總體上，本發(fā)明涉及快速靈敏的用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的方法。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的探針。
背景技術(shù)：
：丙烯酸可廣泛用作用于工業(yè)生產(chǎn)寬范圍的丙烯酸酯和聚合物的原料，用于諸如塑料、膠乳、超吸收聚合物、表面涂層、紡織品、粘合劑和密封劑的應(yīng)用。2012年全球?qū)Ρ┧岬男枨蟪^(guò)136億美元，到2018年可能會(huì)增加到200億美元。在丙烯酸的生產(chǎn)中通常使用的原料之一可以是丙烯，其通常可以衍生自石油化學(xué)來(lái)源。然而，近年來(lái)，通過(guò)替代的、可持續(xù)的、生物可再生來(lái)源來(lái)生產(chǎn)丙烯酸似乎很感興趣。為了生產(chǎn)綠色丙烯酸(包括其衍生物)或者衍生自生物質(zhì)和廢棄物的那些丙烯酸，需要用靈敏的特異性測(cè)定法檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的能力。用于丙烯酸或其衍生物的快速高通量檢測(cè)方法可以用于促進(jìn)微生物丙烯酸生產(chǎn)者的菌株工程化和相關(guān)酶的工程化以改善體內(nèi)丙烯酸生產(chǎn)。還可能需要高靈敏度的方法以提高確定任何丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的準(zhǔn)確性。這樣的方法也可以用于檢測(cè)來(lái)自塑料的丙烯酸酯污染物。這種高靈敏度的方法可用于檢測(cè)由河流或飲用水中的丙烯酸酯污染物引起的環(huán)境污染。一些目前可用的用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的方法可以包括色譜方法，例如與質(zhì)譜檢測(cè)聯(lián)用的氣相色譜(GC)和高壓液相色譜(HPLC)。然而，這些色譜方法中存在的限制可能包括繁瑣的樣品制備程序和待用作檢測(cè)傳感器的化合物的化學(xué)衍生化。這些方法傾向于具有低通量，并且可能不適合篩選大量化學(xué)品。因此，需要提供克服或至少改善上述一個(gè)或多個(gè)缺點(diǎn)的用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的方法。這些優(yōu)點(diǎn)中的一些可以包括改善的檢測(cè)靈敏度和通量。該方法還應(yīng)該能夠更快速地檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在。還需要提供能夠快速檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的探針。該探針還應(yīng)該能夠克服或至少改善上述一個(gè)或多個(gè)缺點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)第一方面，提供用于檢測(cè)樣品中丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的方法，所述方法包括以下步驟：(a)將包含二芳基四唑化合物的探針引入所述樣品；(b)將所述樣品暴露于光；以及(c)基于在所述步驟(c)之后由所述樣品發(fā)射的熒光，檢測(cè)所述樣品中丙烯酸或其衍生物的存在或不存在。與常規(guī)的檢測(cè)方法，例如氣相或液相色譜相比，如上所述的方法允許快速和高通量感測(cè)?？梢杂欣叵龑?duì)繁瑣的樣品提取/制備或待用作檢測(cè)傳感器的化合物的化學(xué)衍生化的需要。也可以減少龐大的檢測(cè)設(shè)備的使用。能夠通過(guò)該方法檢測(cè)的丙烯酸或其衍生物可以包括但不限于丙烯酰胺、丙烯酸酯或其它基于丙烯酸鹽/酯的化合物。有利地，依賴于二芳基四唑和丙烯酸或其衍生物之間的反應(yīng)的本發(fā)明方法可以能夠在光活化后的90秒內(nèi)完成，從而提高檢測(cè)速度。用于光活化的光可以是紫外光(UV)。如上述方法中所述的二芳基四唑化合物可具有式(I)：其中R1至R10中的每一個(gè)獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、氧、硫、鹵素、羥基、任選地被取代的烷基、任選地被取代的酰基、任選地被取代的酯、任選地被取代的氨基、任選地被取代的胺、任選地被取代的酰胺、任選地被取代的羧酸、任選地被取代的羰基、任選地被取代的脲、任選地被取代的烷氧基、任選地被取代的烷基氧基、任選地被取代的烯基、任選地被取代的炔基、任選地被取代的磺酰胺、任選地被取代的氨基磺酰胺、任選地被取代的磺酰脲、任選地被取代的肟、任選地被取代的環(huán)烷基、任選地被取代的芳基、任選地被取代的雜環(huán)烷基和任選地被取代的雜芳基。有利地，所述二芳基四唑可以在R1至R10中的每一處獨(dú)立地包含不同類型的任選取代基，用于提高檢測(cè)的效率或準(zhǔn)確性。特別地，所述二芳基四唑化合物可以選自由以下組成的組：在本發(fā)明方法的步驟(a)中引入的二芳基四唑化合物可以至少1nM的濃度存在于樣品中。在如上所述的方法中，探針可以被生物素化。通過(guò)將生物素化試劑連接至探針，可以使用具有極高親和力、快速結(jié)合速率和高特異性的物質(zhì)例如抗生蛋白鏈菌素和抗生物素蛋白來(lái)分離生物素化探針。生物素化提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，因?yàn)樗试S更有效地捕獲生物素化探針。此外，生物素化探針-丙烯酸/丙烯酸衍生物綴合物的親和純化潛在地移除復(fù)雜(例如生物學(xué))樣品中存在的可能(例如通過(guò)自發(fā)熒光)混淆分析的物質(zhì)。在所公開的本發(fā)明方法的步驟(b)中，暴露可以在10nm至1mm范圍的任何波長(zhǎng)下發(fā)生。特別地，波長(zhǎng)可以是302nm。使用這些波長(zhǎng)的檢測(cè)有利地避免了使用復(fù)雜的發(fā)光源。所述樣品暴露于光可以在酸性或堿性條件下發(fā)生。在如上所述的方法的步驟(b)中，暴露步驟可以進(jìn)一步包括形成反應(yīng)性中間體的步驟。該反應(yīng)性中間體可以是包含腈亞胺偶極的化合物。該腈亞胺偶極能夠與丙烯酸或其衍生物反應(yīng)以產(chǎn)生吡唑啉環(huán)加成物，所述吡唑啉環(huán)加成物可以是熒光的。有利地，這些步驟允許通過(guò)熒光方法檢測(cè)丙烯酸或其衍生物。因此，暴露于光后獲得的熒光樣品可以是包含熒光吡唑啉的環(huán)加成物。為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，在將探針引入含有丙烯酸或其衍生物的樣品之前，丙烯酸或其衍生物可能必須以至少100nM的濃度存在。本發(fā)明方法可以用于檢測(cè)微生物中丙烯酸或其衍生物的存在或不存在，而不在這些生物體例如細(xì)菌中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。根據(jù)另一方面，提供用于檢測(cè)樣品中丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的探針，其中所述探針包含二芳基四唑化合物。該探針可以提供如上所述的優(yōu)點(diǎn)。二芳基四唑化合物可具有如上所示的式(I)。如上所定義的探針可以選自由以下組成的組：有利地，探針可以如上所述被生物素化。根據(jù)另一方面，提供如上所定義的探針用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的用途。以這種方式使用該探針提供如上所述的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)另一方面，提供包含如上所定義的探針用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的試劑盒，其中使所述探針與丙烯酸或其衍生物接觸。該試劑盒能夠提供如上所述的優(yōu)點(diǎn)。定義本文所用的以下詞語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有所指示的含義：在下文或如本公開通篇所述的許多取代基的定義中，取代基可以是末端基團(tuán)或橋連基團(tuán)。此舉旨在表明該術(shù)語(yǔ)的使用意在包括其中基團(tuán)是分子的兩個(gè)其它部分之間的連接體以及其中基團(tuán)是末端部分的情況。使用術(shù)語(yǔ)烷基作為實(shí)例，一些出版物使用術(shù)語(yǔ)“亞烷基”用于橋連基團(tuán)，因此在這些其它出版物中，術(shù)語(yǔ)“烷基”(末端基團(tuán))與“亞烷基”(橋連基團(tuán))之間有所區(qū)別。在本公開中，未作出這樣的區(qū)別，大多數(shù)基團(tuán)可以是橋連基團(tuán)或末端基團(tuán)。短語(yǔ)“任選地被取代的”廣泛地意為該術(shù)語(yǔ)所指的基團(tuán)可以未被取代，或者可以被一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立地選自但不限于以下的基團(tuán)取代：氧、硫、鹵素、烷基、酰基、酯、氨基、酰胺、羧酸、羰基、脲、烷氧基、烷基氧基、烯基、炔基、磺酰胺、氨基磺酰胺、磺酰脲、肟、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)烷基和雜芳基。通常，如果這些基團(tuán)含有碳原子，則它們具有1至12個(gè)碳原子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹵素”或者變體例如“鹵化物(halide)”或“鹵代(halo)”是指氟、氯、溴和碘或者元素周期表的第17族元素。術(shù)語(yǔ)“烷基”可以指在鏈中具有1至12個(gè)碳原子或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子的直鏈或支鏈烷基。示例性烷基包括甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基(tBu)、戊基、異戊基、叔戊基、己基、異己基等。術(shù)語(yǔ)“酰基”可以指-C(O)-R基團(tuán)，其中R是任選地被取代的C1-C12-烷基、C2-C12-烯基、具有3至12個(gè)碳原子的環(huán)烷基，或者具有6個(gè)或更多個(gè)碳原子的芳基，或者具有1至3個(gè)選自N、S或O的雜原子的5至6元環(huán)雜環(huán)烷基或雜芳基。術(shù)語(yǔ)“酯”在其含義內(nèi)包括-O-C(O)-烷基-和-C(O)-O-烷基-。本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基”可以指形式-NRaRb的基團(tuán)，其中Ra和Rb分別選自包括但不限于以下的組：氫、任選地被取代的烷基、任選地被取代的烯基、任選地被取代的炔基和任選地被取代的芳基。術(shù)語(yǔ)“氨基”可以包括如下所定義的胺基團(tuán)(即-NH2)或被取代的胺基團(tuán)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“酰胺”可以指形式-C(O)-NRc-烷基-的基團(tuán)，其中Rc選自包括但不限于以下的組：氫、任選地被取代的烷基、任選地被取代的烯基和任選地被取代的芳基。本文所用的術(shù)語(yǔ)“胺”是指形式NRdRe-烷基-的基團(tuán)，其中Rd和Re分別選自包括但不限于以下的組：氫、任選地被取代的烷基、任選地被取代的烯基和任選地被取代的芳基。“酰胺”和“胺”中的-烷基-可以任選地被取代，并且優(yōu)選具有2至12個(gè)碳原子，更優(yōu)選2至6個(gè)碳原子或者落在這些范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子。術(shù)語(yǔ)“羧酸”或變體例如“羧基”可以意指具有含-C(O)OH的基團(tuán)的分子。術(shù)語(yǔ)“羰基”可以指具有基團(tuán)Rf-C(O)-Rg的分子，其中Rf和Rg可以是任選地被取代的C1-C12-烷基、C2-C12-烯基、具有3至12個(gè)碳原子的環(huán)烷基，或者具有6個(gè)或更多個(gè)碳原子的芳基，或者具有1至3個(gè)選自N、S或O的雜原子的5至6元環(huán)雜環(huán)烷基或雜芳基。該術(shù)語(yǔ)可包括酮。本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷氧基”或變體例如“醇鹽”或“烷基氧基”可以指-O-烷基。代表性實(shí)例包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、叔丁氧基等。術(shù)語(yǔ)“烯基”在其含義內(nèi)包括具有2至12個(gè)碳原子或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子并且在烷基鏈中的任何位置具有至少一個(gè)呈E、Z、順式或反式立體化學(xué)(當(dāng)適用時(shí))的雙鍵的二價(jià)(“亞烯基”)直鏈或支鏈不飽和脂族烴基。烯基的實(shí)例包括但不限于乙烯基(ethenyl)、乙烯基(vinyl)、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1,3-戊二烯基、2,4-戊二烯基、1,4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、2-甲基戊烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基等。除非另有說(shuō)明，否則本文所用的術(shù)語(yǔ)“炔基”可以指具有2至12個(gè)碳原子或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子并且含有至少一個(gè)三鍵的支鏈或非支鏈烴基，例如乙炔基(acetylenyl)、乙炔基(ethynyl)、正丙炔基、異丙炔基、正丁炔基、異丁炔基、叔丁炔基、辛炔基、癸炔基等。本文所用的術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”可以指僅由碳和氫原子組成的穩(wěn)定的非芳族單環(huán)或多環(huán)烴基，其可包括稠合或橋接的環(huán)系，具有3至15個(gè)碳原子或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子?！碍h(huán)烷基”可以通過(guò)單鍵連接至分子的其余部分?！碍h(huán)烷基”可以是飽和的，即僅含有C-C單鍵。單環(huán)環(huán)烷基的實(shí)例包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。本文所用的術(shù)語(yǔ)“芳族基團(tuán)”或者變體例如“芳基”或“亞芳基”可以指具有6至12個(gè)碳原子或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子的芳族烴的一價(jià)(“芳基”)和二價(jià)(“亞芳基”)單環(huán)、多環(huán)、共軛和稠合基團(tuán)。這種基團(tuán)的實(shí)例包括苯基、聯(lián)苯基、萘基、菲基等。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)烷基”可以指在至少一個(gè)環(huán)中含有至少一個(gè)選自氮、硫、氧的雜原子，優(yōu)選1至3個(gè)雜原子的飽和單環(huán)、雙環(huán)或多環(huán)的環(huán)。每個(gè)環(huán)可以是3至12元或者具有在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子。雜環(huán)烷基取代基的實(shí)例包括吡咯烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、哌啶基、哌嗪基、四氫吡喃基、嗎啉基、1,3-二氮雜環(huán)庚烷、1,4-二氮雜環(huán)庚烷、1,4-氧氮雜環(huán)庚烷和1,4-氧硫雜環(huán)庚烷。術(shù)語(yǔ)“雜烷基”是指在鏈中具有2至12個(gè)原子或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的原子、其中一個(gè)或多個(gè)原子是選自S、O和N的雜原子的直鏈或支鏈烷基。示例性雜烷基包括烷基醚、仲烷基胺和叔烷基胺、烷基硫醚等。本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基”可以指包含約5至約12個(gè)環(huán)原子，優(yōu)選約5至約10個(gè)環(huán)原子或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的原子、其中一個(gè)或多個(gè)所述環(huán)原子是單獨(dú)或組合的除碳以外的元素(例如氮、氧或硫)的芳族單環(huán)或多環(huán)環(huán)系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”還可以包括與如上所定義的芳基稠合的如上所定義的雜芳基。合適的雜芳基的非限制性實(shí)例包括吡啶基、吡嗪基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、吡啶酮(包括N-取代的吡啶酮)、異唑基、異噻唑基、唑基、噻唑基、吡唑基、呋咱基、吡咯基、吡唑基、三唑基、1,2,4-噻二唑基、吡嗪基、噠嗪基、喹喔啉基、酞嗪基、羥吲哚基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[2,1-b]噻唑基、苯并呋咱基、吲哚基、氮雜吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹啉基、咪唑基、噻吩并吡啶基、喹唑啉基、噻吩并嘧啶基、吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、異喹啉基、苯并氮雜吲哚基、1,2,4-三嗪基、苯并噻唑基等。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”還指部分飽和的雜芳基部分，例如四氫異喹啉基、四氫喹啉基等。雜芳基可以任選地被取代。詞語(yǔ)“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的組合物可完全不含Y。必要時(shí)，詞語(yǔ)“基本上”可以從本發(fā)明的定義中省略。除非另有說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“包含(comprising和comprise)”和其語(yǔ)法變體意欲表示“開放”或“包括性”用語(yǔ)，使得它們不僅包括所列舉的要素，而且還允許包括其它未列舉的要素。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”在制劑的組分的濃度的背景下，通常意指所述值的+/-5％，更通常所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常所述值的+/-1％，且甚至更通常所述值的+/-0.5％。在本公開通篇內(nèi)，某些實(shí)施方案可以范圍形式公開。應(yīng)了解，呈范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡(jiǎn)潔且不應(yīng)當(dāng)被解釋為對(duì)所公開范圍之保護(hù)范圍的硬性限制。因此，對(duì)一個(gè)范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為已經(jīng)具體地公開了所述范圍內(nèi)的所有可能的子范圍以及單個(gè)數(shù)值。例如，范圍諸如從1至6的描述應(yīng)被認(rèn)為具體地公開了子范圍，諸如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值，例如1、2、3、4、5和6。這無(wú)關(guān)于范圍的寬度而適用。某些實(shí)施方案在本文中也可以被廣泛地和一般性地進(jìn)行描述。落在一般性公開范圍內(nèi)的每個(gè)較窄的類和亞一般性的組也構(gòu)成本公開的一部分。這包括具有從所述類中去除任何主題的附帶條件或否定性限制的實(shí)施方案的一般性描述，無(wú)論所排除的材料是否在本文中具體敘及。具體實(shí)施方式現(xiàn)將公開如上所述方法的示例性、非限制性實(shí)施方案。所述用于檢測(cè)樣品中丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的方法可包括以下步驟：(a)將包含二芳基四唑化合物的探針引入所述樣品；(b)將所述樣品暴露于光；以及(c)基于在步驟(c)之后由所述樣品發(fā)射的熒光，檢測(cè)所述樣品中丙烯酸或其衍生物的存在或不存在。有利地，與常規(guī)方法例如但不限于GC、氣相色譜質(zhì)譜(GCMS)、液相色譜或HPLC等相比，該方法可以高通量提供丙烯酸或其衍生物的快速檢測(cè)。該方法可以利用無(wú)毒性探針且因此允許本發(fā)明方法用于在體外或體內(nèi)檢測(cè)丙烯酸或其衍生物?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明方法檢測(cè)的丙烯酸或其衍生物可包括但不限于丙烯酰胺、丙烯酸酯或任何其它基于丙烯酸鹽/酯的化合物。這些丙烯酸鹽/酯衍生物也可以是丙烯酸或其衍生物的任何丙烯酸鹽、酯、共軛堿?；旧?，這些衍生物或丙烯酸鹽/酯可以含有乙烯基，即彼此雙鍵鍵合的兩個(gè)碳原子，其又直接連接至羰基碳。丙烯酸鹽/酯或基于丙烯酸鹽/酯的化合物還可以包括基于丙烯酸鹽/酯的聚合物或甲基丙烯酸鹽/酯(甲基丙烯酸的鹽和酯)。如上所述的樣品可以是含有丙烯酸或其衍生物的任何樣品。所述樣品可以包含微生物。該生物體可以是病毒、細(xì)菌、任何動(dòng)物或植物細(xì)胞等。該生物體可以能夠產(chǎn)生任何丙烯酸或其衍生物。產(chǎn)生丙烯酸的細(xì)菌的實(shí)例可包括丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)和埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)。在本發(fā)明方法的步驟(a)中，可以將探針引入目標(biāo)樣品中。探針可以包含二芳基四唑化合物。所述二芳基四唑化合物可以具有式(I)：其中R1至R10中的每一個(gè)獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、氧、硫、羥基、鹵素、任選地被取代的烷基、任選地被取代的?；?、任選地被取代的酯、任選地被取代的氨基、任選地被取代的胺、任選地被取代的酰胺、任選地被取代的羧酸、任選地被取代的羰基、任選地被取代的脲、任選地被取代的烷氧基、任選地被取代的烷基氧基、任選地被取代的烯基、任選地被取代的炔基、任選地被取代的磺酰胺、任選地被取代的氨基磺酰胺、任選地被取代的磺酰脲、任選地被取代的肟、任選地被取代的環(huán)烷基、任選地被取代的芳基、任選地被取代的雜環(huán)烷基、任選地被取代的雜烷基、任選地被取代的醇和任選地被取代的雜芳基。由式(I)涵蓋的二芳基四唑化合物的一些實(shí)例可以選自由以下組成的組：特別地，所述二芳基四唑化合物可以是存在于式(I)的二芳基四唑化合物上的取代基R1至R10可影響其檢測(cè)效力。如下文實(shí)施例1至7中所示，當(dāng)用于檢測(cè)相同的化合物例如丙烯酸時(shí)，不同的二芳基四唑化合物可以顯示不同的熒光強(qiáng)度。對(duì)此的一種可能的解釋是，當(dāng)二芳基四唑與丙烯酸或其衍生物反應(yīng)時(shí)，取代基R1至R10可能體積大并且因此引起空間位阻。另一種可能是取代基可以具有不同的電離程度，而一些假設(shè)不是所有的二芳基四唑化合物都以相同的方式反應(yīng)。因此，不同程度的電離和取代可導(dǎo)致當(dāng)二芳基四唑與丙烯酸或其衍生物反應(yīng)時(shí)可形成的吡唑啉熒光團(tuán)的光電子學(xué)中的變化的推拉效應(yīng)。這種變化的光物理效應(yīng)導(dǎo)致不同的熒光強(qiáng)度。因此，某些效應(yīng)可能主導(dǎo)并影響二芳基四唑與丙烯酸或其衍生物的反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，其可進(jìn)而影響熒光發(fā)射的速度或強(qiáng)度。用于本發(fā)明方法的探針可以被生物素化。任何生物素化試劑可以被連接或綴合至探針或二芳基四唑。這種生物素化試劑的實(shí)例可以是生物素。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它生物素化試劑可以與本發(fā)明方法的步驟(a)中使用的探針一起使用。生物素化探針或用作探針的二芳基四唑的優(yōu)點(diǎn)是提高檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。這是因?yàn)檫@些生物素化試劑可以結(jié)合例如抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或中性鏈親和素的特異性分子，所述特異性分子可以對(duì)這些生物素化試劑具有極高親和力、快速結(jié)合速率和高特異性。這種相互作用可有助于分離生物素化探針，從而如實(shí)施例14中所示增強(qiáng)檢測(cè)。一旦包含如上所定義的二芳基四唑化合物的探針與樣品混合，可以如本發(fā)明方法的步驟(b)中所述將樣品暴露于光。這種暴露有助于光活化反應(yīng)。這種暴露可以在電磁譜的任何波長(zhǎng)下發(fā)生。也可以使用落在電磁譜內(nèi)的任何波長(zhǎng)范圍。暴露波長(zhǎng)可以在10nm至1mm的范圍內(nèi)或者為落在該范圍內(nèi)的任何其它波長(zhǎng)。特別地，可以使用302nm的波長(zhǎng)。使用這種波長(zhǎng)避免了對(duì)復(fù)雜的發(fā)光器件的需要?？梢宰⒁獾?，本發(fā)明方法涉及在二芳基四唑和丙烯酸或其衍生物之間的光活化的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)。在特定波長(zhǎng)(例如302nm)下進(jìn)行光照射時(shí)，二芳基四唑可經(jīng)歷裂環(huán)反應(yīng)以產(chǎn)生高反應(yīng)性腈亞胺偶極并釋放氮?dú)狻Ｔ撾鎭啺放紭O隨后可以與丙烯酸或丙烯酸酯親偶極物質(zhì)反應(yīng)以產(chǎn)生在光活化時(shí)可以發(fā)射熒光的吡唑啉環(huán)加成物。基于上述，該方法可以進(jìn)一步包括形成反應(yīng)性中間體的步驟。當(dāng)二芳基四唑與丙烯酸或其衍生物反應(yīng)時(shí)可以形成該反應(yīng)性中間體，可以基于與1,3-偶極環(huán)加成相同的機(jī)理。該反應(yīng)性中間體可以是包含腈亞胺偶極的化合物。腈亞胺可以被分類為共享具有一般結(jié)構(gòu)Rx-CN-NRy的共同官能團(tuán)的一類有機(jī)化合物，所述官能團(tuán)對(duì)應(yīng)于鍵合到腈的N-末端的胺的共軛堿。因此，當(dāng)在本上下文中使用時(shí)，Rx和Ry可以獨(dú)立地為包含1至12個(gè)碳或落在該范圍內(nèi)的任何數(shù)目的碳原子的任選地被取代的有機(jī)部分。這種有機(jī)部分可以包含如對(duì)R1至R10所定義的任選取代基。根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(c)，樣品在暴露于可見光或UV或任何其它形式的光照射后可變成熒光的。如果是這種情況，它可以指示丙烯酸或其衍生物的存在。如果在光活化或暴露于可見光或UV之后樣品沒有發(fā)射熒光，則樣品中可能不存在丙烯酸或其衍生物。暴露于光之后的熒光樣品可歸因于包含熒光吡唑啉的環(huán)加成物?？梢宰⒁獾?，由吡唑啉環(huán)加成物發(fā)射的熒光強(qiáng)度可以取決于待檢測(cè)的丙烯酸或其衍生物中存在的化學(xué)取代基。丙烯酸或其衍生物可具有與其連接的供電子或吸電子化學(xué)取代基，其可影響二芳基四唑反應(yīng)。這些化學(xué)取代基可能體積大并且在二芳基四唑反應(yīng)期間引起空間位阻。在如本文所定義的方法中，在將探針引入樣品之前，丙烯酸或其衍生物可能需要以至少100nM、200nM、300nM、400nM或500nM的濃度存在。檢測(cè)所需的丙烯酸的最小濃度可以為至少100nM、200nM、300nM、400nM或500nM。同時(shí)，檢測(cè)丙烯酰胺所需的最小濃度可以為100nM至1μM。待檢測(cè)的丙烯酰胺的最小濃度可以低于或高于100nM至1μM的范圍。因此，當(dāng)涉及檢測(cè)其它基于丙烯酸鹽/酯的衍生物時(shí)，這些濃度限值可不同。至于待使用的二芳基四唑化合物的濃度，其可需要為至少1nM、10μM或落在1nM至10μM之間的任何濃度。待使用的二芳基四唑化合物的濃度可以取決于丙烯酸或其衍生物的濃度。因此，檢測(cè)所需的二芳基四唑化合物的濃度可以小于10μM。在可被檢測(cè)到之前需要可用的丙烯酸或其衍生物的濃度也可以取決于所使用的二芳基四唑化合物的量。本發(fā)明方法可以在整個(gè)pH范圍，即1至14進(jìn)行。本發(fā)明方法可以在酸性、中性或堿性條件下進(jìn)行。酸性條件可以在pH1至6的范圍下發(fā)生，而堿性條件可以在pH8至14的范圍下發(fā)生。中性條件可以在pH7下發(fā)生。因此，步驟(a)至(c)中的任一個(gè)可以在如上所述的任何pH條件下進(jìn)行。特別地，在本發(fā)明方法的步驟(b)中的樣品暴露于光可以在堿性條件下發(fā)生。根據(jù)本公開，可以存在用于檢測(cè)樣品中丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的探針，其中所述探針包含如上所述的二芳基四唑化合物。所述二芳基四唑化合物可以具有式(I)：其中R1至R10中的每一個(gè)獨(dú)立地選自由以下組成的組：氫、氧、硫、羥基、鹵素、任選地被取代的烷基、任選地被取代的酰基、任選地被取代的酯、任選地被取代的氨基、任選地被取代的胺、任選地被取代的酰胺、任選地被取代的羧酸、任選地被取代的羰基、任選地被取代的脲、任選地被取代的烷氧基、任選地被取代的烷基氧基、任選地被取代的烯基、任選地被取代的炔基、任選地被取代的磺酰胺、任選地被取代的氨基磺酰胺、任選地被取代的磺酰脲、任選地被取代的肟、任選地被取代的環(huán)烷基、任選地被取代的芳基、任選地被取代的雜環(huán)烷基、任選地被取代的醇、任選地被取代的雜烷基和任選地被取代的雜芳基。所述二芳基四唑化合物可以選自由以下組成的組：特別地，如上所述，所述二芳基四唑化合物可以是可以通過(guò)本發(fā)明的探針檢測(cè)的丙烯酸或其衍生物如上所述。所述探針可以與樣品混合，其中后者可以如上所定義。所述探針可用于體外或體內(nèi)檢測(cè)。樣品可以包含或可以不包含丙烯酸或其衍生物。樣品可以是如上所定義的微生物?？梢詫⑺鎏结樕锼鼗栽鰪?qiáng)檢測(cè)。可能存在檢測(cè)丙烯酸或其衍生物所需的探針的最小濃度。該濃度可以取決于樣品中存在的丙烯酸或其衍生物的量。樣品中探針的濃度可能需要為至少1nM、10μM或者1nM至10μM之間的任何濃度范圍。探針的濃度可以取決于待檢測(cè)的丙烯酸或其衍生物的濃度。因此，檢測(cè)所需的探針的濃度可以小于或大于10μM。在將探針引入樣品之前，丙烯酸或其衍生物可能需要以至少100nM、200nM、300nM、400nM或500nM的濃度存在。檢測(cè)所需的丙烯酸的最小濃度可以為至少100nM、200nM、300nM、400nM或500nM。同時(shí)，丙烯酰胺被檢測(cè)所需的最小濃度可以為100nM至1μM/100μM所用的探針或二芳基四唑。丙烯酰胺被檢測(cè)所需的最小濃度可以在100nM至1μM之間或在該范圍之外。當(dāng)涉及檢測(cè)其它基于丙烯酸鹽/酯的衍生物時(shí)，上述濃度限值可能不同。當(dāng)二芳基四唑與丙烯酸或其衍生物反應(yīng)時(shí)，包含二芳基四唑化合物的探針可以發(fā)射熒光。所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度和檢測(cè)速度可以取決于如上所討論的因素。本公開還提供如上所定義的探針用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在的用途。該探針可以包含如上所定義的二芳基四唑化合物，因此能夠提供上述優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本公開，可以存在包含如上所定義的探針的試劑盒。該試劑盒能夠使任何使用者通過(guò)使所述探針與丙烯酸或其衍生物接觸來(lái)檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在?；谏鲜龉_內(nèi)容，本發(fā)明方法還可進(jìn)一步用于檢測(cè)含有末端烯烴的化合物，其包括以下步驟：(1)將樣品與生物素化探針一起孵育以形成混合物，(2)在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)下照射所述混合物以使所述生物素化探針與可能存在于樣品中的含有末端烯烴的化合物綴合，(3)使用抗生蛋白鏈菌素珠捕獲綴合物，(4)充分洗滌珠并洗脫綴合物珠，以及(5)測(cè)量洗脫的綴合物的熒光，以確定樣品中含有末端烯烴的化合物的不存在或存在。磁性抗生蛋白鏈菌素珠可用于幫助分離或捕獲或收集綴合的珠。如上所述的待檢測(cè)的化合物可以包含末端烯烴，并且這樣的末端烯烴可以包括但不限于丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸酯等。用于檢測(cè)這樣的化合物的試劑盒可以由任何本領(lǐng)域技術(shù)人員基于上述方法而獲得。附圖說(shuō)明附圖說(shuō)明了所公開的實(shí)施方案并且用于解釋所公開的實(shí)施方案的原理。然而，應(yīng)了解，附圖設(shè)計(jì)為僅用于說(shuō)明的目的，而不是作為本發(fā)明限制的定義。[圖1a]描繪了如實(shí)施例1中所例示的二芳基四唑化合物1(100μM，隨10mM丙烯酸)的所得熒光發(fā)射光譜。[圖1b]描繪了如實(shí)施例2中所例示的二芳基四唑化合物2(100μM，隨10mM丙烯酸)的所得熒光發(fā)射光譜。[圖1c]描繪了如實(shí)施例3中所例示的二芳基四唑化合物3(100μM，隨10mM丙烯酸)的所得熒光發(fā)射光譜。[圖1d]描繪了如實(shí)施例4中所例示的二芳基四唑化合物4(100μM，隨10mM丙烯酸)的所得熒光發(fā)射光譜。[圖1e]描繪了如實(shí)施例6中所例示的二芳基四唑化合物6(100μM，隨10mM丙烯酸)的所得熒光發(fā)射光譜。[圖1f]描繪了如實(shí)施例7中所例示的二芳基四唑化合物7(100μM，隨10mM丙烯酸)的所得熒光發(fā)射光譜。[圖2]描繪了如實(shí)施例9中所例示的二芳基四唑化合物4和各種濃度的丙烯酸之間的反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜。[圖3]顯示了如實(shí)施例9中所例示的在向100μM二芳基四唑化合物4中添加不同濃度的丙烯酸時(shí)熒光的增加倍數(shù)。[圖4]顯示了在254nm和370nm的兩種UV吸光度下使用HPLC的實(shí)施例10的動(dòng)力學(xué)研究，實(shí)施例10涉及二芳基四唑化合物4(表示為A)和丙烯酸之間的反應(yīng)。[圖5]顯示了如實(shí)施例10中所例示的含有二芳基四唑化合物4和丙烯酸的反應(yīng)混合物在不同時(shí)間間隔的熒光發(fā)射(開啟)。[圖6a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為100mM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖6b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為100mM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖6c]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為100mM時(shí)丙烯酸峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。[圖7a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為10mM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖7b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為10mM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖8a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為1mM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖8b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為1mM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖9a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為750μM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖9b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為750μM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖10a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為500μM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖10b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為500μM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖11a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為250μM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖11b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為250μM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖12a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為100μM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖12b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為100μM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖13a]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為10μM時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖13b]顯示了當(dāng)丙烯酸的濃度為10μM時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖14a]顯示了當(dāng)不存在丙烯酸時(shí)比較實(shí)施例1的GCMS結(jié)果。[圖14b]顯示了當(dāng)不存在丙烯酸時(shí)比較實(shí)施例1的放大的GCMS結(jié)果。[圖15a]顯示了在溶菌肉湯(Lysogenybroth)(LB)培養(yǎng)基中關(guān)于丙烯酸標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)施例11的熒光測(cè)定結(jié)果。[圖15b]顯示了在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中關(guān)于丙烯酸標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)施例11的熒光測(cè)定結(jié)果。[圖16a]顯示了基于實(shí)施例12的二芳基四唑與丙烯酸的反應(yīng)的pH依賴性。[圖16b]顯示了基于實(shí)施例12的二芳基四唑與丙烯酰胺的反應(yīng)的pH依賴性。[圖17]比較了如實(shí)施例13中所示的在不同pH下丙烯酸和兩種不同等級(jí)的丙烯酰胺的熒光測(cè)量。[圖18]比較了如實(shí)施例13中所示的在各種濃度下檢測(cè)的丙烯酰胺的熒光結(jié)果。[圖19]比較了如實(shí)施例13中所示的在不同油介質(zhì)存在下在復(fù)合有機(jī)/洗滌劑混合物中檢測(cè)的丙烯酰胺的熒光結(jié)果。[圖20]比較了如實(shí)施例13中所示的在不同油介質(zhì)中檢測(cè)的丙烯酰胺的熒光結(jié)果。[圖21]顯示了如實(shí)施例13中所示的對(duì)于丙烯酸和丙烯酰胺的熒光探針的pH依賴性。[圖22a]顯示了使用生物素化探針的關(guān)于各種濃度的丙烯酰胺的實(shí)施例14的熒光測(cè)量。[圖22b]顯示了使用未生物素化探針的關(guān)于各種濃度的丙烯酰胺的實(shí)施例14的熒光測(cè)量。[圖22c]顯示了如實(shí)施例14中所示的使用抗生蛋白鏈菌素珠對(duì)生物素化探針和未生物素化探針的分離效果。[圖23]顯示了使用生物素化探針的關(guān)于各種濃度的丙烯酰胺的實(shí)施例14的熒光測(cè)量。[圖24]顯示了如實(shí)施例15中所例示的使用化合物4在大腸桿菌中的丙烯酸的檢測(cè)。在底部最右側(cè)圖中顯示了小棒，其表示10μm的比例尺(參見圖24底部右側(cè)的DIC圖像)。[圖25a]描繪了如實(shí)施例15中所例示的在含有未處理、用丙烯酸、二芳基四唑化合物4或兩者處理的5mM3-丁炔酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的丙酸梭菌中存在的丙烯酸(和/或反應(yīng)中間體)的檢測(cè)。在底部最右側(cè)圖中顯示了小棒，其表示2μm的比例尺(參見圖25a底部右側(cè)的DAPI圖像)。[圖25b]顯示了從如圖25a中所示的實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞裂解物檢測(cè)到的丙烯酸的熒光信號(hào)，使用熒光讀板器對(duì)所述信號(hào)進(jìn)行定量測(cè)量。[圖26]顯示了從丙酸梭菌和大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞裂解物檢測(cè)到的丙烯酸的熒光信號(hào)，所述丙酸梭菌和大腸桿菌在未處理(26a)或用5mM和10mM3-丁炔酸(分別為26b和26c)處理的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。實(shí)施例將進(jìn)一步參照具體實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明的非限制性實(shí)施例和比較實(shí)施例，其不應(yīng)被解釋為以任何方式來(lái)限制本發(fā)明的范圍。二芳基四唑的合成細(xì)節(jié)和吡唑啉產(chǎn)物的表征所有化學(xué)品和溶劑均購(gòu)自商業(yè)來(lái)源并且未經(jīng)純化直接使用。使用SiliCycleP60硅膠(40-63μm,)進(jìn)行快速色譜法。使用BrukerAvanceIII400記錄1HNMR光譜，并且使用TMS或氘代溶劑作為內(nèi)標(biāo)(TMS，0.00；CDCl3，7.26；C6D6，7.15；DMSO-d6，2.50)以ppm報(bào)告化學(xué)位移。多重性報(bào)告如下：s＝單峰，d＝雙峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，b＝寬峰。在75.4MHz下記錄13CNMR光譜，并且使用氘代溶劑作為內(nèi)標(biāo)(CDCl3，77.0；DMSO-d6，39.5；C6D6，128.0)以ppm報(bào)告化學(xué)位移。使用Waters3100單四級(jí)桿LCMS系統(tǒng)進(jìn)行LC-MS分析。使用PhenomenexKinetex2.6uXB-C18柱(50×4.6mm)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。流速為1mL/min，并且如圖所示，UV檢測(cè)設(shè)定為254nm和370nm。氣相色譜在ShimadzuGCMSQP2010上使用30.0m×0.25mm，0.25μm內(nèi)徑的HP-INNOWAX柱進(jìn)行，其以10℃/min從40℃至250℃程序化。使用TecanInfiniteM1000進(jìn)行熒光檢測(cè)。實(shí)施例1-二芳基四唑化合物1和吡唑啉產(chǎn)物1P的合成和表征下面的反應(yīng)方案1a顯示了二芳基四唑化合物1的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案1a將4-甲?；郊姿峒柞?0.824g,5mmol)溶于乙醇(50mL)中，并添加苯磺酰肼(0.863g,5mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用水(100mL)猝滅，并在室溫下攪拌15分鐘。將沉淀過(guò)濾并用冷乙醇洗滌。然后將沉淀溶于吡啶(30mL)中用于下一反應(yīng)。將苯胺(0.465g,0.46mL,5mmol)單獨(dú)溶于水:乙醇(1:1,8mL)中，并添加濃HCl(1.3mL)。也將NaNO2(0.346g,5mmol)單獨(dú)溶于水(2mL)中。將苯胺溶液在冰浴中冷卻5分鐘，然后在冰浴中將NaNO2溶液逐滴添加至苯胺溶液中。將反應(yīng)混合物在冰浴中逐滴添加至來(lái)自第一反應(yīng)的冷卻產(chǎn)物中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。然后用乙酸乙酯(100mL×3)進(jìn)行萃取。向合并的有機(jī)層中添加3MHCl(250mL)，并劇烈攪拌10分鐘。將有機(jī)層濃縮，并用己烷使產(chǎn)物沉淀。將產(chǎn)物進(jìn)一步用冷己烷洗滌。己烷在用于洗滌產(chǎn)物之前在冰中孵育。用于洗滌的孵育己烷的溫度為約0℃至10℃。在隨后的實(shí)施例中重復(fù)這種冷卻己烷溫度的方法，以獲得淺橙色固體(0.538g,38％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.35(dd,J＝8.2,0.6Hz,2H),8.24-8.18(m,4H),7.63-7.56(m,2H),7.56-7.50(m,1H),3.97(s,3H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ166.52,164.41,136.87,131.92,131.28,130.24,129.89,129.75,127.01,119.97,52.32。HRMS(ESI)C15H12N4O2的計(jì)算值為280.096[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為280.096。下面的反應(yīng)方案1b顯示了吡唑啉產(chǎn)物1P的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案1b將二芳基四唑化合物1(20mg,0.0713mmol)和丙烯酸(24.5μL，5摩爾當(dāng)量)的4mL乙酸乙酯(EA)溶液用302nmUV燈照射3小時(shí)。通過(guò)減壓移除過(guò)量的溶劑和試劑，以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，隨后通過(guò)硅膠柱色譜法(己烷(Hex):EA，1:1)對(duì)所述粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。收集到作為黃色固體的產(chǎn)物1P。1HNMR(400MHz,HRMS(ESI)C18H16N2O4的計(jì)算值為324.1115[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為324.111。實(shí)施例2-二芳基四唑化合物2和吡唑啉產(chǎn)物2P的合成和表征下面的反應(yīng)方案2a顯示了二芳基四唑化合物2的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案2a將4-甲酰基苯甲酸甲酯(0.820g,5mmol)溶于乙醇(50mL)中，隨后添加苯磺酰肼(0.862g,5mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用水(100mL)猝滅，并在室溫下攪拌15分鐘。將沉淀過(guò)濾，用冷乙醇洗滌，并溶于吡啶(30mL)中以形成溶液A。然后將4-氟苯胺(0.555g,0.48mL,5mmol)溶于水:乙醇(1:1,8mL)和濃HCl(1.3mL)中。將NaNO2(0.345g,5mmol)溶于水(2mL)中。將兩種混合物在冰浴中冷卻5分鐘，然后在冰浴中將NaNO2溶液逐滴添加至4-氟苯胺溶液中以形成溶液B。在冰浴中將溶液B逐滴添加至溶液A中。然后將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。向合并的有機(jī)層中添加3MHCl(250mL)，隨后劇烈攪拌10分鐘。將有機(jī)層濃縮，并用己烷使產(chǎn)物沉淀。將產(chǎn)物用冷己烷洗滌，以獲得淺粉色固體(0.777g,52％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.36-8.29(m,2H),8.24-8.16(m,4H),7.29(dd,J＝9.1,7.9Hz,2H),3.97(s,3H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ166.46,164.49,164.40,161.91,131.97,131.07,130.24,126.97,121.96,121.87,116.90,116.67,52.33。HRMS(ESI)C15H11FN4O2的計(jì)算值為298.0865[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為298.0866。下面的反應(yīng)方案2b顯示了吡唑啉產(chǎn)物2P的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案2b將二芳基四唑化合物2(20mg,0.0671mmol)和丙烯酸(23μL，5摩爾當(dāng)量)的4mL乙酸乙酯溶液用302nmUV燈照射3小時(shí)。通過(guò)減壓移除過(guò)量的溶劑和試劑，以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，隨后通過(guò)硅膠柱色譜法(己烷:EA，1:1)對(duì)所述粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。收集到作為黃色固體的產(chǎn)物2P。1HNMR(400MHz,HRMS(ESI)C18H15FN2O4的計(jì)算值為342.1022[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為342.1016。實(shí)施例3-二芳基四唑化合物3和吡唑啉產(chǎn)物3P的合成和表征下面的反應(yīng)方案3a顯示了二芳基四唑化合物3的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案3a將4-甲?；郊姿峒柞?0.820g,5mmol)溶于乙醇(50mL)中，隨后添加苯磺酰肼(0.859g,5mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用水(100mL)猝滅，并在室溫下攪拌15分鐘。將沉淀過(guò)濾，用冷乙醇洗滌，并溶于吡啶(30mL)中以形成溶液A。然后將2,4-氟苯胺(0.645g,0.50mL,5mmol)溶于水:乙醇(1:1,8mL)和濃HCl(1.3mL)中。將NaNO2(0.345g,5mmol)溶于水(2mL)中。將兩種混合物在冰浴中冷卻5分鐘，然后在冰浴中將NaNO2溶液逐滴添加至2,4-氟苯胺溶液中以形成溶液B。在冰浴中將溶液B逐滴添加至溶液A中。然后將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。向合并的有機(jī)層中添加3MHCl(250mL)，并劇烈攪拌10分鐘。將有機(jī)層濃縮，并用己烷使產(chǎn)物沉淀。將產(chǎn)物用冷己烷洗滌，以獲得紅色固體(0.173g,11％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.35-8.30(m,2H),8.23-8.18(m,2H),7.91(td,J＝8.6,5.6Hz,1H),7.19-7.10(m,2H),3.97(s,3H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ206.88,129.90,129.11,127.89,127.14,77.32,77.20,77.00,76.68,30.89。HRMS(ESI)C15H10F2N4O2的計(jì)算值為316.0765[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為316.0772。下面的反應(yīng)方案3b顯示了吡唑啉產(chǎn)物3P的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案3b將二芳基四唑化合物3(20mg,0.0633mmol)和丙烯酸(21.7μL，5摩爾當(dāng)量)的4mL乙酸乙酯溶液用302nmUV燈照射3小時(shí)。通過(guò)減壓移除過(guò)量的溶劑和試劑，以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，隨后通過(guò)硅膠柱色譜法(己烷:EA，1:1)對(duì)所述粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。收集到作為黃色固體的產(chǎn)物3P。1HNMR(400MHz,HRMS(ESI)C18H14F2N2O4的計(jì)算值為360.0929[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為360.0922。實(shí)施例4-二芳基四唑化合物4和吡唑啉產(chǎn)物4P的合成和表征下面的反應(yīng)方案4a顯示了二芳基四唑化合物4的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案4a將4-甲酰基苯甲酸(1.000g,6mmol)溶于乙醇(100mL)中，隨后添加苯磺酰肼(1.160g,6mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用水(100mL)猝滅，并在室溫下攪拌15分鐘。將沉淀過(guò)濾，用冷乙醇洗滌，并溶于吡啶(30mL)中以形成溶液A。然后將苯胺(0.587g,0.60mL,5mmol)溶于水:乙醇(1:1,8mL)和濃HCl(1.3mL)中。將NaNO2(0.455g)溶于水(2mL)中。將兩種混合物在冰浴中冷卻5分鐘，然后在冰浴中將NaNO2溶液逐滴添加至苯胺溶液中以形成溶液B。在冰浴中將溶液B逐滴添加至溶液A中。然后將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。向合并的有機(jī)層中添加3MHCl(250mL)，并劇烈攪拌10分鐘。移除溶劑，然后溶于二氯甲烷中。用己烷使產(chǎn)物沉淀。將產(chǎn)物用冷己烷洗滌，以獲得紅色固體(0.820g,45％)。1HNMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.39-8.34(m,2H),8.27-8.22(m,4H),7.71-7.66(m,2H),7.63(d,J＝7.3Hz,1H)。13CNMR(101MHz,MeOD)δ147.01,141.50,141.48,129.93,129.60,127.95,127.89,127.44,127.41,125.52,119.62。HRMS(ESI)C14H10N4O2的計(jì)算值為266.0805[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為266.0804。下面的反應(yīng)方案4b顯示了吡唑啉產(chǎn)物4P的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案4b將二芳基四唑化合物4(20mg,0.0751mmol)和丙烯酸(25.8μL，5摩爾當(dāng)量)的4mL二氯甲烷和甲醇溶液用302nmUV燈照射3小時(shí)。通過(guò)減壓移除過(guò)量的溶劑和試劑，以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，隨后通過(guò)硅膠柱色譜法(MeOH:DCM，3:17)對(duì)所述粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。收集到作為黃色固體的產(chǎn)物4P。1HNMR(400MHz,HRMS(ESI)C17H14N2O4的計(jì)算值為310.0948[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為310.0954。實(shí)施例5-二芳基四唑化合物5的合成和表征下面的反應(yīng)方案5a顯示了二芳基四唑化合物5的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案5a將對(duì)甲苯甲醛(1.000g,8mmol)溶于乙醇(60mL)中，隨后添加苯磺酰肼(1.433g,8mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用水(100mL)猝滅，并在室溫下攪拌15分鐘。將沉淀過(guò)濾，用冷乙醇洗滌，并溶于吡啶(30mL)中以形成溶液A。然后將1,4-苯二胺(0.905g,8mmol)溶于水:乙醇(1:1,10mL)和濃HCl(1.3mL)中。將NaNO2(0.583g,8mmol)溶于水(2mL)中。將兩種混合物在冰浴中冷卻5分鐘，然后在冰浴中將NaNO2溶液逐滴添加至1,4-苯二胺溶液中以形成溶液B。在冰浴中將溶液B逐滴添加至溶液A中。然后將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。向合并的有機(jī)層中添加3MHCl(250mL)，并劇烈攪拌10分鐘。將有機(jī)層濃縮，以獲得紅色固體。將粗產(chǎn)物用柱色譜法(己烷:EA1:1)純化，收集為黃色固體(1.149g,54.9％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.47-8.39(m,1H),8.02-7.97(m,2H),7.76(s,1H),7.54(d,J＝7.2Hz,1H),7.51-7.46(m,2H),7.46-7.42(m,2H),7.12(d,J＝7.9Hz,2H),2.32(s,3H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ148.27,140.92,138.32,133.17,130.26,129.34,128.93,127.85,127.31,29.62,21.39。HRMS(ESI)C14H13N5的計(jì)算值為251.1161[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為251.1171。下面的反應(yīng)方案5b顯示了吡唑啉產(chǎn)物5P的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案5b當(dāng)使用化合物5時(shí)，似乎未觀察到熒光。這可能是由于可能由在二芳基四唑的一個(gè)芳基上存在胺官能團(tuán)引起的熒光的內(nèi)部猝滅。已知胺基團(tuán)能夠參與分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)，這是引起熒光猝滅的可能機(jī)制。實(shí)施例6-二芳基四唑化合物6和吡唑啉產(chǎn)物6P的合成和表征下面的反應(yīng)方案6a顯示了二芳基四唑化合物6的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案6a將對(duì)甲苯甲醛(1.000g,8mmol)溶于乙醇(60mL)中，隨后添加苯磺酰肼(1.433g,8mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用水(100mL)猝滅，并在室溫下攪拌15分鐘。將沉淀過(guò)濾，用冷乙醇洗滌，并溶于吡啶(30mL)中以形成溶液A。然后將4-甲氧基苯胺(1.067g,8mmol)溶于水:乙醇(1:1,10mL)和濃HCl(1.3mL)中。將NaNO2(0.583g,8mmol)溶于水(2mL)中。將兩種混合物在冰浴中冷卻5分鐘，然后在冰浴中將NaNO2溶液逐滴添加至4-甲氧基苯胺溶液中以形成溶液B。在冰浴中將溶液B逐滴添加至溶液A中。然后將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。向合并的有機(jī)層中添加3MHCl(250mL)，并劇烈攪拌10分鐘。將有機(jī)層濃縮，以獲得紅色固體。將粗產(chǎn)物用柱色譜法(己烷:EA5:1)純化，以獲得橙紅色固體(0.8921g,41.6％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.11(d,J＝8.2Hz,2H),8.09-8.06(m,2H),7.32-7.29(m,2H),7.05-7.01(m,2H),3.86(s,3H),2.41(s,3H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ165.05,160.46,140.62,129.62,126.90,121.37,114.69,55.73,21.53。HRMS(ESI)C15H14N4O的計(jì)算值為266.1166[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為266.1168。下面的反應(yīng)方案6b顯示了吡唑啉產(chǎn)物6P的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案6b將二芳基四唑化合物6(20mg,0.0751mmol)和丙烯酸(25.7μL，5摩爾當(dāng)量)的4mL乙酸乙酯溶液用302nmUV燈照射3小時(shí)。通過(guò)減壓移除過(guò)量的溶劑和試劑，以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，隨后通過(guò)硅膠柱色譜法(MeOH:DCM，1:20)對(duì)所述粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。收集到作為黃色固體的產(chǎn)物6P。HRMS(ESI)C18H18N2O3的計(jì)算值為310.1325[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為310.1317。實(shí)施例7-二芳基四唑化合物7和吡唑啉產(chǎn)物7P的合成和表征下面的反應(yīng)方案7a顯示了二芳基四唑化合物7的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案7a將苯甲醛(1.000g,8mmol)溶于乙醇(60mL)中，隨后添加苯磺酰肼(1.623g,8mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，然后用水(100mL)猝滅，并在室溫下攪拌15分鐘。將沉淀過(guò)濾，用冷乙醇洗滌，并溶于吡啶(30mL)中以形成溶液A。然后將4-甲氧基苯胺(1.067g,8mmol)溶于水:乙醇(1:1,10mL)和濃HCl(1.3mL)中。將NaNO2(0.583g,8mmol)溶于水(2mL)中。將兩種混合物在冰浴中冷卻5分鐘，然后在冰浴中將NaNO2溶液逐滴添加至4-甲氧基苯胺溶液中以形成溶液B。在冰浴中將溶液B逐滴添加至溶液A中。然后將混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。將混合物用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。向合并的有機(jī)層中添加3MHCl(250mL)，并劇烈攪拌10分鐘。將有機(jī)層濃縮，以獲得紅色固體。對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行柱色譜法(DCM:MeOH9:1)，以獲得紅色固體(1.420g,59.7％)。1HNMR(400MHz,氯仿-d)δ8.23(dd,J＝7.9,1.7Hz,2H),8.09(d,J＝9.1Hz,2H),7.53-7.47(m,3H),7.04(d,J＝9.1Hz,2H),3.87(s,3H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ163.68,159.20,129.10,127.60,125.68,120.09,113.37,54.35。HRMS(ESI)C14H12N4O的計(jì)算值為252.1003[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為252.1011。下面的反應(yīng)方案7b顯示了吡唑啉產(chǎn)物7P的反應(yīng)途徑。反應(yīng)方案7b將二芳基四唑化合物7(20mg,0.0793mmol)和丙烯酸(27.2μL，5摩爾當(dāng)量)的4mL乙酸乙酯溶液用302nmUV燈照射3小時(shí)。通過(guò)減壓移除過(guò)量的溶劑和試劑，以產(chǎn)生粗產(chǎn)物，隨后通過(guò)硅膠柱色譜法(MeOH:DCM，1:20)對(duì)所述粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。收集到作為黃色固體的產(chǎn)物7P。1HNMR(400MHz,HRMS(ESI)C17H16N2O3的計(jì)算值為296.1169[M+H+]，實(shí)驗(yàn)值為296.1161。實(shí)施例1至7的結(jié)果實(shí)施例1至7證明了當(dāng)前所述的用于檢測(cè)丙烯酸的熒光測(cè)定方法的靈敏度和通量。本發(fā)明方法可利用光可誘導(dǎo)的生物正交化學(xué)，其涉及在二芳基四唑和丙烯酸或其衍生物之間的光活化的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)。這可以或可以不進(jìn)一步擴(kuò)展至烯烴。在302nm下光照射時(shí)，二芳基四唑經(jīng)歷裂環(huán)反應(yīng)，從而產(chǎn)生高反應(yīng)性腈亞胺偶極并釋放N2。該腈亞胺偶極可以與親偶極物質(zhì)反應(yīng)以產(chǎn)生能夠發(fā)熒光的吡唑啉環(huán)加成物。已經(jīng)測(cè)試了如上所合成的七種二芳基四唑檢測(cè)丙烯酸的存在或不存在的能力?；衔?、6和7被設(shè)計(jì)成在芳環(huán)上結(jié)合傾向于提高反應(yīng)速率的供電子基團(tuán)。由于最高占據(jù)分子軌道提升效應(yīng)(HOMO提升效應(yīng))，在N-苯基環(huán)中存在供電子取代基可以導(dǎo)致反應(yīng)速率的增加。當(dāng)腈亞胺偶極的HOMO能級(jí)增加時(shí)，環(huán)加成反應(yīng)的速率能夠被加速。七種二芳基四唑化合物與丙烯酸之間的反應(yīng)的熒光結(jié)果示于下表1中。[表1]“a”表示使100μM的每種化合物與10mM或100μM的丙烯酸反應(yīng)。在302nm下進(jìn)行1分鐘的光照射。使所有七種化合物與丙烯酸反應(yīng)，并測(cè)量它們的熒光性質(zhì)。結(jié)果總結(jié)在上表1中?；衔?、2、3、6和7產(chǎn)生了為背景約3倍的中度熒光增加?；衔?似乎對(duì)丙烯酸無(wú)反應(yīng)性，幾乎沒有或沒有熒光產(chǎn)物形成。有趣的是，在100μM丙烯酸存在下，化合物4在光活化時(shí)產(chǎn)生最高熒光開啟信號(hào)(132倍增加)?；衔?的丙烯酸檢測(cè)下限在使用302nm的UV光進(jìn)行1分鐘光活化時(shí)為500nM。因此，本公開的二芳基四唑化合物能夠用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在。如上所述，化合物5似乎未表現(xiàn)出熒光，這是因?yàn)榭赡艽嬖谟稍诙蓟倪虻囊粋€(gè)芳基上存在胺官能團(tuán)引起的熒光的內(nèi)部猝滅。已知胺基團(tuán)能夠參與分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)，這是能夠引起熒光猝滅的機(jī)制。實(shí)施例8-實(shí)施例1至7的二芳基四唑和丙烯酸之間的反應(yīng)的熒光表征將含有二芳基四唑(0.022mmol)和丙烯酸(0.02至0.050mmol)的溶液用手持式302nmUV燈照射1分鐘。在黑色96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，總反應(yīng)體積為100μL。表1中所示的最大激發(fā)波長(zhǎng)用于每次掃描。使用10μM丙烯酸的反應(yīng)的熒光發(fā)射光譜示于圖1a至圖1f中。其中省略任一反應(yīng)物的對(duì)照實(shí)驗(yàn)的光譜也描繪于圖1a至圖1f中的每一個(gè)中。相應(yīng)地，對(duì)照實(shí)驗(yàn)未觀察到熒光開啟信號(hào)?？捎^察到，在不存在UV活化下未觀察到熒光開啟。如在圖1a至圖1f中可以看出，只有含有二芳基四唑化合物和丙烯酸兩者的孔的光譜在光活化時(shí)顯示最高強(qiáng)度曲線。實(shí)施例9-二芳基四唑化合物4的檢測(cè)限如前所述，化合物4的丙烯酸檢測(cè)下限在使用302nm的UV光進(jìn)行1分鐘光活化時(shí)為500nM丙烯酸。下表2顯示了濃度及其相應(yīng)的熒光增加。[表2]化合物4的濃度100μM100μM100μM100μM丙烯酸的濃度100μM10μM1μM500nM熒光增加倍數(shù)132171.581.12每種濃度的化合物4和丙烯酸的發(fā)射光譜繪制于圖2中。可以觀察到，丙烯酸或其衍生物的濃度影響熒光強(qiáng)度。圖3還顯示了在向100μM二芳基四唑化合物4中添加不同濃度的丙烯酸時(shí)熒光增加倍數(shù)之間的關(guān)系。實(shí)施例10-使用HPLC和熒光的光活化環(huán)加成的反應(yīng)監(jiān)測(cè)將10mM化合物4溶于二氯甲烷和甲醇(1:1)中。將10mM丙烯酸的單獨(dú)溶液溶于甲醇中。然后將10μL的10mM化合物4和10μL的10mM丙烯酸溶于80μL甲醇中。劇烈攪拌后，將混合物分別用302nmUV燈照射0秒、15秒、30秒、45秒、60秒、90秒和120秒。從每個(gè)樣品取出反應(yīng)溶液的等分試樣(10μL)，并立即注入HPLC柱中。通過(guò)在254nm和370nm下的UV吸光度監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品中的化合物4(表示為A)和吡唑啉產(chǎn)物4P(表示為B)。3分鐘后施加5％至90％MeOH的線性梯度歷時(shí)10分鐘，然后保持恒定10分鐘，隨后為歷時(shí)7分鐘的90％至5％MeOH線性下降梯度?；衔?和產(chǎn)物4P分別在約13.4分鐘和12.4分鐘洗脫。涉及二芳基四唑化合物4和丙烯酸的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)研究通過(guò)如上所述用HPLC監(jiān)測(cè)0至120秒來(lái)進(jìn)行。在15秒時(shí)觀察到中間體和產(chǎn)物4P兩者。觀察到反應(yīng)在90秒內(nèi)完成，此時(shí)，原料化合物4幾乎用盡(參見圖4)。15秒后發(fā)生反應(yīng)混合物的熒光開啟。將左側(cè)小瓶至右側(cè)小瓶分別標(biāo)記為未UV活化、15秒、30秒、45秒、60秒、90秒、120秒U(xiǎn)V活化。所有樣品用相同的方法制備，其中將1μL的1mM化合物4和1μL的1mM丙烯酸溶于98μL甲醇中。在活化期間所有樣品瓶子和UV燈之間的距離相等。反應(yīng)混合物在15秒內(nèi)表現(xiàn)出高的熒光開啟(參見圖5)。實(shí)施例11-在LB培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基中丙烯酸標(biāo)準(zhǔn)品的熒光測(cè)定使用本公開的檢測(cè)方法，通過(guò)使100μM化合物4與在LB培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基中的丙烯酸接觸1分鐘光活化來(lái)進(jìn)行熒光測(cè)定。這些培養(yǎng)基通常用于丙烯酸的微生物合成。在光活化完成之前容易地檢測(cè)到熒光。與比較實(shí)施例1中所例示的氣相色譜法相比，這顯著更快。與實(shí)施例10中所示的HPLC方法相比，該方法還提供更高的通量，實(shí)施例10僅設(shè)法在13.4分鐘之前完成化合物4和吡唑啉產(chǎn)物4P的洗脫。因此，圖15a顯示當(dāng)所使用的培養(yǎng)基是LB時(shí)熒光強(qiáng)度與丙烯酸(標(biāo)記為AA)的濃度之間的關(guān)系。圖15b顯示當(dāng)所使用的培養(yǎng)基是基本培養(yǎng)基時(shí)熒光強(qiáng)度與丙烯酸(標(biāo)記為AA)的濃度之間的關(guān)系。該實(shí)施例還表明，本發(fā)明方法能夠使用所公開的二芳基四唑化合物來(lái)體外檢測(cè)丙烯酸。實(shí)施例12-二芳基四唑反應(yīng)的pH依賴性為了進(jìn)一步研究化合物4和丙烯酸之間的反應(yīng)，假設(shè)熒光的大量增加可能是由于化合物4中存在的苯甲酸基團(tuán)，而不是其它例示化合物的其余部分?；衔?含有唯一的可電離基團(tuán)，因此，去質(zhì)子化可有助于由含有羧酸基團(tuán)的吡唑啉產(chǎn)物4P發(fā)射的高熒光。為了證實(shí)上述情況，化合物4與丙烯酸(AA)之間的反應(yīng)以及化合物4與丙烯酰胺(衍生物)之間的反應(yīng)在pH1至pH13的緩沖液中進(jìn)行。圖16a和圖16b顯示吡唑啉產(chǎn)物的熒光在堿性pH下更強(qiáng)，在pH為約8至11下，特別是在pH9下觀察到最高熒光。生色團(tuán)的去質(zhì)子化似乎導(dǎo)致吡唑啉產(chǎn)物的更高熒光強(qiáng)度。這兩個(gè)圖中的對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，二芳基四唑探針在所有測(cè)試的pH下都不是熒光的。實(shí)施例13-丙烯酸或其衍生物的檢測(cè)進(jìn)行了丙烯酸和其一種衍生物，即丙烯酰胺的實(shí)驗(yàn)比較?？紤]的因素包括但不限于pH范圍、檢測(cè)所需的丙烯酰胺的量和不同油介質(zhì)的影響。由于基于實(shí)施例1至7的結(jié)果，化合物4顯示最高熒光，因此在本實(shí)施例中使用該化合物進(jìn)行檢測(cè)。在整個(gè)pH范圍內(nèi)，100μM丙烯酸和兩種不同等級(jí)的丙烯酰胺，特別是凝膠電泳丙烯酰胺(GE)和分子生物學(xué)丙烯酰胺(MB)用100μM化合物4進(jìn)行測(cè)試?；衔?和丙烯酸/丙烯酰胺之間的反應(yīng)在磷酸鹽緩沖液(具有所示的不同pH)中在10％DMSO中進(jìn)行，在302nm下的光活化時(shí)間為1分鐘。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光。丙烯酸在pH11.0下顯示信號(hào)檢測(cè)峰，而丙烯酰胺在pH9.0下顯示峰。該比較的結(jié)果示于圖17中。顯然，本公開的檢測(cè)方法能夠檢測(cè)丙烯酸鹽/酯衍生物。化合物4也用于體外檢測(cè)丙烯酰胺?；衔?和丙烯酰胺之間的反應(yīng)在具有10％DMSO的pH9.0的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行，在302nm下的光活化時(shí)間為1分鐘。如圖18中所示，使用100μM化合物4，使用熒光酶標(biāo)儀可以容易地檢測(cè)到1μM至100μM的丙烯酰胺濃度。在含有1％Tween-20的pH9.0的磷酸鹽緩沖液中的10％(v/v)不同的油中摻入10mM丙烯酰胺(凝膠電泳等級(jí))。對(duì)照未受污染。這些混合物的反應(yīng)設(shè)定為用100μM化合物4，在302nm下的光活化時(shí)間為1分鐘。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光。如圖19所支持的，顯示化合物4能夠檢測(cè)復(fù)合有機(jī)/洗滌劑混合物中的丙烯酰胺。在含有1％Tween-20的pH9.0磷酸鹽緩沖液中的10％(v/v)不同的油用100μM化合物4進(jìn)行測(cè)試，在302nm下的光活化時(shí)間為1分鐘。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光。向日葵油中雙鍵的存在可能是該油具有最高熒光測(cè)量的原因。因此，當(dāng)使用本發(fā)明方法時(shí)，“雙鍵”可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的讀數(shù)或可能作為污染物。結(jié)果示于圖20中。在pH7至13的范圍內(nèi)，100μM丙烯酸和丙烯酰胺(凝膠電泳等級(jí))用100μM化合物4進(jìn)行測(cè)試?；衔?和丙烯酸/丙烯酰胺之間的反應(yīng)在磷酸鹽緩沖液(具有不同的所示pH)中在10％DMSO中進(jìn)行，在302nm下的光活化時(shí)間為1分鐘。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光。丙烯酸在pH10.0下顯示信號(hào)檢測(cè)峰，而丙烯酰胺在pH9.0下具有熒光峰。結(jié)果示于圖21中。實(shí)施例14-使用生物素化探針的檢測(cè)在pH9.0緩沖液中的不同濃度的丙烯酰胺用100μM生物素化化合物4(參見圖22a)或未綴合的化合物4(參見圖22b)在溶液中進(jìn)行測(cè)試，在302nm下的光活化時(shí)間為1分鐘。使用熒光酶標(biāo)儀獲取熒光讀數(shù)。使用抗生蛋白鏈菌素珠，與丙烯酰胺綴合的生物素化探針被下拉并分離(參見圖22c)，并且對(duì)應(yīng)于增加量的丙烯酰胺檢測(cè)到增加的熒光。對(duì)照包含未生物素化探針用于下拉，其顯示背景珠熒光?；诖?，生物素化提高本檢測(cè)方法的速度和準(zhǔn)確性。從圖23可以觀察到生物素化探針也對(duì)丙烯酸起作用。左側(cè)的兩個(gè)小瓶?jī)H含有生物素化化合物4。左側(cè)的第一個(gè)(最左邊的)小瓶暴露于UV達(dá)2分鐘，但未顯示熒光。左側(cè)的第二個(gè)小瓶未暴露于UV。另一方面，布置于右側(cè)的兩個(gè)小瓶含有與丙烯酸混合的生物素化化合物4。布置于右側(cè)的第一個(gè)(左)小瓶在通過(guò)UV光活化的2分鐘內(nèi)觀察到熒光。布置于右側(cè)的第二個(gè)(最右邊的)小瓶未顯示任何熒光，因?yàn)樗鼪]有暴露于UV。在如圖23中所示的這組實(shí)驗(yàn)中，探針含有與生物素基團(tuán)綴合的化合物4。實(shí)施例15-體內(nèi)檢測(cè)在該實(shí)施例中測(cè)試化合物4在體內(nèi)作為丙烯酸傳感器的用途。使大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)至晚對(duì)數(shù)期(OD600約為1.0)，并在37℃下用100μM丙烯酸處理10分鐘。洗滌后，將細(xì)胞用100μM化合物4處理，并在37℃下在黑暗中孵育30分鐘。將細(xì)胞洗滌，沉淀，懸浮于1×PBS中，并封固在載玻片上。然后將它們暴露于302nm的UV光達(dá)1分鐘，并在室溫下恢復(fù)約2小時(shí)后在熒光顯微鏡(使用DAPI濾光片)下成像。對(duì)照細(xì)胞包括未處理的細(xì)胞；單獨(dú)用丙烯酸或化合物4處理并且未經(jīng)UV處理的細(xì)胞。圖24中的結(jié)果顯示，細(xì)菌細(xì)胞僅在丙烯酸和化合物4兩者存在下發(fā)熒光。已經(jīng)顯示在兩種細(xì)菌種類中丙烯酸作為代謝中間體產(chǎn)生，所述兩種細(xì)菌種類例如但不限于丙酸梭菌和埃氏巨球形菌。在這些微生物中，乳酸至丙酸的還原通過(guò)丙烯酰輔酶A中間體進(jìn)行。為了測(cè)試針對(duì)丙烯酸的體內(nèi)產(chǎn)生的二芳基四唑傳感器，將化合物4應(yīng)用于丙酸梭菌細(xì)胞。使丙酸梭菌細(xì)胞在缺氧室中生長(zhǎng)至晚對(duì)數(shù)期(OD600約為1.0)，并用100μM化合物4處理。在37℃下在黑暗中孵育30分鐘后，將細(xì)胞洗滌，沉淀，懸浮于PBS緩沖液中，并封固在載玻片上。將細(xì)胞暴露于302nm的UV光達(dá)1分鐘，并在室溫下恢復(fù)約2小時(shí)后在熒光顯微鏡(使用DAPI濾光片)下成像。對(duì)照細(xì)胞包括用丙烯酸和化合物4處理以觀察陽(yáng)性熒光的細(xì)胞；未處理的細(xì)胞和單獨(dú)用丙烯酸處理并且未經(jīng)UV處理的細(xì)胞。圖25a和圖25b中的結(jié)果顯示在添加100μM丙烯酸的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中和在丙酸梭菌細(xì)胞中細(xì)胞都是熒光的。圖25b顯示丙酸梭菌裂解物的熒光結(jié)果。這表明在這些細(xì)胞中丙烯酸中間體的產(chǎn)生，并且二芳基四唑探針能夠檢測(cè)它們。圖26顯示了在未處理(26a)或用5mM和10mM3-丁炔酸(分別為26b和26c)處理的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的丙酸梭菌和大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞裂解物的熒光信號(hào)。將細(xì)胞裂解物用500mM二芳基四唑化合物4處理用于熒光檢測(cè)。使用來(lái)自如上段中所示的相同實(shí)驗(yàn)的這些細(xì)胞裂解物，使用熒光讀板器定量測(cè)量熒光信號(hào)。因此，這表明本公開的二芳基四唑探針可用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物。作為?；o酶A脫氫酶抑制劑的3-丁炔酸能夠促進(jìn)丙烯酰輔酶A在細(xì)胞中的積累。在丙酸梭菌中，丙烯酰輔酶A通常轉(zhuǎn)化成丙酰輔酶A。然而，在3-丁炔酸的存在下，該反應(yīng)被抑制。因此，在含有3-丁炔酸的細(xì)胞中，熒光信號(hào)較高，表明丙烯酸含量較高。丙酸梭菌天然產(chǎn)生丙烯酸，但大腸桿菌可能不會(huì)天然產(chǎn)生丙烯酸。比較實(shí)施例1-氣相色譜如上所述，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中使用化合物4來(lái)檢測(cè)丙烯酸?；衔?和丙烯酸之間的反應(yīng)在水中進(jìn)行，在302nm下的光活化時(shí)間為1分鐘。使用100μM化合物4，使用熒光酶標(biāo)儀可以容易地檢測(cè)到1μM至100μM的丙烯酸濃度(參見圖3和實(shí)施例9)。將該結(jié)果與不使用本公開設(shè)想的二芳基四唑化合物的丙烯酸的GC檢測(cè)進(jìn)行比較。用于GC分析的樣品必須提取到揮發(fā)性有機(jī)溶劑(例如乙醚)中，然后才能進(jìn)行分析。GC分析的檢測(cè)限為250μM(參見下表3)，而使用實(shí)施例9和11中所公開的熒光測(cè)定可容易地檢測(cè)到100μM的所提取丙烯酸。GC的耗時(shí)的樣品提取過(guò)程不提供高通量篩選方法。[表3]將丙烯酸(6.8μL,99μmol)溶于溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基(993.2μL)中，并劇烈攪拌10秒，然后用LB稀釋至其各自的濃度。可使用基本培養(yǎng)基來(lái)替換LB培養(yǎng)基。將1000μL每種濃度的樣品轉(zhuǎn)移至2mL微量離心管(eppendorftube)中，并用30-50μL5MHCl酸化。將每個(gè)樣品劇烈攪拌約10秒，并靜置3至5分鐘。測(cè)試每個(gè)樣品的pH以確保pH≤2。然后向酸化的樣品中添加乙醚(1000μL×2)用于提取。然后將合并的乙醚層濃縮至約60μL用于氣相色譜質(zhì)譜。提取的樣品不允許完全蒸發(fā)，因?yàn)樗鼘⒂绊慓CMS結(jié)果。在約17.4分鐘的保留時(shí)間檢測(cè)到丙烯酸。各種濃度的丙烯酸的GCMS結(jié)果示于圖6a至圖14c中。圖6c顯示當(dāng)丙烯酸的濃度為100mM時(shí)丙烯酸峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。與在90秒之前或甚至在1分鐘之前檢測(cè)丙烯酸的本公開的方法相比，該GC方法較慢。工業(yè)適用性如本文所定義的方法使得能夠通過(guò)使如上所述的二芳基四唑與含有丙烯酸或其衍生物的樣品接觸或混合來(lái)檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的存在或不存在。如果檢測(cè)到丙烯酸或其衍生物，則這種混合物的光活化可導(dǎo)致混合物發(fā)熒光。有利的是，該熒光感測(cè)方法可以提供快速檢測(cè)丙烯酸或其衍生物的方法，而不需要例如GCMS和HPLC的那些繁瑣的樣品制備。可以消除化學(xué)衍生化和龐大的檢測(cè)設(shè)備，因?yàn)闄z測(cè)依賴于熒光。另外有利的是，與常規(guī)方法例如GCMS、液相色譜或HPLC等相比，本發(fā)明方法還可以允許高通量檢測(cè)。本發(fā)明方法還可以使用非細(xì)胞毒性化合物作為檢測(cè)探針。因此，本發(fā)明的方法和探針可用于在體外和體內(nèi)檢測(cè)丙烯酸或其衍生物。相應(yīng)地，如本文所述的探針可以用于如上所述的本檢測(cè)方法中，并且這種探針可以具有上述優(yōu)點(diǎn)。所述探針可以進(jìn)一步生物素化以提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。當(dāng)使用或用于檢測(cè)丙烯酸或其衍生物時(shí)，包含這種探針的試劑盒也可具有上述優(yōu)點(diǎn)。顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，在閱讀上述公開內(nèi)容之后，本發(fā)明的各種其它修改和調(diào)整對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，并且所有這樣的修改和調(diào)整均意欲在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3