāo)簽的氨基酸序列。

Flag標(biāo)簽的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所顯示的1×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所顯示的3×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列。

編碼HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:16中顯示。HBeAg的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:18中顯示。

核酸分子可以包含編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中顯示。嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:17中顯示。

核酸分子可以包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列，其中所述序列在編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信號(hào)肽和接頭的核酸序列的3'下游(插入)。

編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列可以在編碼乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29個(gè)氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。

核酸分子可以包含嗜肝DNA病毒基因組。優(yōu)選地，嗜肝DNA病毒基因組是乙型肝炎病毒(HBV)基因組。HBV基因組可以是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因組。HBV基因組可以是HBV基因型D的基因組。優(yōu)選地，HBV基因組是HBV基因型D亞基因型ayw的基因組。

編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸可以在編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白、優(yōu)選地HBV核心蛋白的核酸的5’上游(插入)。編碼HBV核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:23中顯示。核心蛋白可以是HBV核心蛋白。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中顯示。

包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子可以插入如本文定義的嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)中。如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中顯示。包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子可以插入嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖中。

將包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子插入與HBV基因組的位置C1902和A1903相對應(yīng)的核苷酸之間。

核酸分子可以在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的5’包含能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列。優(yōu)選地，能夠與嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV(編碼)的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列主要能夠與優(yōu)選地對應(yīng)于位置T1849至A1854或任選地對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至T1855的核苷酸形成堿基對。能夠與嗜肝DNA病毒基因組的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列可以由(至多)9個(gè)核苷酸組成。

能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的示例性序列由SEQ ID NO:26中所示的序列組成。能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的示例性序列編碼如SEQ ID NO:40中所示的多肽。

核酸分子可以在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的3’包含編碼接頭的序列。接頭可以由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。優(yōu)選地，接頭僅由一個(gè)氨基酸殘基如甘氨酸殘基組成。編碼接頭的序列可以由序列GGC組成。編碼接頭的序列可以編碼甘氨酸殘基。編碼序列可以用于并適當(dāng)?shù)亟?jīng)選擇以保持核心蛋白起始密碼子的可靠Kozak基序。

核酸分子可以包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述核酸序列包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列。核酸分子可以包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述核酸序列包含編碼如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。

一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽優(yōu)選符合可讀框地融合于嗜肝DNA病毒e抗原(或融合入嗜肝DNA病毒e前核心蛋白)、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)(或融合入乙型肝炎病毒前核心蛋白)中。

編碼加標(biāo)簽的HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:20中顯示。加標(biāo)簽的HBeAg的優(yōu)選氨基酸序列在SEQ ID NO:22中顯示。

編碼加標(biāo)簽的乙型肝炎病毒前核心蛋白的示例性核酸序在SEQ ID NO:19中顯示。加標(biāo)簽的乙型肝炎病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:21中顯示。

HBV基因組的示例性核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中顯示。

核酸可以轉(zhuǎn)錄成前基因組(pg)嗜肝DNA病毒RNA。嗜肝DNA病毒RNA優(yōu)選地是HBV RNA。

包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含于載體如表達(dá)載體中。優(yōu)選地，嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

核酸通常允許加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的翻譯。核酸可以包含于包含如SEQ ID NO:39中所顯示的序列的載體中。

在某些實(shí)施方案中，核酸設(shè)計(jì)成阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。例如，核酸不含有在編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG。例如，在編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG可以由核酸TG替換?？梢酝ㄟ^點(diǎn)突變修飾核酸以阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。載體可以包含如SEQ ID NO:35中所顯示的序列。

包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核酸序列的核酸分子可以在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以是四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、抗生素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、銅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或除草劑誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以優(yōu)選地是CMV啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以是tet-EF-1α啟動(dòng)子。

另外，可以將一個(gè)或多個(gè)終止密碼子引入一種或多種嗜肝DNA病毒包膜蛋白的、優(yōu)選地一種或多種HBV包膜蛋白的編碼區(qū)。

一種或多種HBV包膜蛋白可以如下一者或多者：L、M和/或S。HBV包膜蛋白可以是S。

一種或多種HBV包膜蛋白的示例性編碼區(qū)(或編碼所述包膜蛋白的示例性核酸序列)在SEQ ID NO:36(L)、37(M)或38(S)中顯示。SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)可以突變成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明涉及如上文定義和提供的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。

該蛋白質(zhì)包含加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地加標(biāo)簽的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)可以包含如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原僅含有一個(gè)標(biāo)簽。

標(biāo)簽可以由6至22個(gè)氨基酸組成。標(biāo)簽可以是血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽或C9標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽可以是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽。優(yōu)選地，兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是不同的標(biāo)簽。所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的整個(gè)長度是約14個(gè)至約31個(gè)氨基酸。兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽可以是以下兩者或更多者：HA標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和/或C9標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽可以是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

編碼標(biāo)簽的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的編碼HA標(biāo)簽的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的編碼His標(biāo)簽的核酸序列；如SEQ ID NO:4中所示的編碼c-myc標(biāo)簽的核酸序列、如SEQ ID NO:5中所示的編碼V5標(biāo)簽的核酸序列、和/或如SEQ ID NO:6中所示的編碼C9標(biāo)簽的核酸序列。

編碼Flag標(biāo)簽的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所顯示的編碼1×Flag標(biāo)簽的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所顯示的編碼3×Flag標(biāo)簽的核酸序列。

標(biāo)簽的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:9中所示的His標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc標(biāo)簽的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所示的V5標(biāo)簽的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:13中所示的C9標(biāo)簽的氨基酸序列。

Flag標(biāo)簽的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所顯示的1×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所顯示的3×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列。

蛋白質(zhì)可以包含嗜肝DNA病毒前核心蛋白。編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中顯示。嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:17中顯示。

該蛋白質(zhì)可以包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒前核心蛋白的信號(hào)肽和接頭的氨基酸序列的C末端。該蛋白質(zhì)可以在乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29個(gè)氨基酸的氨基酸序列的C末端包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列。

該蛋白質(zhì)可以包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒核心蛋白的氨基酸序列的N末端、優(yōu)選地HBV核心蛋白的氨基酸序列的N末端。編碼HBV核心蛋白的示例性核酸在SEQ ID NO:23中顯示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中顯示。

一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列可以插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)編碼的氨基酸序列中。如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中顯示。一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列可以插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖編碼的氨基酸序列；優(yōu)選插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖編碼的氨基酸序列。

可以將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列插入與HBV前核心蛋白(如SEQ ID NO:17中所顯示的一種)的位置G29和位置M30相對應(yīng)的氨基酸殘基之間。

該蛋白質(zhì)還可以在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列的N末端包含(至多)3個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其中所述至多3個(gè)氨基酸的氨基酸序列由能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的核酸序列編碼。能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的核酸序列主要能夠與優(yōu)選地對應(yīng)于位置T1849至T1855或任選地對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至T1855的核苷酸形成堿基對。能夠與嗜肝DNA病毒pgRNA、優(yōu)選地HBV pgRNA的ε結(jié)構(gòu)的下部莖或如嗜肝DNA病毒基因組、優(yōu)選地HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的示例性核酸序列由SEQ ID NO:26中所示的序列組成。(至多)3個(gè)氨基酸的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:40中顯示。

該蛋白質(zhì)還可以在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列的C末端包含接頭。接頭可以由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。優(yōu)選地，接頭僅由一個(gè)氨基酸殘基如甘氨酸殘基組成。

加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列可以包含如SEQ ID NO:41中所顯示的核酸序列編碼的氨基酸序列。其中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列可以包含如SEQ ID NO:42中所顯示的氨基酸序列。

一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽優(yōu)選符合可讀框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原、優(yōu)選地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

編碼加標(biāo)簽的HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:20中顯示。優(yōu)選地，加標(biāo)簽的HBeAg具有如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。

編碼加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:19中顯示。加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:21中顯示。

本發(fā)明涉及包含如本文定義和提供的核酸分子的宿主細(xì)胞和/或涉及包含如本文定義和提供的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞。真核細(xì)胞可以是肝細(xì)胞來源的。真核細(xì)胞可以是肝瘤細(xì)胞或可以衍生自肝瘤細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是HepG2(ATCC#HB-8065)。

本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生如上文定義的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在允許蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)如上文定義的宿主并且從培養(yǎng)物回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明涉及用于本發(fā)明方法中的試劑盒。同樣地，本發(fā)明涉及篩選疑似能夠抑制嗜肝DNA病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的候選分子的試劑盒的用途。本文相對于評估候選分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的方法所提供的解釋在已作必要修正的情況下適用于此處。

試劑盒可以包含特異性識(shí)別如本文定義的嗜肝DNA病毒抗原e的抗體和特異性識(shí)別如本文定義的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的一種或多種抗體。

本發(fā)明(在本發(fā)明背景下待制備)的試劑盒或本發(fā)明的方法和用途還可以包括或配有使用手冊。例如，所述使用手冊可以指導(dǎo)技術(shù)人員(如何)評估候選分子抑制cccDNA的能力和/或如何評估本發(fā)明加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。特別地，所述使用手冊可以包含使用或應(yīng)用本文提供的方法或用途的指導(dǎo)。

本發(fā)明(在本發(fā)明背景下待制備)的試劑盒還可以包含適于實(shí)施本發(fā)明方法和用途/本發(fā)明方法和用途所要求的物質(zhì)/化學(xué)品和/或設(shè)備。例如，這類物質(zhì)/化學(xué)品和/或設(shè)備是用于穩(wěn)定和/或儲(chǔ)存化合物的溶劑、稀釋劑和/或緩沖液，所述化合物是特異性確定如本文定義的所述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原(蛋白質(zhì)(表達(dá)))水平所需的。

本發(fā)明涉及如本文定義和提供的核酸分子、如本文定義和提供的蛋白質(zhì)和/或如本文定義和提供的宿主細(xì)胞用于篩選疑似能夠抑制嗜肝DNA病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的候選分子的用途。本文相對于評估候選分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的方法所提供的解釋在已作必要修正的情況下適用于此處。

如本文所用，術(shù)語“包含”和“包括”或其語法變體將視為規(guī)定所述的特征、整數(shù)、步驟或組分，但是不排除增加一個(gè)或多個(gè)附加特征、整數(shù)、步驟、組分或其群組。這個(gè)術(shù)語涵蓋術(shù)語“由……組成”和“基本上由……組成”。因此，術(shù)語“包含”/“包括”/”具有”意指任何其他組分(或同樣意指任何其他特征、整數(shù)、步驟等)可以存在。

術(shù)語“由……組成”意指無其他組分(或同樣意指無其他特征、整數(shù)、步驟等)可以存在。

在本文中使用時(shí)，術(shù)語“基本上由……組成”或其語法變體將視為規(guī)定所述的特征、整數(shù)、步驟或組分，但是不排除增加一個(gè)或多個(gè)附加特征、整數(shù)、步驟、組分或其群組，但條件是上述附加特征、整數(shù)、步驟、組分或其群組不實(shí)質(zhì)地改變要求保護(hù)的組合物、裝置或方法的基本特征和新特征。

因此，術(shù)語“基本上由……組成”意指特定其他組分(或同樣地特定其他特征、整數(shù)、步驟等)可以存在，即這些不實(shí)質(zhì)地影響組合物、裝置或方法的必需特征。換而言之，術(shù)語“基本上由……組成”(其可以在本文中與術(shù)語“基本上包含”互換使用)允許除強(qiáng)制性組分(或同樣地強(qiáng)制性特征、整數(shù)、步驟等)之外的其他組分在組合物、裝置或方法中存在，前提是裝置或方法的必需特征并未實(shí)質(zhì)地受其他組分的存在影響。

術(shù)語“方法”指用于實(shí)現(xiàn)給出任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、生物學(xué)和生物物理技術(shù)人員已知或從已知方式、手段、技術(shù)和程序容易開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和程序。

如本文所用，術(shù)語“分離”指已經(jīng)從其體內(nèi)位置取出的組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的組合物或化合物基本上不含在其體內(nèi)位置存在的其他物質(zhì)(例如，其他蛋白質(zhì)或其他化合物)(即純化或半純化的組合物或化合物)。

如本文所用術(shù)語“約”指±10％。

本發(fā)明參考以下非限制性圖和實(shí)施例進(jìn)一步描述。

除非另外說明，否則既定的重組基因技術(shù)方法如通過引用方式完整并入本文的例如Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)中所述那樣使用。

以下實(shí)施例說明本發(fā)明：

這些圖顯示：

圖1.HA標(biāo)簽序列插入HBV前核心蛋白ORF中。

描述了HBV前核心蛋白(基因型D，亞型ayw，nt 1816-2454)的ORF，5’部分(nt 1816-1941)以核苷酸序列顯示。在nt 1941和前核心蛋白ORF的終止密碼子之間的序列省略。加框表示前核心蛋白ORF的起始密碼子、同向重復(fù)序列1(DR1)和核心蛋白ORF的符合可讀框的起始密碼子。在質(zhì)粒pTREHBV-HAe中突變前核心蛋白ORF的5'末端起始密碼子?？煽康膒gRNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)(nt 1820)以箭頭標(biāo)記。HBV核苷酸位置依據(jù)Galibert命名法確定(5)。以預(yù)測的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(下部莖、凸起、上部莖、環(huán))說明充當(dāng)HBV pgRNA中后續(xù)DNA復(fù)制的必需順式元件的關(guān)鍵莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(ε,ε)。為了將符合可讀框地融合的HA標(biāo)簽序列在不改變?chǔ)诺膲A基配對情況下置入前核心蛋白ORF，將含有HA標(biāo)簽的DNA序列(gtggacatcTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTggc；SEQ ID NO:41)符合可讀框地插入與核心蛋白ORF的起始密碼子毗鄰的上游位置(參見插入物框)。這個(gè)序列修飾導(dǎo)致HA標(biāo)簽加接頭序列符合可讀框地融合入前核心蛋白，并且核心蛋白的完整ORF在ε的下游維持。

圖2.加HA標(biāo)簽的HBeAg的表達(dá)和分泌

(A)野生型和加HA標(biāo)簽的前核心蛋白的胞內(nèi)表達(dá)。將HepG2細(xì)胞用質(zhì)粒pcHBe或pcHA-HBe轉(zhuǎn)染，5天后，通過使用抗HBc(頂部小圖)和抗HA(中部小圖)抗體，令全細(xì)胞裂解物接受蛋白質(zhì)印跡分析。β-肌動(dòng)蛋白充當(dāng)內(nèi)參對照。標(biāo)記野生型前核心蛋白和加HA標(biāo)簽的前核心蛋白(HA-前核心蛋白)。

(B)檢測培養(yǎng)液中加HA標(biāo)簽的HBeAg。將HepG2細(xì)胞模擬轉(zhuǎn)染或用質(zhì)粒pcHBe或pcHA-HBe轉(zhuǎn)染，在指示的時(shí)間點(diǎn)收集上清液樣品并且在轉(zhuǎn)染后第5天收獲細(xì)胞。使用抗HA抗體，對上清液樣品進(jìn)行免疫沉淀(IP)并且通過蛋白質(zhì)印跡法采用針對HA的抗體檢測加HA標(biāo)簽的HBeAg(HA-HBeAg)。顯示抗體的輕鏈(LC)。通過HA蛋白質(zhì)印跡法揭示HA-前核心蛋白的胞內(nèi)表達(dá)。

圖3.HA-HBeAg在HepHA-HBe細(xì)胞系中的分泌。

將建立的加HA標(biāo)簽的HBeAg穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，尤其HepHA-HBe4和HepHA-HBe47細(xì)胞，在匯合條件下接種在膠原蛋白涂覆的12孔板中。接種細(xì)胞的當(dāng)日設(shè)為第0天，并且每隔1天補(bǔ)充培養(yǎng)基。在指示的時(shí)間點(diǎn)收集上清液樣品并且通過如“材料和方法”中所述的AlphaLISA分析法檢測HA-HBeAg。在直方圖中AlphaLISA信號(hào)(相對光單位)(Y-軸)對應(yīng)于時(shí)間點(diǎn)(X-軸)作圖

圖4.HA-重組HBV基因組在瞬時(shí)染的細(xì)胞中的復(fù)制。

將HepG2細(xì)胞用pTREHBVDES或pTREHBV-HAe和質(zhì)粒pTet-off共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后5天收獲細(xì)胞，并且分別通過RNA印跡法、蛋白質(zhì)印跡法和DNA印跡雜交法分析基于質(zhì)粒的HBV RNA、核心蛋白、衣殼化pgRNA的產(chǎn)生和病毒DNA復(fù)制。pgRNA：前基因組RNA；sRNA：表面RNA；RC：松弛型環(huán)狀DNA；SS：單鏈DNA。

圖5.HepBHAe穩(wěn)定細(xì)胞系中HBV cccDNA依賴性加HA標(biāo)簽的HBeAg表達(dá)的合理設(shè)計(jì)的示意圖。

在pTREHBV-HAe和pTet-off穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因含有tet-CMV啟動(dòng)子控制下的1.1倍超長HBV基因組。前核心蛋白的起始密碼子(ATG)在HBV DNA的5'末端突變，第二起始密碼子在3’多余處未改變。將含有HA標(biāo)簽的片段(以灰色顯示)如材料和方法中所述插入前核心蛋白ORF。轉(zhuǎn)基因還在表面小蛋白(S)ORF中含有兩個(gè)串聯(lián)終止密碼子以阻止病毒包膜蛋白表達(dá)。(B)一旦移除Tet，則pgRNA轉(zhuǎn)錄并且產(chǎn)生核心蛋白和聚合酶，導(dǎo)致pgRNA包裝和(C)pgRNA逆轉(zhuǎn)錄成rcDNA。DNA修復(fù)機(jī)制將(D)rcDNA轉(zhuǎn)化成(E)環(huán)狀cccDNA模板，其中HA-前核心蛋白ORF得到恢復(fù)，產(chǎn)生HA-前核心蛋白mRNA、及(F)用于從頭病毒復(fù)制的pgRNA。(G)HA-前核心蛋白從HA-前核心蛋白mRNA翻譯并加工成可以通過ELISA檢測到的分泌型HA-HBeAg。preC、C、pol、L、M、S和X分別代表前核心蛋白、核心蛋白、聚合酶、表面大抗原、中等抗原和小抗原和X蛋白的ORF起始密碼子。DR代表同向重復(fù)序列。CTD代表C末端結(jié)構(gòu)域。

圖6.HepBHAe13細(xì)胞中病毒DNA復(fù)制、cccDNA積累和加HA標(biāo)簽的HBeAg生產(chǎn)的動(dòng)力學(xué)。

將HepBHAe13細(xì)胞在四環(huán)素存在下接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞單層變得匯合時(shí)，從培養(yǎng)基移除四環(huán)素并且每隔1天更換培養(yǎng)基。在指示的時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞樣品和上清液樣品。提取并通過DNA印跡雜交法分析胞內(nèi)核心蛋白DNA(上半小圖)和cccDNA(底部小圖)。DP-rc代表去蛋白化(無蛋白質(zhì))的RC DNA。通過如上文所述的HA IP-蛋白質(zhì)印跡法檢測分泌型加HA標(biāo)簽的HBeAg。

圖7.支持HA-重組HBV DNA復(fù)制的額外誘導(dǎo)型HepBHAe細(xì)胞系。

將HepDES19細(xì)胞和新建立的克隆編號(hào)不同的HepBHAe細(xì)胞按相同的密度在四環(huán)素存在下接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)，將一組細(xì)胞在四環(huán)素存在下培養(yǎng)，并且將另一組細(xì)胞在四環(huán)素不存在下培養(yǎng)。6天后，收獲細(xì)胞并通過DNA印跡分析病毒核心蛋白DNA。

圖8.HepBHAe細(xì)胞系中cccDNA的真實(shí)性。

通過Hirt提取法提取HepDES19細(xì)胞和所示的HepBHAe細(xì)胞中產(chǎn)生的cccDNA并對其進(jìn)行凝膠電泳和DNA印跡雜交(泳道1、5、8、11、14)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HBV cccDNA的真實(shí)性，將Hirt DNA樣品在裝載凝膠前加熱到85℃持續(xù)5分鐘，一種使DP-rcDNA變性成SS DNA，同時(shí)cccDNA保持非變性并且其電泳遷移率保持不變的條件(泳道2、6、9、12、15)。將熱變性的DNA樣品進(jìn)一步用EcoRI消化，在所述條件下cccDNA線性化成基因組長度的雙鏈DNA(泳道3、7、10、13、16)。

圖9.AlphaLISA檢測HepBHAe細(xì)胞系中的HA-HBeAg。

將HepBHAe細(xì)胞在四環(huán)素存在下接種于平板中。當(dāng)細(xì)胞變得匯合時(shí)，從培養(yǎng)基移除四環(huán)素并且每隔1天更換培養(yǎng)基。在指示的時(shí)間點(diǎn)收獲上清液樣品并對其進(jìn)行AlphaLISA以檢測HA-HBeAg。AlphaLISA讀數(shù)(相對光單位，RLU)表述為每秒的計(jì)數(shù)(CPS)。

圖10.HBV復(fù)制抑制劑(3TC)阻斷HepBHAe13細(xì)胞中的HA-HBeAg表達(dá)。

將HepBHAe13細(xì)胞在6孔板中在四環(huán)素存在下培養(yǎng)直至匯合。一組細(xì)胞在四環(huán)素存在下持續(xù)維持。第二組細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)換成無四環(huán)素的培養(yǎng)基。第三組細(xì)胞隨后在含有10μM 3TC的無四環(huán)素培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每隔1天補(bǔ)充培養(yǎng)基，并且對指示的時(shí)間點(diǎn)上收獲的上清液樣品進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫測定(CLIA)以檢測加HA標(biāo)簽的HBeAg。

圖11.HBV cccDNA形成抑制劑降低HepBHAe13細(xì)胞中的HA-HBeAg水平。將細(xì)胞接種于96孔板中并且當(dāng)細(xì)胞變得匯合時(shí)，從培養(yǎng)基移除四環(huán)素以誘導(dǎo)病毒復(fù)制。同時(shí)，將細(xì)胞不處理或用化合物在所示的濃度處理，在處理組和未處理組中將DMSO濃度歸一化為0.5％。每4天重復(fù)處理。在處理后第12天，對培養(yǎng)液進(jìn)行HA-HBeAg CLIA并且將讀數(shù)作為百分?jǐn)?shù)(均值±SD)相對于對照作圖。

圖12.額外的HepBHAe細(xì)胞克隆中病毒RNA轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制和cccDNA積累的動(dòng)力學(xué)。

將所示的HepBHAe細(xì)胞在四環(huán)素存在下接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞單層變得匯合時(shí)，從培養(yǎng)基移除四環(huán)素并且每隔1天更換培養(yǎng)基。細(xì)胞在指示的時(shí)間點(diǎn)收獲。提取總病毒RNA(上半小圖)、胞質(zhì)核心蛋白DNA(中部小圖)并分別通過RNA印跡和DNA印跡雜交分析。將提取的cccDNA在85℃熱變性5分鐘并且隨后用EcoR I線性化，隨后進(jìn)行DNA印跡分析(底部小圖)。

圖13.HA-HBeAg在額外的HepBHAe細(xì)胞克隆中的cccDNA依賴性表達(dá)。

選出的HepBHAe細(xì)胞在96孔板中在四環(huán)素存在下培養(yǎng)直至匯合。一組細(xì)胞在四環(huán)素存在下持續(xù)維持。第二組細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)換成無四環(huán)素的培養(yǎng)基。第三組細(xì)胞隨后在含有10μM 3TC的無四環(huán)素培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每隔1天補(bǔ)充培養(yǎng)基，并且在處理后第9天收獲的上清液樣品進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫測定法(CLIA)以檢測加HA標(biāo)簽的HBeAg。

實(shí)施例說明本發(fā)明。

實(shí)施例1：誘導(dǎo)型表達(dá)乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA依賴性加表位標(biāo)簽的e抗原的培養(yǎng)細(xì)胞系及其篩選抗病毒物質(zhì)的用途

材料和方法

質(zhì)粒

為了構(gòu)建含有敲除其起始密碼子的融合人流感血凝素(HA)的前核心蛋白可讀框的四環(huán)素誘導(dǎo)型HBV復(fù)制載體，將通過Genscript Inc化學(xué)合成下述DNA片段，所述DNA片段含有CMV-IE啟動(dòng)子TATA框基序和下游HBV片段(基因型D，亞型ayw，nt 1805-2335)，同時(shí)缺失nt 1816(A)及在前核心蛋白ORF中插入HA標(biāo)簽序列。在這個(gè)DNA片段內(nèi)部，SacI限制性酶位點(diǎn)在5'末端存在并且真實(shí)BspEI限制性位點(diǎn)在3'末端存在。通過將合成的DNA片段插入質(zhì)粒pTREHBVDES中的SacI/BspEI限制性位點(diǎn)，構(gòu)建載體pTREHBV-HAe。pTREHBV-HAe的完整序列在SEQ ID NO:35顯示。

為了產(chǎn)生融合HA的前核心蛋白表達(dá)載體，通過使用引物5’-ATTGGATCCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3’和5’-ACAGTAGTTTCCGGAAGTGTTGATAGGATAGGGG-3’從pTREHBV-HAe擴(kuò)增含有HBV nt 1816-2335連同HA序列插入物的PCR片段。將該P(yáng)CR片段用BamHI和BspEI限制性酶處理并插入前核心蛋白表達(dá)載體(pcHBe)中的相同限制性位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pcHA-HBe。pcHA-HBe的完整序列在SEQ ID NO:39顯示。

細(xì)胞培養(yǎng)物

支持HBV復(fù)制的肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2細(xì)胞(HB-8065^TM)從ATCC獲得。先前已經(jīng)描述了誘導(dǎo)型表達(dá)HBV DNA和cccDNA的HepG2衍生的HepDES19細(xì)胞系(7)。將細(xì)胞系在補(bǔ)充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-F12培養(yǎng)基(Cellgro)中維持。

為了建立HepBHAe細(xì)胞系，將HepG2細(xì)胞用表達(dá)Tet應(yīng)答性轉(zhuǎn)錄激活物的質(zhì)粒pTet-off(Clontech)和其中修飾的HBV pgRNA的轉(zhuǎn)錄受CMV-IE啟動(dòng)子連同四環(huán)素應(yīng)答元件控制的質(zhì)粒pTREHBV-HAe轉(zhuǎn)染。在1μg/ml四環(huán)素存在下用500μg/ml G418選擇轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞。挑取G418耐藥性集落并擴(kuò)充成細(xì)胞系。通過在無四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)HBV復(fù)制，并且通過DNA印跡雜交測定病毒DNA復(fù)制中間體的水平。選擇HBV高水平復(fù)制的細(xì)胞系并命名為具有不同克隆編號(hào)的HepBHAe。

通過用pcHA-HBe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞產(chǎn)生加HA標(biāo)簽的HBeAg穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系HepHA-HBe，用500μg/ml G418選擇集落并且通過抗HA蛋白質(zhì)印跡分析法鑒定陽性集落。

按照與HepG2相同的方式培養(yǎng)HepBHAe穩(wěn)定細(xì)胞系和HepHA-HBe穩(wěn)定細(xì)胞系，除了添加500μg/ml的G418。對于HepBHAe細(xì)胞，在維持期間按1μg/ml常規(guī)添加四環(huán)素以抑制HBV pgRNA轉(zhuǎn)錄。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞(約1.0×10⁶個(gè))接種在膠原蛋白涂覆的35mm直徑培養(yǎng)皿的無抗生素DMEM/F12培養(yǎng)基中。在溫育過夜后，通過遵循制造商的說明，每個(gè)孔用總計(jì)4μg質(zhì)粒以脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000(Life Technologies)轉(zhuǎn)染。在指示的時(shí)間點(diǎn)收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣品或上清液樣品。

病毒核酸分析

通過遵循制造商的操作方案，用TRIzol試劑(Life Technologies)提取細(xì)胞總RNA。將衣殼化的病毒pgRNA如下純化：在250μl含有10mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、1％NP-40和50mM NaCl裂解緩沖液中在37℃充分裂解來自一個(gè)12孔平板的細(xì)胞10分鐘，并通過離心移除胞核。將樣品與6U微球菌核酸酶和15μl 100mM CaCl₂在37℃溫育15分鐘以消化游離的核酸。根據(jù)制造商的操作方案，通過添加750μlTRIzol LS試劑(Invitrogen)提取衣殼化的病毒pgRNA。將RNA樣品通過1.5％含有2.2M甲醛的瓊脂糖凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到20×SSC緩沖液(1×SSC是0.15M NaCl加0.015M檸檬酸鈉)中的Hybond-XL膜(GEHealthcare)上。

將胞質(zhì)病毒核心蛋白DNA如下提?。涸?.5ml含有10mMTris-HCl，pH 8.0、10mM EDTA、1％NP40和2％蔗糖的裂解緩沖液中在37℃裂解來自一個(gè)35mm直徑培養(yǎng)皿的細(xì)胞10分鐘。通過離心移除細(xì)胞殘片和胞核，并且將上清液在37℃與3μl 1M Mg(OAc)₂和5μl 10mg/mlDNA酶I(Calbiochem)溫育30分鐘。上清液隨后與15μl 0.5M EDTA和130μl含有1.5M NaCl的35％聚乙二醇(PEG)8000混合以沉淀核衣殼。在冰上溫育1小時(shí)后，將病毒核衣殼通過在4℃按10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘沉淀，隨后在37℃在400μl含有0.5mg/ml鏈霉蛋白酶(Calbiochem)、0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)、100mM NaCl、25mMTris-HCl(pH 7.4)和10mM EDTA的消化緩沖液中消化1小時(shí)。消化混合物苯酚提取，并且DNA用乙醇沉淀并溶解于TE(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA)緩沖液中。來自每塊平板的三分之一核心蛋白DNA樣品由電泳法分離進(jìn)入1.2％瓊脂糖凝膠。凝膠隨后在含有0.2N HCl的緩沖液中進(jìn)行脫嘌呤，在含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的溶液中變性，并在含有1M Tris-HCl(pH 7.4)和1.5M NaCl的緩沖液內(nèi)中和。DNA隨后印跡到20×SSC緩沖液中的Hybond-XL膜上。

通過使用改良的Hirt提取程序?qū)嵤o蛋白質(zhì)的病毒DNA(cccDNA和無蛋白質(zhì)的rcDNA)的提取(4,8)。簡而言之，在3ml 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM EDTA和0.7％SDS中裂解來自一個(gè)35mm直徑培養(yǎng)皿的細(xì)胞。在室溫溫育30分鐘后，將裂解物轉(zhuǎn)移至15ml管中，并且這個(gè)步驟后是添加0.8ml 5M NaCl及在4℃溫育過夜。裂解物隨后通過在4℃按10,000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘澄清并用苯酚提取2次及用酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)提取一次。將DNA在室溫在乙醇中沉淀過夜并溶解于TE緩沖液中。隨后將三分之一的無蛋白質(zhì)的DNA樣品在1.2％瓊脂糖凝膠中分離并轉(zhuǎn)移到Hybond-XL膜上。

為了檢測HBV RNA和DNA，用[α-³²P]UTP(800Ci/mmol；PerkinElmer)標(biāo)記的正鏈或負(fù)鏈特異性全長HBV Riboprobe探測膜。雜交在5ml EKONO雜交緩沖液(Genotech)中實(shí)施，在65℃預(yù)雜交1小時(shí)并在65℃雜交過夜，隨后在65℃于0.1×SSC和0.1％SDS中洗滌1小時(shí)。將膜對磷光成像儀屏曝光，并通過Typhoon FLA-7000系統(tǒng)(GEHealthcare)檢測雜交信號(hào)。

蛋白質(zhì)印跡分析

將35mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌1次并在500μl 1×Laemmli緩沖液中裂解。將總計(jì)50μl細(xì)胞裂解物在SDS-12％聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜膜(Millipore)上。將膜用蛋白質(zhì)印跡Breeze封閉緩沖液(Life Technologies)封閉并用針對HBcAg(aa170-183)、HA標(biāo)簽(Sigma-Aldrich，克隆M2)、β-肌動(dòng)蛋白(Sigma-Aldrich)的抗體探測。通過IRDye第二抗體揭示結(jié)合的抗體。將免疫印跡信號(hào)用Li-COR Odyssey系統(tǒng)可視化和定量。

免疫沉淀

在0.5ml含有10mM Tris-HCl，pH 8.0、10mM EDTA、1％NP40、2％蔗糖和1×蛋白酶抑制劑混合物(G-biosciences)的裂解緩沖液中裂解來自一個(gè)35mm直徑培養(yǎng)皿的細(xì)胞。在離心以除去細(xì)胞殘片后，將澄清的細(xì)胞裂解物與50μl Ezview Red抗HA(Sigma-Aldrich)在4℃溫育過夜伴以溫和轉(zhuǎn)動(dòng)。來自一個(gè)35mm直徑培養(yǎng)皿的0.5ml培養(yǎng)基樣品(總計(jì)1ml)直接進(jìn)行免疫沉淀。將珠在4℃用TBS緩沖液(0.15M NaCl、0.05M Tris-HCl[pH 7.4])洗滌3次。沉淀的珠用Laemmli緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品制備。使用針對HA標(biāo)簽的抗體(Sigma-Aldrich)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測免疫沉淀的加HA標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。

檢測加HA標(biāo)簽的HBeAg的ELISA

對于化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLIA)檢測加HA標(biāo)簽的HBeAg，將鏈霉親和素涂布的高靈敏平板(黑色，目錄號(hào)：15525，Thermo Scientific)用PBST(PBS外加0.05％Tween20)洗滌3次，并且隨后在室溫與50μl抗HA-生物素(目錄號(hào)：A00203，Genscript；PBS中5μg/ml)溫育30分鐘，隨后用200μlPBST洗滌3次。在移除洗滌緩沖液后，將50μl培養(yǎng)上清液樣品添加于ELISA孔中并在室溫溫育30分鐘，隨后用200μlPBST洗滌3次。隨后，將50μl辣根過氧化物酶(HRP綴合的抗HBe抗體(來自HBeAg CLIA試劑盒，目錄號(hào)：CL0312-2，Autobio Diagnostics)添加于孔中并在室溫溫育30分鐘。用200μlPBST洗滌5次后，添加來自CLIA試劑盒的25μl每種底物A和B并且將平板溫和地振搖10秒。在光度計(jì)上讀取平板。

對于AlphaLISA檢測加HA標(biāo)簽的HBeAg，將抗HA-生物素(目錄號(hào)：A00203，Genscript)在1×分析緩沖液(25mM HEPES、0.1M NaCl、0.1％BSA，pH 7.4)中稀釋至2μg/ml并分配5μl至Proxiplate-384HS(目錄號(hào)：6008279，Perkin Elmer)的每個(gè)孔中。隨后將5μl培養(yǎng)液樣品添加于各孔中并溫和地混合，隨后在室溫溫育30分鐘。隨后、添加5μl 0.2μg/ml抗HBe(克隆29，批號(hào)20110305，Autobio Diagnostics)并溫和地混合，隨后在室溫溫育30分鐘。隨后，將分析溶液與5μl稀釋的抗小鼠IgG AlphaLISA接納體珠(目錄號(hào)：AL105C，Perkin Elmer)(125μg/ml)混合并在室溫溫育30分鐘，隨后在室溫與5μl AlphaScreen鏈霉親和素供體珠(目錄號(hào)：6760002S，Perkin Elmer)(125μg/ml)溫育1小時(shí)。在溫育后，在Envision2104多標(biāo)記讀數(shù)儀(Perkin Elmer)上讀取平板。

結(jié)果

本文提供兩種類型的分別從轉(zhuǎn)基因和HBV cccDNA表達(dá)加HA標(biāo)簽的HBeAg(HA-HBeAg)的新細(xì)胞系及通過化學(xué)發(fā)光免疫測定法和AlphaLISA測定法檢測重組HBeAg的方法。細(xì)胞系和測定法適于高通量篩選減少HBV cccDNA水平和/或沉默cccDNA轉(zhuǎn)錄的化合物。

緊湊的HBV DNA基因組小尺寸和重疊基因組構(gòu)造在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不影響病毒DNA復(fù)制和后續(xù)cccDNA形成的情況下限制了報(bào)道基因的插入。

前核心蛋白/HBeAg可以在HepDE19細(xì)胞中工程化成cccDNA依賴性(3)。本領(lǐng)域已知，HBV基因組具有顯示重疊ORF和多個(gè)順式元件的高度緊湊型基因構(gòu)造。因此，認(rèn)為基因插入/缺失或序列替換將很可能影響病毒DNA復(fù)制。先前的工作已經(jīng)通過GFP替換HBV序列，如在大多數(shù)情況下的包膜蛋白編碼區(qū)，以產(chǎn)生重組HBV基因組，但是需要病毒蛋白的反式互補(bǔ)以支持病毒復(fù)制和病毒粒裝配(Protzer等人,PNAS(1999),96:10818-23)。另外，那些報(bào)告的重組HBV基因組如果用來感染容許性細(xì)胞則僅可以產(chǎn)生第一輪cccDNA合成，cccDNA的胞內(nèi)擴(kuò)增被阻斷，原因是缺陷型病毒DNA復(fù)制。

即便有以上的現(xiàn)有技術(shù)知識(shí)，在本文中嘗試以下情況并且其是合理的：在前核心蛋白可讀框(ORF)中符合可讀框地融合外源短表位標(biāo)簽可以由HBV基因組耐受并且從cccDNA模板表達(dá)，因此一對標(biāo)簽特異性抗體和HBeAg抗體將顯著地改善ELISA檢測的特異性。

為了構(gòu)建具有人流感血凝素(HA)融合的前核心蛋白可讀框的四環(huán)素誘導(dǎo)型HBV復(fù)制載體，將含有HA標(biāo)簽的DNA序列(gtggacatcTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTggc；SED ID NO.：41)插入與HBV表達(dá)載體pTREHBVDES中核心蛋白ORF的起始密碼子毗鄰的符合可讀框的上游位置，其中HBV pgRNA表達(dá)以Tet-off方式受四環(huán)素(tet)調(diào)節(jié)的CMV-IE啟動(dòng)子控制。HA標(biāo)簽(大寫)的側(cè)翼序列(小寫)設(shè)計(jì)成維持HBV基因組莖環(huán)結(jié)構(gòu)(ε)的堿基配對和核心蛋白ORF起始密碼子的Kozak基序(圖1)。獲得的重組質(zhì)粒命名為pTREHBV-HAe(SEQ ID NO:35)。除了HA標(biāo)簽插入外，質(zhì)粒pTREHBV-HAe還在前核心蛋白ORF的5'末端起始密碼子中含有點(diǎn)缺失(ATG至TG)，藉此阻止前核心蛋白從質(zhì)粒模板中的HBV基因組表達(dá)。此外，將兩個(gè)串聯(lián)終止密碼子引入小(S)包膜蛋白氨基端的編碼區(qū)中(217TTGTTG222 to 217TAGTAG222；突變加下劃線)以阻斷HBV感染性粒子的產(chǎn)生。

為了檢驗(yàn)加表位標(biāo)簽的HBV前核心蛋白表達(dá)和HBeAg分泌的可行性，如上文所述，將含有HA標(biāo)簽的DNA序列插入前核心蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcHBe中的相同病毒DNA位置，并且構(gòu)建體命名為pcHA-HBe(SEQID NO:39)。pcHA-HBe在HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致加HA標(biāo)簽的前核心蛋白的胞內(nèi)表達(dá)和加HA標(biāo)簽的HBeAg的胞外積累(圖2)，因此證實(shí)HA標(biāo)簽插入前核心蛋白不影響前核心蛋白表達(dá)、翻譯后加工和HBeAg分泌。也已經(jīng)建立用于檢測加HA標(biāo)簽的HBeAg(HA-HBeAg)的化學(xué)發(fā)光ELISA和AlphaLISA，如材料和方法章節(jié)中所述。

根據(jù)上文，通過將pcHA-HBe穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，建立以組成型方式表達(dá)加HA標(biāo)簽的HBeAg的細(xì)胞系。通過AlphaLISA測定法選出高水平表達(dá)加HA標(biāo)簽的HBeAg的兩個(gè)克隆，并且將它們分別命名為HepHA-HBe4和HepHA-HBe47(圖3)。

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測定法中，重組HBV質(zhì)粒pTREHBV-HAe能夠復(fù)制HBV DNA到與pTREHBVDES所實(shí)現(xiàn)水平可比較的水平(圖4)，提示HA標(biāo)簽插入由HBV基因組復(fù)制耐受。隨后，將pTREHBV-HAe隨pTET-off(Clontech)一起穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞以產(chǎn)生四環(huán)素誘導(dǎo)型HBV細(xì)胞系。理論上，在這種細(xì)胞系中，一旦誘導(dǎo)，前核心蛋白和其衍生物HBeAg將不從轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生，原因在于前核心蛋白ORF起始密碼子沉默。轉(zhuǎn)錄的pgRNA將表達(dá)病毒核心蛋白和聚合酶并啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生rcDNA，從而通過胞內(nèi)擴(kuò)增途徑導(dǎo)致cccDNA形成。前核心蛋白不完整ORF在pgRNA的3’多余處的起始密碼子將拷貝入病毒DNA序列，并且加HA標(biāo)簽的前核心蛋白的完整ORF將在rcDNA轉(zhuǎn)變成cccDNA期間重構(gòu)。因此，HA-前核心蛋白mRNA僅可以從cccDNA轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生核內(nèi)cccDNA的分泌型加HA標(biāo)簽的HBeAg替代標(biāo)記(圖5)。

我們已經(jīng)獲得5個(gè)以四環(huán)素依賴性方式支持高水平HBV DNA復(fù)制的細(xì)胞系(HepBHAe1、HepBHAe13、HepBHAe34、HepBHAe45、HepBHAe82)(圖6和圖7)。

在代表性株系HepBHAe13細(xì)胞中，當(dāng)撤除四環(huán)素時(shí)觀察到病毒產(chǎn)物(包括復(fù)制型DNA中間體和cccDNA)合成和積累的時(shí)間依賴性動(dòng)力學(xué)。在HepBHAe13細(xì)胞的培養(yǎng)液中，移除四環(huán)素后第6天還通過蛋白質(zhì)印跡法檢測到加HA標(biāo)簽的HBeAg，并且此后抗原水平逐漸增加。加HA標(biāo)簽的HBeAg(HA-HBeAg)的水平與病毒核心蛋白DNA和cccDNA的胞內(nèi)水平成正比(圖6)。已經(jīng)通過熱變性和進(jìn)一步限制性酶消化證實(shí)從HepBHAe細(xì)胞系產(chǎn)生的cccDNA的真實(shí)性(圖8)。因此，已經(jīng)建立了支持前核心蛋白中插入含有HA標(biāo)簽的重組HBV的DNA復(fù)制和cccDNA形成的誘導(dǎo)型細(xì)胞系。

在16天時(shí)間過程研究中，來自培養(yǎng)的HepBHAe細(xì)胞的上清液樣品上的AlphaLISA測定法展示加HA標(biāo)簽的HBeAg的水平增加(圖9)。選擇HepHBAe13細(xì)胞以進(jìn)一步驗(yàn)證。細(xì)胞在三種條件下培養(yǎng)：1)在四環(huán)素存在下以抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)；2)在四環(huán)素不存在下以誘導(dǎo)病毒DNA復(fù)制；3)在四環(huán)素不存在下但是給予3TC處理以阻斷病毒DNA復(fù)制及后續(xù)cccDNA形成。化學(xué)發(fā)光免疫測定法(CLIA)顯示，作為cccDNA建立和基因表達(dá)的結(jié)果，培養(yǎng)基中加HA標(biāo)簽的HBeAg信號(hào)在撤除四環(huán)素后的第6天出現(xiàn)并且此后逐漸增加。如預(yù)測，在四環(huán)素存在下或在3TC處理(tet-)下的任何時(shí)間點(diǎn)在培養(yǎng)液中均未檢出HA-HBeAg(圖10)。另外，兩種先前鑒定的cccDNA形成抑制劑，具體為CCC-0975和CCC-0346(3)、顯示劑量依賴地抑制HA-HBeAg從HepBHAe13細(xì)胞產(chǎn)生(圖11)。因此，HepBHAe13細(xì)胞中加HA標(biāo)簽的HBeAg的產(chǎn)生是cccDNA依賴的。

此外，對其他HepBHAe細(xì)胞系(包括HepBHAe1、HepBHAe45和HepBHAe82)的時(shí)間過程研究展示了撤除四環(huán)素時(shí)HBVmRNA、胞質(zhì)核心蛋白DNA和核cccDNA的時(shí)間依賴性積累(圖12)。如圖13中所示，在這些三個(gè)額外的HepBHAe細(xì)胞系中驗(yàn)證了cccDNA依賴的加HA標(biāo)簽的HBeAg產(chǎn)生。

總之，本文中已經(jīng)建立了新的誘導(dǎo)性型細(xì)胞系，所述細(xì)胞系以HBVcccDNA依賴方式表達(dá)加HA標(biāo)簽的HBeAg，后者可以在用本文所述的HA-HBeAg檢測方法篩選抗病毒化合物中充當(dāng)HBV cccDNA的替代標(biāo)記。

本發(fā)明參考以下核苷酸序列和氨基酸序列。

本文中提供的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中可獲得并且可以在ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene從萬維網(wǎng)取回；這些序列還涉及注釋的和修飾的序列。本發(fā)明還提供其中使用本文所提供之簡潔序列的同源序列和變體的技術(shù)和方法。優(yōu)選地，這類“變體”是遺傳變體。

SEQ ID NO：1：

編碼血凝素(HA)標(biāo)簽的核苷酸序列

TACCCATACGACGTTCCAGATTACGCT

SEQ ID NO：2：

編碼His標(biāo)簽的核苷酸序列

CATCATCATCATCATCAC

SEQ ID NO：3：

編碼Flag標(biāo)簽的核苷酸序列

GACTACAAGCACGACGACGACAAG

SEQ ID NO：4：

編碼c-myc標(biāo)簽的核苷酸序列

ATG GCA TCA ATG CAG AAG CTG ATC TCA GAG GAG GAC CTG

SEQ ID NO：5：

編碼V5標(biāo)簽的核苷酸序列

GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG

SEQ ID NO：6：

編碼C9標(biāo)簽的核苷酸序列

ACTGAAACATCTCAAGTAGCTCCAGCT

SEQ ID NO：7∶

編碼3×Flag標(biāo)簽的核苷酸序列

GACTACAAAGACCACGACGGTGACTACAAAGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAG

SEQ ID NO：8：

HA標(biāo)簽的氨基酸序列

YPYDVPDYA

SEQ ID NO：9：

His標(biāo)簽的氨基酸序列

HHHHHH

SEQ ID NO：10：

Flag標(biāo)簽的氨基酸序列

DYKDDDDK

SEQ ID NO：11：

c-myc標(biāo)簽的氨基酸序列

EQKLISEEDL

SEQ ID NO：12：

V5標(biāo)簽的氨基酸序列

GKPIPNPLLGLDST

SEQ ID NO：13：

C9標(biāo)簽的氨基酸序列

TETSQVAPA

SEQ ID NO：14：

3×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列

DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK

SEQ ID NO：15：

編碼乙型肝炎病毒前核心蛋白的核苷酸序列

前核心蛋白ORF序列：

ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAG

SEQ ID NO：16：

編碼乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核苷酸序列

HBeAg DNA序列：

TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTT

SEQ ID NO：17：

乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列

前核心蛋白的氨基酸序列：

MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC

SEQ ID NO：18：

乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的氨基酸序列

HBeAg氨基酸序列(從前核心蛋白除去N端信號(hào)肽(19aa)和C末端精氨酸豐富結(jié)構(gòu)域(34aa))：

SKLCLGWLWGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV

SEQ ID NO：19：

編碼加HA標(biāo)簽乙型肝炎病毒前核心蛋白的核苷酸序列。

加HA標(biāo)簽的前核心蛋白DNA序列：

ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCTACCCATACCACGTTCCAGATTACGCTGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAG

SEQ ID NO：20：

編碼加HA標(biāo)簽的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核苷酸序列

加HA標(biāo)簽的HBeAg DNA序列：

TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTT

SEQ ID NO：21：

加HA標(biāo)簽的乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列。HA標(biāo)簽加下劃線。

加HA標(biāo)簽的前核心蛋白的氨基酸序列：

MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGVDIYPYDVPDYAGMDlDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC

SEQ ID NO：22：

加HA標(biāo)簽的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的氨基酸序列。HA標(biāo)簽加下劃線。

加HA標(biāo)簽的HBeAg氨基酸序列：

SKLCLGWLWGVDIYPYDVPDYAGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV

SEQ ID NO：23：

編碼HBV核心蛋白的核苷酸序列ATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAG

SEQ ID NO：24：

HBV核心蛋白的氨基酸序列

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC

SEQ ID NO：25：

如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的核苷酸序列

TGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACA

SEQ ID NO：26：

能夠與嗜肝DNA病毒基因組的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的核苷酸序列

GTGGACATC

SEQ ID NO：27：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型D，亞型ayw。Genbank登錄號(hào)U95551(C1902和A1903為粗體。前核心蛋白的ORF加下劃線)AATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAACAAAACAAAGAGATGGGGTTACTCTCTGAATTTTATGGGTTATGTCATTGGAAGTTATGGGTCCTTGCCACAAGAACACATCATACAAAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAACTTCCTATTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGTTTTGCTGCCCCATTTACACAATGTGGTTATCCTGCGTTAATGCCCTTGTATGCATGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATACCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGTCATGGGCCATCAGCGCGTGCGTGGAACCTTTTCGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCGGGACTGATAACTCTGTTGTCCTCTCCCGCAAATATACATCGTATCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCGAATGTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCTGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGATTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGGAACTTTACTGGTCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTTAATCCTCATTGGAAAACACCATCTTTTCCTAATATACATTTACACCAAGACATTATCAAAAAATGTGAACAGTTTGTAGGCCCACTTACAGTTAATGAGAAAAGAAGATTGCAATTGATTATGCCTGCTAGGTTTTATCCAAAGGTTACCAAATATTTACCATTGGATAAGGGTATTAAACCTTATTATCCAGAACATCTAGTTAATCATTACTTCCAAACTAGACACTATTTACACACTCTATGGAAGGCGGGTATATTATATAAGAGAGAAACAACACATAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG

SEQ ID NO：28：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型A(Genbank登錄號(hào)AP007263)

AATTCCACTGCCTTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTCACATCTCGTCAATCTCCGCGAGGACTGGGGACCCTGTGGCGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAGTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAAACCCTAACAAAACAAAAAGATGGGGTTATTCCCTAAACTTCATGGGTTACATAATTGGAAGTTGGGGAACTTTGCCACAGGATCATATTGTACAAAAGATCAAACACTGTTTTAGAAAACTTCCTGTTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCTCCATTTACACAATGTGGATATCCTGCCTTAATGCCTTTGTATGCATGTATACAAGCTAAACAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTAAGTAAACAGTACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAGCTCATCGGAACTGACAATTCTGTCGTCCTCTCGCGGAAATATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTTCGCGGAACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCTCGGGGCCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCAGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGTCCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCATCAGATCCTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCCCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCCTACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAGGACTGGGAGGAGCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTACATGTCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACAATTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTTTATTCCTCTACAGTACCTATCTTTAATCCTGAATGGCAAACTCCTTCCTTTCCTAAGATTCATTTACAAGAGGACATTATTAATAGGTGTCAACAATTTGTGGGCCCTCTCACTGTAAATGAAAAGAGAAGATTGAAATTAATTATGCCTGCTAGATTCTATCCTACCCACACTAAATATTTGCCCTTAGACAAAGGAATTAAACCTTATTATCCAGATCAGGTAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGACATTATTTACATACTCTTTGGAAGGCTGGTATTCTATATAAGAGGGAAACCACACGTAGCGCATCATTTTGCGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGGTTGGTCATCAAAACCTCGCAAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGCCAACAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCGGTATTTTGGGGGGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG

SEQ ID NO：29：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型B(Genbank登錄號(hào)AB602818)

AACTCCACCACTTTTCACCAAACTCTTCAAGATCCCAGAGTCCGGGCTCTGTACTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAGCCCTGCTCAGAATACTGTCTCTGCCATATCGTCAATCTTATCGAAGACTGGGGACCCTGTGCCGAACATGGAGAACATCGCATCAGGACTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTCACCAACCTGTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTCACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGGAGTTGGGGCACATTGCCACAGGAACATATTGTACAAAAAATCAAACTATGTTTTAGGAAACTTCCTGTAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTAAGTAAACAGTATCTAGCCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGAAACTCATCGGGACTGACAATTCTGTCGTGCTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCGTCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAAACCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCACAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTGTGTTTCATGAGTGGGAGGAGCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAGTCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCGTCGGTACGAGACCTCCTAGATACCGCTGCTGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAATCTCCTGAACATTGCTCACCTCACCACACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGCTGGGGGGAATTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTAGAAGATCCAGCGTCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAACACTAACATGGGCCTAAAGATCAGGCAATTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCGGCCTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCACCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTCTATTCTTCTACAGTACCTGTCTTTAATCCTGAATGGCAAACTCCTTCTTTTCCAGACATTCATTTGCAGGAGGATATTGTTGATAGATGTAAGCAATTTGTGGGACCCCTTACAGTAAATGAAAACAGGAGACTAAAATTAATAATGCCTGCTAGATTTTATCCTAATGTTACCAAATATTTGCCCTTAGATAAAGGGATCAAACCTTATTATCCAGAGCATGTAGTTAATCATTACTTCCAGACAAGACATTATTTGCATACTCTTTGGAAGGCGGGTATCTTATATAAGAGAGAGTCAACACATAGCGCCTCATTTTGCGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGAAAAGGCATGGGGACAAATCTTTCTGTCCCCAATCCCCTGGGATTCTTCCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCAAAGCCAACTCAGAAAATCCAGATTGGGACCTCAACCCACACAAGGACAACTGGCCGGACGCCCACAAGGTGGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACCCCTCCCCACGGGGGACTGTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTTACATCTGTGCCAGCAGCTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCTTATCTCCACCTCTAAGGGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG

SEQ ID NO：30：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型C(Genbank登錄號(hào)AB540584)

AACTCCACAACTTTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGGCCTATACTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCATATCGTCAATCTTCACGAGGACTGGGGACCCTGTACCGAACATGGAGAACACAACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACAAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAMCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAACCCTAATAAAACCAAGCGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTTATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTACCACAGGAACATATTGTTCTAAAAATCAAACAATGTTTTCGGAAACTGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTCTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGGTATCCTGCCTTGATGCCTTTGTATGCATGTATACAAGCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTATAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTATTTGCTGACGCAACCCCCACTGGATGGGGCTTGGCAATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCTTAGCAGCCTGCTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCRAATCTTATTGGAACCGACAACTCCGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGGTGTGCTGCAAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCAGCGGACGACCCGTCTCGGGGCCGTTTGGGACTCTACCGTCCCCTTCTTCGTCTGCCGTTCCGGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAGGTCTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCGGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCTAGGGAATTAGTAGTCAGTTATGTTAATGTTAATATGGGCCTAAAGATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCCTTTGGAGTGTGGATACGCACTCCTCCCGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAATTTTACTGGGCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTCAATCCTGAGTGGCAAACTCCCTCCTTTCCTCACATTCATTTGCAGGAGGACATTATTAATAGATGTCAACAATATGTGGGCCCTCTTACAGTTAATGAAAAAAGGAGATTAAAATTAATTATGCCTGCCAGGTTTTATCCTAACCGTACCAAATATTTGCCCCTAGATAAAGGCATTAAACCTTATTATCCTGAATATACAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGGCATTATTTACATACTCTGTGGAAGGCTGGCATTCTATATAAGAGAGAAACTACACGCAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGGTTGGTCCTCCAAACCTCGAAAGGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATCCTCTGGGCTTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCGGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGATCACTGGCCAGCAGCAAACCAGGTAGGAGCGGGAGCCTTCGGGCCAGGGTTCACCCCACCGCACGGCGGTCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCGTATTGACAACAGTGCCAGCAGCGCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGCAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG

SEQ ID NO：31：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型E(Genbank登錄號(hào)AP007262)

AATTCCACAACATTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTAAGAGGCCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTGAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCACTCATCTCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAAGGCATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCTCCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAGTACGGGACCCTGCCGAACCTGCACGACTCTTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGTTGTTTAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCATGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCCGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTATACCTCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAATCCCAACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTAAATTTCATGGGTTATGTAATTGGTAGTTGGGGGTCATTACCACAAGAACACATCAGACTGAAAATCAAAGACTGTTTTAGAAAGCTCCCTGTTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTCTATATGCGTGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATATGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGATGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGAAACTCATAGGGACAGATAATTCTGTCGTTCTCTCCCGGAAATATACATCATTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGAGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCAGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCCTCTCGGGGCCGCTTGGGGGTCTATCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAGATCTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCTGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGACTAGATTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTAAGAGATCTTCTAGATACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGATGCCTTAGAATCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTTTGCTGGGGAGAATTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTAAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAATACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAATTATTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTCATAGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGAATACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCACAAGGTGGGAAATTTTACGGGGCTTTATTCTTCTACTATACCTGTCTTTAATCCTAACTGGAAAACTCCATCTTTTCCTGATATTCATTTGCACCAGGACATTATTAACAAATGTGAACAATTTGTAGGTCCTYTAACAGTAAATGAAAAACGAAGATTAAACTTAGTCATGCCTGCTAGATTTTTTCCCATCTCCACGAAATATTTGCCCCTAGAGAAAGGTATAAAACCTTATTATCCAGATAATGTAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGACACTATTTACATACCCTATGGAAGGCGGGCATCTTATATAAAAGAGAAACTACCCGTAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCTTATTCTTGGGAACACGAGCTACATCATGGGGCTTTCTTGGACGGTCCCTCTCGAATGGGGGAAGAATCATTCCACCACCAATCCTCTGGGATTTTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCATTCAGAGCAAACACCAGAAATCCAGATTGGGACCACAATCCCAACAAAGACCACTGGACAGAAGCCAACAAGGTAGGAGTGGGAGCATTTGGGCCGGGGTTCACTCCCCCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAAGGCATGCTAAAAACATTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCAATCACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG

SEQ ID NO：32：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型F(Genbank登錄號(hào)HE974366)

AACTCAACCCAGTTCCATCAGGCTCTGTTGGATCCCAGGGTAAGGGCTCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACACAAAACCCTGCTCCGACTATTGCCTCTCTCACATCCTCAATCTTCTCGACGACTGGGGGCCCTGCTATGAACATGGACAACATTACATCAGGACTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGTGTGTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGACTACCCGGGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTTACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAGGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGATCCACGACCACCAGCACGGGACCCTGCAAAACCTGCACAACTCTTGCACAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCCTGTTGCTGTTCAAAACCCTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTAGGAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCAATTTGTTCAGTGGTGCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTTAGTTATATTGATGATCTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTGCAGCACCTTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTGTTATCTGTGGGTATCCATTTAAATACTTCTAAAACTAAGAGATGGGGTTACACCCTACATTTTATGGGTTATGTCATTGGTAGTTGGGGATCATTACCTCAAGATCATATTGTACACAAAATCAAAGAATGTTTTCGGAAACTGCCTGTAAATCGTCCAATTGATTGGAAAGTCTGTCAACGCATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTCACACAATGTGGTTATCCTGCTCTCATGCCTCTGTATGCTTGTATTACTGCTAAACAGGCTTTTGTTTTTTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCTGTAAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCCAGGCAACGGCCGGGCCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATTGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTTGCAGCTTGTTTCGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGACTCTCATCGGCACGGACAACTCTGTTGTCCTCTCTAGGAAGTACACCTCCTTCCCATGGCTGCTCGGGTGTGCTGCAAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTGTACCGCCCTCTTCTCCGTCTGCCGTTCCAGCCGACAACGGGTCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTTCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCCTTGGAGTTTGCCAACAGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGGAGGGTCAATGACCCGGATTGCAGAATACATCAAAGACTGTGTATTTAAGGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGACTAGGTTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTTTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGCGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGATTTCTTTCCATCGGTTCGGGACCTACTCGACACCGCTTCAGCCCTTTACCGGGATGCTTTAGAGTCACCTGAACATTGCACTCCCCATCACACTGCCCTCAGGCAAGTTATTTTGTGCTGGGGTGAGTTAATGACTTTGGCTTCCTGGGTGGGCAATAACTTGGAAGACCCTGCTGCCAGGGATTTAGTAGTTAACTATGTTAACACTAACATGGGCCTAAAAATTAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGCCTTACTTTTGGAAGAGATATAGTTCTTGAGTATTTGGTGTCCTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACAAAATGCCCCTATCCTATCCACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCGTCGCCGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAATTTTACGGGGCTTTACTCTTCTACTGTGCCTGCTTTTAATCCTGACTGGTTAACTCCTTCTTTTCCTAATATTCATTTACATCAAGACCTAATTTCTAAATGTGAACAATTTGTAGGCCCACTCACTAAAAATGAATTAAGGAGGTTAAAATTGGTTATGCCAGCTAGATTTTATCCTAAGGTTACCAAATATTTTCCTATGGAGAAAGGAATCAAGCCTTATTATCCTGAGCATGCAGTTAATCATTACTTTAAAACAAGACATTATTTGCATACTTTATGGAAGGCGGGAATTTTATATAAGAGAGAATCCACACGTAGCGCATCATTTTGTGGGTCACCATATTCCTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGCACCTCTCTCAACGACAAGAAGAGGCATGGGACAGAATCTTTCTGTGCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCAGACCATCAGCTGGATCCGCTATTCAAAGCAAATTCCAGCAGTCCCGACTGGGACTTCAACACAAACAAGGACAGTTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTGGGAGCATACGGTCCAGGGTTCACACCCCCACACGGTGGCCTGCTGGGGTGGAGCCCTCAGGCACAAGGTATGTTAACAACCTTGCCAGCAGATCCGCCTCCTGCTTCCACCAATCGGCGGTCCGGGAGAAAGCCAACCCCAGTCTCTCCACCTCTAAGAGACACTCATCCACAGGCAATGCAGTGG

SEQ ID NO：33：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型G(Genbank登錄號(hào)AP007264)

AACTCTACAGCATTCCACCAAGCTCTACAAAATCCCAAAGTCAGGGGCCTGTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGGATAGTGAACCCTGTTCCGACTATTGCCTCTCACATCTCGTCAATCTTCTCCAGGATTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGTGCCCGTGTGTCCTGGCCTAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAATCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTGATTCCAGGATCCTCGACCACCAGTACGGGACCCTGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTATCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATCTAAACCCTAACAAAACAAAAAGATGGGGTTATTCCTTAAATTTTATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTGCCACAAGAACACATCACACAGAAAATTAAGCAATGTTTTCGGAAACTCCCTGTTAACAGGCCAATTGATTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTGGTCTGTTGGGTTTCGCTGCTCCTTTTACCCAATGTGGTTACCCTGCCTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCTAAGCAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTATAAGGCCTTTCTCTGTAAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCTAGGCAACGGCCCGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATCGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCTGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAACTCATTGGGACTGACAATTCTGTCGTCCTTTCTCGGAAATATACATCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTTCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCAGCGCTGAATCCAGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGTTTGGGGCTCTGTCGCCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCTGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTACATGGAAACCGCCATGAACACCTCTCATCATCTGCCAAGGCAGTTATATAAGAGGACTCTTGGACTGTTTGTTATGTCAACAACCGGGGTGGAGAAATACTTCAAGGACTGTGTTTTTGCTGAGTGGGAAGAATTAGGCAATGAGTCCAGGTTAATGACCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGTAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTAGGGCATGGATAGAACAACTTTGCCATATGGCCTTTTTGGCTTAGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTGCTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTTTTCCCGTCTGTTCGTGATCTTCTCGACACCGCTTCAGCTTTGTACCGGGAATCCTTAGAGTCCTCTGATCATTGTTCGCCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCAATCCTGTGCTGGGGTGAGTTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGAGATTTGGTGGTCAATTATGTTAATACTAATATGGGTTTAAAAATCAGGCAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGGAGAGAAACCGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTCGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTGCATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCACAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTGTATTCTTCTACTATACCTGTCTTTAATCCTGATTGGCAAACTCCTTCTTTTCCAAATATCCATTTGCATCAAGACATTATAACTAAATGTGAACAATTTGTGGGCCCTCTCACAGTAAATGAGAAACGAAGATTAAAACTAGTTATGCCTGCCAGATTTTTCCCAAACTCTACTAAATATTTACCATTAGACAAAGGTATCAAACCGTATTATCCAGAAAATGTAGTTAATCATTACTTCCAGACCAGACATTATTTACATACCCTTTGGAAGGCGGGTATTCTATATAAGAGAGAAACGTCCCGTAGCGCTTCATTTTGTGGGTCACCATATACTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCTTTCTTGGACGGTCCCTCTCGAGTGGGGAAAGAACCTTTCCACCAGCAATCCTCTAGGATTCCTTCCCGATCACCAGTTGGACCCAGCATTCAGAGCAAATACCAACAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAAAAAGGACCCTTGGCCAGAGGCCAACAAAGTAGGAGTTGGAGCCTATGGACCCGGGTTCACCCCTCCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGTCTCAGGGCACACTAACAACTTTGCCAGCAGATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGTCAGTCAGGGAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCACTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG

SEQ ID NO：34：

HBV基因組的核苷酸序列，HBV基因型H(Genbank登錄號(hào)AB516393)

AACTCAACACAGTTCCACCAAGCACTGTTGGATTCGAGAGTAAGGGGTCTGTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGAAACACAGAACCCTGCTCCGACTATTGCCTCTCTCACATCATCAATCTTCTCGAAGACTGGGGACCCTGCTATGAACATGGAGAACATCACATCAGGACTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGTGTGTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGTACCACCCGGGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCACTTACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTGTGTCCTCTACTTCCAGGATCTACAACCACCAGCACGGGACCCTGCAAAACCTGCACCACTCTTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCCTGCTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGGAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCAATTTGCTCAGTGGTGCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTTAGTTATATGGATGATTTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTGCAGCATCTTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTTTGTTATCTGTGGGCATCCATTTGAACACAGCTAAAACAAAATGGTGGGGTTATTCCTTACACTTTATGGGTTATATAATTGGGAGTTGGGGGACCTTGCCTCAGGAACATATTGTGCATAAAATCAAAGATTGCTTTCGCAAACTTCCCGTGAATAGACCCATTGATTGGAAGGTTTGTCAACGCATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCAGCCCCTTTTACTCAATGTGGTTATCCTGCTCTCATGCCCTTGTATGCCTGTATTACCGCTAAGCAGGCTTTTGTTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCTGTCAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCAGGCCTTTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCGATTGGCCATCAGCGCATGCGCGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCCTGTTTCGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGGACGTTATCGGCACTGACAACTCCGTTGTCCTTTCTCGGAAGTACACCTCCTTCCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCCTCTCGTGGTCGCTTGGGGCTCTGCCGCCCTCTTCTCCGCCTACCGTTCCGGCCGACGACGGGTCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGCCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGCCCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCCTTGGAACTTGCCAACAACCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTTTCGCCCCGGTCAACGACCTGGATTGAGGAATACATCAAAGACTGTGTATTTAAGGACTGGGAGGAGTCGGGGGAGGAGTTGAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTTTTGTTCATGTCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCATTTTTGCCTTCTGACTTCTTCCCGTCTGTCCGGGACCTACTCGACACCGCTTCAGCCCTCTACCGAGATGCCTTAGAATCACCCGAACATTGCACCCCCAACCACACTGCTCTCAGGCAAGCTATTTTGTGCTGGGGTGAGTTGATGACCTTGGCTTCCTGGGTGGGCAATAATTTAGAGGATCCTGCAGCAAGAGATCTAGTAGTTAATTATGTCAATACTAACATGGGTCTAAAAATTAGACAATTATTATGGTTTCACATTTCCTGCCTTACATTTGGAAGAGAAACTGTGCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATCCGCACTCCACCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACAACGAGGCAGGGCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCACCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTACCGGTCTTTACTCCTCTACTGTACCTGTTTTCAATCCTGACTGGTTAACTCCTTCTTTTCCTGACATTCACTTGCATCAAGATCTGATACAAAAATGTGAACAATTTGTAGGCCCACTCACTACAAATGAAAGGAGACGATTGAAACTAATTATGCCAGCTAGGTTTTATCCCAAAGTTACTAAATACTTCCCTTTGGATAAAGGTATTAAGCCTTACTATCCAGAGAATGTGGTTAATCATTACTTTAAAACTAGACATTATTTACATACTTTGTGGAAGGCAGGAATTCTATATAAGAGAGAATCCACACATAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCCTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGCACCTCTCTCAACGGCGAGAAGGGGCATGGGACAGAATCTTTCTGTGCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCAGACCACCAGTTGGATVCACTATTCAGAGCAAATTCCAGCAGTCCCGATTGGGACTTCAACACAAACAAGGACAATTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTGGGAGGCTTCGGTCCAGGGTTCACACCCCCACACGGTGGCCTTCTGGGGTGGAGCCCTCAGGCACAGGGCATTCTGACAACCTCGCCACCAGATCCACCTCCTGCTTCCACCAATCGGAGGTCAGGAAGAAAGCCAACCCCAGTCTCTCCACCTCTAAGGGACACACATCCACAGGCCATGCAGTGG

SEQ ID NO：35：

載體pTREHBV-HAe的核苷酸序列(5，980nt)

載體：pTRE2(Clontech)

nt 356-452：HBV nt 1805-1902，具有A1816缺失

nt 453-491：HA標(biāo)簽插入，含側(cè)翼序列

nt 462-488：HA標(biāo)簽序列

nt 492-3761：HBV nt 1903-3182/1-1990

SEQ ID NO:36：

編碼HBV包膜蛋白表面大蛋白(L)的核苷酸序列

ATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA

SEQ ID NO：37：

編碼HBV包膜蛋白表面中等蛋白(M)的核苷酸序列

ATGCAGTGGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTITGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA

SEQ ID NO：38：

編碼HBV包膜蛋白表面小蛋白(S)的核苷酸序列

ATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA

SEQ ID NO：39：

表達(dá)載體pcHA-HBe的核苷酸序列(6，682nt)

載體：pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)

nt 929-1015：HBVnt 1816-1902

nt 1016-1054：插入

nt 1025-1051：HA標(biāo)簽序列

nt 1055-21 12：HBV1903-2605/1573-1926

SEQ ID NO:40：

標(biāo)簽N末端的氨基酸序列

VDI

SEQ ID NO:41：

包含5’和3’額外核苷酸的編碼HA標(biāo)簽核苷酸序列。加下劃線的核苷酸顯示編碼HA標(biāo)簽的序列。

GTGGACATCTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTGGC

SEQ ID NO:42：

包含N末端和C末端額外氨基酸的HA標(biāo)簽的氨基酸序列。加下劃線的氨基酸殘基顯示HA標(biāo)簽的序列。

VDIYPYDVPDYAG

如本文中討論的額外參考文獻(xiàn)

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本文中提到的全部參考文獻(xiàn)通過引用的方式完整并入?，F(xiàn)在已經(jīng)充分描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以在寬大和等同的條件、參數(shù)等范圍內(nèi)實(shí)施本發(fā)明而不影響本發(fā)明或其任何實(shí)施方案的精神或范圍。

根據(jù)上文并且還如所附權(quán)利要求中所闡述，本發(fā)明尤其涉及以下項(xiàng)：

1.一種用于評估候選分子抑制嗜肝DNA病毒共價(jià)閉合環(huán)狀(ccc)DNA的能力的方法，包括步驟

(a)使包含核酸分子的細(xì)胞與所述候選分子接觸，所述核酸分子包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；

(b)評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且

(c)當(dāng)加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平與對照相比降低時(shí)選擇候選分子。

2.項(xiàng)1的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝炎病毒(HBV))并且其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

3.項(xiàng)1或2的方法，其中所述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原僅含有一個(gè)標(biāo)簽。

4.項(xiàng)3的方法，其中所述標(biāo)簽由6至22個(gè)氨基酸組成。

5.項(xiàng)3或4的方法，其中所述標(biāo)簽選自血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和C9標(biāo)簽。

6.項(xiàng)5的方法，其中所述Flag標(biāo)簽是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

7.項(xiàng)1或2的方法，其中所述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原含有兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽。

8.項(xiàng)7的方法，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是不同的標(biāo)簽。

9.項(xiàng)7或8的方法，其中所述標(biāo)簽由6至22個(gè)氨基酸組成。

10.根據(jù)項(xiàng)7至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是以下兩者或更多者：血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和/或C9標(biāo)簽。

11.項(xiàng)10的方法，其中所述Flag標(biāo)簽是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

12.項(xiàng)5或10的方法，

其中編碼HA標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:1中顯示；其中編碼His標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:2中顯示；其中編碼c-myc標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:4中顯示；其中編碼V5標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:5中顯示；和/或其中編碼C9標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:6中顯示。

13.項(xiàng)6或11的方法，其中編碼1×Flag標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:3中顯示；或其中編碼3×Flag標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:7中顯示。

14.項(xiàng)5或10的方法，

其中HA標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中顯示；

其中His標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中顯示；其中c-myc標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中顯示；

其中V5標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中顯示；和/或

其中C9標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中顯示。

15.項(xiàng)6或11的方法，

其中1×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中顯示；或

其中3×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中顯示。

16.根據(jù)項(xiàng)2至15中任一項(xiàng)的方法，其中編碼HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:16中顯示。

17.根據(jù)項(xiàng)2至15中任一項(xiàng)的方法，其中HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:18中顯示。

18.根據(jù)項(xiàng)1至17中任一項(xiàng)的方法，其中核酸分子包含編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。

19.項(xiàng)18的方法，其中編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:15中顯示。

20.項(xiàng)18的方法，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中顯示。

21.根據(jù)項(xiàng)1至17中任一項(xiàng)的方法，其中核酸分子包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列，其中所述序列在編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信號(hào)肽和接頭的核酸序列的3'下游。

22.項(xiàng)21的方法，其中所述編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列在編碼乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29個(gè)氨基酸的核酸序列的3'下游。

23.根據(jù)項(xiàng)1至22中任一項(xiàng)的方法，其中核酸分子包含嗜肝DNA病毒基因組。

24.項(xiàng)23的方法，其中所述嗜肝DNA病毒基因組是乙型肝炎病毒(HBV)基因組。

25.項(xiàng)24的方法，其中所述HBV基因組是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因組。

26.項(xiàng)24的方法，其中所述HBV基因組是HBV基因型D的基因組。

27.項(xiàng)26的方法，其中所述HBV基因型D的基因組是HBV亞基因型ayw的基因組。

28.根據(jù)項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法1至27，其中編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸在編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸的5’上游。

29.項(xiàng)28的方法，其中嗜肝DNA病毒核心蛋白是HBV核心蛋白。

30.項(xiàng)29的方法，其中編碼HBV核心蛋白的核酸在SEQ ID NO:23中顯示。

31.項(xiàng)29的方法，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中顯示。

32.根據(jù)項(xiàng)1至31中任一項(xiàng)的方法，其中將包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)。

33.項(xiàng)32的方法，其中嗜肝DNA病毒基因組是HBV基因組。

34.項(xiàng)33的方法，其中如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的核酸序列在SEQ ID NO:25中顯示。

35.根據(jù)1至34項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中將包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖。

36.項(xiàng)35的方法，其中嗜肝DNA病毒基因組是HBV基因組。

37.根據(jù)項(xiàng)1至36中任一項(xiàng)的方法，其中將包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子插入與HBV基因組的位置C1902和位置A1903相對應(yīng)的核苷酸之間。

38.根據(jù)項(xiàng)1至37中任一項(xiàng)的方法，其中核酸分子在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的5’包含能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列。

39.項(xiàng)38的方法，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列能夠與對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至A1854的核苷酸形成堿基對。

40.項(xiàng)38或39的方法，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列由至多9個(gè)核苷酸組成。

41.項(xiàng)40的方法，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列組成，或其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列編碼如SEQ ID NO:40中所顯示的多肽。

42.根據(jù)項(xiàng)1至41中任一項(xiàng)的方法，其中核酸分子在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的3’包含編碼接頭的序列。

43.項(xiàng)42的方法，其中所述接頭由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。

44.項(xiàng)42的方法，其中所述接頭僅由一個(gè)氨基酸殘基組成。

45.項(xiàng)44的方法，其中所述氨基酸是甘氨酸殘基。

46.根據(jù)項(xiàng)42至44中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼接頭的序列由序列GGC組成；或其中所述序列編碼甘氨酸殘基。

47.根據(jù)項(xiàng)1至46中任一項(xiàng)的方法，其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列，或

其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含編碼如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。

48.根據(jù)項(xiàng)1至47中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽符合可讀框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原。

49.項(xiàng)48的方法，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

50.根據(jù)項(xiàng)2至49中任一項(xiàng)的方法，其中編碼加標(biāo)簽的HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:20中顯示。

51.根據(jù)項(xiàng)2至50中任一項(xiàng)的方法，其中加標(biāo)簽的HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:22中顯示。

52.根據(jù)項(xiàng)2至51中任一項(xiàng)的方法，其中編碼加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中顯示。

53.根據(jù)項(xiàng)2至52中任一項(xiàng)的方法，其中加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中顯示。

54.根據(jù)項(xiàng)24至53中任一項(xiàng)的方法，其中HBV基因組的核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34的任一項(xiàng)中顯示。

55.根據(jù)項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法23至54，其中核酸轉(zhuǎn)錄成前基因組(pg)嗜肝DNA病毒RNA、尤其前基因組(pg)HBV RNA。

56.根據(jù)項(xiàng)1至55中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。

57.項(xiàng)56的方法，其中所述核酸不含有在編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG。

58.項(xiàng)56或57的方法，其中在編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG已經(jīng)由核酸TG替換。

59.根據(jù)項(xiàng)56至58中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸已經(jīng)通過點(diǎn)突變被修飾以阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。

60.根據(jù)項(xiàng)1至59中任一項(xiàng)的方法，其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含于載體中。

61.項(xiàng)60的方法，其中載體包含如SEQ ID NO:35中所顯示的序列。

62.根據(jù)項(xiàng)1至61中任一項(xiàng)的方法，其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。

63.項(xiàng)56至62中任一項(xiàng)所述的方法，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

64.項(xiàng)62或63的方法，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、抗生素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、銅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或除草劑誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

65.根據(jù)項(xiàng)62至64中任一項(xiàng)的方法，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子或tet-EF-1α啟動(dòng)子。

66.根據(jù)項(xiàng)23至65中任一項(xiàng)的方法，其中將一個(gè)或多個(gè)終止密碼子引入一種或多種嗜肝DNA病毒包膜蛋白的編碼區(qū)。

67.項(xiàng)66的方法，其中所述一種或多種嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一種或多種HBV包膜蛋白。

68.項(xiàng)67的方法，其中一種或多種HBV包膜蛋白是表面大蛋白(L)、表面中等蛋白(M)和表面小蛋白(S)的一者或多者。

69.項(xiàng)67的方法，其中HBV包膜蛋白是表面小蛋白(S)。

70.根據(jù)67至69項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中一種或多種HBV包膜蛋白的編碼區(qū)在SEQ ID NO:36(L)、SEQ ID NO:37(M)和/或SEQ ID NO:38(S)中顯示。

71.項(xiàng)70的方法，其中將SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)突變成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表達(dá)。

72.根據(jù)項(xiàng)1至71中任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞。

73.項(xiàng)72的方法，其中真核細(xì)胞是肝細(xì)胞來源的。

74.項(xiàng)72或73的方法，其中真核細(xì)胞是肝瘤細(xì)胞或衍生自肝瘤細(xì)胞。

75.根據(jù)項(xiàng)72至74中任一項(xiàng)的方法，其中真核細(xì)胞是HepG2(ATCC#HB-8065)。

76.根據(jù)項(xiàng)1至75中任一項(xiàng)的方法，其中核酸分子或包含前者的載體穩(wěn)定整合在細(xì)胞的基因組中。

77.根據(jù)項(xiàng)1至76中任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟(a)還包括步驟(aa)，所述步驟(aa)包括在以下條件培養(yǎng)包含核酸分子的細(xì)胞，所述核酸分子包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述條件允許

(i)合成嗜肝DNA病毒前基因組(pg)RNA；

(ii)逆轉(zhuǎn)錄所述合成的pgRNA成為負(fù)鏈DNA；

(iii)合成第二正鏈DNA，從而所述負(fù)鏈DNA和所述正鏈DNA形成雙鏈松弛型環(huán)狀DNA；

(iv)從所述松弛型環(huán)狀雙鏈DNA形成cccDNA；

(v)任選地恢復(fù)允許翻譯加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的條件；

(vi)轉(zhuǎn)錄編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；

(vii)翻譯加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。

78.項(xiàng)77的方法，其中恢復(fù)允許翻譯加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的條件是恢復(fù)起始密碼子。

79.根據(jù)項(xiàng)1至78中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于評估候選分子抑制嗜肝DNA病毒ccc DNA形成的能力。

80.項(xiàng)79的方法，其中細(xì)胞在cccDNA已經(jīng)形成之前與候選分子接觸。

81.根據(jù)項(xiàng)1至78中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于評估候選分子減少嗜肝DNA病毒ccc DNA的量或數(shù)目的能力。

82.根據(jù)項(xiàng)1至78中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于評估候選分子減少嗜肝DNA病毒ccc DNA轉(zhuǎn)錄的能力。

83.項(xiàng)81或82的方法，其中細(xì)胞在cccDNA已經(jīng)形成之后與候選分子接觸。

84.根據(jù)項(xiàng)1至83中任一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)步驟(b)評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平通過ELISA、CLIA或AlphaLISA進(jìn)行。

85.根據(jù)項(xiàng)1至84中任一項(xiàng)的方法，其中根據(jù)步驟(b)評估加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的水平包括使用特異性識(shí)別所述嗜肝DNA病毒e抗原的抗體和特異性識(shí)別一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的一種或多種抗體。

86.根據(jù)項(xiàng)77至85中任一項(xiàng)的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝炎病毒(HBV))并且其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

87.核酸分子，包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。

88.項(xiàng)87的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

89.項(xiàng)87或88的核酸分子，其中所述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原僅含有一個(gè)標(biāo)簽。

90.項(xiàng)89的核酸分子，其中所述標(biāo)簽由6至22個(gè)氨基酸組成。

91.項(xiàng)89或90的核酸分子，其中所述標(biāo)簽選自血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和C9標(biāo)簽。

92.項(xiàng)91的核酸分子，其中所述Flag標(biāo)簽是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

93.項(xiàng)87或88的核酸分子，其中所述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原含有兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽。

94.項(xiàng)93的核酸分子，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是不同的標(biāo)簽。

95.項(xiàng)93或94的核酸分子，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的整個(gè)長度是14至31個(gè)氨基酸。

96.項(xiàng)93至95中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是以下兩者或更多者：血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和/或C9標(biāo)簽。

97.項(xiàng)96的核酸分子，其中所述Flag標(biāo)簽是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

98.項(xiàng)91或96中任一項(xiàng)的核酸分子，

其中編碼HA標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:1中顯示；其中編碼His標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:2中顯示；其中編碼c-myc標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:4中顯示；其中編碼V5標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:5中顯示；和/或其中編碼C9標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:6中顯示。

99.項(xiàng)92或97的核酸分子，

其中編碼1×Flag標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:3中顯示；或

其中編碼3×Flag標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:7中顯示。

100.項(xiàng)91或96的核酸分子，

其中HA標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中顯示；

其中His標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中顯示；

其中c-myc標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中顯示；

其中V5標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中顯示；和/或

其中C9標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中顯示。

101.項(xiàng)92或97的核酸分子，

其中1×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中顯示；或

其中3×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中顯示。

102.項(xiàng)88至101中任一項(xiàng)的核酸分子，其中編碼HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:16中顯示。

103.項(xiàng)88至101中任一項(xiàng)的核酸分子，其中HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:18中顯示。

104.項(xiàng)87至103中任一項(xiàng)的核酸分子，其中核酸分子包含編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。

105.項(xiàng)104的核酸分子，其中編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:15中顯示。

106.項(xiàng)104的核酸分子，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中顯示。

107.項(xiàng)87至106中任一項(xiàng)的核酸分子，其中核酸分子包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列，其中所述序列在編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信號(hào)肽和接頭(“前核心蛋白”區(qū)域)的核酸序列的3'下游。

108.項(xiàng)107的方法，其中所述編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸序列在編碼乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29個(gè)氨基酸的核酸序列的3’下游。

109.項(xiàng)87至108中任一項(xiàng)的核酸分子，其中核酸分子包含嗜肝DNA病毒基因組。

110.項(xiàng)109的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因組是乙型肝炎病毒(HBV)基因組。

111.項(xiàng)110的核酸分子，其中所述HBV基因組是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因組。

112.項(xiàng)110的核酸分子，其中所述HBV基因組是HBV基因型D的基因組。

113.項(xiàng)112的核酸分子，其中所述HBV基因型D的基因組是HBV亞基因型ayw的基因組。

114.項(xiàng)87至113中任一項(xiàng)的核酸分子，其中編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的核酸在編碼嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸的5’上游。

115.項(xiàng)114的核酸分子，其中核酸序列編碼HBV核心蛋白。

116.項(xiàng)115的核酸分子，其中編碼HBV核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:23中顯示。

117.項(xiàng)114的核酸分子，其中核心蛋白是HBV核心蛋白。

118.項(xiàng)116的核酸分子，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中顯示。

119.項(xiàng)87至118中任一項(xiàng)的核酸分子，其中將包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)。

120.項(xiàng)119的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因組是HBV基因組。

121.項(xiàng)120的核酸分子，其中如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的核酸序列在SEQ ID NO:25中顯示。

122.項(xiàng)87至121中任一項(xiàng)的核酸分子，其中將包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖。

123.項(xiàng)122的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因組是HBV基因組。

124.項(xiàng)87至123中任一項(xiàng)的核酸分子，其中將包含編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的核酸分子插入與HBV基因組的位置C1902和A1903相對應(yīng)的核苷酸之間。

125.項(xiàng)87至124中任一項(xiàng)的核酸分子，其中核酸分子在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的5’包含能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列。

126.項(xiàng)125的核酸分子，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列能夠與對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至A1854的核苷酸形成堿基對。

127.項(xiàng)125或126的核酸分子，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列由至多9個(gè)核苷酸組成。

128.項(xiàng)127的核酸分子，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列組成，或其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的序列編碼如SEQ ID NO:40中所顯示的多肽。

129.項(xiàng)87至128中任一項(xiàng)的核酸分子，其中核酸分子在編碼一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的序列的3’包含編碼接頭的序列。

130.項(xiàng)129的核酸分子，其中所述接頭由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。131.項(xiàng)129的核酸分子，其中所述接頭僅由一個(gè)氨基酸殘基組成。

132.項(xiàng)131的核酸分子，其中所述氨基酸是甘氨酸殘基。

133.項(xiàng)129至131中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述編碼接頭的序列由序列GGC組成；或其中所述序列編碼甘氨酸殘基。

134.項(xiàng)87至133中任一項(xiàng)的核酸分子，其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列，或

其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含編碼如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。

135.項(xiàng)87至134中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽符合可讀框地融合于嗜肝DNA病毒e抗原中。

136.項(xiàng)135的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

137.項(xiàng)88至136中任一項(xiàng)的核酸分子，其中編碼加標(biāo)簽的HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:20中顯示。

138.項(xiàng)88至137中任一項(xiàng)的核酸分子，其中加標(biāo)簽的HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:22中顯示。

139.項(xiàng)88至138中任一項(xiàng)的核酸分子，其中編碼加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中顯示。

140.項(xiàng)88至139中任一項(xiàng)的核酸分子，其中加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中顯示。

141.項(xiàng)110至140中任一項(xiàng)的核酸分子，其中HBV基因組的核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34的任一項(xiàng)中顯示。

142.項(xiàng)109至141中任一項(xiàng)的核酸分子，其中核酸轉(zhuǎn)錄成前基因組(pg)嗜肝DNA病毒RNA。

143.項(xiàng)142的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒RNA是HBV RNA。

144.項(xiàng)87至143中任一項(xiàng)的核酸分子，其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含于載體中。

145.項(xiàng)144的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

146.項(xiàng)87至145中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述核酸允許加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。

147.項(xiàng)146的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

148.項(xiàng)147的核酸分子，其中核酸包含于包含如SEQ ID NO:39中所顯示的序列的載體中。

149.項(xiàng)87至148中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述核酸阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。

150.項(xiàng)149的核酸分子，其中所述核酸不含有在編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG。

151.項(xiàng)147或150的核酸分子，其中在編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密碼子ATG已經(jīng)由核酸TG替換。

152.項(xiàng)147至151中任一項(xiàng)的核酸分子，其中所述核酸已經(jīng)通過點(diǎn)突變被修飾以阻止加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的翻譯。

153.項(xiàng)144、145和149至152中任一項(xiàng)的核酸分子，其中載體包含如SEQ ID NO:35中所顯示的序列。

154.項(xiàng)87至153中任一項(xiàng)的核酸分子，其中包含編碼加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。

155.項(xiàng)149至154中任一項(xiàng)的核酸分子，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

156.項(xiàng)154或155的核酸分子，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、抗生素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、銅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，或除草劑誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

157.項(xiàng)154至156中任一項(xiàng)的核酸分子，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子或tet-EF-1α啟動(dòng)子。

158.項(xiàng)110至157中任一項(xiàng)的核酸分子，其中將一個(gè)或多個(gè)終止密碼子引入一種或多種嗜肝DNA病毒包膜蛋白的編碼區(qū)。

159.項(xiàng)158的核酸分子，其中所述一種或多種嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一種或多種HBV包膜蛋白。

160.項(xiàng)159的核酸分子，其中一種或多種HBV包膜蛋白是以下一者或多者：L、M和/或S。

161.項(xiàng)159的核酸分子，其中HBV包膜蛋白是S。

162.項(xiàng)159至161中任一項(xiàng)的核酸分子，其中一種或多種HBV包膜蛋白的編碼區(qū)在SEQ ID NO:36(L)、37(M)或38(S)中顯示。

163.項(xiàng)162的核酸分子，其中將SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)突變成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表達(dá)。

164.蛋白質(zhì)，如項(xiàng)87至163中任一項(xiàng)中所限定的核酸分子編碼。

165.蛋白質(zhì)，包含加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原。

166.項(xiàng)165的蛋白質(zhì)，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

167.項(xiàng)166的蛋白質(zhì)，其中乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)包含如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。

168.項(xiàng)165至167中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原僅含有一個(gè)標(biāo)簽。

169.項(xiàng)168的蛋白質(zhì)，其中所述標(biāo)簽由6至22個(gè)氨基酸組成。

170.項(xiàng)165至169中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述標(biāo)簽選自血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和C9標(biāo)簽。

171.項(xiàng)170的蛋白質(zhì)，其中所述Flag標(biāo)簽是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

172.項(xiàng)165至167中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原含有兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽。

173.項(xiàng)172的蛋白質(zhì)，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是不同的標(biāo)簽。

174.項(xiàng)172或173的蛋白質(zhì)，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽的整個(gè)長度是14至31個(gè)氨基酸。

175.項(xiàng)172至174中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)標(biāo)簽是以下兩者或更多者：血凝素(HA)標(biāo)簽、His標(biāo)簽、Flag標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽、V5標(biāo)簽和/或C9標(biāo)簽。

176.項(xiàng)175的蛋白質(zhì)，其中所述Flag標(biāo)簽是1×Flag標(biāo)簽或3×Flag標(biāo)簽。

177.項(xiàng)170或175的蛋白質(zhì)，

其中編碼HA標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:1中顯示；其中編碼His標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:2中顯示；其中編碼c-myc標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:4中顯示；其中編碼V5標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:5中顯示；和/或其中編碼C9標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:6中顯示。

178.項(xiàng)171或176的蛋白質(zhì)，

其中編碼1×Flag標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:3中顯示；或

其中編碼3×Flag標(biāo)簽的核酸序列在SEQ ID NO:7中顯示。

179.項(xiàng)170或175的蛋白質(zhì)，

其中HA標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中顯示；

其中His標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中顯示；

其中c-myc標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中顯示；

其中V5標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中顯示；和/或

其中C9標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中顯示。

180.項(xiàng)171或176的蛋白質(zhì)，

其中1×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中顯示；或

其中3×Flag標(biāo)簽的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中顯示。

181.項(xiàng)165至180中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，包含嗜肝DNA病毒前核心蛋白。

182.項(xiàng)181的蛋白質(zhì)，其中編碼嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:15中顯示。

183.項(xiàng)181的蛋白質(zhì)，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中顯示。

184.項(xiàng)165至183中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒前核心蛋白的信號(hào)肽和接頭的氨基酸序列序列的C末端。

185.項(xiàng)184的蛋白質(zhì)，其中所述包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序的蛋白質(zhì)在乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29個(gè)氨基酸的氨基酸序列的C末端。

186.項(xiàng)165至183中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒核心蛋白的氨基酸序列的N末端。

187.項(xiàng)186的蛋白質(zhì)，其中嗜肝DNA病毒核心蛋白是HBV核心蛋白。

188.項(xiàng)187的蛋白質(zhì)，其中編碼HBV核心蛋白的核酸在SEQ ID NO:23中顯示。

189.項(xiàng)187的蛋白質(zhì)，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中顯示。

190.項(xiàng)165至189中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列插入如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)編碼的氨基酸序列。

191.項(xiàng)190的蛋白質(zhì)，其中嗜肝DNA病毒基因組是HBV基因組。

192.項(xiàng)191的蛋白質(zhì)，其中如HBV基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的核酸序列在SEQ ID NO:25中顯示。

193.項(xiàng)165至192中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列插入如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖編碼的氨基酸序列。

194.項(xiàng)193的蛋白質(zhì)，其中嗜肝DNA病毒基因組是HBV基因組。

195.項(xiàng)165至194中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中將一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列插入與HBV前核心蛋白(如SEQ ID NO:17中所顯示的一種)的位置G29和位置M30相對應(yīng)的氨基酸殘之間。

196.項(xiàng)165至195中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，還在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列的N末端包含至多3個(gè)氨基酸的氨基酸序列，其中所述至多3個(gè)氨基酸的氨基酸序列由能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基配對的核酸序列編碼。

197.項(xiàng)196的蛋白質(zhì)，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的核酸序列能夠與對應(yīng)于HBV基因組位置T1849至A1854的核苷酸形成堿基對。

198.項(xiàng)198的蛋白質(zhì)，其中能夠與如嗜肝DNA病毒基因組編碼的ε結(jié)構(gòu)的下部莖形成堿基對的核酸序列由SEQ ID NO:26中所示的序列組成。

199.項(xiàng)196至198中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述至多3個(gè)氨基酸的氨基酸序列在SEQ ID NO:40中顯示。

200.項(xiàng)165至199中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，還在一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的氨基酸序列的C末端包含接頭。

201.項(xiàng)200的蛋白質(zhì)，其中所述接頭由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基組成。202.項(xiàng)201的蛋白質(zhì)，其中所述接頭僅由一個(gè)氨基酸殘基組成。

203.項(xiàng)202的蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸是甘氨酸殘基。

204.項(xiàng)1至46中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列編碼的氨基酸序列；或

其中加標(biāo)簽的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。

205.項(xiàng)165至204中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中所述一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽符合可讀框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原。

206.項(xiàng)205的蛋白質(zhì)，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。

207.項(xiàng)166至206中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中編碼加標(biāo)簽的HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:20中顯示。

208.項(xiàng)166至207中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中加標(biāo)簽的HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:22中顯示。

209.項(xiàng)166至208中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中編碼加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中顯示。

210.項(xiàng)166至209中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)，其中加標(biāo)簽的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中顯示。

211.宿主細(xì)胞，包含項(xiàng)87至163中任一項(xiàng)的核酸分子或項(xiàng)164至210中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)。

212.項(xiàng)211的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞。

213.項(xiàng)212的宿主細(xì)胞，其中真核細(xì)胞是肝細(xì)胞來源的。

214.項(xiàng)212或213的宿主細(xì)胞，其中真核細(xì)胞是肝瘤細(xì)胞或衍生自肝瘤細(xì)胞。

215.項(xiàng)212至214中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其中真核細(xì)胞是HepG2(ATCC#HB-8065)。

216.用于產(chǎn)生如項(xiàng)164至210中任一項(xiàng)所限定的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在允許蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)項(xiàng)210至215中任一項(xiàng)的宿主并且從培養(yǎng)物回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。

217.試劑盒，用于項(xiàng)1至86中任一項(xiàng)的方法中。

218.試劑盒，包含特異性識(shí)別如項(xiàng)165至167中任一項(xiàng)所限定的嗜肝DNA病毒抗原e的抗體和特異性識(shí)別如項(xiàng)168至180中任一項(xiàng)所限定的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽的一種或多種抗體。

219.項(xiàng)87至163中任一項(xiàng)的核酸分子、項(xiàng)164至210中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)和/或項(xiàng)中211至215任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞的用途，用于篩選疑似能夠抑制嗜肝DNA病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的候選分子。