本發(fā)明涉及一種診斷血液癌癥的方法。
背景技術(shù)：
：自然殺傷(nk)細胞是淋巴細胞譜系的成員且屬于固有免疫系統(tǒng)。它們顯示出天然細胞毒性并產(chǎn)生細胞因子1,2。大多數(shù)外周血中的人nk細胞是cd3-cd56暗細胞，少數(shù)顯示cd3-cd56亮表型。后一群體擅長產(chǎn)生細胞因子，而cd56暗細胞主要顯示細胞毒性活性3。與此相反，cd3-cd56亮細胞在淋巴結(jié)和扁桃體中占多數(shù)。體外證據(jù)表明cd56亮細胞是cd56暗細胞的前體，在體內(nèi)也是這種情況4。此外，cd16表達暗示nk細胞發(fā)育遵循此路徑：cd56亮cd16-→cd56亮cd16暗→cd56暗cd16暗→cd56暗cd16+。額外的標志物可以鑒定這些群體中的其他的亞類5,6。相比之下，活化nk細胞的體內(nèi)鑒定更加困難。雖然cd69長期表達是未知的，但cd69表達在nk細胞刺激后增加，并且被認為是包括人類在內(nèi)的活化的真正標志物7。在小鼠中，長期刺激后cd69的穩(wěn)定表達存在爭議：鼠cmv感染后cd69表達是瞬時的8，而il-15處理后是cd69表達是穩(wěn)定的9。nk細胞在遇到它們的靶標后被活化，所述靶標主要是主要組織相容性復(fù)合物i(mhc-i)的表達改變的細胞，上述細胞包括轉(zhuǎn)化的細胞或病毒感染的細胞(其下調(diào)mhc-i表達以逃避細胞毒性t淋巴細胞(ctl)的識別)。“喪失自我(missingself)”假說提出nk細胞基于mhc-i表達區(qū)分靶細胞與其他健康的“自身”細胞。nk細胞活化取決于由活化和抑制性受體介導(dǎo)的復(fù)雜信號機制。主要的nk細胞抑制性受體識別mhc-i(在人類中稱為hla)復(fù)合物，且包括識別hla-e的nkg2a和識別自身經(jīng)典i類分子hla-a、hla-b和hla-c的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(kir)。活化nk細胞的受體感知細胞上的應(yīng)激和/或非自身配體，即通過激活受體nkg2d來識別應(yīng)激誘導(dǎo)的配體ul16結(jié)合蛋白(ulbp)和mhci類多肽相關(guān)序列(mic)2。nk細胞識別并消除血源性癌細胞。然而，這些腫瘤細胞發(fā)現(xiàn)了不同的免疫逃避機制10,11，并且顯著數(shù)量的這類患者顯示出有限的長期存活。治療這些患者的一些選擇包括可以與免疫治療相關(guān)的新化學(xué)物質(zhì)12。最近發(fā)表了使用抗kir的首次臨床試驗，其中抗kir能阻斷kir介導(dǎo)的對nk細胞的抑制7。與可比較的急性骨髓性白血病(aml)患者群體的報道相比，其顯示出沒有毒性、總體有利且無復(fù)發(fā)存活的特點。該治療的一個令人關(guān)注的替代方法是使用同種異體nk細胞，這是因為已證明同種異體nk細胞臨床級產(chǎn)品是有效的13且造血細胞移植后nk細胞介導(dǎo)的治療似乎是安全的14-16。然而，nk細胞不是同質(zhì)群體，有保持不同生理活性的不同亞類。此外，nk細胞的不同活化模式(例如細胞因子vs靶細胞)源自不同的轉(zhuǎn)錄模式17。鑒定具有較高抗腫瘤活性的群體并選擇它們進行擴增和/或患者輸注將是令人關(guān)注的。蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)調(diào)節(jié)細胞過程，包括分化，有絲分裂周期，細胞生長和致癌轉(zhuǎn)化18。cd45是由ptprc基因編碼的ptp，其在造血細胞中特異性表達19。cd45通過與受體復(fù)合物的組分直接相互作用，或通過去磷酸化和活化各種src家族激酶(sfk)(即lck)，來調(diào)節(jié)受體信號傳導(dǎo)20。但是它可以通過抑制jak激酶21或通過使src的活化殘基去磷酸化20來抑制細胞因子受體信號傳導(dǎo)。cd45活性對于有效的免疫應(yīng)答是關(guān)鍵的，因為cd45缺陷在小鼠22-24和人25,26中均導(dǎo)致重癥綜合性免疫缺陷(scid)表型。這可以解釋這種磷酸酶的高表達及其復(fù)雜的調(diào)節(jié)。cd45表達隨細胞成熟而增加27。cd45家族包括衍生自單個復(fù)雜基因的幾個成員27。初始t淋巴細胞對于長cd45ra同種型通常是陽性的。通過cd45mrna前體進行活化誘導(dǎo)的選擇性剪切，活化和記憶t細胞表達cd45ro(最短的cd45同種型)27-30。已經(jīng)提出cd45ro表達也識別記憶nk細胞31。大多數(shù)關(guān)于cd45功能的研究已在t細胞中進行。但關(guān)于其對nk細胞的功能了解甚少，盡管通常認為cd45通過其使sfk的抑制位點去磷酸化的能力正調(diào)節(jié)這些細胞的活化，導(dǎo)致細胞因子和趨化因子產(chǎn)生。然而，在來自cd45缺陷小鼠的nk細胞中，體外細胞毒性僅輕微受損32-34。此外，與t細胞和b細胞相比，cd45缺陷型nk細胞顯示多種磷酸化蛋白的基礎(chǔ)磷酸化增加，這表明cd45使nk細胞中包括sfk的活化酪氨酸殘基的多種底物去磷酸化34。體內(nèi)研究顯示由于所有免疫受體酪氨酸活化基序(itam)依賴的nk細胞功能(包括脫粒)受損，cd45缺陷的nk細胞無法保護小鼠免受巨細胞病毒感染35。以上引用的結(jié)果大多數(shù)是從小鼠模型中獲得的，并不能反映人類概況。因此，取決于活化的類型和強度，cd45在人類nk細胞中的作用是一個開放的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種用于診斷血液癌癥的方法。具體地，本發(fā)明通過權(quán)利要求來限定。nk細胞淋巴細胞譜系在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起重要的作用。完全成熟的cd56暗cd16+群體對該功能顯示出可靠的較高細胞溶解活性，但對負責(zé)它的細胞知之甚少。淋巴細胞譜系的主要標志物之一是磷酸酶cd45，磷酸酶cd45在t淋巴細胞中以兩種主要同種型存在，其中靜息t細胞中表達大cd45ra同種型，而效應(yīng)/記憶t細胞中表達短cd45ro同種型。在本文中，發(fā)明人表明來自健康供體的nk細胞主要是cd45ra高ro-，而它們中的3％是cd45ra暗ro-，cd45ra暗ro-在hsc同種異體移植患者中豐富10倍且主要對應(yīng)于未成熟細胞。血液癌癥患者的這一群體也示出5倍增加，在他們完全成熟的nk細胞區(qū)室中也發(fā)現(xiàn)了這一群體。但是這些細胞未顯示高脫粒活性。來自這些患者的一些nk細胞獲得cd45ro表達，產(chǎn)生少數(shù)屬于cd56暗cd16暗區(qū)室的cd45ra暗ro細胞，并產(chǎn)生了大多數(shù)不丟失cd45ra表達的細胞cd45raro細胞。該群體屬于完全成熟的區(qū)室并代表了抗腫瘤nk細胞。這是基于以下事實，即cd45raro細胞：i)最近脫粒了；ii)顯示大的尺寸(fs)和粒度(ss)；iii)顯示高代謝(cd71+)；和iv)是增殖的(ki-67+)。這些細胞在人類白血病患者體內(nèi)進行了胞啃作用的事實為它們執(zhí)行抗腫瘤功能提供了明確的證據(jù)。在血液或骨髓中存在的cd45raronk細胞鑒定了血源性癌癥患者并且可以用作診斷工具。因此，本發(fā)明涉及一種用于診斷患者中的血液癌癥的方法，所述方法包括：i)檢測從所述患者獲得的樣品中cd45raronk細胞的存在，以及ii)當(dāng)在所述樣品中檢測到cd45raronk細胞存在時，推斷所述患者患有血液癌癥。如本文所使用的，術(shù)語“血液癌癥”或“血源性癌癥”具有其在本領(lǐng)域中的通常含義且是指通常起因于血細胞或骨髓細胞的癌癥。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法尤其適合于診斷選自由白血病、淋巴瘤和骨髓瘤所組成的組中的血液癌癥。在一些實施方式中，血液癌癥例如淋巴瘤是成熟(外周)b細胞腫瘤。在具體的實施方式中，成熟b細胞腫瘤選自由b細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤；b細胞幼淋巴細胞白血病；淋巴漿細胞淋巴瘤；邊緣區(qū)淋巴瘤，如脾邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤(+/-絨毛淋巴細胞)、淋巴結(jié)邊緣區(qū)淋巴瘤(+/-單核細胞b細胞)和粘膜相關(guān)淋巴組織(malt)型結(jié)外邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤；毛細胞白血病；漿細胞骨髓瘤/漿細胞瘤；濾泡型淋巴瘤、濾泡中心；套細胞淋巴瘤；彌漫性大細胞b細胞淋巴瘤(包括縱隔大b細胞淋巴瘤、血管內(nèi)大b細胞淋巴瘤和原發(fā)性滲出性淋巴瘤)；和伯基特淋巴瘤/伯基特細胞白血病所組成的組。在一些實施方式中，血液癌癥例如淋巴瘤選自由多發(fā)性骨髓瘤(mm)和非霍奇金淋巴瘤(nhl)、套細胞淋巴瘤(mcl)、濾泡型淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(wm)或b細胞淋巴瘤和彌漫性大b細胞淋巴瘤(dlbcl)所組成的組。在一些實施方式中，非霍奇金淋巴瘤(nhl)屬于侵襲性nhl或惰性nhl兩種類型之一。侵襲性nhl生長快速，并可能相對快地導(dǎo)致個體死亡?？梢栽跀?shù)月或甚至數(shù)周中來測量未經(jīng)治療的存活率。侵襲性nhl的例子包括b細胞腫瘤、彌漫性大b細胞淋巴瘤、t/nk細胞腫瘤、間變性大細胞淋巴瘤、外周t細胞淋巴瘤、前體b淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、前體t淋巴母細胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、成人t細胞淋巴瘤/白血病(htlv1+)、原發(fā)性cns淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、多形性移植后淋巴增殖性疾病(ptld)、aids相關(guān)淋巴瘤、真性組織細胞性淋巴瘤和母細胞性nk細胞淋巴瘤。最常見的侵襲性nhl類型是彌漫性大細胞淋巴瘤。惰性nhl生長緩慢，大多數(shù)個體直到疾病進展到晚期才顯示明顯的癥狀?？梢栽跀?shù)年中來測量惰性nhl個體的未治療的存活率。非限制性例子包括濾泡型淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤(例如結(jié)外邊緣區(qū)淋巴瘤(也稱為粘膜相關(guān)淋巴組織-malt淋巴瘤)、淋巴結(jié)邊緣區(qū)b細胞淋巴瘤(單核細胞b細胞淋巴瘤)、脾邊緣區(qū)淋巴瘤)，和淋巴漿細胞淋巴瘤(瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥)。在某些情況下，可發(fā)生組織學(xué)轉(zhuǎn)化，例如，個體的惰性nhl可轉(zhuǎn)化為侵襲性nhl。在一些實施方式中，血液癌癥例如白血病選自由急性淋巴細胞白血病(all)、急性骨髓性細胞白血病(aml)、慢性淋巴細胞白血病(cll)和小淋巴細胞性淋巴瘤(sll)所組成的組。急性淋巴細胞白血病也稱為急性淋巴母細胞白血病，并且在本文中可以互換使用。兩個術(shù)語都描述了起始于骨髓中的白細胞、淋巴細胞的一種類型的癌癥。在一些實施方式中，樣品是血液樣品或是骨髓樣品。如本文所使用的，術(shù)語“血液樣品”具有其本領(lǐng)域的通常含義且一般指從患者獲得的全血樣品。在一些實施方式中，血液樣品是pbmc樣品。如本文所使用的，術(shù)語“pbmc”或“外周血單核細胞”或“未分級的pbmc”是指還未富集指定亞群的完整的pbmc，即具有圓形核的白細胞群體。pbmc樣品通?？赡芤呀?jīng)過選擇步驟，以包含非粘附性pbmc(其含有t細胞、b細胞、自然殺傷(nk)細胞、nkt細胞和dc前體)。因此，根據(jù)本發(fā)明的pbmc樣品含有淋巴細胞(b細胞、t細胞、nk細胞、nkt細胞)。這些細胞通常可以使用ficoll(分離血液層的親水性多糖)從全血中提取，其中pbmc在血漿層下方形成細胞環(huán)。此外，可以使用優(yōu)先裂解紅細胞的低滲裂解緩沖液從全血中提取pbmc。這些方法是本領(lǐng)域?qū)＜乙阎?。可以通過percoll密度梯度、負消減方法或通過facs分選方法來制備nk細胞。也可以通過使用親和素-生物素系統(tǒng)的免疫吸附柱或通過接入有抗體的微珠的免疫選擇來分離這些細胞。也可以將這些不同技術(shù)的組合使用，任選地與塑料粘附方法組合。如本文所使用的，術(shù)語“骨髓樣品”具有其在本領(lǐng)域中的通常含義。術(shù)語骨髓樣品包括“骨髓抽吸物”，其指通過抽吸(包括但不限于骨髓抽吸和骨髓活檢)從骨髓腔抽出的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“nk細胞”具有其在本領(lǐng)域中的通常含義且是指自然殺傷(nk)細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過測定例如特異性表型標志物(例如cd56)的表達，和表達不同種類的細胞因子的能力或誘導(dǎo)細胞毒性的能力，來容易地鑒定nk細胞。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法包括由分離樣品(例如pbmc樣品)中的nk細胞群體組成的步驟。分離nk細胞的方法是本領(lǐng)域熟知的。通過去除非靶細胞(例如t細胞、b細胞、樹突狀細胞...)來分離nk細胞。用微珠雞尾酒和針對譜系特異性抗原的生物素綴合的抗體雞尾酒間接磁性標記非靶細胞。通過將磁性標記的非靶細胞保留在macs分離器磁場中的macs柱內(nèi)來將其去除，而未標記的nk細胞穿過柱子。可以通過流式細胞術(shù)或熒光顯微鏡來評價富集的nk細胞的純度。如本文所使用的，術(shù)語“cd45raronk細胞”是指表達cd45ra和cd45ro兩種標志物的nk細胞亞類。如本文所使用的，術(shù)語“cd45”具有其在本領(lǐng)域中的通常含義且是指由ptprc基因編碼的在造血細胞中特異性表達的蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)19。cd45通過與受體復(fù)合物的成分直接相互作用，或通過激活和去磷酸化各種src家族激酶(sfk)(即lck)來調(diào)節(jié)受體信號傳導(dǎo)20。但它可以通過抑制jak激酶或通過使src的活化殘基去磷酸化來抑制細胞因子受體的信號傳導(dǎo)20。通常可區(qū)分cd45的兩種同種型：cd45ra和cd45ro。術(shù)語“cd45ra”是其中cd45基因的外顯子4不表達的cd45同種型。術(shù)語“cd45ro”是指其中cd45基因的外顯子4、5和6不表達的cd45同種型?；颊哐簶悠分衏d45raronk細胞的存在通常在于檢測一些特異性細胞表面標志物的存在和/或缺失。用于檢測細胞表面(例如nk細胞表面)的特異性表面標志物表達的標準方法是本領(lǐng)域眾所周知的。通常由檢測cd45raronk細胞的存在組成的步驟包括使用：適合于將nk細胞與其他細胞區(qū)分開的一組結(jié)合配偶體，以及包括特異性針對cd45ra的至少一種差異性結(jié)合配偶體和特異性針對cd45ro的至少一種差異性結(jié)合配偶體的一組結(jié)合配偶體。如本文所使用的，術(shù)語“特異性針對表面標志物的結(jié)合配偶體”是指任何能夠以高親和力結(jié)合所述表面標志物(例如cd4ra或cd45ro)的分子(天然的或非天然的)。所述結(jié)合配偶體包括但不限于抗體、適體(aptamer)和肽。結(jié)合配偶體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體(例如kitmiltenycd45ra&cd45ro抗體)。在一些實施方式中，結(jié)合配偶體可以是一組適體。本發(fā)明的多克隆抗體或其片段可以根據(jù)已知方法，通過向選自例如豬、牛、馬、兔、山羊、綿羊和小鼠等的宿主動物施用適當(dāng)?shù)目乖虮砦粊懋a(chǎn)生。可用本領(lǐng)域已知的各種佐劑來提高抗體產(chǎn)量。盡管可用于實施本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，但優(yōu)選單克隆抗體?？赏ㄟ^培養(yǎng)連續(xù)細胞系，使用提供產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)，來制備和分離本發(fā)明的單克隆抗體或其片段。用于制備和分離的技術(shù)包括但不限于最初的雜交瘤技術(shù)；人類b細胞雜交瘤技術(shù)；以及ebv-雜交瘤技術(shù)。在一些實施方式中，結(jié)合配偶體可以是適體。適體是就分子識別而言代表抗體替代物的一類分子。適體是具有以高親和力和特異性識別幾乎任何類別的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。這樣的配體可以通過采用隨機序列文庫的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(selex)來分離。隨機序列文庫可通過dna或rna的組合化學(xué)合成獲得。在該文庫中，每個分子均是具有獨特序列的最終經(jīng)化學(xué)修飾的線性寡聚體。肽適體由通過平臺蛋白(例如大腸桿菌的硫氧還蛋白a)展示的構(gòu)象約束的抗體可變區(qū)組成，這些構(gòu)象約束的抗體可變區(qū)通過兩種雜交方法選自組合文庫。本發(fā)明的結(jié)合配偶體(例如抗體或適體)通常標記有可檢測的分子或物質(zhì)，例如優(yōu)選熒光分子或放射性分子或本領(lǐng)域已知的任何其它標記。本領(lǐng)域中已知標記通常(直接或間接地)提供信號。如本文所使用的，對于抗體或適體，術(shù)語“經(jīng)標記的”旨在包括通過使可檢測的物質(zhì)例如熒光團[例如異硫氰酸熒光素(fitc)或藻紅蛋白(pe)或吲哚菁(cy5)]或放射性試劑與抗體或適體偶聯(lián)(即物理地連接)來直接標記抗體或適體，以及通過與可檢測物質(zhì)的反應(yīng)來間接標記探針或抗體。本發(fā)明的抗體或適體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法用放射性分子進行標記。例如，放射性分子包括但不限于用于閃爍法研究的放射性原子，例如i123、i124、in111、re186、re188。在一些實施方式中，抗體已經(jīng)綴合至熒光團(例如fitc綴合的抗體和/或pe綴合的抗體)。上述測定通常包括結(jié)合配偶體(即抗體或適體)與固體支持物的結(jié)合。固體表面可以是包被有結(jié)合配偶體的微量滴定板。在孵育nk細胞樣品后，可以用針對共同nk細胞標志物的抗體檢測與結(jié)合配偶體特異性結(jié)合的nk細胞。或者，固體表面可以是珠子，例如活化珠、磁響應(yīng)珠。珠子可以由不同的材料制成，包括但不限于玻璃、塑料、聚苯乙烯和丙烯酸。此外，珠子優(yōu)選是經(jīng)熒光標記的。在優(yōu)選的實施方式中，熒光珠是被容納在可從bectondickinsonbiosciences(圣何塞,加利福尼亞)購買的trucount(tm)管中的那些珠子。根據(jù)本發(fā)明，用于檢測cd45raronk細胞的優(yōu)選方法是流式細胞術(shù)方法。所述方法是本領(lǐng)域公知的。例如，因此可以使用熒光激活細胞分選(facs)。通常使用如下文實施例中所描述的facs方法。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法還包括檢測所述cd45raronk細胞上至少一種表型標志物的存在的步驟，其中該至少一種表型標志物的存在表明血液癌癥的性質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明的方法包括檢測1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種表型標志物的步驟。在一些實施方式中，所述表型標志物是cd分子，所述cd分子選自由cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、cd1e、cd2、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd4、cd5、cd6、cd7、cd8α、cd8β、cd9、cd10、cd11a、cd11b、cd11c、cdw12、cd13、cd14、cd15u、cd16a、cd16b、cdw17、cd18、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd24、cd25、cd26、cd27、cd28、cd29、cd30、cd31、cd32、cd33、cd34、cd35、cd36、cd37、cd38、cd39、cd40、cd41、cd42a、cd42b、cd42c、cd42d、cd43、cd44、cd44r、cd46、cd47r、cd48、cd49a、cd49b、cd49c、cd49d、cd49e、cd49f、cd50、cd51、cd52、cd53、cd54、cd55、cd56、cd57、cd58、cd59、cd60a、cd60b、cd60c、cd61、cd62e、cd62l、cd62p、cd63、cd64、cd65、cd65s、cd66a、cd66b、cd66c、cd66d、cd66e、cd66f、cd68、cd69、cd70、cd71、cd72、cd73、cd74、cd75、cd75s、cd77、cd79a、cd79b、cd80、cd81、cd82、cd83、cd84、cd85、cd86、cd87、cd88、cd89、cd90、cd91、cd92、cdw93、cd94、cd95、cd96、cd97、cd98、cd99、cd100、cd101、cd102、cd103、cd104、cd105、cd106、cd107a、cd107b、cd108、cd109、cd110、cd111、cd112、cdw113、cd114、cd115、cd116、cd117、cd118、cdw119、cd120a、cd120b、cd121a、cdw121b、cd122、cd123、cd124、cdw125、cd126、cd127、cdw128a、cdw128b、cd129、cd130、cd131、cd132、cd133、cd134、cd135、cdw136、cdw137、cd138、cd139、cd140a、cd140b、cd141、cd142、cd143、cd144、cdw145、cd146、cd147、cd148、cdw149、cd150、cd151、cd152、cd153、cd154、cd155、cd156a、cd156b、cdw156c、cd157、cd158、cd159a、cd159c、cd160、cd161、cd162、cd162r、cd163、cd164、cd165、cd166、cd167a、cd168、cd169、cd170、cd171、cd172a、cd172b、cd172g、cd173、cd174、cd175、cd175s、cd176、cd177、cd178、cd179a、cd179b、cd180、cd181、cd182、cd183、cd184、cd185、cdw186、cd191、cd192、cd193、cd195、cd196、cd197、cdw198、cdw199、cdw197、cd200、cd201、cd202b、cd203c、cd204、cd205、cd206、cd207、cd208、cd209、cdw210、cd212、cd213a1、cd213a2、cdw217、cdw218a、cdw218b、cd220、cd221、cd222、cd223、cd224、cd225、cd226、cd227、cd228、cd229、cd230、cd231、cd232、cd233、cd234、cd235a、cd235b、cd235ab、cd236、cd236r、cd238、cd239、cd240ce、cd240d、cd240dce、cd241、cd242、cd243、cd244、cd245、cd246、cd247、cd248、cd249、cd252、cd253、cd254、cd256、cd257、cd258、cd261、cd262、cd263、cd264、cd265、cd266、cd267、cd268、cd269、cd271、cd272、cd273、cd274、cd275、cd276、cd277、cd278、cd279、cd280、cd281、cd282、cd283、cd284、cd289、cd292、cdw293、cd294、cd295、cd296、cd297、cd298、cd299、cd300a、cd300c、cd300e、cd301、cd302、cd303、cd304、cd305、cd306、cd307、cd309、cd312、cd314、cd315、cd316、cd317、cd318、cd319、cd320、cd321、cd322、cd324、cdw325、cd326、cdw327、cdw328、cdw329、cd331、cd332、cd333、cd334、cd335、cd336、cd337、cdw338、和cd339所組成的組。選自由cd5、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd24、cd79a、cd103、pax-5、κ、λ、cd200、細胞質(zhì)κ或細胞質(zhì)λ所組成的組中的至少一種表型標志物的存在通常表明血液癌癥源自于b細胞。例如，表a顯示了源自于b細胞的血液癌癥的典型表型標志物。表a：源自于b細胞的血液癌癥(cllb細胞慢性淋巴細胞白血病；b-plb細胞幼淋巴細胞白血??；mcl套細胞淋巴瘤；mzlb邊緣區(qū)淋巴瘤b細胞淋巴瘤；smzlb脾邊緣區(qū)b-細胞淋巴瘤；fl濾泡型淋巴瘤)的典型表型標志物cd19cd5cd23cd20cd22cd10cd11ccd25cd103cll++++++b-pl+++mcl++++mzlb++++smzlb++++fl++++選自由cd1、cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、tcrα-β、tcrγ-δ,和cd3所組成的組中的至少一種表型標志物的存在通常表明血液癌癥起源于t細胞。選自由cd11b、cd13，cd14(mo2)、cd14(my4)、cd15、cd33、cd41、cd61、cd64、cd117、cd235a和髓過氧化物酶所組成的組中的至少一種表型標志物的存在通常表明血液癌癥起源于骨髓細胞。通常根據(jù)與檢測cd45ra和cd45ro同樣的方法來檢測表型標志物。因此，一組結(jié)合配偶體可用于確定表型標志物的存在，優(yōu)選使用熒光激活細胞分選(facs)。一旦患者被診斷為患有血液癌癥，醫(yī)生就可以選擇將最準確的治療施用于患者。治療通常包括化學(xué)療法、放射療法和免疫療法。因此，本發(fā)明還涉及一種用于在有需要的主體中治療血液癌癥的方法，所述方法包括以下步驟：(i)根據(jù)本發(fā)明的方法來進行所述方法以鑒定患有血液癌癥的主體，(ii)用化療劑、靶向癌癥療法、免疫治療劑或放射治療劑治療所述患有血液癌癥的主體。在一些實施方式中，患者一旦診斷為患有血液癌癥則施用化療劑。術(shù)語“化療劑”是指有效抑制腫瘤生長的化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎缌蛱孢吆铜h(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽/酯，例如白消安、右苯丙胺和哌泊硫磺；氮丙啶，例如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙烯亞胺和甲基化三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亞乙基三胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲蜜胺；番荔素(特別是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜樹堿(carnptothecin)(包括合成類似物托泊替康)；苔蘚抑素；卡利他汀(callystatin)；cc-1065(包括它的阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；自念珠藻環(huán)肽(cryptophycin)(特別是自念珠藻環(huán)肽1和自念珠藻環(huán)肽8)；多拉司他汀；多卡霉素(包括合成類似物，kw-2189和cbi-tmi)；電穿孔素；泛曲霉素；珊瑚類二萜(sarcodictyin)；海綿抑制素；氮芥例如苯丁酸氮芥、氯萘噠嗪、環(huán)磷酰胺、雌氮芥(estrarnustine)、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、鹽酸甲氧氮芥、美法侖、諾啡比林、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲洛磷胺、尿嘧啶芥子；亞硝脲如卡莫司汀、氯唑菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司?。豢股乩缦┒部股?例如卡里奇霉素，特別是卡里奇霉素11和卡里奇霉素211，參見例如agnewchemintl.ed.engl.33:183-186(1994)；達內(nèi)霉素(dynemicin)包括達內(nèi)霉素a；埃斯波霉素；以及新制癌菌素發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二抗生素發(fā)色團)、阿克拉希霉素、放線菌素、阿托霉素、重氮絲氨酸、博萊霉素、放線菌素c(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅霉索(canninomycin)、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地多柔比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(包括嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯烷-多柔比星和脫氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊達比星、馬賽洛霉素、絲裂霉素、麥考酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培羅霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、桿菌霉素、鏈霉素、鏈佐星、結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物例如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-fu；雄激素如卡魯斯特、丙酸色丙酸托烷酯、表薄甾烷醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑如糠酸；乙酰葡醛酯；醒磷酰胺糖苷(aldophospharnideglycoside)；氨基乙酰丙酸；安吖啶；貝塔布辛；比生群；依達曲沙；地磷酰胺；去甲膽堿；二嗪酮；埃洛磷；乙酸橢圓梨酯；埃坡霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；美登木素生物堿如美登素和安莎霉素；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹達莫；硝唑蘭；戊糖他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基芐肼；拉佐生；根霉素；西佐呋喃；有機鍺化合物(spirogennanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯毒素(特別是t-2毒素、鞣花素a、咯里啶a和蛇形菌素)；氨基甲酸乙酯；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司??；絲溴酮(mitobromtol)；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉烷類，例如紫杉醇(bristol-myerssquibboncology,普林斯頓,n.].)和多烯紫杉醇(rhone-poulencrorer,antony,法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(vp-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素c；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本；諾安托；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；塞羅達；伊班膦酸鹽/酯；cpt-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；視黃酸；卡培他濱；以及任何上述藥物可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包括用于調(diào)節(jié)或抑制腫瘤上的激素作用的抗激素劑，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、三氧嘧啶、酮替芬、ly117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述藥物在藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實施方式中，一旦患者被診斷為患有血液癌癥則施用靶向癌癥療法。靶向癌癥療法是通過干擾參與癌癥生長、進展和擴散的特定分子(“分子靶標”)來阻斷癌癥的生長和擴散的藥物或其他物質(zhì)。靶向癌癥療法有時被稱為“分子靶向藥物”、“分子靶向療法”、“精確藥物”或類似名稱。在一些實施方式中，靶向療法由向患者施用酪氨酸激酶抑制劑組成。術(shù)語“酪氨酸激酶抑制劑”是指作為受體和/或非受體酪氨酸激酶的選擇性或非選擇性抑制劑的多種治療劑或藥物的任一種。酪氨酸激酶抑制劑和相關(guān)化合物是本領(lǐng)域公知的并且描述于美國專利公開2007/0254295中，其通過以引用的方式整體并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，酪氨酸激酶抑制劑相關(guān)的化合物將重演酪氨酸激酶抑制劑的作用，例如相關(guān)化合物將作用于酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)通路上的不同成員，以產(chǎn)生與酪氨酸激酶的酪氨酸激酶抑制劑相同的效果。適用于本發(fā)明實施方式的方法的酪氨酸激酶抑制劑和相關(guān)化合物的例子包括但不限于達沙替尼(bms-354825)、pp2、bez235、沙拉卡尼、吉非替尼(iressa)、舒尼替尼(sutent；su11248)、埃羅替尼(tarceva；osi-1774)、拉帕替尼(gw572016；gw2016)、卡那替尼(ci1033)、塞瑪辛尼(semaxinib)(su5416)、瓦他拉尼(ptk787/zk222584)、索拉非尼(bayer43-9006)、伊馬替尼(glleevec；sti571)、來氟米特(su101)、凡德他尼(zactima；zd6474)、mk-2206(8-[4-氨基環(huán)丁基)苯基]-9-苯基-1,2,4-三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2h)-酮鹽酸鹽)，它們的衍生物，它們的類似物，及它們的組合。適用于本發(fā)明的其它酪氨酸激酶抑制劑和相關(guān)化合物描述于例如美國專利公開2007/0254295、美國專利no.5,618,829、5,639,757、5,728,868、5,804,396、6,100,254、6,127,374、6,245,759、6,306,874、6,313,138、6,316,444、6,329,380、6,344,459、6,420,382、6,479,512、6,498,165、6,544,988、6,562,818、6,586,423、6,586,424、6,740,665、6,794,393、6,875,767、6,927,293和6,958,340中，所有這些全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。在某些實施方式中，酪氨酸激酶抑制劑是小分子激酶抑制劑，已口服給藥，并且經(jīng)過了至少一個i期臨床試驗，更優(yōu)選至少一個ii期臨床試驗，甚至更優(yōu)選至少一個iii期臨床試驗且最優(yōu)選由fda批準用于至少一種血液學(xué)或腫瘤學(xué)適應(yīng)癥。這樣的抑制劑的例子包括但不限于吉非替尼、埃羅替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、bms-599626(ac-480)、來那替尼、krn-633、cep-11981、伊馬替尼、尼羅替尼、達沙替尼、azm-475271、cp-724714、tak-165、舒尼替尼、瓦他拉尼、cp-547632、凡德他尼、博舒替尼、來他替尼、坦度替尼、米哚妥林、恩扎妥林、aee-788、帕唑帕尼、阿西替尼、莫塔塞尼、osi-930、西地尼布、krn-951、多韋替尼、賽麗西麗(seliciclib)、sns-032、pd-0332991、mkc-i(ro-317453；r-440)、索拉非尼、abt-869、布立尼布(bms-582664)、su-14813、替拉替尼、su-6668、(tsu-68)、l-21649、mln-8054、aew-541和pd-0325901。在一些實施方式中，患者一旦被診斷為患有血液癌癥則施用免疫治療劑。如本文所使用的，術(shù)語“免疫治療劑”是指間接或直接增強、刺激或增加機體針對癌細胞的免疫應(yīng)答和/或減少其它抗癌療法的副作用的化合物、組合物或治療。因此，免疫療法是直接或間接刺激或增強免疫系統(tǒng)對癌細胞的應(yīng)答，和/或減輕可能由其它抗癌劑引起的副作用的療法。免疫療法在本領(lǐng)域中也稱為免疫學(xué)治療、生物學(xué)治療、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑治療和生物治療。本領(lǐng)域已知的常見免疫治療劑的例子包括但不限于細胞因子、癌癥疫苗、單克隆抗體和非細胞因子佐劑?；蛘?，免疫療法的治療可以由向患者施用一定量的免疫細胞(t細胞、nk細胞、樹突狀細胞、b細胞……)組成。免疫治療劑可以是非特異性的，即通常增強免疫系統(tǒng)以使得人體能更有效地對抗癌細胞的生長和/或擴散，或者它們可以是特異性的，即靶向癌細胞本身，免疫治療方案可以將非特異性和特異性免疫治療劑組合使用。非特異性免疫治療劑是刺激或間接改善免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。非特異性免疫治療劑已經(jīng)單獨用作治療癌癥的主要療法，以及除主要療法之外的情況下，非特異性免疫治療劑用作佐劑以增強其它治法的有效性(例如癌癥疫苗)。在后一種情況下，非特異性免疫治療劑還可以起到減小其它療法的副作用(例如由某些化療劑誘導(dǎo)的骨髓抑制)的效果。非特異性免疫治療劑可以作用于關(guān)鍵的免疫系統(tǒng)細胞并引起次級應(yīng)答，例如細胞因子和免疫球蛋白產(chǎn)量的增加。或者，非特異性免疫治療劑本身可包含細胞因子。非特異性免疫治療劑通常分類為細胞因子或非細胞因子佐劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多細胞因子可用于癌癥治療中，作為設(shè)計用于加強免疫系統(tǒng)的普通非特異性免疫療法，或者作為與其它療法一起提供的佐劑。合適的細胞因子包括但不限于干擾素、白細胞介素和集落刺激因子。本發(fā)明考慮的干擾素(ifn)包括常見的ifn類型，ifn-α、ifn-β和ifn-γ。ifn可以直接作用于癌細胞，例如通過減緩它們的生長，促進它們發(fā)展成具有更正常表現(xiàn)的細胞，和/或增加它們的抗原產(chǎn)量從而使得癌細胞更容易被免疫系統(tǒng)識別和破壞。ifn還可以間接作用于癌細胞，例如通過減緩血管生成，增強免疫系統(tǒng)和/或刺激自然殺傷(nk)細胞、t細胞和巨噬細胞。重組ifn-α可作為roferon(rochepharmaceuticals)和introna(scheringcorporation)商購獲得。本發(fā)明考慮的白細胞介素包括il-2、il-4、il-11和il-12。市售的重組白細胞介素的實例包括(il-2；chironcorporation)和(il-12；wyethpharmaceuticals)。zymogenetics有限公司(西雅圖,wash.)目前正在測試重組形式的il-21，其也被考慮用于本發(fā)明的組合中。本發(fā)明考慮的集落刺激因子(csf)包括粒細胞集落刺激因子(g-csf或非格司亭)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf或沙格司亭)和促紅細胞生成素(阿法依泊汀、達比波廷)。用一種或多種生長因子治療可以幫助在接受傳統(tǒng)化療的患者中刺激產(chǎn)生新的血細胞。因此，用csf治療可有助于減少與化療相關(guān)的副作用，并允許使用更高劑量的化療劑。各種重組集落刺激因子可商購獲得，例如(g-csf；amgen)，neulasta(培非格司亭；amgen)，leukine(gm-csf；berlex)，procrit(促紅細胞生成素；orthobiotech)，epogen(促紅細胞生成素；amgen)，arnesp(促紅細胞生成素)。除了具有特異性或非特異性靶標之外，免疫治療劑可以是主動的(即刺激身體自身的免疫應(yīng)答)，或者它們可以是被動的(即包含在身體外部產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)組分)。被動特異性免疫治療通常涉及使用特異性針對在癌細胞表面上發(fā)現(xiàn)的特定抗原或特異性針對特定細胞生長因子的一種或多種單克隆抗體。單克隆抗體可以多種方式用于癌癥治療，例如，增強主體對特定類型癌癥的免疫應(yīng)答，通過靶向特異性細胞生長因子(例如參與血管生成的那些細胞生長因子)，或者在連接或綴合于諸如化療劑、放射性粒子或毒素的試劑情況下，通過增強其它抗癌劑遞送至癌細胞能力，來干擾癌細胞的生長。目前用作癌癥免疫治療劑的適合包括在本發(fā)明組合中的單克隆抗體包括但不限于，利妥昔單抗曲妥珠單抗替伊莫單抗托西莫單抗西妥昔單抗(c-225,)、貝伐單抗吉妥單抗阿侖珠單抗和bl22。其它例子包括抗ctla4抗體(例如伊匹單抗)、抗pd1抗體、抗pdl1抗體、抗timp3抗體、抗lag3抗體、抗b7h3抗體、抗b7h4抗體或抗b7h6抗體。在一些實施方式中，抗體包括b細胞清除抗體。典型的b細胞清除抗體包括但不限于抗cd20單克隆抗體[例如利妥昔單抗(roche)、替伊莫單抗(bayerschering)、托西莫單抗(glaxosmithkline)、ame-133v(appliedmolecularevolution)、奧克雷珠單抗(roche)、奧法木單抗(humax-cd20,gemnab)、tru-015(trubion)和immu-106(immunomedics)]、抗cd22抗體[例如依帕珠單抗，leonardetal.,clinicalcancerresearch(z004)10:53z7-5334]、抗cd79a抗體、抗cd27抗體或抗cd19抗體(例如美國專利號7,109,304)、抗baff-r抗體(例如貝利木單抗，glaxosmithkline)、抗april抗體(例如抗人april抗體，prosciinc.)和抗il-6抗體[例如此前由debenedettietal.,jimmunol(2001)166:4334-4340和suzukietal.,europjofimmunol(1992)22(8)1989-1993描述的，在此通過以引用的方式整體并入本文]。免疫療法的治療可以為同種異體移植，具體為用造血干細胞hsc進行同種異體移植。免疫療法治療還可能是由nicholasp.restifo,marke.dudleyandstevena.rosenberg“adoptiveimmunotherapyforcancer:harnessingthetcellresponse,naturereviewsimmunology,volume12,april2012描述的過繼性免疫療法。在過繼性免疫療法中，分離患者循環(huán)的淋巴細胞、nk細胞，在體外擴增并重新施用予患者。活化的淋巴細胞或nk細胞最優(yōu)選是先前從血液或腫瘤樣品中分離并在體外活化(或“擴增”)的患者自身的細胞。在一些實施方式中，患者一旦被診斷為患有血液癌癥則施用放射治療劑。如本文所使用的，術(shù)語“放射治療劑”是指但不限于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的有效治療或改善癌癥的任何放射治療劑。例如，放射治療劑可以是諸如在近距離放射治療或放射性核素治療中施用的那些治療劑。這樣的方法可以任選地進一步包括施用一種或多種額外的癌癥療法，例如但不限于化學(xué)療法和/或另一種放射療法。本發(fā)明的又一方面涉及用于監(jiān)測患有血液癌癥的患者的治療有效性的方法，所述方法包括i)檢測來自所述患者的血液樣品中的cd45raronk細胞的存在，以及ii)當(dāng)在血液樣品中未檢測到cd45raronk細胞的存在時，推斷所述患者的治療是有效的。通常對患者施用上述的治療。將通過以下附圖和實施例進一步對本發(fā)明進行說明。然而，這些實施例和附圖不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。附圖說明圖1.血液惡性腫瘤患者和健康供體具有不同的nk細胞亞類譜。a)對來自健康供體和多發(fā)性骨髓瘤(mm)患者的血液樣品(bs)的pbmc或來自mm患者的骨髓(bms)的pbmc進行染色。小圖中示出了表達不同cd45同種型的nk細胞的百分比。b)源自mm患者血液樣品的不同nk細胞亞類(基于cd45同種型的表達)的fs和ss值以及成熟情況(cd56/cd16表達)。c)健康供體和血液癌癥患者中的這些nk細胞群體的百分比。誤差棒顯示每種醫(yī)療狀況的至少四個不同個體的平均值±sd。hd，健康供體；mm，多發(fā)性骨髓瘤；b-cll，b細胞慢性淋巴細胞白血??；bcl，b細胞淋巴瘤；aml，急性骨髓性白血??；bs，血液樣品；bms，骨髓樣品。d)在nk成熟的不同階段(cd56/16表達)的cd45ra、cd45raro、cd45ra暗和cd45ra暗ro細胞的百分比。每個點表示一個供體。同樣顯示了平均值±sd。圖2.cmv+患者和血液癌癥患者具有不同的nk細胞亞類譜。a)純化來自腎移植后cmv感染再活化(cmv+)或未再出現(xiàn)cmv感染(cmv陰性)患者的pbmc，并計算nk細胞的百分比。b)分析(a)中所述樣品中處于不同成熟階段(cd56/cd16)的nk細胞的豐度(以百分比計)。c)顯示了每種nk細胞亞類(cd45同種型/cd69)的百分比。在(b)和(c)中誤差棒表示每種醫(yī)療狀況的至少四個個體的平均值±sd。圖3.cd69、cd45ra和cd45ro鑒定不同的nk細胞亞類。a)純化來自健康供體(hd)和患不同血液惡性腫瘤的患者的pbmc，并計算處于nk細胞成熟(cd56/cd16)的不同階段的cd69+細胞的百分比。還描述了平均值±sd。b)顯示了來自健康供體(hd)和患不同血液惡性腫瘤的患者的pbmc中表達或不表達cd45ra、cd45ro和cd69的nk細胞的百分比。誤差棒表示每種醫(yī)療狀況的至少四個個體的平均值±sd。c～d)顯示來自患不同血源性癌癥的患者的血液樣品(bs)或骨髓樣品(bms)的nk細胞中cd45ro或cd45ra對cd69表達的代表圖。沒有獲得用于分析的健康供體的骨髓樣品。圖4.cd45ro鑒定不同的nk細胞群體。純化來自健康供體(hd)和患不同血液惡性腫瘤的患者的pbmc。a)每百萬個nk細胞中每種nk細胞亞類(cd45/cd69表達)中cd107a+細胞數(shù)量。誤差棒表示每種醫(yī)療狀況的至少四個個體的平均值±sd。b)六種不同亞類(cd45/cd69)中cd107a+nk細胞的百分比。c)上部的圖片，分離自mm患者(用于比較也顯示，相應(yīng)血液樣品bs中的百分比)或aml患者的骨髓樣品(bms)的不同nk細胞亞類中的cd107a+細胞的百分比。底部的圖片，暴露于靶k562腫瘤細胞后，不同nk細胞亞類中cd107a+細胞的百分比(體外細胞毒性試驗描述于圖7中)。d～e)來自健康供體(hd)和b細胞慢性淋巴細胞性白血病(b-cll)或b細胞淋巴瘤(bcl)患者的血液樣品的六種不同nk細胞亞類(cd45/cd69)中，表達cd71或ki-67的nk細胞的百分比。誤差棒表示每種醫(yī)療狀況的至少四個個體的平均值±sd。圖5.cd45raro細胞對腫瘤細胞進行了胞啃。純化來自bcl(a)或aml(b)患者的pbmc并用不同的抗體染色。在該實驗中，nk細胞群體對應(yīng)于cd56+nkp46+細胞。圖中描述了每種nk細胞亞類中關(guān)于cd45ra/ro的細胞的百分比。圖6.血液惡性腫瘤患者和健康供體具有不同的nk細胞亞類譜。a)用抗cd19(b細胞)抗體、抗cd3(t細胞，cd3+cd56-)抗體和抗cd56(nk細胞，cd56+cd3-)抗體，對健康供體和多發(fā)性骨髓瘤(mm)患者的血液樣品(bs)中或mm患者的骨髓樣品(bms)中或其他血液學(xué)疾病患者的樣品中的pbmc進行染色以用于facs分析，從而鑒定不同的淋巴細胞群體，并且還用抗cd16抗體來染色從而鑒定處于不同成熟階段的nk細胞亞類，以及用抗cd45ra抗體和抗cd45ro抗體來染色。表達不同cd45同種型的nk細胞的百分比顯示在小圖中。b)在健康供體和血液癌癥患者中基于cd45ra和ro表達的不同nk細胞群體的百分比。所述群體對應(yīng)于圖1a中的象限：左上(cd45ra)、左下(cd45ra暗)，右上(cd45raro)和右下(cd45ra暗ro)。誤差棒顯示了每種醫(yī)學(xué)狀況平均值±sd，與健康供體血液(左圖)或骨髓(右圖)樣品相比的學(xué)生t檢驗：*p<0.01；**p<0.001；***p<0.0001。hd，健康供體；mm，多發(fā)性骨髓瘤；b-cll，b細胞慢性淋巴細胞白血??；bcl，b細胞淋巴瘤；aml，急性骨髓性白血?。籦s，血液樣品；bms，骨髓樣品。圖7.cd45raronk細胞的功能表征。a)源自mm患者血液樣品的不同nk細胞亞類(基于cd45同種型的表達)的fs和ss數(shù)值。b～c)在代表性bcl患者中，不同的nk細胞亞類中cd71和ki67的表達。d～e)顯示來自不同血源性癌癥患者的血液樣品(bs)或骨髓樣品(bms)的nk細胞中cd45ro或cd45ra對cd69表達的代表圖。圖8.cd45raro鑒定脫粒的nk細胞。純化來自健康供體(hd)和患不同血液惡性腫瘤的患者的pbmc。a)每百萬個nk細胞中每種nk細胞亞類(cd45ra/ro表達)中的cd107a+細胞數(shù)量。誤差棒表示每種醫(yī)療狀況的平均值±sd；與健康供體樣品相比的學(xué)生t檢驗。b)四種不同亞類中cd107a+nk細胞的百分比。c)上部的圖片，分離自mm患者(用于比較，也顯示了相應(yīng)血液樣品bs中的百分比)或aml患者的骨髓樣品(bms)的不同nk細胞亞類中的cd107a+細胞的百分比。底部的圖片，暴露于靶k562腫瘤細胞后，不同nk細胞亞類中cd107a+細胞的百分比(在體外細胞毒性試驗中)。將pbmc與靶k562腫瘤細胞以效應(yīng)子：靶標10:1的比例孵育4小時。附加圖1.血源性癌癥患者中nk細胞亞類被調(diào)節(jié)。用針對cd45ra、cd45ro、cd56和cd16的抗體對來自不同血液惡性腫瘤患者的pbmc進行染色，并如圖3所示進行分析。圖中示出表達不同cd45同種型的nk細胞的百分比。b-cll，b細胞慢性淋巴細胞白血??；bcl，b細胞淋巴瘤；aml，急性骨髓性白血??；bs，血液樣品；bms，骨髓樣品。附加圖2.cd45ra暗細胞在體外活化后獲得cd69表達。將從血液樣品分離的pbmc與靶k562腫瘤細胞以效應(yīng)子：靶標10:1的比例孵育4小時。在體外細胞毒性測定結(jié)束時(之后)或測定前(之前)，用針對cd45ra和cd69的抗體對離體pbmc進行標記。顯示了每種nk細胞亞類中的細胞百分比(基于cd45ra和cd69表達)；來自患b細胞慢性淋巴細胞性白血病(b-cll)或b細胞淋巴瘤(bcl)的兩個患者的代表性數(shù)據(jù)。附加圖3.cd45raro細胞對b-cll患者的腫瘤細胞進行了胞啃。純化來自b-cll患者的pbmc并用不同的抗體進行染色。在該實驗中，nk細胞群對應(yīng)于cd56+nkp46+細胞。圖中描述了每種nk細胞亞類中關(guān)于cd45ra/ro的細胞的百分比。具體實施方式材料與方法細胞培養(yǎng)將k562細胞系(attcccl243)在具有10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培養(yǎng)基(glutamaxtm培養(yǎng)基)中保持對數(shù)生長。細胞用含5％co2的空氣于37℃下在濕潤室中培養(yǎng)，并每周以1:10傳代兩次。在獲得知情同意后，從具有不同血液疾病的患者和健康供體獲得骨髓和外周血樣品。通過ficoll-hypaque(sigma)密度梯度離心純化細胞。將原代細胞在37℃和5％co2的條件下于濕潤氣氛中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)是在補充有10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基(glutamaxtm培養(yǎng)基)中進行。外周血單核細胞(pbmc)純化使用histopaque-1077(sigma)回收pbmc。簡言之，將3ml～6ml在rpmi中以1:2稀釋的血液或以1:3稀釋的骨髓樣品添加到5mlhistopaque的頂部。將細胞在20℃下1600rpm不間斷地離心30分鐘。從中間白色環(huán)收集單核細胞。在rpmi中洗滌后，將細胞懸浮于補充有10％fbs(invitrogen)的完全rpmi培養(yǎng)基中?；颊?健康供體的選擇在患者知情同意后，在法國蒙彼利埃chu的腫瘤學(xué)和臨床血液部門收集來自不同血液癌癥患者的數(shù)據(jù)和樣品?；颊邊⒓恿擞伞澳系刂泻１Ｗo協(xié)會i(comitésdeprotectiondespersonnessudméditerranéei)(ref1324)”和id-rcb:2011-a00924-37批準的兩個獨立的臨床計劃。細胞表面標志物的多色染色用7aad(beckman)將pbmc染色以鑒定活細胞，并為了細胞表型分型用針對表面標志物的以下抗cd25-fitc抗體、抗cd45ro-fitc抗體、抗cd69-pe抗體、抗cd138-pe抗體、抗cd62l-pe抗體、抗cd19-pe抗體、抗cd3-pe抗體、抗cd19-ecd抗體、抗cd38-ecd抗體、抗cd56-pecy7抗體、抗cd56-apc抗體、抗cd3-apc抗體、抗cd45-apcalexafluor750抗體、抗cd45ra-apcalexafluor750抗體、抗cd16-pacificblue抗體、抗cd57-pacificblue抗體、抗cd45-kromeorange抗體、抗cd16-kromeorange(beckman)抗體、抗cd158b-fitc抗體、抗cd158a-pe抗體、抗cd107a-hv500抗體、抗ki-67-v450抗體(bdbiosciences)和抗cd71-apc抗體(immunotools)抗體進行染色。簡言之，將1×106個細胞與不同的抗體在pbs/2％fbs中于37℃下孵育30分鐘。然后洗滌細胞并懸浮于200μl～250μlpbs/2％fbs中并使用gallios流式細胞儀(beckman)和kaluza軟件對染色進行分析。使用fsc/ssc和7aad染色對存活的淋巴細胞進行篩選。b淋巴細胞(cd19+)、t淋巴細胞(cd3+cd56-)和nk細胞(cd56+cd3-)是基于cd19、cd3或cd56的表達來區(qū)分的。然后基于cd45ra和cd45ro表達：cd45ra+ro-(cd45ra)、cd45ra+ro+(cd45raro)、cd45ra暗ro-(cd45ra暗)、cd45ra暗ro+(cd45ra暗ro)，將nk細胞分為四個不同的群體。然后分析這些不同群體的cd16、cd69、cd62l、cd57和cd107a的表達和細胞尺寸/粒度(fsc/ssc)。體外cd107a脫粒試驗在pbmc純化和nk細胞定量后，將300萬個細胞于37℃下與k562靶細胞(效應(yīng)子(nk細胞):靶標的比率為1:10)在500μl終體積(具有10％fbs和10u/mlil2的rpmiglutamax)中孵育4小時。培養(yǎng)基還含有1.5μl抗cd107a抗體(bdbiosciences,franklinlakes,nj)和1μl用于防止cd107a降解的莫能菌素(bdgolgi-stopbdbiosciences)。然后，將細胞重懸于含有抗cd45ro-fitc抗體、抗cd69-pe抗體、抗cd19-ecd抗體、抗7aad抗體、抗cd56-pecy7抗體、抗cd3-apc抗體、抗cd45ra-apcalexafluor750抗體、抗cd107a-hv500抗體和抗cd16-ko抗體(bdbiosciences,beckman)的50μl抗體雞尾酒中。在一些實驗中，還在暴露于靶細胞之前將pbmc與抗cd69抗體和抗cd45ra抗體一起孵育。在beckmancoulterfacsgallios流式細胞儀上使用kaluza軟件分析樣品。最初在前向角散射和側(cè)向角散射(ssc)上對事件進行篩選以鑒定淋巴細胞。使用cd56相對cd3的雙變量圖獲得至少10000個nk細胞。細胞表面和細胞內(nèi)標志物的多色染色在純化了pbmc后，通過與10％正常人血清在室溫下孵育15分鐘來預(yù)封閉1百萬個細胞，然后用50μl針對細胞表面標志物的panelki-67抗體雞尾酒(抗cd45ro-fitc抗體、抗cd69-pe抗體、抗cd19-ecd抗體、抗cd3-pe-cy5.5抗體、抗cd56-apc抗體、抗cd45ra-apcalexafluor750抗體、抗ki-67抗體和抗cd16-ko抗體)(bdbiosciences,beckman)進行染色。用染色緩沖液洗滌細胞兩次并在4℃下重懸浮于250μlbdcytofix/cytoperm溶液中20分鐘。將細胞在bdperm/wash溶液中洗滌兩次。接下來將細胞在50μl含有針對圖中所述細胞內(nèi)標志物的抗體雞尾酒的bdperm/wash溶液中，于4℃下在黑暗中固定/透化30分鐘。將細胞在bdperm/wash溶液中洗滌兩次，并重懸于染色緩沖液中，然后使用kaluza軟件的beckmancoulterfacsgallios流式細胞儀上進行流式細胞術(shù)分析。最初在前向角散射和側(cè)向角散射(ssc)上對事件進行門選(gate)以鑒定淋巴細胞。使用cd56相對cd3的雙變量圖獲得至少10000個nk細胞。ebv細胞培養(yǎng)：將k562細胞系(atccccl243)和類淋巴母細胞ebv細胞系plh(ihw編號：9047)在具有10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培養(yǎng)基(glutamaxtm培養(yǎng)基)中保持對數(shù)生長。細胞用含5％co2空氣于37℃下在濕潤室中培養(yǎng)，并每周以1:10傳代兩次。單個純nk細胞的鑒定用cd56+nk細胞分離試劑盒(miltenyibiotec,auburn,ca,usa)從b細胞淋巴瘤患者的pbmc中富集并純化原代cd56+nk細胞。通過流式細胞術(shù)測量的cd56+nk細胞的純度(cd56+cd3-的％)為>90％。純化的cd56+nk細胞已經(jīng)用抗cd335(nkp46)-pe進行染色，以與抗cd45ra-fitc抗體、抗cd45ro-apc抗體和抗cd19-vioblue抗體(檢測能胞啃的nk細胞)一起正式鑒定nk細胞。純化和染色的nk細胞用deparraytm系統(tǒng)(siliconbiosystems,menarini)進行了分析。這種新技術(shù)使我們能夠?qū)蝹€細胞進行檢測、枚舉和拍攝。deparraytm步驟根據(jù)制造商的說明書和文章(lianidouetal.,2013)中所述進行細胞分選實驗。簡言之，deparray盒中手動裝載14μl樣品和800μl緩沖液，純化和染色的nk細胞必須回收在其中。將盒子裝入deparray系統(tǒng)中后，系統(tǒng)將樣品自動注射到盒子的微室中，在其中細胞自發(fā)地組織成由16000個電籠組成的預(yù)編程電場，單個細胞被捕獲在這些電籠中。捕獲圖像幀和明場圖像，對于四個熒光濾光片立方體(fitc、pe、apc和dapi/hoechst/vioblue/pacificblue)每一個，該圖像幀都覆蓋微室的整個表面。捕獲的圖像被數(shù)字化處理并呈現(xiàn)在能夠由操作者對感興趣的細胞進行選擇的軟件模塊中。體外nk細胞刺激方案用高劑量的il-2(1000u/ml，ebiosciences)，或用淋巴母細胞ebv細胞系plh連同il-2(100u/ml)和il-15(5ng/ml,miltenyi)在10或20天期間內(nèi)刺激pbmc(1.106個細胞/ml)。統(tǒng)計圖中所示的所有實驗都使用來自針對每種惡性腫瘤的6個患者和相同人數(shù)的健康供體的樣品來進行。結(jié)果：cd45是成熟的人類nk細胞的標志物為了確定在人類nk細胞中cd45高表達是否與在其他淋巴細胞類型中一樣也是細胞成熟的標志物(26)，我們分析了來自pbmc的三種主要類型的人淋巴細胞(t細胞、b細胞和nk細胞)中的cd45表達。b細胞和t細胞顯示具有相當(dāng)水平的cd45表達的相對同質(zhì)的群體。cd56亮(因此相對不成熟的)nk細胞顯示較低的總cd45表達，這與cd45是淋巴細胞成熟標志物的觀點一致。大多數(shù)nk細胞和b細胞表達cd45ra，而極少表達cd45ro。相反，大部分t細胞群體表達cd45ro，而不是cd45ra。然后我們分析了總cd45表達與已知nk細胞標志物的關(guān)聯(lián)。nk細胞中cd45的表達與kircd158a和cd158b的表達以及cd16(nk細胞成熟的標志物(14,34))的表達相關(guān)。相反，cd45在cd25(細胞增殖的標志物)陽性的細胞中表達較低。與cd45陰性細胞相比，cd45陽性細胞還更頻繁地表達與nk細胞溶解活性相關(guān)的cd69(35)。這些結(jié)果表明在nk細胞中，總cd45表達主要與nk細胞成熟標志物(例如cd16和kir)的高表達以及cd56和cd25(未成熟nk細胞的標志物)的低表達相關(guān)。不同cd45同種型在體內(nèi)的表達：健康供體以前的結(jié)果表明：與t細胞相比，很少的nk細胞表達cd45ro。對來自健康供體的nk細胞中的細胞表面標志物表達的更詳細分析顯示，絕大多數(shù)nk細胞是cd45racd69-細胞，且僅有5％的nk細胞表達cd69。在具有低cd45ra表達的4％的nk細胞(cd45ra暗)中僅1％是cd69+。此外，基于cd56和cd16的表達，可以認為cd45ra+ro-(cd45ra)細胞是完全成熟的細胞，而在未成熟的群體中一致地發(fā)現(xiàn)了cd45ra暗ro-(cd45ra暗)細胞。非常少的cd45ra+ro+(cd45raro)細胞是cd56暗cd16+，而cd45ra暗ro+(cd45ra暗ro)細胞是cd56暗cd16暗。這些結(jié)果表明cd45ra和cd45ro表達與健康供體中的nk細胞成熟相關(guān)。不同cd45同種型在體內(nèi)的表達：同種異體移植的患者然后我們調(diào)查了同種異體移植患者中的nk細胞譜，在這些同種異體移植患者中nk細胞群體由供體造血干細胞重建。在這些患者中，cd45ro和/或cd45ra暗nk細胞比健康對照組中更豐富，在用兩個標志物在圖中繪制時產(chǎn)生了彗星樣形狀。與所預(yù)期的相同，基于cd56和cd16表達，來自同種異體移植患者的血液樣品中的未成熟nk細胞的數(shù)目大于健康對照組。這些cd56亮細胞是cd16-，這表明它們是從頭產(chǎn)生的nk細胞而不是在活化后獲得cd56表達的cd56暗細胞。cd56亮細胞在體內(nèi)成熟期間變?yōu)楫a(chǎn)生穿孔素的cd56暗cd62l+cd57-細胞，同時響應(yīng)細胞因子維持高ifn-γ產(chǎn)量(12,36)。然后，cd56暗cd62l-cd57+細胞顯示對細胞因子的低響應(yīng)和更高的細胞毒能力(12,37)。事實上，與cd16表達相獨立，在同種異體移植患者中cd56亮細胞的cd62l表達高于cd56暗細胞。并且cd56暗細胞中cd57表達的密度高于cd56亮細胞。此外，與健康供體相比，來自同種異體移植患者的所有nk細胞群體都富含cd45ra暗和cd45ro細胞。然而，如在健康供體中觀察到的，更成熟的nk細胞亞類中cd45ra暗細胞的百分比逐漸降低。不同cd45同種型在體內(nèi)的表達：血液惡性腫瘤的患者對先前描述的患者進行骨髓移植，作為對不同血液癌癥的治療。在所有這些患者中，cd45ro和/或cd45ra暗nk細胞比健康對照中更豐富。具體的，一些cd45ra細胞也是cd45ro+。因此，我們假設(shè)除了cd45ra表達降低的未成熟nk細胞群之外，一些nk細胞可能已被靶標腫瘤細胞活化。因此，我們調(diào)查了患不同血液惡性腫瘤的患者的nk細胞譜。如先前在健康供體中所述的，發(fā)現(xiàn)nk細胞主要是具有少量cd45ra暗細胞的成熟cd45ra細胞，尤其是在未成熟nk細胞亞類中。cd45raro細胞占所有nk細胞的約0.2％(圖1a頂部的圖片)。令人驚訝的是，來自多發(fā)性骨髓瘤(mm)患者的血液樣品含有四倍多的cd45ra暗細胞和約5％的cd45ro細胞，其通常保持cd45ra表達(圖3a中間的圖片)。由于mm的特征在于腫瘤細胞在骨髓中的積累，我們還研究了應(yīng)該與腫瘤細胞更密切接觸的骨髓nk細胞是否比循環(huán)nk細胞更具活性。但情況并不是這樣，因為cd45ra暗和cd45ro細胞在血液和骨髓樣品中百分比是相似的(圖1a，中間的圖片和下部的圖片)。此外，來自mm患者的nk細胞亞類的尺寸(fs)更大并且具有高粒度(ss)(圖1b)。這個群體主要對應(yīng)于幾乎完全屬于cd56暗cd16+亞類的cd45raro細胞(圖1a和圖1b下部的圖片)。盡管cd45ra暗ro細胞(主要是cd56暗cd16暗)的尺寸和粒度也略有增加(1b)，這些cd45raro細胞的大尺寸(fs)和粒度(ss)表明它們與其他nk亞類相比具有更高的代謝活性。與此相反，cd45ra暗細胞具有低的fs和ss值并明顯富集在未成熟區(qū)室中。在來自其他血液癌癥例如急性骨髓性白血病(aml)、b細胞慢性淋巴細胞白血病(b-cll)和b細胞淋巴瘤(bcl)的患者的血液樣品中也觀察到cd45ra暗和cd45ro群體的類似增加(附加圖1)。總之，與健康對照相比，來自血液惡性腫瘤患者的所有分析樣品中cd45ra群體減少，而cd45ra暗、cd45ra暗ro和c45raro細胞部分增加(圖1c)。最后，我們在來自血癌患者和健康供體的樣品中在四個nk細胞發(fā)育階段(基于cd56/cd16表達)對不同cd45同種型的表達進行定量(圖1d)。在健康供體中，未成熟區(qū)室含有15％的cd45ra暗細胞，而在完全成熟的nk細胞亞型中基本上不存在該群體。然而，cd45raro細胞僅發(fā)現(xiàn)于成熟的區(qū)室中。在所有血液癌癥患者(不依賴于腫瘤類型)中，cd45ra暗細胞數(shù)目在成熟nk細胞區(qū)室中的增加。cd45ra暗ro細胞在未成熟區(qū)室中增加且cd45raro細胞尤其是在最成熟的nk細胞亞類中大量增加。事實上，來自血液癌癥患者的cd56暗cd16+nk細胞亞類中的cd45ra暗和cd45raro群體的大量增加將它們與健康供體清楚地區(qū)分開并且可以用作診斷工具。不同cd45亞型在體內(nèi)的表達：cmv再活化的患者我們接下來詢問導(dǎo)致nk細胞活化的其他病癥(例如病毒感染)是否可以產(chǎn)生相似的表型。因此我們分析了腎移植后cmv感染的再活化(cmv+)或未再活化(cmv陰性)患者的pbmc樣品。cmv再活化誘導(dǎo)nk細胞總數(shù)的增加(圖2a)。此外，與cmv陰性患者相比，cmv+患者顯示與cd56亮亞類的減少相關(guān)的cd56暗cd16暗細胞的增加(圖2b)。我們不清楚這些變化的原因，但可能是由于不同的因素，如cmv誘導(dǎo)的nk細胞成熟(38)，或?qū)mv感染細胞中不同nk細胞標志物表達的影響，如之前描述的蛻膜nk細胞(39)。這些變化伴隨著cd45同種型的表達模式的微小變化，主要是表達cd69和cd45ro的cd45ra暗細胞的增加(圖2c)。這些結(jié)果表明，由病毒感染或血液癌癥活化的nk細胞中cd45同種型的表達模式不同。具體來說，cd45raro細胞主要存在于來自患有血液癌癥患者的樣品中，而它們在同種異體移植或病毒感染的患者中代表較小的部分。cd45同種型和cd69表達之間的關(guān)系cd69表達在nk細胞刺激后增加被認為是nk細胞活化(包括體內(nèi))的真正標志物(17)。在健康供體中，cd69主要由完全成熟的cd56暗cd16+細胞表達(圖3a)，而在血液惡性腫瘤患者中，在其他nk細胞亞類中也檢測到cd69+細胞(圖3a)。事實上，與健康供體相比，在這樣的患者中所有的nk亞類都觀察到cd69表達，而與其成熟程度無關(guān)(圖3b)。對患者的不同cd45群體中cd69表達的分析顯示：與健康對照相比，存在共表達cd69和cd45ro的較大量的cd45ra和cd45ra暗細胞(圖3b和圖3c)。cd45ro+細胞主要是cd69+(圖3c)；然而，反過來并不成立，這是由于大多數(shù)cd69+細胞不是cd45ro。健康供體中cd45ro+細胞數(shù)量非常少，無法對該群體進行任何有意義的分析。在健康供體中，cd45ra暗細胞主要是cd69-(圖3b和圖3d)。cd45ra暗細胞在患者中顯著增加且許多也是cd69+。然而，cd45ra表達的減少并不總是與cd69表達的獲得相關(guān)。事實上，患者的樣品尤其在cd45ra暗cd69-和cd45racd69+中富集，在cd45ra暗cd69+細胞中富集較低。由于無法獲得aml患者的血樣，我們使用骨髓(bm)樣品并獲得相似的結(jié)果(圖3c和圖3d)。來自mm患者的骨髓顯示出相似的模式。不幸的是，我們不能分析來自健康供體的骨髓樣品，因此我們不能確定地、如血液樣品中那樣推斷出血液惡性腫瘤患者和健康供體的骨髓樣品中的nk細胞是不同的。然而，來自mm患者的血液和骨髓樣品中nk細胞群體相似表明在血液中發(fā)現(xiàn)的健康供體-患者差異也存在于骨髓中?？傊?，患者在所有nk細胞亞類中均顯示出cd69表達的增加，但cd45ra中cd69+細胞的相對百分比高于cd45ra暗細胞(圖3b)。這些數(shù)據(jù)表明cd69上調(diào)與cd45ra下調(diào)和cd45ro上調(diào)一起與nk細胞活化相配。cd69+細胞主要在終末分化的cd56暗cd16+亞類(圖3a)中，而cd45ra暗細胞主要在未成熟群體(cd56亮和cd56暗cd16暗)中。這一發(fā)現(xiàn)表明cd45ra的丟失和cd69表達的獲得鑒定兩種不同的生理過程且這兩種群體可能具有不同的功能。相反，與cd45同種型的表達相比，不同nk細胞亞類中的cd69表達沒能改善對血液惡性腫瘤患者的鑒定。不同cd45同種型的表達離體鑒定不同的nk細胞功能為了鑒定不同nk細胞亞類的功能，首先我們通過用抗cd107a抗體體外染色pbmc來測試細胞脫粒(圖4a)。在健康供體中，約40×103個細胞/百萬個nk細胞為cd107a+。這些細胞中的大多數(shù)是cd45ra(要么是cd69+要么是cd69-)，少量細胞是cd45ro+。顯著地，所有cd45raro和大多數(shù)cd45ra暗ro細胞是cd107a+(圖4b)。總體而言，在cd69+中觀察到cd107a表達比在cd69-細胞中高，并且cd45ra下調(diào)與cd107a表達的獲得并不相關(guān)。來自血液癌癥患者的nk細胞顯示出cd107a+細胞的大量增加(圖4a)，尤其是在這些患者中特異性增加的cd69+和/或cd45ro+亞類中大量增加。此外，與cd69-亞類相比，cd69+亞類中cd107a+細胞的百分比更高，而cd45ra表達的減少與脫粒的增加無關(guān)(圖4b)。與健康供體一樣，cd45rarocd69+和cd45ra暗rocd69+部分(以較低的程度)主要含有已脫粒的細胞。這不僅在循環(huán)nk細胞中出現(xiàn)，因為對于來自mm和aml患者的骨髓樣品的nk細胞也獲得了相似的結(jié)果(圖4c上部的圖片)。然后，我們測試了從轉(zhuǎn)鐵蛋白到細胞的鐵遞送所需的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白1(tfr1或cd71)的表達。cd71表達在活性代謝細胞中增加，這是因為鐵是用于基本生物化學(xué)活性(如氧轉(zhuǎn)運、能量代謝和dna合成)的輔因子(40)。與cd45raro細胞的高代謝活性一致(圖4b)，cd71表達在健康對照和血液惡性腫瘤患者的cd45ro+細胞中都更高(圖4d)。此外，這些細胞中的大多數(shù)也表達增殖標志物ki-67(圖4e)。與cd69-亞類相比，cd69+中cd71和ki-67表達也適度地提高?？傊?，我們的結(jié)果表明cd45ro+細胞(尤其是在它們也表達cd45ra的情況下)獲得cd69表達，更大并具有更高的粒度和代謝(圖4d)、增殖(圖4e)和脫粒(圖4b)。這些發(fā)現(xiàn)表明cd45raro細胞，以及可能還有cd45ra暗ro細胞，是識別腫瘤細胞和脫粒的nk細胞。cd45rarocd107a+細胞主要屬于cd56暗cd16+部分，而cd45ra暗rocd107a+細胞主要是cd56暗cd16暗細胞。來自血液癌癥患者的其他nk細胞亞類在體外顯示針對k562細胞的細胞溶解活性為了研究來自血液癌癥患者的其他nk細胞亞類是否具有脫粒的內(nèi)在缺陷，我們使用k562靶細胞培養(yǎng)來自健康供體或患者的pbmc。在健康供體中，離體時已經(jīng)較高的脫粒cd45ro+細胞的數(shù)目幾乎增加到100％。cd107a+細胞的百分比尤其在cd45ra暗亞類和cd69+亞類中增加。類似地，來自血液惡性腫瘤患者的所有nk細胞群體(尤其是cd45ra暗細胞)也保留了脫粒的能力。然而，在我們的分析中，我們可能低估了脫粒的cd69-或cd45ra暗細胞的百分比，這是因為在與靶細胞孵育4小時后，cd69和/或cd45同種型的表達可能已經(jīng)改變。因此，我們首先用抗cd69和抗cd45ra抗體孵育pbmc以確定基礎(chǔ)nk細胞表型，然后我們分析暴露于k562細胞后的cd107a表達(附加圖2)。事實上，在與靶細胞接觸之前的nk細胞譜與體外觀察到的表型相似，表明這是一種有效的方法。與靶細胞在體外孵育(4小時)后，cd45ra和cd45ra暗群體中cd69+細胞的數(shù)目迅速增加(兩種亞類中均有約100％的增加)。然而，cd45ra和cd45ra暗細胞的整體百分比在此期間保持穩(wěn)定(附加圖2)。我們認識到來自健康供體的cd69-nk細胞的脫粒比圖7a中所示的高(圖7c)?；罨募毎赡芡瑫r獲得cd69和cd107a表達。這在來自血液癌癥患者的nk細胞中更加明顯，血液癌癥患者中大部分細胞在cd69-細胞初期脫粒。暴露于靶細胞后獲得cd69表達的cd45ra暗細胞主要為cd56暗cd16暗和完全成熟的cd56暗cd16+。總之，cd45ra暗細胞也可以至少通過獲得cd69和cd107a表達來響應(yīng)刺激。cd45raronk細胞在體內(nèi)進行胞啃(trogocytosis)為了研究cd45raro細胞是否在體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤活性，我們研究了這些細胞是否對腫瘤靶標進行胞啃。胞啃是一種淋巴細胞從相互作用的細胞中提取表面分子并在其自身表面上表達它們的過程，該過程已在離體b淋巴母細胞白血病(ball)中觀察到。因為在這個實驗中我們研究了其他細胞類型的標志物，我們使用雙標記來鑒定nk細胞并對cd56+nkp46+細胞進行門選。我們觀察到來自bcl患者的14％的nk細胞在其膜中表達bcl標志物cd19(圖5a)。該數(shù)值在cd45raro群體中增加至52％，而在其他群體中低得多。盡管nk細胞群體主要是cd45ra暗ro，但該群體也獲得了骨髓標志物cd14的較低水平的表達。然而，兩種標志物染色均呈陽性的nk細胞非常罕見。這表明兩個不同的nk細胞群體進行著胞啃，而cd45raro正在對腫瘤細胞進行胞啃。我們在另一種cd19+疾病b-cll中觀察到非常相似的結(jié)果(附加圖3)。為了排除nk細胞不是在所有腫瘤中都獲得cd19，我們研究了來自aml患者的nk細胞(圖5b)。約10％的nk細胞表達aml標志物cd14，且僅有3％表達所有nk細胞群中均表達的cd19。相比之下，90％的cd45raro表達cd14，這表明他們在aml患者的cd14+群體中大規(guī)模地進行胞啃?？傊覀兊臄?shù)據(jù)顯示nk細胞對腫瘤細胞進行胞啃且由cd45raro群體對此負責(zé)。因此，cd45raronk細胞的應(yīng)用可以用作鑒定血液癌癥患者(如果該群體存在)和疾病種類(在膜中表達的標志物)的診斷工具。cd45raro群體的表型表征cd45raro細胞屬于cd56+cd16+亞類且大部分表達成熟標志物cd57，盡管它們的一半共表達cd62l。cd45raro群體包含較高百分比的表達kir的細胞，盡管其僅對cd158e在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的。gzmb+細胞的百分比與其他亞類相似，但該細胞因子的細胞內(nèi)水平較低。這可能是由于生產(chǎn)的缺乏或近期的脫粒已經(jīng)清空細胞內(nèi)的存儲。cd45raro細胞與另一個成熟標志物的cd45ra相比也表達相似水平的cd161/殺傷細胞凝集素樣受體亞家族b成員1(klrb1)或天然細胞毒性受體(ncr)nkp46以及稍高水平的活化nkg2d受體。然而，他們顯示較低水平的cd94糖蛋白和可能較低水平的抑制性nk受體nkg2a?？傊琧d45raro細胞是完全成熟的nk細胞，主要表達成熟細胞的nk受體。cd45raro群體的代謝表征活化的淋巴細胞通常增大了它們的尺寸(skaketal.,2008；zarconeetal.,1987)并且變成高代謝活性細胞(sanchez-martinezetal.,2015；sanchez-martinezetal.,2014)。絲氨酸/蘇氨酸激酶mtor可能在nk細胞活化后使代謝轉(zhuǎn)變與細胞骨架組織相聯(lián)系(marcaisandwalzer,2014)。我們觀察到來自mm患者的nk細胞亞型尺寸(fs)更大，粒度(ss)高，且對應(yīng)于cd45raro細胞(圖7a)。這表明它們是與其他nk亞類相比具有更高的代謝活性的活化的細胞。因此，我們通過將nk細胞與愛潑斯坦巴爾病毒(ebv)類淋巴母細胞細胞系plh孵育來在體外活化nk細胞。為了支撐nk細胞的存活，我們添加了低濃度的兩種nk細胞活化細胞因子：il-2(100u/ml)和il-15(5ng/ml)(aneletal.,2012)。我們孵育nk細胞長達20天以反映長期活化。與以前的報道(skaketal.,2008；zarconeetal.,1987)一致，10天的活化誘導(dǎo)了尺寸(fcs)和粒度(ssc)增加，這在第20天更加相關(guān)。在體外活化3天后，nk細胞開始丟失cd45ra。然而，如果真正的cd45raro群體出現(xiàn)或細胞丟失cd45ra而獲得cd45ro，則是有問題的。在最初活化的10天后，大多數(shù)細胞是cd45ra-cd45ro+。然而，在第20天，培養(yǎng)物中出現(xiàn)了cd45raro群體。這不排除輔佐細胞的存在，因為用細胞因子的長期活化產(chǎn)生了類似的模式?？傊琧d45raronk細胞在長期活化后也在體外存活下來。接下來，我們評估了患者cd45raro群體的體外活化。細胞因子誘導(dǎo)活化三天引起了cd45同種型表達的強烈重排，且無法評估個別群體的真實性。這些結(jié)果進一步表明，cd45raro細胞至少在體外可以改變它們的cd45表型。然后，我們測定了從轉(zhuǎn)鐵蛋白到細胞的鐵遞送所需的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白1(tfr1或cd71)的表達。cd71表達在活性代謝細胞中增加，這是因為鐵是用于基本生物化學(xué)活性(如氧轉(zhuǎn)運、能量代謝和dna合成)的輔因子(wangandpantopoulos,2011)。與cd45raro細胞的高fs和ss所表明的較高代謝活性一致，健康對照和血液惡性腫瘤患者的cd45ro+細胞中的cd71表達均較高(圖7b)。此外，這些細胞中的大多數(shù)也表達增殖標志物ki-67(圖7c)?？傊?，cd45raro細胞代表處于增殖的高代謝細胞的nk亞類。cd69表達在nk細胞刺激后增加，且被認為是nk細胞活化的真正標志物(elpeketal.,2010)，包括離體情況(veyetal.,2012)?；颊咧胁煌腸d45群體中的cd69表達分析顯示cd45ro+細胞主要是cd69+(圖7d)；但反過來并不成立，這是由于大多數(shù)cd69+細胞不是cd45ro。健康供體中cd45ro+細胞數(shù)量非常少，無法對該群體進行任何有意義的分析。在健康供體中，cd45ra暗細胞主要是cd69-(圖7e)。在患者中，cd45ra暗細胞顯著增加且許多也是cd69+。然而，cd45ra表達的減少并不總與cd69表達獲得相關(guān)。事實上，患者的樣品尤其在cd45ra暗cd69-和cd45racd69+中富集，在cd45ra暗cd69+細胞中富集程度較低。這一發(fā)現(xiàn)表明cd45ra的丟失和cd69表達的獲得識別兩種不同的生理過程，且這兩種群體可能具有不同的功能。cd45raro群體的功能表征為了鑒定不同nk細胞亞類的功能，首先我們通過用抗cd107a抗體在體外對pbmc進行染色來評估細胞脫粒(圖8a)。在健康供體中，約1％的nk細胞是cd107a+。這些細胞中的大多數(shù)是cd45ra，少量是cd45ro+細胞。顯著地，大多數(shù)cd45raro和一半的cd45ra暗ro細胞是cd107a+(圖8b)。來自血液癌癥患者的nk細胞顯示cd107a+細胞大量增加(圖8a)，尤其是在這些患者中特異性增加的cd45ro+亞類中大量增加。cd45ra表達的減少與脫粒的增加無關(guān)(圖8b)。與健康供體一樣，cd45raro和較少的cd45ra暗ro部分主要含有已脫粒的細胞(圖8b)。與cd45ro-群體相比，這兩個群體的中值cd107a-mfi大大增加。這不僅是循環(huán)nk細胞的情況，因為對于來自mm和aml患者的骨髓樣品的nk細胞也獲得了相似的結(jié)果(圖8b和圖8c上部的圖片)。相比之下，cd45raro細胞顯示低gzmb含量。我們的解釋是cd45raro細胞近期在體內(nèi)進行了脫粒。在使用k562作為靶標細胞進行體外分析之后，盡管其他群體脫粒顯著增加，但cd45raro細胞繼續(xù)顯示出更高的脫粒率(圖8c底部的圖片)。令人關(guān)注的是，不同的cd45nk細胞亞類在4小時體外細胞毒性試驗后沒有改變。該結(jié)果和體外活化結(jié)果顯示cd45ra和cd45ro的表達在短時間內(nèi)是穩(wěn)定的，但是可以在長期持續(xù)活化后改變。討論：鑒定新的人類nk細胞群體對于理解其生理學(xué)和改善其在臨床中的治療用途是重要的。在這里，我們表明鑒定不同的nk細胞群體也可以提供關(guān)于主體生理狀態(tài)的有價值的信息。事實上，在成熟區(qū)室中存在的大量cd45ra暗和cd45ro+細胞可以清楚地鑒定血液惡性腫瘤患者。因此，我們假設(shè)它們的檢測可以用作血液癌癥的診斷工具，且由于這些特定的nk細胞群體會在消除靶向的腫瘤細胞時減少，因此它們還可以用于評估抗腫瘤治療的功效。在宿主免疫系統(tǒng)受損時，增強了白血病發(fā)生(41,42)。其他人和我們已經(jīng)表明在幾個小鼠模型中需要完全功能性nk細胞(43～48)來根除血源性腫瘤，并且nk細胞浸潤與幾種癌癥的良好預(yù)后相關(guān)聯(lián)(49～51)。同種異體反應(yīng)性nk細胞的使用可代表新的癌癥療法(特別是對于造血起源的腫瘤)。事實上，移植物與宿主(gvh)定向中的kir-kir配體不相容性改善了臨床中不相關(guān)的臍帶血干細胞移植(ucbt)后的結(jié)果(52,53)，其中移植物與宿主(gvh)定向主要基于nk細胞的同種異體反應(yīng)性。此外，nk細胞：i)對gvh疾病(gvhd)不負責(zé)；ii)可以作為“分化的”細胞注射，因此不需要在患者體內(nèi)長時間存活；iii)防止機會性感染(52)，這可能通過它們對b細胞和t細胞、巨噬細胞和更重要的多形核細胞的免疫調(diào)節(jié)作用來實現(xiàn)(54)。然而，體內(nèi)nk細胞活化的評估是困難的，這是因為我們?nèi)狈λ鼈冞M行分析的有效方法。通常使用的是cd69表達(6,17)；然而，我們的結(jié)果顯示cd69表達不意味著脫粒和溶細胞活性，而脫粒和溶細胞活性被認為是nk細胞抗腫瘤活性的最重要的組成部分(12)。與此相反，我們的工作表明cd45ro表達在血液惡性腫瘤患者中鑒定了脫粒的nk細胞亞類。我們認為，同樣涉及nk細胞活性的有效抗腫瘤療法(例如抗腫瘤抗原的單克隆抗體)應(yīng)該也增加了這類nk細胞群體。此外，在臨床上標準使用同種異體nk細胞之前最重要的未解決問題是移植足夠數(shù)量的顯示有效抗腫瘤活性的細胞。為此，關(guān)鍵是確定不同的nk細胞群體及其細胞溶解活性。在這里，我們證明cd45同種型的表達應(yīng)有利于這項任務(wù)且在cd45raro群體中脫粒是增強的。因此，在自體nk細胞擴增期間增加cd45ro+亞類的方案應(yīng)會得出更好的臨床結(jié)果。cd45活性通過二聚化調(diào)節(jié)，在質(zhì)膜上自發(fā)的cd45同源二聚化抑制了其活性(55)。cd45胞外結(jié)構(gòu)域的大小與cd45二聚化的程度成反比，因此與自身抑制作用成反比(55)。較大的cd45同種型(例如cd45ra)較不有效地二聚化，因此它們應(yīng)比較小的同種型(例如cd45ro)更好地促進tcr信號傳導(dǎo)(19)。然而，cd45活性也取決于其質(zhì)膜定位，并因此取決于其胞外結(jié)構(gòu)域(19,56)。至少在t細胞中，太高的cd45活性導(dǎo)致src激酶中的活化殘基去磷酸化，而太低的cd45活性可能留下磷酸化的抑制性殘基。因此，對于有效的nk細胞活化重要的是cd45活性保持在特定窗口內(nèi)(26)，并且特定的cd45同種型的量將調(diào)節(jié)最終的活性。我們發(fā)現(xiàn)cd45raronk細胞顯示出最大的溶細胞活性，這表明cd45ra和cd45ro同種型的表達可能給予nk細胞適當(dāng)水平的cd45活性來進行有效的信號傳導(dǎo)以提高其細胞溶解活性。這與小鼠體內(nèi)的結(jié)果一致，其中cd45是nk細胞的完全細胞毒性活性所需的(57)。然而，cd45不是體外nk細胞毒性所必需的(31～33)。與此相一致，我們觀察到在體外其他表達不同cd45同種型的nk細胞亞類也顯示出細胞毒性活性。此外，不同cd45同種型的表達改變cd45配體的識別。例如，不同cd45同種型上的o-聚糖的豐度和類型調(diào)節(jié)細胞對半乳凝素-1的敏感性(58)。由腫瘤細胞大量產(chǎn)生的半乳凝素-1阻斷了t細胞介導(dǎo)的細胞毒性反應(yīng)(59)并誘導(dǎo)胸腺細胞和t細胞的凋亡(58)。通過cd45ro的表達，基于其對半乳凝素-1或其它配體的抗性來選擇抗腫瘤nk細胞是可能的。實際上，由于o-聚糖主要結(jié)合cd45胞外結(jié)構(gòu)域，因此表達短cd45同種型的細胞(如cd45ro)將具有相對較少的o-聚糖，從而對半乳凝素-1更具抗性。在體外，我們發(fā)現(xiàn)來自健康供體的外周血樣品中非常少的、表達cd45ro的nk細胞。這是令人驚訝的，特別是如果像已經(jīng)提出的那樣：cd45ro表達鑒定記憶nk細胞(30)。該發(fā)現(xiàn)表明，在血液樣品中記憶nk細胞的量可能極低或者cd45ro可能不是記憶nk細胞的標志物?；蛘撸琻k細胞中的cd45ro表達可能在離體樣品處理期間特異性減少。我們認為這是不可能的，因為nk細胞比其他淋巴細胞類型表達的總cd45水平稍高(圖1)。事實上，我們發(fā)現(xiàn)cd45ro多數(shù)與效應(yīng)nk細胞相關(guān)；然而，與在大多數(shù)t細胞群體中觀察到的不同，cd45ra的下調(diào)不需要nk細胞活化。這表明在nk細胞中，不同cd45同種型的表達與在t細胞中所起作用不同。參考文獻：在本申請中，各種參考文獻描述了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。這些參考文獻的公開內(nèi)容通過引用的方式并入本公開中。1.a.velardi,roleofkirsandkirligandsinhematopoietictransplantation.curropinimmunol20,581-587(2008).2.l.l.lanier,uponthetightrope:naturalkillercellactivationandinhibition.natimmunol9,495-502(2008).3.c.baier,a.fino,c.sanchez,l.farnault,p.rihet,b.kahn-perles,r.t.costello,naturalkillercellsmodulationinhematologicalmalignancies.frontiersinimmunology4,459(2013).4.m.villalba,m.g.rathore,n.lopez-royuela,e.krzywinska,j.garaude,n.allende-vega,fromtumorcellmetabolismtotumorimmuneescape.intjbiochemcellbiol45,106-113(2013).5.m.villalba,n.lopez-royuela,e.krzywinska,m.g.rathore,r.a.hipskind,h.haouas,n.allende-vega,chemicalmetabolicinhibitorsforthetreatmentofblood-bornecancers.anti-canceragentsinmedicinalchemistry14,223-232(2014).6.n.vey,j.h.bourhis,n.boissel,d.bordessoule,t.prebet,a.charbonnier,a.etienne,p.andre,f.romagne,d.benson,h.dombret,d.olive,aphase1trialoftheanti-inhibitorykirmabiph2101foramlincompleteremission.blood120,4317-4323(2012).7.d.h.mckenna,jr.,d.sumstad,n.bostrom,d.m.kadidlo,s.fautsch,s.mcnearney,r.dewaard,p.b.mcglave,d.j.weisdorf,j.e.wagner,j.mccullough,j.s.miller,goodmanufacturingpracticesproductionofnaturalkillercellsforimmunotherapy:asix-yearsingle-institutionexperience.transfusion47,520-528(2007).8.j.s.miller,y.soignier,a.panoskaltsis-mortari,s.a.mcnearney,g.h.yun,s.k.fautsch,d.mckenna,c.le,t.e.defor,l.j.burns,p.j.orchard,b.r.blazar,j.e.wagner,a.slungaard,d.j.weisdorf,i.j.okazaki,p.b.mcglave,successfuladoptivetransferandinvivoexpansionofhumanhaploidenticalnkcellsinpatientswithcancer.blood105,3051-3057(2005).9.l.ruggeri,a.mancusi,e.burchielli,f.aversa,m.f.martelli,a.velardi,naturalkillercellalloreactivityinallogeneichematopoietictransplantation.curropinoncol19,142-147(2007).10.j.e.rubnitz,h.inaba,r.c.ribeiro,s.pounds,b.rooney,t.bell,c.h.pui,w.leung,nkaml:apilotstudytodeterminethesafetyandfeasibilityofhaploidenticalnaturalkillercelltransplantationinchildhoodacutemyeloidleukemia.jclinoncol28,955-959(2010).11.d.sanchez-martinez,e.krzywinska,m.g.rathore,a.saumet,a.cornillon,n.lopez-royuela,l.martinez-lostao,a.ramirez-labrada,z.y.lu,j.f.rossi,d.fernandez-orth,s.escorza,a.anel,c.h.lecellier,j.pardo,m.villalba,all-transretinoicacid(atra)inducesmir-23aexpression,decreasesctscexpressionandgranzymebactivityleadingtoimpairednkcellcytotoxicity.intjbiochemcellbiol49,42-52(2014).12.y.t.bryceson,s.c.chiang,s.darmanin,c.fauriat,h.schlums,j.theorell,s.m.wood,molecularmechanismsofnaturalkillercellactivation.journalofinnateimmunity3,216-226(2011).13.c.i.domaica,m.b.fuertes,i.uriarte,m.v.girart,j.sardanons,d.i.comas,d.digiovanni,m.i.gaillard,l.bezrodnik,n.w.zwirner,humannaturalkillercellmaturationdefectsupportsinvivocd56(bright)tocd56(dim)lineagedevelopment.plosone7,e51677(2012).14.l.moretta,dissectingcd56dimhumannkcells.blood116,3689-3691(2010).15.a.g.freud,j.yu,m.a.caligiuri,humannaturalkiller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