交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年6月4日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/007,830的權(quán)益，其通過引用全文并入本文。

背景技術(shù)：

乳腺癌是迄今為止女性中最常見的癌癥形式，并且是人類癌癥死亡的第二大主要原因。盡管在乳腺癌診斷和治療中已取得進(jìn)展，但是該疾病的發(fā)病率從1940年起以每年約1％的速率穩(wěn)步上升。如今，生活在北美洲的女性在其一生中罹患乳腺癌的可能性為八分之一。

目前乳房攝影術(shù)(mammography)的廣泛使用已經(jīng)導(dǎo)致乳腺癌檢測(cè)的改善。盡管如此，由乳腺癌引起的死亡率仍未改變，每100000名女性中大約有27例死亡。醫(yī)生使用乳腺影像報(bào)告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)(bi-rads)——乳房攝影術(shù)的一種普遍認(rèn)可的預(yù)測(cè)值風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和質(zhì)量保證工具——將乳腺病變分成從0到vi范圍的若干種bi-rads類別，并基于bi-rads分類作出診斷和疾病管理的建議?？赡苡捎阱e(cuò)誤歸類至不正確的bi-rads類別的比例較高及其對(duì)臨床因素的影響，乳腺癌常常是在極晚期的階段才被發(fā)現(xiàn)，此時(shí)的治療選擇和存活率已非常有限。事實(shí)上，女性基于其bi-rads分類獲得的信息可表示是否召回進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估和未能早期檢測(cè)的可能性之間的差異。雖然放射科醫(yī)生之間對(duì)于該范圍的較低端(即bi-radsi或ii)和該范圍的較高端(bi-radsiv或v)具有高度的一致性或共識(shí)，但放射科醫(yī)生之間對(duì)于他們將乳腺病變分類為ii類和iii類似乎觀察到較高程度的不一致性。inter-andintra-radiologistvariabilityinthebi-radsassessmentandbreastdensitygroupscategoriesforscreeningmammograms.redondo等人.brjradiol.85(1019)；2012年11月,第1465-1470頁；useoftheamericancollegeofradiologybi-radsguidelinesbycommunityradiologists:concordanceofassessmentsandrecommendationsassignedtoscreeningmammograms.lehman等人.am.j.roentgenology.2002；179(1),第15-20頁。因此，對(duì)于更好的疾病分類、乳腺病變的早期檢測(cè)和乳房病癥的診斷的需求尚未得到滿足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體進(jìn)行針對(duì)與乳房病癥相關(guān)的至少一種生物標(biāo)志物的篩查。在某些實(shí)施方案中，有需要的個(gè)體的乳房病癥診斷或預(yù)后方法對(duì)于具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的診斷或預(yù)后特別有用。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括使乳頭與收集裝置相接觸。在一些實(shí)施方案中，該收集裝置包含固相樣品收集介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該收集裝置進(jìn)一步包含使該裝置附接至乳房的乳房接合部件。在一些實(shí)施方案中，該固相樣品收集介質(zhì)選自吸收性紙、顯微鏡載玻片、毛細(xì)管、收集管、柱、微型柱、孔(well)、板、膜、濾器、樹脂、無機(jī)基質(zhì)、珠、顆粒狀層析介質(zhì)、塑料微粒、膠乳顆粒、涂覆的管、涂覆的模板、涂覆的珠、涂覆的基質(zhì)或其組合。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在乳房攝影術(shù)之前從所述個(gè)體的乳房的乳頭導(dǎo)管處去除角蛋白。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在乳房攝影術(shù)之前將阿托品施用到個(gè)體的乳頭上。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在進(jìn)行乳房攝影術(shù)之前將催產(chǎn)素施用于所述個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，所述篩查包括使來自導(dǎo)管內(nèi)流體的細(xì)胞與能結(jié)合選自ck5、ck14、ck7、ck18和p63的抗原的抗體相接觸。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種生物標(biāo)志物包括細(xì)胞學(xué)、蛋白質(zhì)、糖蛋白、dna、rna、基因突變、單核苷酸多態(tài)性、dna拷貝數(shù)、dna的甲基化、組蛋白和/或蛋白質(zhì)、微rna、微生物組(microbiome)或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述篩查包括使來自導(dǎo)管內(nèi)流體的細(xì)胞與能結(jié)合選自ck5、ck14、ck7、ck18和p63的抗原的抗體相接觸。在一些實(shí)施方案中，所述篩查包括在所述導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中確定一種或多種mirna的存在和/或水平、對(duì)mirna特征(signature)進(jìn)行概況分析(profiling)，或其組合。在一些實(shí)施方案中，該mirna選自表3、表4、表5或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的mirna是外來體的(exosomal)。在一些實(shí)施方案中，所述篩查包括擴(kuò)增、測(cè)序、限制性長度多態(tài)性分析、微陣列分析、多重分析或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述篩查包括使來自導(dǎo)管內(nèi)流體的細(xì)胞與能結(jié)合upa、pai-1及gal-galnac的抗體相接觸、檢測(cè)導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中公開于表5中的改變的mirna特征，或檢測(cè)導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中upa、pai-1及galnac轉(zhuǎn)移酶基因的改變的dna甲基化模式。

在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括根據(jù)所述篩查的結(jié)果來確定或修改針對(duì)個(gè)體的治療方案。在一些實(shí)施方案中，該治療方案包括治療劑、放射療法和/或手術(shù)切除乳房組織。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為蒽環(huán)類(例如，多柔比星或表柔比星)、鉑劑、紫杉烷(例如，紫杉醇或多烯紫杉醇(docetaxel))或其組合。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為ado-曲妥珠單抗emtansine、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、阿那曲唑、丁酸、卡培他濱、卡鉑、順鉑、環(huán)磷酰胺、多烯紫杉醇、鹽酸多柔比星、鹽酸表柔比星、艾立布林、依維莫司、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、鹽酸吉西他濱、醋酸戈舍瑞林、伊沙匹隆、二甲苯磺酸拉帕替尼、來曲唑、脂質(zhì)體多柔比星、醋酸甲地孕酮、氨甲喋呤、米托蒽醌、紫杉醇、帕米膦酸二鈉、培妥珠單抗、雷洛昔芬、他莫昔芬或他莫昔芬衍生物(諸如4-羥基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬和順式他莫昔芬)、托瑞米芬、曲妥珠單抗、長春瑞濱(ado-trastuzumabemtansine,albumin-boundpaclitaxel,anastrozole,butyricacid,capecitabine,carboplatin,cisplatin,cyclophosphamide,docetaxel,doxorubicinhcl,epirubicinhcl,eribulin,everolimus,exemestane,fluorouracil,fulvestrant,gemcitabinehcl,goserelinacetate,ixabepilon,lapatinibditosylate,letrozole,liposomaldoxorubicin,megestrolacetate,methotrexate,mitoxantrone,paclitaxel,pamidronatedisodium,pertuzumab,raloxifene,tamoxifen,oratamoxifenderivative(suchas4-hydroxytamoxifen,n-desmethyltamoxifenandcis-tamoxifen),toremifene,trastuzumab,vinorelbine)或其組合。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為ado-曲妥珠單抗emtansine、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、阿那曲唑、丁酸、卡培他濱、卡鉑、順鉑、環(huán)磷酰胺、多烯紫杉醇、鹽酸多柔比星、鹽酸表柔比星、艾立布林、依維莫司、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、鹽酸吉西他濱、醋酸戈舍瑞林、伊沙匹隆、二甲苯磺酸拉帕替尼、來曲唑、脂質(zhì)體多柔比星、醋酸甲地孕酮、氨甲喋呤、米托蒽醌、紫杉醇、帕米膦酸二鈉、培妥珠單抗、雷洛昔芬、他莫昔芬、他莫昔芬衍生物、4-羥基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬、內(nèi)昔芬(endoxyfen)、順式他莫昔芬、托瑞米芬、曲妥珠單抗、長春瑞濱或其組合。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為serm、serd、ai、其藥用鹽或其組合。在一些實(shí)施方案中，該治療劑進(jìn)一步包括至少一種ω-3脂肪酸和至少一種維生素d化合物。

具體實(shí)施方式

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物的篩查。在一些實(shí)施方案中，該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品包括乳腺流體，全細(xì)胞，細(xì)胞碎片，細(xì)胞膜，導(dǎo)管內(nèi)流體中選定的液體部分、細(xì)胞部分或其它固體部分，以及該導(dǎo)管內(nèi)流體的蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽、脂質(zhì)、糖、寡糖、糖脂類、核苷酸(包括dna和rna多核苷酸)和其它類似生物化學(xué)組分和分子組分。在一些實(shí)施方案中，該方法包括使收集裝置與乳房相接觸。在一些實(shí)施方案中，由乳房攝影裝置施加的壓力導(dǎo)致導(dǎo)管內(nèi)流體從乳房中擠出(expression)。在一些實(shí)施方案中，該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品通過收集裝置收集。在一些實(shí)施方案中，對(duì)該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥的生物標(biāo)志物的篩查。

定義

術(shù)語“個(gè)體”、“受試者”或“患者”可以互換使用。如本文所用，它們表示任何哺乳動(dòng)物(即，在分類學(xué)分類為動(dòng)物界:脊索動(dòng)物門:脊椎動(dòng)物亞門:哺乳綱內(nèi)的任意目、科和屬的種)。在一些實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物為人類。這些術(shù)語均不需要或不限于以醫(yī)護(hù)工作者(例如，醫(yī)生、注冊(cè)護(hù)士、從業(yè)護(hù)士、醫(yī)生助手、護(hù)理員或臨終護(hù)理人員)的監(jiān)督(例如持續(xù)的或間歇性的)為特征的情形。

如本文所用，“乳房病癥”意為乳房的任何病癥。乳房病癥包括乳房的良性病變及乳腺癌。良性乳房病變包括但不限于致密型乳腺、乳腺炎、柱狀細(xì)胞增生、非典型柱狀細(xì)胞增生、導(dǎo)管增生、小葉增生、非典型導(dǎo)管增生和非典型小葉增生。

如本文所用，“乳腺癌”意為乳腺細(xì)胞的任何惡性腫瘤。存在若干種乳腺癌。示例性的乳腺癌包括但不限于原位導(dǎo)管癌、原位小葉癌、侵襲性(或浸潤性)導(dǎo)管癌、侵襲性(或浸潤性)小葉癌、炎性乳腺癌、三陰性乳腺癌、er+乳腺癌、her2+乳腺癌、腺樣囊性(或腺囊性)癌、低分級(jí)(low-grade)腺鱗癌、髓樣癌、粘液(或膠質(zhì))癌、乳頭狀癌、小管癌、化生性癌和微乳頭狀癌。單個(gè)乳腺腫瘤可以是這些類型的組合或侵襲性和原位癌的混合。

如本文所使用的術(shù)語“診斷”是指分子或病理學(xué)狀態(tài)、疾病或病況的鑒別，諸如乳房病癥或乳房病癥的分子亞型的鑒別。

如本文所使用的術(shù)語“預(yù)后”是指對(duì)可歸因于乳腺癌的死亡的可能性或包括復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和抗藥性在內(nèi)的乳房病癥進(jìn)展的可能性的預(yù)測(cè)。術(shù)語“預(yù)測(cè)”可指基于觀察、經(jīng)驗(yàn)或科學(xué)推理的預(yù)言或預(yù)估的行為。在一個(gè)實(shí)例中，在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤并且/或者進(jìn)行一段特定時(shí)間的化學(xué)療法而癌癥未見復(fù)發(fā)后，醫(yī)生可預(yù)測(cè)患者能存活的可能性。

當(dāng)前的診斷方法

乳房攝影(mammogram)是乳房的x射線照片。其利用電離輻射來產(chǎn)生乳房組織的圖像，該圖像使得腫塊和/或微鈣化能夠可視化。乳房攝影用來對(duì)沒有疾病指征(sign)或癥狀的女性進(jìn)行乳房病癥的檢查以及在發(fā)現(xiàn)腫塊或疾病的其它指征或癥狀后進(jìn)行乳房病癥的檢查。

乳房攝影術(shù)減少了年齡為40到74歲的女性因癌癥而死亡的人數(shù)。然而，乳房攝影術(shù)有若干缺點(diǎn)，包括：假陽性結(jié)果和過度診斷、假陰性結(jié)果和無法全面診斷以及輻射暴露。當(dāng)放射科醫(yī)生在不存在乳腺癌時(shí)錯(cuò)誤地將乳房攝影解釋成表示存在乳腺癌時(shí)將產(chǎn)生假陽性結(jié)果。假陽性結(jié)果導(dǎo)致過度診斷及過度治療。研究表明，在10次每年進(jìn)行的乳房攝影后具有假陽性結(jié)果的可能性為約50％到60％。在乳房攝影顯示原位導(dǎo)管癌(dcis——可變成癌性細(xì)胞的異常細(xì)胞在乳腺管的內(nèi)襯中積累的一種非侵襲性腫瘤)的情況下，假陽性尤為常見。這導(dǎo)致過度診斷及過度治療。假陰性結(jié)果導(dǎo)致無法全面診斷及癌癥的進(jìn)展。假陰性結(jié)果在具有致密型乳腺或患有小葉癌、粘液癌或快速發(fā)展的癌的個(gè)體中很常見。大多數(shù)絕經(jīng)前女性具有致密型乳腺，并且許多絕經(jīng)后女性也具有致密型乳腺。乳房攝影術(shù)在具有致密型乳腺的女性中發(fā)現(xiàn)癌癥的靈敏度可為15％到30％。

乳房攝影術(shù)的一種普遍認(rèn)可的預(yù)測(cè)值風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和質(zhì)量保證工具為乳腺影像報(bào)告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)(bi-rads)。乳腺病變被分為從0到vi范圍的若干種bi-rads類別。醫(yī)生采用bi-rads作為乳房病癥管理工具來提出建議。

表1

雖然觀察者間對(duì)于該范圍的較低端(即bi-radsi或ii)和該范圍的較高端(bi-radsiv或v)具有高度的一致性，但據(jù)報(bào)道，觀察者間在bi-radsii類和iii類之間較高程度地缺乏一致性(即，不一致性)(inter-andintra-radiologistvariabilityinthebi-radsassessmentandbreastdensitygroupscategoriesforscreeningmammograms.redondo等人.brjradiol.85(1019)；2012年11月,第1465-1470頁；useoftheamericancollegeofradiologybi-radsguidelinesbycommunityradiologists:concordanceofassessmentsandrecommendationsassignedtoscreeningmammograms.lehman等人.am.j.roentgenology.2002；179(1).第15-20頁)。具有最高的53.5％的不一致性的評(píng)估為“可能良性發(fā)現(xiàn)”(iii類)。例如，放射科醫(yī)生之間關(guān)于分類成bi-radsii和iii類還是分類成iva和ivb類的分歧意味著，其中一位放射科醫(yī)生已檢測(cè)到良性病變且未發(fā)現(xiàn)召回個(gè)體進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估的理由，而另一位已發(fā)現(xiàn)可能良性的病變并建議進(jìn)一步評(píng)估，這似乎是一種主觀評(píng)價(jià)(redondo等人；bi-radslexiconforusandmammography:interobservervariabilityandpositivepredictivevalue.lazarus等人.radiology.2006,239(2),第385-391頁)。事實(shí)上，女性得到的信息(這將改變下一步)是召回進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。但由于錯(cuò)誤歸類的比例較高及其對(duì)臨床因素的影響，在放射科醫(yī)生群體中關(guān)于bi-radsiii和iv類的最終評(píng)估的歸類存在一些爭議。因此，對(duì)于更好的疾病分類、乳腺病變的早期檢測(cè)和乳房病癥的診斷的需求尚未得到滿足。

乳房病癥

正常的乳腺由導(dǎo)管和具有雙層結(jié)構(gòu)的小葉組成。腔分泌細(xì)胞圍繞中空內(nèi)腔，進(jìn)而被與基底膜直接接觸的一層肌上皮細(xì)胞所圍繞。

乳腺增生

增生(又稱上皮增生或增生性乳腺疾病)是指內(nèi)襯于導(dǎo)管或小葉的細(xì)胞的過度生長。當(dāng)增生在導(dǎo)管中時(shí)，稱為導(dǎo)管增生或?qū)Ч苌掀ぴ錾?。?dāng)增生累及小葉時(shí)，稱為小葉增生。

增生通常采用芯針活檢或手術(shù)活檢來診斷?；诩?xì)胞在顯微鏡下所見，將增生表述為輕度增生、普通增生或非典型增生。輕度增生并不會(huì)增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。普通類型的增生(沒有異型性)，也稱為普通型增生，使患癌風(fēng)險(xiǎn)增加至無乳腺異常的女性的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的約1¹/2至2倍。非典型增生(非典型導(dǎo)管增生[adh]或非典型小葉增生[alh])使乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加至無乳腺異常的女性的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的約4至5倍。

此外，隨著篩查乳房攝影術(shù)的廣泛采用，乳腺的柱狀細(xì)胞病變(ccl)，包括柱狀細(xì)胞增生(cch)，已成為乳房活檢中的常見發(fā)現(xiàn)。接近于已知的癌前變化和癌性變化的ccl的存在表明ccl可能是癌變前的，并且已知ccl和低分級(jí)dcis的高頻率發(fā)生存在于同一乳房中，且ccl和dcis通常發(fā)生在同一個(gè)或相鄰的末端導(dǎo)管小葉單位(tdlu)中。由于更晚期的ccl和非典型增生及dcis在細(xì)胞學(xué)變化及結(jié)構(gòu)變化上的相似性，提出ccl是非典型乳腺增生和乳腺癌的先兆。

乳腺癌

乳腺癌通常開始于小葉或?qū)Ч艿募?xì)胞中。乳腺癌可能為“混合瘤”，這意味著其包含癌性導(dǎo)管細(xì)胞和小葉細(xì)胞的混合物。在這類情況下，癌被視為導(dǎo)管癌。如果乳腺中存在多于一個(gè)腫瘤，則將乳腺癌描述為多灶性或多中心的。在多灶性乳腺癌中，所有腫瘤均源自原始腫瘤，并且它們通常位于乳腺的相同區(qū)段。如果癌為多中心的，則意味著所有腫瘤均分別形成，并且它們通常位于乳腺的不同區(qū)域。

侵襲性與非侵襲性：克服乳房攝影術(shù)的現(xiàn)有缺點(diǎn)

非侵襲性癌停留在乳腺的導(dǎo)管或小葉內(nèi)。它們沒有長入或侵入乳腺之內(nèi)或之外的正常組織。非侵襲性癌有時(shí)被稱為原位癌(“在同一個(gè)地方”)且很多人認(rèn)為其為癌前病變(pre-cancer)。

侵襲性癌擴(kuò)張或遷移到正常、健康的組織內(nèi)。大多數(shù)乳腺癌是侵襲性的。癌是非侵襲性的還是侵襲性的將會(huì)影響對(duì)其的治療選擇和響應(yīng)。

乳腺癌可以既為侵襲性的又為非侵襲性的。這意味著，癌的一部分已經(jīng)長入正常組織內(nèi)，且癌的一部分仍停留在乳導(dǎo)管或乳小葉內(nèi)。在這樣的情況下，這些癌將被視為侵襲性的。

在大多數(shù)情況下，乳腺癌被分類為以下中的一種：dcis(原位導(dǎo)管癌)；mic(微侵襲性乳腺癌)；micb和dcim。dcis為停留在乳導(dǎo)管內(nèi)的非侵襲性癌。mic為dcis的亞型。它具有小于1.0mm的大小，并且約10％或更少的mic細(xì)胞已經(jīng)離開導(dǎo)管組織(原始腫瘤部位)。

lcis(原位小葉癌)：lcis為停留在小葉內(nèi)的細(xì)胞的過度生長。其表明發(fā)展為侵襲性癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。idc(侵襲性導(dǎo)管癌)是乳腺癌最常見的類型。侵襲性導(dǎo)管癌(idc)雖然從乳導(dǎo)管內(nèi)開始，但已經(jīng)長入乳腺內(nèi)的周圍正常組織中。ilc(侵襲性小葉癌)雖然在小葉內(nèi)開始，但長入乳腺內(nèi)的周圍正常組織中。

表2

分子亞型

基因表達(dá)概況分析將乳腺癌分為四個(gè)主要的生物學(xué)上不同的本征亞型：管腔a型、管腔b型、人表皮生長因子受體-2(her2)過表達(dá)型及基底樣/三陰性型。這些分子亞型具有預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值。不同分子亞群的預(yù)后和化療敏感性不同。

er+乳腺癌的特征為在癌細(xì)胞的表面上存在雌激素受體。er+癌細(xì)胞的生長與雌激素的利用度有關(guān)。針對(duì)er+乳腺癌的治療選擇為阻斷雌激素的化療劑(例如他莫昔芬)。

her2+乳腺癌的特征為在癌細(xì)胞的細(xì)胞表面上有過量的her2。her2+癌通常用曲妥珠單抗聯(lián)合其它化療劑進(jìn)行治療。

三陰性乳腺癌是一種特征為細(xì)胞缺乏雌激素受體和孕酮受體且其表面上沒有過量的her2蛋白質(zhì)的乳腺癌。三陰性乳腺癌通常比其它乳腺癌更具侵襲性。由于該腫瘤細(xì)胞缺乏雌激素和孕酮受體，因此激素療法(例如他莫昔芬)是無效的。此外，由于細(xì)胞缺乏her2蛋白質(zhì)，因此靶向her2的藥物(例如曲妥珠單抗)是無效的。

管腔癌

大多數(shù)乳腺癌為管腔腫瘤。管腔腫瘤細(xì)胞看起來像在內(nèi)襯于乳導(dǎo)管的內(nèi)部(管腔)細(xì)胞中開始的乳腺癌的細(xì)胞。

管腔a型乳腺癌為er+和/或pr+、her2-、低ki67。約42-59％的乳腺癌為管腔a型。管腔a型腫瘤往往具有低或中等的腫瘤分級(jí)。在四個(gè)亞型中，管腔a型腫瘤往往具有最好的預(yù)后，并具有相當(dāng)高的存活率和相當(dāng)?shù)偷膹?fù)發(fā)率。僅有約15％的管腔a型腫瘤具有p53突變，p53突變是與預(yù)后不良相關(guān)的因素。

管腔b型乳腺癌為er+和/或pr+、her2+(或具有高ki67的her2-)。約6-17％的乳腺癌為管腔b型。具有管腔b型腫瘤的女性往往比那些具有管腔a型腫瘤的女性在更年輕的年齡時(shí)被診斷出。與管腔a型腫瘤相比，管腔b型腫瘤也往往具有導(dǎo)致預(yù)后不良的因素，包括：較差的腫瘤分級(jí)、較大的腫瘤大小和p53基因突變。通常，具有管腔b型腫瘤的女性具有相當(dāng)高的存活率，盡管并不像具有管腔a型腫瘤的女性的存活率那么高。

基底樣

約14-20％的乳腺癌為基底樣乳腺癌?；讟尤橄侔┡c管腔癌的不同之處在于對(duì)于免疫表型標(biāo)志物er-/pr-/her2-為三陰性的但表達(dá)ck5/6?；讟尤橄侔┍憩F(xiàn)出加重的缺氧和高腫瘤分級(jí)，并具有以高細(xì)胞增殖和較差的臨床結(jié)果為特征的侵襲性表型。大多數(shù)brca1乳腺癌和許多brca2乳腺癌為三陰性/基底樣兩者。與雌激素受體陽性亞型(管腔a型和管腔b型腫瘤)相比，三陰性/基底樣腫瘤通常為侵襲性的并具有不良的預(yù)后。三陰性/基底樣腫瘤通常采用手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法的某種組合來治療。這些腫瘤不能用激素療法或曲妥珠單抗來治療，因?yàn)樗鼈優(yōu)榧に厥荏w陰性和her2/neu-陰性的。

乳腺癌的診斷或預(yù)后方法

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物的篩查。有需要的個(gè)體的乳房病癥的這些診斷或預(yù)后方法對(duì)于具有bi-radsii-v病變、優(yōu)選bi-radsii-iv病變、更優(yōu)選bi-radsiii-iv病變的個(gè)體的診斷或預(yù)后特別有用。在一些實(shí)施方案中，該方法可用于區(qū)分管腔型和基底樣乳腺癌。在其它實(shí)施方案中，該方法可用于區(qū)分癌前病變與癌癥、增生與癌癥以及侵襲性與非侵襲性癌癥。在一些實(shí)施方案中，該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品包括乳腺流體，全細(xì)胞，細(xì)胞碎片，細(xì)胞膜，導(dǎo)管內(nèi)流體選定的液體部分、細(xì)胞部分或其它固體部分，以及導(dǎo)管內(nèi)流體的蛋白質(zhì)、糖蛋白、肽、脂質(zhì)、糖、寡糖、糖脂類、核苷酸(包括與細(xì)胞結(jié)合的和無細(xì)胞的dna(例如，cfdna、線粒體dna)和與細(xì)胞結(jié)合的和無細(xì)胞的rna多核苷酸、無細(xì)胞的dna和無細(xì)胞的rna(例如，mrna、線粒體rna和微rna)和其它類似生物化學(xué)組分和分子組分。在一些實(shí)施方案中，該方法包括使收集裝置與乳房相接觸。在一些實(shí)施方案中，由乳房攝影裝置施加的壓力導(dǎo)致導(dǎo)管內(nèi)流體從乳房中擠出。在一些實(shí)施方案中，所擠出流體的量為少于1微升。在一些實(shí)施方案中，所擠出流體的量為少于1納升。在一些實(shí)施方案中，所擠出流體的量為1納升到1皮升之間。在一些實(shí)施方案中，所擠出流體的量為1皮升、2皮升、3皮升、4皮升、5皮升、6皮升、7皮升、8皮升、9皮升、10皮升、10皮升到15皮升之間或15皮升到20皮升之間。在一些實(shí)施方案中，通過收集裝置收集導(dǎo)管內(nèi)流體樣品。在一些實(shí)施方案中，對(duì)導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥的生物標(biāo)志物的篩查。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括清潔乳房的乳頭。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在乳房攝影術(shù)之前將催產(chǎn)素施用于該個(gè)體。

收集裝置

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物的篩查。在一些實(shí)施方案中，該方法包括使收集裝置與乳房相接觸。在一些實(shí)施方案中，通過收集裝置收集導(dǎo)管內(nèi)流體樣品。在一些實(shí)施方案中，該收集裝置是可佩戴的。

在一些實(shí)施方案中，該收集裝置包含固相樣品收集介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該收集裝置進(jìn)一步包含使該裝置附接至乳房的乳房接合部件。

在一些實(shí)施方案中，該固相樣品收集介質(zhì)為吸收性紙。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙吸收流體。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙與蛋白質(zhì)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙與核苷酸、多核苷酸、dna、rna或其組合結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙不與細(xì)胞結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，所述收集裝置包含吸收性紙。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙吸收流體。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙與蛋白質(zhì)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙與核苷酸、多核苷酸、dna、rna或其組合結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該吸收性紙不與細(xì)胞結(jié)合。

與本文公開的方法一起使用的吸收性紙(其在本文中也可被稱為“膜”)是由適于收集上皮細(xì)胞和生物標(biāo)志物例如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸、rna、dna等的任意材料制成的。吸收性紙包括例如由硝化纖維素、微纖維素、混合纖維素酯或其它任何適用于導(dǎo)管內(nèi)流體樣品收集的材料制成的那些吸收性紙。

在一些實(shí)施方案中，吸收性紙不會(huì)對(duì)乳頭和/或乳暈造成紙切口。在一些實(shí)施方案中，吸收性紙成形為避免對(duì)乳頭和/或乳暈造成紙切口。

吸收性紙通過采用金屬模具由大的紙料沖壓該紙而形成。吸收性紙大到足以覆蓋或部分地覆蓋乳頭。在一些實(shí)施方案中，吸收性紙大到足以覆蓋乳頭。因此，在吸收性紙的任意尺寸上，吸收性紙?jiān)谄淦骄叽鏰處的直徑或長度可為約1.0英寸至約3.0英寸。吸收性紙的直徑可為例如約1.0、約1.1、約1.15、約1.2、約1.25、約1.3、約1.35、約1.4、約1.45、約1.5、約1.55、約1.6、約1.65、約1.7、約1.75、約1.8、約1.85、約1.9、約1.95、約2.0、約2.1、約2.15、約2.2、約2.25、約2.3、約2.35、約2.4、約2.45、約2.5、約2.55、約2.6、約2.65、約2.7、約2.75、約2.8、約2.85、約2.9、約2.95或約3.0英寸。在一些實(shí)施方案中，吸收性紙覆蓋或部分覆蓋乳房的乳暈。在一些實(shí)施方案中，吸收性紙覆蓋乳房的乳暈。在一些實(shí)施方案中，吸收性紙部分地覆蓋乳房的乳暈。在一些實(shí)施方案中，吸收性紙覆蓋乳頭但不延伸到乳房的乳暈。

吸收性紙的厚度可以變化，以允許最佳的樣品收集，并包括厚度為約0.0001英寸至約0.1英寸的材料。例如，吸收性紙的厚度可為約0.0001、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09或約0.1英寸。

在一些實(shí)施方案中，所述固相樣品收集介質(zhì)包括顯微鏡載玻片、毛細(xì)管、收集管、柱、微型柱、孔、板、膜、濾器、樹脂、無機(jī)基質(zhì)、珠、顆粒狀層析介質(zhì)、塑料微粒、膠乳顆粒、涂覆的管、涂覆的模板、涂覆的珠、涂覆的基質(zhì)或其組合。

催產(chǎn)素

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物的篩查。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在乳房攝影術(shù)之前將催產(chǎn)素或其類似物(包括羰催產(chǎn)素(carbetocin))施用于該個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在乳房攝影術(shù)之前將羰催產(chǎn)素施用于該個(gè)體。

在一些實(shí)施方案中，催產(chǎn)素或其類似物，包括羰催產(chǎn)素，刺激腺泡-導(dǎo)管組織的肌上皮收縮，這導(dǎo)致從個(gè)體的乳頭擠出導(dǎo)管內(nèi)流體。在一些實(shí)施方案中，鼻內(nèi)施用催產(chǎn)素或其類似物，包括羰催產(chǎn)素。在一些實(shí)施方案中，通過肌肉內(nèi)或血管內(nèi)注射來施用催產(chǎn)素或其類似物，包括羰催產(chǎn)素。在一些實(shí)施方案中，以有效刺激導(dǎo)管內(nèi)流體從乳頭擠出的量施用催產(chǎn)素或其類似物，包括羰催產(chǎn)素。

一旦經(jīng)過足夠的施用后時(shí)間，從而使催產(chǎn)素能到達(dá)并刺激目標(biāo)腺泡-導(dǎo)管組織，即從乳頭直接收集導(dǎo)管內(nèi)流體。在收集到導(dǎo)管內(nèi)流體后對(duì)該導(dǎo)管內(nèi)流體進(jìn)行生物測(cè)定，以確定乳房病癥的生物標(biāo)志物的存在和/或量。

任何適宜的催產(chǎn)素或其類似物(包括羰催產(chǎn)素)的制劑用于本文公開的方法中。

乳房的準(zhǔn)備

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物和/或與特定乳房病癥中較好的臨床結(jié)果有關(guān)的標(biāo)志物如t細(xì)胞標(biāo)志物的篩查。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括清潔乳房的乳頭。

用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄇ鍧嵢轭^。在一些實(shí)施方案中，對(duì)乳頭進(jìn)行消毒。在一些實(shí)施方案中，從乳頭處去除碎屑(例如，角蛋白栓)，從而增大對(duì)乳頭導(dǎo)管的可及性。在一些實(shí)施方案中，用含有去角質(zhì)(dekeratinizing)凝膠的溫和磨砂膏(scrub)來擦洗乳頭。在一些實(shí)施方案中，用去角質(zhì)劑(exfoliant)擦洗乳頭。任何合適的去角質(zhì)劑均可與本文所公開的方法結(jié)合使用。合適的去角質(zhì)劑的實(shí)例包括但不限于微纖維布、粘性剝離片、微珠面部磨砂膏、縐紙、碎杏仁或扁桃殼、糖或鹽晶體、浮石以及研磨材料，例如海綿、絲瓜絡(luò)、刷子、水楊酸、羥基乙酸、水果酶、檸檬酸、蘋果酸、α羥基酸(aha)和β羥基酸(bha)。在一些實(shí)施方案中，清潔乳頭導(dǎo)致乳頭導(dǎo)管打開。在一些實(shí)施方案中，清潔后乳頭導(dǎo)管的直徑為約0.1mm到約0.3mm。

乳頭導(dǎo)管具有環(huán)形平滑肌，其傾向于保持導(dǎo)管的管腔閉合。在一些實(shí)施方案中，將阿托品或相關(guān)的肌肉松弛藥如托吡卡胺或苯福林施用至個(gè)體。

導(dǎo)管內(nèi)流體的處理

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物的篩查。在一些情況下，在收集到乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體之后清洗固相樣品收集介質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，清洗固相樣品收集介質(zhì)去除了附著的干擾物。在一些實(shí)施方案中，清洗固相樣品收集介質(zhì)包括使其與緩沖溶液、去污劑或水接觸。示例性的去污劑包括但不限于：吐溫20(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯)、吐溫80(聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯)、tritonx-100(辛基苯氧基聚環(huán)氧乙醇)、(lifetechonologies，ca)和十四烷基三甲基溴化銨。在一些實(shí)施方案中，如此清洗的流出物利用包括但不限于顯微術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)的方法來分析。例如，在清洗含有導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的吸收性紙或膜以移除任意細(xì)胞之后，利用顯微術(shù)評(píng)估該清洗溶液，并確定流出物中的細(xì)胞數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，確定存在于流出物中的任何細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)一種或多種細(xì)胞外標(biāo)志物和/或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物對(duì)存在于流出物中的細(xì)胞進(jìn)行染色，以確定該細(xì)胞是否具有正常的概況(profile)或者是否具有一種或多種指示癌細(xì)胞的標(biāo)志物。例如，可分析細(xì)胞中brca1、brca2、p63、細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞角蛋白、her2或任何其它標(biāo)志物(該標(biāo)志物可基于其存在、不存在或其水平來指示該細(xì)胞為癌細(xì)胞或正常細(xì)胞)的存在與否。

在其它實(shí)施方案中，在清洗含有導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的吸收性紙或膜后，針對(duì)蛋白質(zhì)、dna如cfdna和線粒體dna以及rna如無細(xì)胞的rna和微rna(包括pri-mirna、pre-mirna和成熟mirna)的存在對(duì)清洗溶液進(jìn)行評(píng)估。提取dna或rna，隨后進(jìn)行進(jìn)一步的如本文公開的分析?？蛇M(jìn)行的分析的實(shí)例包括但不限于dna拷貝數(shù)變化、染色體畸變、dna突變(復(fù)制、缺失、倒位等)和單核苷酸多態(tài)性(snp)、dna甲基化、組蛋白甲基化和蛋白質(zhì)甲基化mirna表達(dá)或特征、凝集素特征變化和微生物組變化的確定。

在另一些實(shí)施方案中，在清洗含有導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的固相收集介質(zhì)如吸收性紙或膜后，對(duì)該固相收集介質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的如本文公開的分析。

在一些實(shí)施方案中，在測(cè)定之前或與之同時(shí)進(jìn)行初步評(píng)估以驗(yàn)證在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的樣品來源和/或質(zhì)量。這類初步評(píng)估的重點(diǎn)在于驗(yàn)證從乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體收集的樣品確實(shí)為乳房來源的，并且未被其它潛在的污染物(諸如來自乳頭周圍皮膚的汗液)所污染。其它用于樣品驗(yàn)證的乳腺流體標(biāo)志物包括但不限于特征性地由正常和癌性乳房上皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞角蛋白，以及與人乳脂肪球蛋白(hmfg)的糖蛋白組分相對(duì)應(yīng)的人乳房上皮抗原(hme-ag)。

篩查與分類

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物的篩查。在一些實(shí)施方案中，尤其是對(duì)患有bi-radsii-iv類的個(gè)體，本文公開的方法作為用作乳房攝影術(shù)的輔助手段的伴隨診斷方法是有用的。相應(yīng)地，在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體進(jìn)行針對(duì)與乳房病癥相關(guān)的至少一種生物標(biāo)志物的篩查。

在其它實(shí)施方案中，該方法可用于預(yù)測(cè)治療選擇、治療結(jié)果如患者復(fù)發(fā)和疾病復(fù)發(fā)、存活和對(duì)諸如化學(xué)療法、激素療法、放射療法等療法的響應(yīng)。在另一些實(shí)施方案中，本文公開的方法可用于監(jiān)控個(gè)體對(duì)治療性處理的響應(yīng)。

可在導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中測(cè)定的乳房病癥標(biāo)志物包括細(xì)胞學(xué)、基因突變(包括置換、缺失和倒位)、單核苷酸多態(tài)性(snp)、dna拷貝數(shù)、dna甲基化模式或特征、組蛋白甲基化模式或特征、微rna模式、微生物組模式、其它疾病生物標(biāo)志物或其組合。關(guān)于可用于本發(fā)明目的的乳房病癥標(biāo)志物的概括性和非全面的綜述，參見hirata等人.diseasemarkers,2014,第2014卷,文章id513158；pultz等人.j.cancer.2014,第5卷，第559-571頁；lari和keurer,j.cancer.2011,第2卷,第232-261頁，所有這些文獻(xiàn)均全文并入本文。

在一些實(shí)施方案中，所述篩查包括細(xì)胞學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、fish、ich、ria或其任意組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該篩查包括elisa。在其它實(shí)施方案中，該篩查包括基因、多核苷酸、dna(包括cfdna和線粒體dna)、rna(包括mrna、無細(xì)胞的或外來體的mirna和線粒體rna)、脂肪酸和糖蛋白以及凝集素的擴(kuò)增、測(cè)序、限制性片段長度多態(tài)性和微陣列或多重分析。

在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增通過連接酶鏈反應(yīng)(lcr)或聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)進(jìn)行，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄酶(rt-pcr)、定量pcr(qpcr)、定量rt-pcr(qrt-pcr)、實(shí)時(shí)pcr、等溫pcr、多重pcr、甲基化特異性pcr等。

在其它實(shí)施方案中，測(cè)序?yàn)殡p脫氧測(cè)序、反向-終止測(cè)序、新一代測(cè)序、條碼測(cè)序、配對(duì)末端測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、多重測(cè)序、合成測(cè)序、雜交測(cè)序、連接測(cè)序、單分子測(cè)序、單分子實(shí)時(shí)合成測(cè)序、亞硫酸氫鹽測(cè)序、全基因組測(cè)序和全外顯子組測(cè)序。在另一些實(shí)施方案中，通過rna-seq、全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測(cè)序和mrna-seq進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，在乳房病癥和微生物菌群失衡有關(guān)的情況下，優(yōu)選16srna測(cè)序。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)序?yàn)樯疃葴y(cè)序或超深度測(cè)序。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，該篩查包括本文公開的方法的任意組合且包括本領(lǐng)域已知的其它方法是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的單個(gè)細(xì)胞、多個(gè)細(xì)胞、單個(gè)細(xì)胞核和多個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行篩查。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)無細(xì)胞的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行篩查。

在一些實(shí)施方案中，利用亞硫酸氫鹽測(cè)序、甲基化敏感性pcr、甲基化dna免疫沉淀(medip)、甲基敏感性單核苷酸引物延伸(ms-snupe)、全基因組甲基化概況分析、甲基化敏感性限制酶分析、聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性分析、甲基化特異性量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(ms-qfret)、全基因組作圖或其組合中的任意一種或多種進(jìn)行對(duì)dna甲基化的篩查或評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，該dna甲基化篩查進(jìn)一步包括微陣列或多重雜交、基因表達(dá)、拷貝數(shù)分析、新一代測(cè)序或其組合。

乳導(dǎo)管包含兩種類型的上皮細(xì)胞，即內(nèi)管腔細(xì)胞和外基底/肌上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，利用生物標(biāo)志物表達(dá)(例如，通過免疫組織化學(xué)染色、通過差異性基因表達(dá)、mirna模式/特征和dna甲基化模式/特征、組蛋白甲基化模式/特征，等等)、基因分型、確定包括基因突變(缺失、插入、復(fù)制和倒位)、snp等遺傳標(biāo)志物的存在與否來區(qū)分管腔型乳腺癌與基底樣乳腺癌，區(qū)分增生、癌前病變、非侵襲性及侵襲性癌癥與轉(zhuǎn)移癌。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用生物標(biāo)志物表達(dá)(例如，通過免疫組織化學(xué)染色、mirna模式/標(biāo)記的改變和dna和/或組蛋白甲基化模式/標(biāo)記)來區(qū)分常見類型的增生與非典型增生、ccl與增生、癌前病變與癌癥、侵襲性與非侵襲性癌癥，等等。腫瘤蛋白p63(或者轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白63)是核轉(zhuǎn)錄因子p53家族的成員。p63的存在是基底上皮層的特征。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中p63的存在表明乳腺癌為基底樣乳腺癌。

細(xì)胞角蛋白(ck)5和ck14的存在是基底上皮層的特征。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中ck5和ck14的存在表明乳腺癌為基底樣乳腺癌。另外，ck5和ck14的存在是祖細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞的特征。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中ck5和ck14的存在表明該細(xì)胞為肌上皮細(xì)胞或祖細(xì)胞。

ck7和ck18的存在是管腔上皮層的特征。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中ck7和ck18的存在表明乳腺癌為管腔乳腺癌。

普通型導(dǎo)管增生表現(xiàn)出具有ck5/14和ck7/18兩者的表達(dá)的管腔染色模式。在肌上皮的細(xì)胞核中觀察到殘留的p63。在一些實(shí)施方案中，ck5、ck14、ck7和ck18的存在表明增生為普通型導(dǎo)管增生。

非典型導(dǎo)管增生或原位導(dǎo)管癌表現(xiàn)出分化的腺體免疫表型(ck7/ck18陽性)，但除肌上皮外為ck5/14-陰性。在一些實(shí)施方案中，ck7/ck18的存在及ck5/14的缺失表明增生為非典型導(dǎo)管增生。

侵襲性乳腺病變根據(jù)肌上皮細(xì)胞(ck5/14和/或p63)的數(shù)目減少或缺失及腺上皮細(xì)胞(ck7/18)的存在來鑒定。在一些實(shí)施方案中，在疑似乳腺癌的情況下，減少的或應(yīng)激下(under-stress)的肌上皮細(xì)胞的存在指示了向浸潤性的(infiltrating)狀態(tài)及可能侵襲性的(invasive)狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。原發(fā)性乳腺癌表現(xiàn)出管腔(導(dǎo)管壁)細(xì)胞數(shù)目的增加和肌上皮細(xì)胞數(shù)目的減少。隨著乳腺癌從原位的逐步發(fā)展成浸潤性的，最后發(fā)展成侵襲性的，肌上皮細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目減少。如果發(fā)現(xiàn)比管腔細(xì)胞的正常數(shù)目大，則提示肌上皮細(xì)胞的數(shù)目正在減少，并值得關(guān)注。在一些實(shí)施方案中，肌上皮細(xì)胞的缺失或數(shù)目減少及腺上皮細(xì)胞的存在表明病變是侵襲性的。

在一些實(shí)施方案中，通過免疫組織化學(xué)來確定生物標(biāo)志物表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，該免疫組織化學(xué)法是直接法。在一些實(shí)施方案中，從結(jié)合乳房攝影術(shù)獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中分離出的細(xì)胞與能結(jié)合靶抗原(例如，p63、ck5、ck7、ck14、ck18、er、pr、her-2、ki67、upa、pai-1和半乳糖-n-乙酰半乳糖胺(gal-galnac))的標(biāo)記抗體接觸。任何合適的標(biāo)記物均與本文所公開的方法結(jié)合使用。在一些實(shí)施方案中，該標(biāo)記物為染料(或染色劑)。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)各種抗體使用不同的染料。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于能與存在于相同細(xì)胞類型中的生物標(biāo)志物結(jié)合的抗體使用相同的染料。例如，對(duì)于能與存在于管腔乳腺癌細(xì)胞中的生物標(biāo)志物(ck7/18)結(jié)合的抗體使用第一染料，而對(duì)于能與存在于基底乳腺癌細(xì)胞中的生物標(biāo)志物(ck5/14和p63)結(jié)合的抗體使用第二染料。

在一些實(shí)施方案中，所述免疫組織化學(xué)法是間接法。在一些實(shí)施方案中，從導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中分離的細(xì)胞與未標(biāo)記的第一抗體接觸且與靶抗原(例如，p63、ck5、ck7、ck14、ck18)結(jié)合，并且被標(biāo)記的第二抗體與該第一抗體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，第一抗體與生物標(biāo)志物(例如，ck5、ck7、ck14、ck18或p63)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，辣根過氧化物酶(hrp)第二抗體與能結(jié)合ck5/14和p63的抗體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，堿性磷酸酶(ap)第二抗體與能結(jié)合ck7/18的抗體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，基于第一抗體的物種來源，產(chǎn)生可與該第一抗體反應(yīng)的第二抗體，例如，如果第一抗體為小鼠抗體，則第二抗體將為，例如，兔抗小鼠抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用綴合的山羊抗小鼠多聚堿性磷酸酶(alp)和綴合的山羊抗兔多聚辣根過氧化物酶(hrp)作為第二抗體，并與小鼠及兔igg上的重鏈和輕鏈反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，色原(例如，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(dab))與hrp結(jié)合并產(chǎn)生顯色反應(yīng)產(chǎn)物。在色原為dab的情況下，色原反應(yīng)產(chǎn)物為棕色。當(dāng)色原為貝久紫(bajoranpurple)時(shí)，色原反應(yīng)產(chǎn)物為薰衣草紫。

在一些實(shí)施方案中，色原(例如，固紅(fr))與ap結(jié)合，并產(chǎn)生顯色反應(yīng)產(chǎn)物。在色原為fr的情況下，色原反應(yīng)產(chǎn)物為紅色或粉紅色。在一些實(shí)施方案中，從導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中分離的細(xì)胞在與第一抗體接觸之前與過氧化物封閉劑接觸。在色原為佛瑞吉藍(lán)(ferangiblue)的情況下，色原反應(yīng)產(chǎn)物為明亮的寶藍(lán)色。

在一些實(shí)施方案中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染色。在一些實(shí)施方案中，采用蘇木精、核固紅、甲基綠或甲基藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染色。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了將乳腺癌分類為基底樣乳腺癌的方法，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7和ck18的抗體相接觸；以及(b)如果ck5和ck14抗體與細(xì)胞結(jié)合，則將該癌癥分類為基底樣的。在一些實(shí)施方案中，將乳腺癌分類為基底樣乳腺癌的方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7、ck18和p63的抗體相接觸；以及(b)如果ck5、ck14及p63抗體與在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞結(jié)合，則將該癌癥分類為基底樣的。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了將乳腺癌分類為管腔型的方法，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7、ck18和p63的第一抗體相接觸；以及(b)如果(i)抗ck7和抗ck18第一抗體與所述多個(gè)細(xì)胞結(jié)合，并且(ii)抗ck5、抗ck14和抗p63第一抗體不與在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞結(jié)合，則將該癌癥分類為管腔型。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了將增生分類為普通型導(dǎo)管增生的方法，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7、ck18和p63的第一抗體相接觸；以及(b)如果ck5、ck14、ck7、ck18和p63第一抗體與在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞結(jié)合，則將該增生分類為普通型導(dǎo)管增生。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了將增生分類為非典型導(dǎo)管增生的方法，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7、ck18和p63的第一抗體相接觸；以及(b)如果(i)ck7和ck18第一抗體與在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞結(jié)合，則將該增生分類為非典型導(dǎo)管增生。在一些實(shí)施方案中，本文公開了將增生分類為非典型導(dǎo)管增生的方法，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7、ck18和p63的第一抗體相接觸；以及(b)如果ck5、ck15和p63與在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞結(jié)合，則將該增生分類為非典型導(dǎo)管增生。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了將乳腺癌分類為侵襲性的方法，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7、ck18和p63的第一抗體相接觸；以及(b)如果結(jié)合ck5、ck14和p63第一抗體的細(xì)胞與結(jié)合ck7和ck18第一抗體的細(xì)胞的比值小于或等于侵襲性對(duì)照，則將該癌癥分類為侵襲性的。在一些實(shí)施方案中，導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中沒有細(xì)胞結(jié)合ck5、ck14和p63。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了將乳腺癌分類為非侵襲性的方法，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ck5、ck14、ck7、ck18和p63的第一抗體相接觸；以及(b)如果結(jié)合ck5、ck14和p63第一抗體的細(xì)胞與結(jié)合ck7和ck18第一抗體的細(xì)胞的比值大于或等于非侵襲性對(duì)照，則將該癌癥分類為非侵襲性的。

本文公開了檢測(cè)乳房病癥的方法，該方法包括使源自在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體收集的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的細(xì)胞與能結(jié)合upa、pai-1及gal-galnac的抗體相接觸。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)乳房病癥的方法包括使源自在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsii、bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體收集的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的細(xì)胞與能結(jié)合upa、pai-1和gal-galnac的抗體相接觸。

在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使導(dǎo)管內(nèi)流體樣品與針對(duì)色氨酸降解酶如吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(ido-1)、吲哚胺2,3-雙加氧酶-2(ido-2)、酪氨酸2,3-雙加氧酶(tdo)或其組合中的任意一種或多種的抗體相接觸。ido-1、ido-2和tdo活性參與通過tregs調(diào)節(jié)t細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)癌癥受試者中的免疫抑制以及賦予腫瘤免疫抗性。據(jù)稱ido-1、ido-2和tdo有助于腫瘤逃逸。因此，本文所公開的方法可用于將乳腺癌分類為侵襲性的，該方法包括：(a)使在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞與能結(jié)合ido-1、ido-2、tdo或其組合的第一抗體相接觸；以及(b)如果結(jié)合ido-1、ido-2、tdo或其組合的細(xì)胞的比例大于或等于非侵襲性對(duì)照，則將該癌癥分類為侵襲性的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)乳房病癥的方法包括使源自在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsii、bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體收集的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的細(xì)胞與能結(jié)合ido-1、ido-2、tdo或其組合的抗體相接觸。

在一些實(shí)施方案中，在收集導(dǎo)管內(nèi)流體樣品后，清洗吸收性紙，收集流出物，并評(píng)估流出物中的細(xì)胞數(shù)。在一些實(shí)施方案中，在樣品無細(xì)胞的情況下，將患者鑒定為患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低。在一些實(shí)施方案中，在樣品包含一個(gè)細(xì)胞的情況下，將患者鑒定為患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低，并且任選地分析細(xì)胞中的生物標(biāo)志物表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，在樣品包含2個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的情況下，將患者鑒定為存在患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，并且分析細(xì)胞中的生物標(biāo)志物表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，采用任何適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鏊鰳悠分械募?xì)胞(如果有的話)的細(xì)胞學(xué)，該方法包括但不限于：顯微術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)或其組合。在一個(gè)非限制性的實(shí)例中，細(xì)胞樣品可采用蘇木精和曙紅進(jìn)行染色。

在一些實(shí)施方案中，采用本文中描述的方法測(cè)量的蛋白質(zhì)為樣品中的總蛋白質(zhì)含量。在一些實(shí)施方案中，使吸收性紙暴露于膠體金或膠體銀，并采用任何適宜的方法來測(cè)定總蛋白質(zhì)含量(濃度)。在一些實(shí)施方案中，在接觸個(gè)體的乳房前，吸收性紙預(yù)負(fù)載或預(yù)涂覆有膠體金或膠體銀。在此方面使用的術(shù)語“膠體金屬顆粒”意在包括顆粒的分散體，優(yōu)選溶膠，其由金屬、金屬化合物或涂覆有金屬或金屬化合物的核組成。本文中使用的術(shù)語“金膠體”和“膠體金組合物”是指亞微米大小的金顆粒均勻地分散在流體(例如，水或水性緩沖液)中的懸浮液。在定量分析中使用的膠體金組合物含有高度濃縮的金顆粒。在一個(gè)實(shí)例中，該膠體金組合物具有3.5×10¹²至7.0×10¹²個(gè)顆粒/毫升，例如(3.5-5.25)×10¹²個(gè)顆粒/毫升的金顆粒濃度。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的總蛋白質(zhì)濃度，并且如果該樣品的總蛋白質(zhì)濃度大于300ng，則將患者鑒定為需要進(jìn)一步的乳腺癌評(píng)估。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的總蛋白質(zhì)濃度，并且如果該樣品的總蛋白質(zhì)濃度等于或低于200ng蛋白質(zhì)，則將患者鑒定為患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的總蛋白質(zhì)濃度，并且如果該樣品的總蛋白質(zhì)濃度為約300ng到約2ug，則將患者鑒定為患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)升高。

在一些實(shí)施方案中，如果在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品包含約50pg至約0.5ng蛋白質(zhì)，并且不含細(xì)胞，則將患者鑒定為患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低。

在一些實(shí)施方案中，如果在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品含有至少約300ng蛋白質(zhì)以及兩(2)個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞，則將患者鑒定為需要進(jìn)一步的乳腺癌評(píng)估或者診斷為患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中等或高。在一些實(shí)施方案中，在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的細(xì)胞部分包含約2個(gè)細(xì)胞到約50個(gè)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的細(xì)胞部分包含至少十(10)個(gè)細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品包含mirna。在一些實(shí)施方案中，mirna為無細(xì)胞的或外來體的。在一些實(shí)施方案中，對(duì)導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行篩查包括確定該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中一種或多種mirna的存在和/或水平、對(duì)mirna特征進(jìn)行概況分析，或其組合。在一些實(shí)施方案中，mirna包括oncomir、腫瘤抑制物mirna或其組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，mirna模式或特征可包括oncomir和腫瘤抑制物mirna兩者，并且相比于未患乳房病癥的個(gè)體，此特征在患有乳房病癥的個(gè)體中可能改變。在一些實(shí)施方案中，在患有乳房病癥的個(gè)體的一只或兩只乳房中mirna特征可能改變。在某些實(shí)施方案中，對(duì)導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行篩查，以將包含至少一種能夠與該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的mirna的至少一部分結(jié)合的寡核苷酸探針或引物的個(gè)體予以分層或分類。在其它實(shí)施方案中，對(duì)導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行篩查，以將包含多種能夠與該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的mirna的至少一部分結(jié)合的寡核苷酸探針或引物的個(gè)體予以分層或分類。在其它實(shí)施方案中，對(duì)導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行篩查，以將具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體進(jìn)一步分類。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了用于將個(gè)體分類為患有乳房病癥的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；b)檢測(cè)該導(dǎo)管內(nèi)流體中一種或多種選自表3、表4、表5或其組合的mirna的存在，其中在該mirna具有高于mirna閾值的測(cè)量值時(shí)檢測(cè)到該mirna的存在；以及c)如果所檢測(cè)的mirna具有高于所述閾值的測(cè)量值，則將該個(gè)體分類為患有乳房病癥。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了用于將個(gè)體分類為患有乳房病癥的方法，該方法包括：a)從經(jīng)歷乳房攝影術(shù)的個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；b)檢測(cè)該導(dǎo)管內(nèi)流體中一種或多種選自表3、表4、表5或其組合的mirna的存在的減少，其中在mirna具有低于mirna閾值的測(cè)量值時(shí)檢測(cè)到該mirna的存在的減少；以及c)如果所檢測(cè)的mirna具有低于所述閾值的測(cè)量值，則將該個(gè)體分類為患有乳房病癥。

表3乳房病癥中改變的mirna

表4乳房病癥中的腫瘤抑制物mirna

在一些實(shí)施方案中，利用任何本領(lǐng)域已知的pcr方法來檢測(cè)mirna的存在。此類pcr方法包括但不限于rt-pcr、實(shí)時(shí)pcr、半定量pcr、qpcr、多重pcr或等溫pcr。在其它實(shí)施方案中，可通過與可包含在微陣列或生物芯片上或雜交溶液中的一種或多種mirna探針雜交來檢測(cè)mirna。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過mirna微陣列或多重雜交和分析來測(cè)定mirna特征。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種mirna探針可附接于固相樣品收集介質(zhì)(諸如多重中或微陣列上)。在一些實(shí)施方案中，該mirna探針可附接至由諸如玻璃、改性或功能化玻璃、塑料、尼龍、纖維素或硝化纖維素紙、樹脂、二氧化硅或硅基材料等材料制成的固相樣品收集介質(zhì)。該mirna探針可共價(jià)地或非共價(jià)地附接至固相樣品收集介質(zhì)。

診斷或預(yù)后可基于與來自患有乳房病癥的受試者的樣品相比，來自正常受試者的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的mirna的差異性表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，用于將個(gè)體分類為處于患cch、adh、dcis或idc的風(fēng)險(xiǎn)中或具有cch、adh、dcis或idc的方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體，以及b)檢測(cè)至少一種選自表3的mirna的改變的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，用于將個(gè)體分類為具有柱狀細(xì)胞增生的方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體，以及b)檢測(cè)選自表3的mirna的改變的表達(dá)。將個(gè)體分類為具有cch的優(yōu)選實(shí)施方案包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsii、bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳頭獲取的該個(gè)體的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中選自let-7c、mir-27a、mir-92a、mir-383、mir-202、mir-107、mir-141、mir-183、mir-454、mir-650、mir-335、mir-566、mir497、mir-27a、mir-204、mir-20a、mir-132、mir-539和mir-221的至少一種或多種mirna進(jìn)行篩查。let-7c、mir-27a、mir-92a、mir-383、mir-202、mir-107、mir-141、mir-183和/或mir-454的改變的表達(dá)將指示上皮細(xì)胞的cch，而mir-650、mir-335、mir-566、mir497、mir-27a、mir-204、mir-20a、mir-132、mir-539和/或mir-221的改變的表達(dá)將指示基質(zhì)來源的cch。

在一些實(shí)施方案中，用于將個(gè)體分類為具有非典型導(dǎo)管增生的方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體，以及b)檢測(cè)至少一種選自表3的mirna的改變的表達(dá)。將個(gè)體分類為具有adh的優(yōu)選實(shí)施方案包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳頭獲取的該個(gè)體的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中選自mir-21、mir-183、mir-200c、mir-200b、mir-638、mir-572、mir-671-5p、mir-30d、mir-1275、mir-15b和mir-644的至少一種或多種mirna進(jìn)行篩查。

在一些實(shí)施方案中，用于將個(gè)體分類為具有dcis的方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體，以及b)檢測(cè)至少一種選自表3的mirna的改變的表達(dá)。將個(gè)體分類為具有dcis的優(yōu)選實(shí)施方案包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳頭獲取的該個(gè)體的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中選自mir-195、mir-557、mir-554、mir-1207-5p、mir-874、mir-556-3p和mir-556-3p的至少一種或多種mirna進(jìn)行篩查。

在一些實(shí)施方案中，用于將個(gè)體分類為具有idc的方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體，以及b)檢測(cè)至少一種選自表3的mirna的改變的表達(dá)。將個(gè)體分類為具有idc的優(yōu)選實(shí)施方案包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳頭獲取的該個(gè)體的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中選自mir-933、mir-141、mir-96、mir638、mir-575、let-7f、mir-15a、mir-671-5p、mir-20a、mir-1202、mir-183、mir-141、mir-19b、mir-1915、mir-107、mir-21、mir-1274b、mir-1268、mir-200b、mir-106b、mir-634、mir-129、mir-572、mir-933、mir-17、mir-29b、mir-877、mir-425、mir-23b、mir-193a、mir-193b、mir-181a、mir-143、mir-145、mir-17-5p、mir-20a、mir-30b和mir-30d的至少一種或多種mirna進(jìn)行篩查。

公開于表4中的腫瘤抑制物mirna的靶標(biāo)與乳腺癌有關(guān)，并且是本領(lǐng)域已知的(modulationofcancertraitsbytumorsuppressormicrornas.grammatikakis,i.等人.int.j.mol.sci.2013，vol14,第1822-1842頁；microrna17/20inhibitscellularinvasionandtumormetastasisinbreastcancerbyheterotypicsignaling.yu等人.proc.natl.acad.sciences.2010,vol.107(18)，第8231-8236頁，每一篇均全文并入本文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，此類靶標(biāo)落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且本文公開的方法包括此類靶標(biāo)作為乳房病癥的生物標(biāo)志物。

表5與侵襲性乳腺癌中改變的靶標(biāo)表達(dá)相關(guān)的mirna

在一些實(shí)施方案中，將經(jīng)歷乳房攝影術(shù)的個(gè)體分類為處于患乳腺癌(cch、adh、dcis、idc或lcis)的風(fēng)險(xiǎn)中或患有乳腺癌(cch、adh、dcis、idc或lcis)的方法包括在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品，并對(duì)個(gè)體中調(diào)節(jié)upa、pai-1和gal-galnac表達(dá)的、列于表5中的mirna的改變的表達(dá)進(jìn)行篩查。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，還對(duì)列于表5中的調(diào)節(jié)ido1表達(dá)的mirna的表達(dá)進(jìn)行了篩查。優(yōu)選的實(shí)施方案包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳頭獲取的該個(gè)體的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中調(diào)節(jié)upa、pai-1和gal-galnac轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的選自mir-23b、mir193a、mir193b、mir181a、mir143、mir145、mir-17-5p、mir-20a、mir30b和mir-30d的mirna的改變的表達(dá)進(jìn)行篩查。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，還對(duì)調(diào)節(jié)ido-1的mirna181a進(jìn)行篩查。在一些實(shí)施方案中，用于將受試者分類為患有管腔a型乳腺癌的方法包括：a)從經(jīng)歷乳房攝影的受試者的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品，以及b)檢測(cè)至少一種選自mir-29a、mir181a和mir-652的mirna的改變的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，將受試者分類為處于患侵襲性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有侵襲性乳腺癌的方法包括從經(jīng)歷乳房攝影術(shù)的受試者處獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品，并對(duì)調(diào)節(jié)upa、pai-1和gal-galnac轉(zhuǎn)移酶的mirna的改變的特征進(jìn)行篩查。galnac轉(zhuǎn)移酶3、6和7為優(yōu)選的galnac轉(zhuǎn)移酶。更優(yōu)選的galnac轉(zhuǎn)移酶為β1→3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，諸如b3galt1和b3galt5。此類方法包括對(duì)上調(diào)upa、pai-1和gal-galnac表達(dá)的改變的mirna特征進(jìn)行篩查。在一些實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)調(diào)節(jié)ido-1、ido-2、tdo或其組合的mirna的改變的特征進(jìn)行篩查。已知ido1和ido-2及tdo有助于腫瘤逃逸并且與癌癥相關(guān)的免疫抑制有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)調(diào)節(jié)upa、pai-1、galnac轉(zhuǎn)移酶和ido-1的mirna的改變的特征進(jìn)行篩查。相應(yīng)地，在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于將受試者分類為處于患侵襲性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有侵襲性乳腺癌的方法包括：a)從經(jīng)歷乳房攝影術(shù)的受試者處獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品，以及b)檢測(cè)mir-23b、mir193a、mir-193b、mir-181a、mir-143、mir-145、mir-17-5p、mir-20a、mir-548a-3p、mir-183*、mir-124、mir-29a*、mir-506、mir-3143、mir-4324、mir-569、mir-548e、mir-491-3p、mir-3672、mir-544b、mir-135b、mir-2117、mir-590-3p、mir-378*、mir-135a、mir30b和mir-30d的改變的水平。mir193a、mir-193b和mir-181a水平的降低以及mir30b和mir-30d水平的升高會(huì)指示升高的侵襲性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。

在一些實(shí)施方案中，mir-21、mir-494和mir-183的存在增加或上調(diào)會(huì)指示癌癥轉(zhuǎn)移或癌癥進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)升高和/或不良預(yù)后。在其它實(shí)施方案中，let-7a、let-7b和let-7c及mir-1308的上調(diào)會(huì)指示乳房病癥的轉(zhuǎn)移潛能。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，mir-200家族的mirna成員如mir-200b和mir-200c是優(yōu)選的診斷、預(yù)后和/或預(yù)測(cè)性轉(zhuǎn)移疾病標(biāo)志物。

在一些實(shí)施方案中，本文公開了將個(gè)體分類為具有乳房病癥的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；b)利用該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品評(píng)估該個(gè)體的dna甲基化特征；以及c)根據(jù)該個(gè)體的dna甲基化特征將個(gè)體分類為具有乳房病癥。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)導(dǎo)管內(nèi)液體樣品中的dna甲基化特征將個(gè)體分類為具有為管腔a型、管腔b型或基底樣乳腺癌的乳房病癥。在其它實(shí)施方案中，根據(jù)特定基因的dna甲基化特征，可將個(gè)體診斷或預(yù)后為具有低存活率和/或復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)或具有低存活率和/或復(fù)發(fā)。

在一些實(shí)施方案中，個(gè)體具有至少一種或多種列于表6中的基因的dna過甲基化。

在一些實(shí)施方案中，個(gè)體具有至少一種或多種易于dna甲基化的基因的dna低甲基化。例如，但不限于，諸如upa和pai-1的基因的低甲基化或脫甲基化將指示升高的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，是對(duì)具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；以及b)利用該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品評(píng)估該個(gè)體的dna甲基化特征。

可用于本發(fā)明目的的全基因組和特定基因dna甲基化概況分析的方法是本領(lǐng)域已知的，包括以上提供的此類方法的非窮盡列舉。在一些實(shí)施方案中，對(duì)dna甲基化的篩查或評(píng)估通過亞硫酸氫鹽測(cè)序、甲基化敏感性pcr、甲基化dna免疫沉淀(medip)、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(ms-snupe)、全基因組甲基化概況分析、甲基化敏感性限制酶分析、聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制分析、甲基化特異性量子點(diǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(ms-qfret)、全基因組作圖或其組合來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的評(píng)估方法為全基因組dna甲基化概況分析。dna甲基化概況分析方法是本領(lǐng)域已知的(dedeurwaerder等人.embomolecularmedicine,2011)。此類分析的商業(yè)資源是可得的，例如illuminainfiniumhumanmethylation27bead芯片(illumina)。

表6用于dna甲基化模式/特征分析的靶基因

在某些實(shí)施方案中，本文公開了將個(gè)體分類為乳腺cpg島甲基化表型(b-cimp)的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體；以及b)表征該個(gè)體的cpg島甲基化表型；其中如果將該個(gè)體表征為b-cimp，則認(rèn)為該個(gè)體具有較低的乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和/或提升的存活率。將個(gè)體的表型表征為b-cimp的方法是本領(lǐng)域已知的(fang,f等人,scitranslmed.2011,3:75ra25)。

在一些實(shí)施方案中，本文公開了將個(gè)體分類為具有乳房病癥的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；并且b)利用該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品確定該個(gè)體的dna甲基化表型；以及c)將該個(gè)體的dna甲基化特征表征為乳腺cpg島甲基化表型，其中如果將該個(gè)體分類為具有乳腺cpg島甲基化表型，則認(rèn)為該個(gè)體具有較低的乳腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和/或提升的存活率。

在一些實(shí)施方案中，是用于將個(gè)體分類為處于患管腔型乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有管腔型乳腺癌的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；以及b)確定一種或多種選自rassf1、fzd9、ptgs2、mme、hoxa9、pax6、scgb3a1、fabp3、fgfp3、gas7、hdac9、hoxa11、mme、pax6、pomc和rbp1的基因的dna甲基化狀態(tài)，其中如果該基因是過甲基化的，則將該個(gè)體表征為處于患管腔型乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有管腔型乳腺癌。

在一些實(shí)施方案中，是用于將個(gè)體分類為處于患基底樣乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有基底樣乳腺癌的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；以及b)確定一種或多種選自cdh17、ewphx1、tff1、rara、mest、bcr、c4b、sept5、serpina5和thy1的基因的dna甲基化狀態(tài)，其中如果該基因是過甲基化的，則將該個(gè)體表征為處于患管腔型乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有管腔型乳腺癌。

在一些實(shí)施方案中，是用于將個(gè)體分類為處于患管腔型乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有管腔型乳腺癌的方法，該方法包括：a)在乳房攝影術(shù)期間從該個(gè)體的乳頭獲取導(dǎo)管內(nèi)流體樣品；以及b)確定upa和pai-1的dna甲基化狀態(tài)，其中如果這些基因是低甲基化的，則將該個(gè)體表征為處于患管腔型乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中或患有管腔型乳腺癌。

其它優(yōu)選的實(shí)施方案包括利用在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳頭獲取的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品對(duì)該個(gè)體中的acadl、reck和sfr2的改變的dna甲基化進(jìn)行評(píng)估。個(gè)體中一種或多種acadl、reck和sfr2基因的增加的dna甲基化會(huì)指示升高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和/或較差的存活率。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中包括利用在乳房攝影術(shù)期間從具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的乳頭獲取的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品對(duì)該個(gè)體中的upa和pai-1基因的改變的dna甲基化進(jìn)行評(píng)估。upa和pai-1基因的低甲基化會(huì)指示升高的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。

治療方法

在某些實(shí)施方案中，本文公開了對(duì)有需要的個(gè)體的乳房病癥進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法，該方法包括對(duì)在乳房攝影術(shù)期間獲得的該個(gè)體的乳房的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品進(jìn)行針對(duì)乳房病癥標(biāo)志物的篩查。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括根據(jù)篩查結(jié)果來確定針對(duì)受試者的治療療程。在一些實(shí)施方案中，該方法包括確定針對(duì)具有bi-radsiii或bi-radsiv病變的個(gè)體的治療療程。在一些實(shí)施方案中，醫(yī)療人員根據(jù)篩查結(jié)果為個(gè)體制定治療方案。在一些實(shí)施方案中，該治療方案包括治療劑、放射療法和/或手術(shù)切除乳房組織。在一些實(shí)施方案中，該治療方案包括多種治療劑。

在一些實(shí)施方案中，該治療劑為蒽環(huán)類(例如，多柔比星或表柔比星)、鉑劑、紫杉烷(例如，紫杉醇或多烯紫杉醇)或其組合。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為ado-曲妥珠單抗emtansine、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、阿那曲唑、卡培他濱、卡鉑、順鉑、環(huán)磷酰胺、多烯紫杉醇、鹽酸多柔比星、鹽酸表柔比星、艾立布林、依維莫司、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、鹽酸吉西他濱、醋酸戈舍瑞林、伊沙匹隆、二甲苯磺酸拉帕替尼、來曲唑、脂質(zhì)體多柔比星、醋酸甲地孕酮、氨甲喋呤、米托蒽醌、紫杉醇、帕米膦酸二鈉、培妥珠單抗、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬、曲妥珠單抗、長春瑞濱或其組合。

在一些實(shí)施方案中，該治療劑為serm、serd、ai、其藥用鹽或其組合。在一些實(shí)施方案中，該serm選自他莫昔芬、順式他莫昔芬、4-羥基他莫昔芬(4-oht)、內(nèi)昔芬(endoxifen)、去甲基他莫昔芬(desmethyltamoxifen)、拉索昔芬(lasofoxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、苯并噻吩(benzothiophene)、苯卓昔芬(bazedofoxifene)、阿佐昔芬(arzoxifene)、米潑昔芬(miproxifene)、左美洛昔芬(levormeloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、氯米芬(clomifene)、艾多昔芬(idoxifene)、托瑞米芬(toremifene)、em652和era-92。優(yōu)選地，在一些實(shí)施方案中，該治療劑為他莫昔芬或他莫昔芬衍生物(諸如4-羥基他莫昔芬、n-去甲基他莫昔芬、內(nèi)昔芬和順式他莫昔芬)。在一些實(shí)施方案中，該serd包括氟維司群(fulvestrant)、arn-810或ch4986399。在一些實(shí)施方案中，該ai選自阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)和來曲唑(letrozole)。在一些實(shí)施方案中，所述多種治療劑包括serd、serm、ai、其藥用鹽或其組合。在一些實(shí)施方案中，該治療劑包括至少一種ω-3脂肪酸和至少一種維生素d化合物。

在一些實(shí)施方案中，該治療劑為丁酸。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為多柔比星。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為表柔比星。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為紫杉醇。在一些實(shí)施方案中，該治療劑為多烯紫杉醇。

在一些實(shí)施方案中，該治療劑為本文公開于表3、表4、表5或其組合中的抗腫瘤抑制物mirna的沉默劑(silencer)。此類抗腫瘤抑制物mirna的非限制性實(shí)例為p63。在其它實(shí)施方案中，該治療劑為本文公開于表3、表4、表5或其組合中的oncomir的激活劑。在一些實(shí)施方案中，該治療劑基于本文公開的mirna的人類或非人類序列。在一些實(shí)施方案中，mirna的抑制劑為反義寡核苷酸。反義寡核苷酸可包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其組合。反義核苷酸可具有一種或多種化學(xué)修飾，例如，糖修飾或骨架修飾。

在一些實(shí)施方案中，該治療劑為如本文所公開的乳房病癥中過甲基化的基因的dna過甲基化抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，dna過甲基化的抑制將降低與乳房病癥有關(guān)的某些基因的基因沉默效應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，該治療劑為dna甲基化激活劑或dna甲基化劑。在這樣的情況下，參與細(xì)胞增殖和腫瘤形成的基因?qū)⒊聊虮磉_(dá)減少。

在一些實(shí)施方案中，該治療劑為聯(lián)合療法。當(dāng)施用聯(lián)合療法時(shí)，每種藥劑可與其它任何藥劑聯(lián)合(例如，同時(shí))施用或單獨(dú)施用。進(jìn)一步地，所有藥劑均可根據(jù)請(qǐng)求保護(hù)的方法予以施用?；蛘?，一些藥劑可根據(jù)請(qǐng)求保護(hù)的方法予以施用，而其它藥劑則全身施用。

在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為caf：環(huán)磷酰胺、多柔比星和5-fu。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為tac：多烯紫杉醇、多柔比星和環(huán)磷酰胺。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為ac→t：多柔比星和環(huán)磷酰胺，繼以紫杉醇或多烯紫杉醇。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為fec：→t：5-fu、表柔比星和環(huán)磷酰胺，繼以多烯紫杉醇或紫杉醇。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為tc：多烯紫杉醇和環(huán)磷酰胺。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為tch：多烯紫杉醇、卡鉑和曲妥珠單抗，其用于her2/neu陽性腫瘤。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為cmf：環(huán)磷酰胺、氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為a→cmf：多柔比星繼以cmf。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為ec：表柔比星和環(huán)磷酰胺。在一些實(shí)施方案中，該聯(lián)合療法為ac：多柔比星和環(huán)磷酰胺。

實(shí)施例

通過參考以下實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明。列入這些實(shí)施例僅僅是為了描述示例性實(shí)施方案，而不應(yīng)解釋為包含本發(fā)明的整個(gè)范圍。

實(shí)施例1

在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的評(píng)估

使用吸收性紙作為固相收集介質(zhì)。在乳房攝影前對(duì)個(gè)體施用催產(chǎn)素。清潔兩只乳房的乳頭并去除角蛋白栓。將硝化纖維素濾器附接至兩個(gè)乳頭上。將每只乳房置于乳房攝影裝置中并進(jìn)行乳房攝影術(shù)。

在收集到乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品后，采用任何適宜的緩沖洗液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)清洗該硝化纖維素濾器。將流出物收集在改進(jìn)的細(xì)胞學(xué)小瓶中，并進(jìn)行離心分離。將細(xì)胞從流出物中分離，并轉(zhuǎn)移到干凈的顯微鏡載玻片的中心區(qū)域，并施加蓋玻片。使該載玻片風(fēng)干，然后例如在無水酒精中進(jìn)行固定。

單克隆抗體ck5、ck14、p63和兔單克隆抗體ck7和ck18采用單一抗體稀釋劑進(jìn)行復(fù)用(multiplexed)，并施加到顯微鏡載玻片上。然后再施加由山羊抗小鼠-hrp和山羊抗兔-ap的混合物組成的無生物素多染(multistain)檢測(cè)試劑。依次施加dab和固紅色原。采用蘇木精對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染色。

分析結(jié)果與乳房攝影結(jié)果進(jìn)行比較。如果結(jié)果一致，則不進(jìn)行附加的分析。如果結(jié)果不一致，則進(jìn)行附加的分析或測(cè)試。

實(shí)施例2

在乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的處理

使用吸收性紙作為固相收集介質(zhì)。在乳房x攝影術(shù)前對(duì)個(gè)體施用催產(chǎn)素。清潔兩只乳房的乳頭并去除角蛋白栓。將硝化纖維素濾器附接至兩個(gè)乳頭上。將每只乳房置于乳房攝影裝置中并進(jìn)行乳房攝影術(shù)。

在收集到乳房攝影術(shù)期間獲得的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品后，采用任何適宜的緩沖洗液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水)清洗該硝化纖維素濾器。將流出物收集在改進(jìn)的細(xì)胞學(xué)小瓶中，并進(jìn)行離心分離。將細(xì)胞從流出物中分離，并轉(zhuǎn)移到干凈的顯微鏡載玻片的中心區(qū)域，并施加蓋玻片。使該載玻片風(fēng)干，然后例如在無水酒精中進(jìn)行固定。

預(yù)處理

使細(xì)胞與過氧化物封閉劑(biocare的peroxidazed1)接觸。

接下來，進(jìn)行熱恢復(fù)(heatretrieval)預(yù)處理。將diva溶液在biocare的decloakingchamber中預(yù)熱至95℃保持30分鐘。然后，將載玻片放入已預(yù)熱的溶液中并在95℃及壓力下恢復(fù)40分鐘。或者，將組織切片蒸45-60分鐘，或使用95℃水浴40分鐘。使溶液冷卻20分鐘，然后在蒸餾水中清洗。

施加蛋白質(zhì)封閉劑—采用biocare的backgroundsniper在室溫(rt)下溫育10-15分鐘。

將載玻片與第一抗體(即，針對(duì)ck5、ck14、ck7、ck18和p63的抗體)在室溫下溫育30-60分鐘。

采用biocare的mach2doublestain2將載玻片在室溫下溫育30分鐘。

當(dāng)使用biocare的betazoiddab時(shí)，在室溫下溫育5分鐘。

采用biocare的vulcan固紅在室溫下溫育10-20分鐘。在去離子水中沖洗。

用去離子水沖洗。與蘇木精溫育30-60秒。用去離子水沖洗。施加tacha的bluing溶液1分鐘。

采用光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可視化。

實(shí)施例3

導(dǎo)管內(nèi)流體的評(píng)估

本試驗(yàn)是涉及三(3)名健康的、非妊娠的、非哺乳的女性受試者的單中心研究。受試者按來診所的順序而加入。

主要試驗(yàn)?zāi)康氖谴_定在乳房攝影術(shù)步驟過程中產(chǎn)生導(dǎo)管內(nèi)流體的30到65歲女性的百分比，如根據(jù)蛋白質(zhì)在硝化纖維素濾器上的存在而確定的。

次要目的是在細(xì)胞學(xué)上評(píng)價(jià)導(dǎo)管內(nèi)流體中細(xì)胞(如果有的話)的存在和類型。

方法：

簡言之，通過將配衡的(tared)硝化纖維素濾器附接至每個(gè)乳頭(每只乳房一個(gè))，采用該硝化纖維素濾器來收集在乳房攝影術(shù)期間擠出的導(dǎo)管內(nèi)流體。在一組受試者中進(jìn)行乳房攝影術(shù)。在第二組受試者中未進(jìn)行乳房攝影術(shù)(對(duì)照組)。對(duì)通過清洗含有導(dǎo)管內(nèi)流體樣本的濾器而收集的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。

評(píng)估：

該試驗(yàn)的主要終點(diǎn)是如根據(jù)在經(jīng)歷乳房攝影術(shù)時(shí)蛋白質(zhì)在硝化纖維素濾器上的存在所確定的，完成產(chǎn)生導(dǎo)管內(nèi)流體的試驗(yàn)的女性的百分比。

次要終點(diǎn)是如通過細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)所確定的，細(xì)胞在導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中的存在。

結(jié)果：

對(duì)于使用從這些受試者組獲得的濾器完成的蛋白質(zhì)檢測(cè)，在從對(duì)照組獲得的樣品上都沒有顯示出蛋白質(zhì)的存在。來自經(jīng)歷過乳房攝影的組的所有濾器均顯示出蛋白質(zhì)的存在。

實(shí)施例4

導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中mirna的檢測(cè)

利用包含使裝置附接至乳房的乳房接合部件的收集裝置，從經(jīng)歷乳房攝影術(shù)的女性受試者的兩只乳房的乳頭抽吸出導(dǎo)管內(nèi)流體樣品。將該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品收集到固相樣品收集介質(zhì)如吸收性紙上。清洗吸附在吸收性紙上的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品，并且如下分離總rna(包括mirna)。

將400μltrizol^tm(carlsbad，ca)添加至2ml微量離心管中，該微量離心管含有1cm×1cm和1英寸×1英寸大小的具有導(dǎo)管內(nèi)流體樣品的吸收性紙。該管在旋渦震蕩器上在4℃下以2000rpm渦旋30分鐘。在進(jìn)一步添加1.2mltrizol^tm然后添加0.24ml氯仿后，該管在室溫下再渦旋5分鐘，并在另一個(gè)2分鐘后在4℃下以14000g離心15分鐘。收集頂部的水相，與等體積的75％乙醇混合，并按照制造商的使用方案在purelink^tmrna旋柱(spincolumn)(qiavac^tm，用于24plus設(shè)備(valencia，ca)上進(jìn)行處理。采用100μl水從旋柱上洗脫rna，并在-80℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

含有200μlban和10μl聚丙烯載體的冷卻的trizol試劑可與一些樣品一起使用來提高rna的回收和收率。任選地，也可在此相分離期間向混合物中添加溴苯甲醚以改善分離的rna的可視化，并且去除分離方案中的氯仿和溴氯丙烷。

含有來自其它樣品的mirna的rna將采用nanodrop分光光度法或agilent定量法進(jìn)行定量。利用采用agilentbioanalyzer的rna6000nanolabchipseriesiiassay，確證至少一些樣品中的mirna的濃度和完整性。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟和條件，利用對(duì)每種mirna靶標(biāo)特異性的莖環(huán)rt引物對(duì)rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并且用無核酸酶水稀釋以產(chǎn)生每次反應(yīng)50μm的濃度。隨后dna可在約-20℃下保存?zhèn)溆?。mirna表達(dá)水平的相對(duì)定量可通過實(shí)時(shí)pcr來進(jìn)行，其中使用mir-16和/或另一種穩(wěn)定表達(dá)的小rna的表達(dá)水平，以對(duì)靶mirna的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。所有反應(yīng)均一式三份進(jìn)行，并采用試驗(yàn)間對(duì)照?？刹捎?-deltadeltact來分析數(shù)據(jù)，以確定靶mirna的相對(duì)量。

對(duì)于一些樣品，將采用taqman^tmmirna分析(appliedfostercity，ca)測(cè)定成熟mirna的水平。taqmanmirna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將用于利用mirna特異性寡核苷酸在42℃下使15μl中的9.9μlrna逆轉(zhuǎn)錄30分鐘。mirna特異性引物和1.33μl的rt反應(yīng)將在一式三份的40-或42-循環(huán)定量pcr中使用，并且使用sdstm軟件(2.3版本，applied)量化循環(huán)(cq)值確定為從重復(fù)三次的pcr反應(yīng)中獲得的平均值。

待篩查的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中循環(huán)的靶mirna列于表3、表4和表5中。例如，循環(huán)mir-195是早期乳腺癌以及心肌梗死(mi)的標(biāo)志物(long等人.plosone.2012,vol.7(12)e50926)。在乳腺癌患者和mi患者中觀察到血液mir-195水平的升高。作為另一個(gè)實(shí)例，高mir-26a與減少的ezh2表達(dá)相關(guān)，并且與他莫昔芬在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的有利結(jié)果相關(guān)(jansen等人.breastcancerres.treat.2012,133:937-947)。然而，naf中的循環(huán)mir-195水平或mir26a未知。測(cè)定naf中的循環(huán)mir-195和mir26a。

使用prism^tm(graphpad軟件，lajollaca)和excel軟件(microsoft)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制。所有t檢驗(yàn)和mann-whitneyu檢驗(yàn)都將是雙尾檢驗(yàn)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的范圍包括本文公開的方法，該方法包括針對(duì)mirna的篩查，以及基于mirna表達(dá)和特征預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)諸如他莫昔芬的藥物治療的響應(yīng)和由于他莫昔芬治療而引起的諸如mi等副作用的可能性的能力。

實(shí)施例5

導(dǎo)管內(nèi)流體樣品中dna甲基化特征的檢測(cè)

利用包含使裝置附接至乳房的乳房接合部件的收集裝置，從經(jīng)歷乳房攝影術(shù)的女性受試者的兩只乳房的乳頭抽吸出導(dǎo)管內(nèi)流體樣品。將該導(dǎo)管內(nèi)流體樣品收集到固相樣品收集介質(zhì)如吸收性紙上。清洗吸附在吸收性紙上的導(dǎo)管內(nèi)流體樣品，并且根據(jù)供應(yīng)商的使用說明(qiagen，valencia，ca)采用qiagen-dnaeasyblood&tissue從清洗流出物中提取dna。按照制造商的使用說明采用qiaampdnamini(qiagen)提取dna。使用nanodropnd-1000uv-is分光光度計(jì)(technologies，wilmington，de)對(duì)dna進(jìn)行定量。采用基于illuminahumanmethylation27beadchips的技術(shù)(illumina)來分析位點(diǎn)特異性cpg甲基化。開發(fā)出該陣列以分析選自多于14000種基因的27578個(gè)cpg位點(diǎn)。這允許在單個(gè)核苷酸的分辨率下對(duì)每個(gè)樣品的所有位點(diǎn)進(jìn)行探詢。根據(jù)制造商的使用方案利用zymoexdna甲基化試劑盒(zymoresearch，orange，ca)用亞硫酸氫鈉處理基因組dna，并且采用制造商的使用方案進(jìn)行芯片處理和數(shù)據(jù)分析。用methylationmodule軟件核查微珠陣列數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

以上具體實(shí)施方案的描述將充分揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)，從而他人在無須過多實(shí)驗(yàn)且不脫離總體概念的情況下，可通過應(yīng)用現(xiàn)有的知識(shí)容易地修改和/或針對(duì)各種應(yīng)用調(diào)整此類具體實(shí)施方案，因此此類調(diào)整和修改應(yīng)當(dāng)并且旨在被包含在所公開的實(shí)施方案的等同物的含義及范圍之內(nèi)。盡管已結(jié)合其具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但顯然很多改變、修改和變動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。因此，旨在包含落入隨附的權(quán)利要求的精神及寬泛范圍中的所有此類改變、修改和變化形式。

應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述和具體實(shí)例僅以說明的方式給出，因?yàn)榛谠撛敿?xì)描述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，本發(fā)明的某些特征，盡管為了清楚起見以單獨(dú)的實(shí)施方案的形式予以描述，但它們也可在單個(gè)實(shí)施方案中以組合方式來提供。相反，本發(fā)明為了簡潔起見而以單一實(shí)施方案描述的各種特征也可單獨(dú)提供或者以任何適當(dāng)?shù)淖咏M合形式提供。