相關申請的交叉引用

本申請要求2014年8月20日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/039,584的優(yōu)先權，該文通過引用納入本文。

發(fā)明背景

2種衍生自相同培養(yǎng)物、品系、物種、生物體、器官或組織的細胞可能在基因型、表型或基因表達方式上不同。這種細胞之間的屬性變化可能是生物上或醫(yī)學上感興趣的。因此，用于操作和詢問個體細胞的方法現在廣泛用于生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)。微流體裝置已經適用于單細胞操作，因為它們允許流體，例如，細胞培養(yǎng)基通過具有與這些單細胞相當的尺寸的通道和腔室。在微流體裝置中，細胞可經追蹤、分選、表征、經過治療、或裂解以收獲它們含有的物質。在這些裝置中單細胞的其他操作是可能的。

對細胞一個接著一個通過微流體裝置的通路(例如從貯存儲器至分析地點)進行計量在技術上有挑戰(zhàn)性，部分是因為細胞粘附。這種現象是一些細胞粘附于相鄰表面或互相粘附的趨勢。細胞粘附受到單個細胞的細胞壁或血漿膜中粘附蛋白質的控制，并且對于體內組織功能和細胞間相互作用是關鍵的。然而，在微流體裝置中，細胞粘附可能導致細胞不希望地固定在通道和腔室的內表面上。為了檢測細胞粘附，這些表面可通過化學治療或應用微觀紋理來鈍化。表面鈍化可能是昂貴的，并且給定的治療可能僅在小范圍的實驗條件下有作用?；蛘?，可通過向細胞施加力或改變其化學環(huán)境來逆轉細胞在微流體表面上的固定。除非溫和進行，這些動作可能擾亂將在下游測量的細胞性質，或者改變待從細胞收獲的生物分子的組分。

技術實現要素：

本文提供了將多個細胞運輸通過流動腔室的方法，其中細胞初始固定在流動腔室的內表面上。所述方法包括：從流動腔室的內表面選擇性釋放細胞；并且使液體流動通過流動腔室使得釋放的細胞隨著液體運行，從而運輸細胞通過流動腔室。

在一些實施方式中，該方法還包括在選擇性釋放細胞之前，將細胞固定在流動腔室的內表面上。固定細胞可包括施加捕集勢(trappingpotential)。選擇性釋放細胞可包括移去該捕集勢。

在該方法的一些實施方式中，選擇性釋放細胞包括施加捕集勢。

在一些實施方式中，流動腔室的內表面包括電極并且捕集勢從電場梯度產生。該捕集勢可產生自介電電泳。電極可以是光電導的并且可通過光電鑷子(tweezer)提供捕集勢。

在一些實施方式中，捕集勢產生自光場梯度?？赏ㄟ^聚焦激光束、光鑷子或全息光鑷子來提供這種捕集勢。

在該方法的一些實施方式中，流動腔室的內表面包括光催化材料，并且選擇性釋放細胞包括照射該表面。在這些實施方式中，選擇性釋放細胞也可包括在表面附近誘導ph變化或生成羥基。流動腔室的內表面也可包括含有ph-敏感性或者可與羥基有反應性的試劑的基質層。光催化材料可以是二氧化鈦。

在該方法的一些實施方式中，細胞是粘附的。在一些實施方式中，細胞是非粘附的。在一些實施方式中，細胞一次釋放一個。在一些實施方式中，同時釋放多個細胞中的至多2、5或10個細胞。

在該方法的一些實施方式中，流動腔室包括出口，該液體流向出口，并且釋放的細胞一次一個到達出口。在一些實施方式中，流動腔室包括出口，該液體流向出口，并且至多2、5或10個釋放的細胞同時到達出口。

在一些實施方式中，流動腔室的內表面是透明的。

在一些實施方式中，該方法還包括檢測來自固定在流動腔室的內表面上的一個或多個細胞的信號，其中該細胞基于信號從流動腔室的內表面上選擇性釋放。該信號可反映一個或多個細胞的細胞周期階段、活力、或細胞類型。該信號可反映一個或多個細胞中的基因表達。

發(fā)明詳述

i.綜述

入射到流動腔室，如微流體通道上的光可與液體流聯用以計量單個細胞通過腔室。通過下述的機制，光可通過將單個細胞固定在腔室表面上或使它們離開該表面來介導它們在腔室中的遷移。光強度或其他參數的變化可從表面上選擇性釋放細胞并進入平行移向該表面的流體流中。然后細胞可被運載到下游，其中可一次一個或以所需的分組對它們進行分析或觀察。由于施加光的結果，細胞經受的力或化學處理是溫和的并且最小化對細胞生理的擾亂。從流動腔室的表面上選擇性釋放細胞可基于在細胞固定在表面上時從它們檢測到的信號。

ii.定義

“計量”是指用于控制物體進入液體流或物體在液體流中懸浮時通過結構的手段。計量可涉及例如物體進入流體流的時間或順序，物體之間的分離，或在一段時間內通過結構中的點的物體的數量。

“固定”是指向物體施加外力，從而限制物體可能作出的運動程度或速率。外力可以是例如，捕集勢或流體拖曳力。外力也可以是作用在物體上的回復力、粘附力和/或拉力，如果其錨定于另一個物體，如表面。固定的物體的運動程度或速率可相對于沒有外力的情況下中的參數降低。

“選擇性釋放”是指降低、移去或抵消固定特定物體或物體組的外力同時不顯著改變固定其他物體的外力。

“流動腔室”是指一種結構，其中可留下細胞和液體介質，并且細胞和介質可流動通過。該術語包括微流體通道和腔室、顯微流動池、血細胞計數器、以及用于觀察和分析細胞的類似結構?！皟缺砻妗笔侵?i)物理上由玻璃或其他固體材料與流動腔室的外部空間分離，并且(ii)與細胞和液體介質接觸的流動腔室的表面。

“捕集勢”是指將物體限制或拉至特定空間區(qū)域的力場。當限制到該區(qū)域時，該物體被稱為“捕集的”。

“介電電泳”是指，當介電顆粒位于不均勻電場中時，施加在該顆粒上的力，和由該力導致的任何運動。

“光電子鑷子”或等同的“oet”是指使用介電電泳操縱介電顆粒的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括多個電極，其中的至少一個是光敏的。當在多個電極中的電極之間施加交流電偏壓(a.c.bias)并且光入射到光敏電極上時，可在該多個電極中的電極之間生成非均勻電場。

“光阱”是指與聚焦的激光束相關的捕集勢。

iii.方法

本發(fā)明的方法將多個細胞運輸通過流動腔室，其中細胞初始固定在流動腔室的內表面上。該方法包括從流動腔室的內表面選擇性釋放細胞，并且使液體流過流動腔室使得釋放的細胞與液體一起運行的步驟。

該細胞可初始通過任何可行機制固定在流動腔室內。例如，該細胞可通過表面和細胞上的部分之間的靜電、范德華力、疏水性或親水性相互作用粘貼或粘附在流動腔室的內表面。可由細胞表面上的蛋白質、糖蛋白、糖、或脂質，或其任意組合介導固定。在一些實施方式中，固定可在細胞保留或通過流動腔室并與腔室的表面相互作用時隨機發(fā)生。如果需要，流動腔室內的特定表面可設置成誘導通過細胞的固定，如用細胞對其有親和性的化學官能團或紋理。可用于該目的的表面微成像技術綜述于，例如，kane等，biomaterials20：2363-2376(1999)和el-ali等，nature442：403-411(2006)。固定機制可針對某些細胞類型或細胞表面不同有特異性，或者在另一方面可針對許多細胞類型無特異性且通用。

該方法可包括在選擇性釋放細胞之前將該細胞固定在表面上的步驟。該步驟可包括使細胞懸液流動通過流動腔室并且允許發(fā)生隨機固定，如表面粘貼或粘附。或者，該步驟可包括主動誘導固定。例如，化學物可被導入流動腔室以交聯流動腔室和細胞表面上的部分。又例如，可以針對細胞表面的蛋白質的配體或光脈沖的形式向細胞施加外部刺激以加速與細胞粘附相關的生理過程?？墒褂萌我馑柽^程來固定細胞。細胞可在固定期間浸沒到液體介質中并且在選擇性釋放期間保持浸沒并運輸通過流動腔室。

在一些實施方式中，由于施加捕集勢，細胞被初步固定。該勢可限制細胞至流動腔室表面附近或與其重合，使得需要力來將細胞從該區(qū)域中移去。捕集勢優(yōu)選足夠大，使得將細胞從所需區(qū)域移去所需的力超過施加勢時細胞可能經受的任何其他力。這類其他力包括，例如，從細胞周圍的流體流動產生的拖曳力。捕集勢可施加足夠的時間使細胞粘附或粘貼表面，或直至需要選擇性釋放細胞之時。捕集勢可產生自電場梯度或光場梯度，例如，并且可產生自入射到流動腔室上的光。

在一些實施方式中，捕集勢產生自介電電泳。可通過將2個或更多個電極施加在流動腔室內或與之相鄰并且在它們之間導入非均勻電場來施加勢。優(yōu)選地，電極之一位于流動腔室表面上，并且介電電泳向該電極拖曳細胞。在細胞暴露于電場之后，在細胞中誘導偶極，并且介電電泳力由于該偶極和電場梯度之間的偶聯而作用于細胞上。介電電泳力的幅度和方向取決于細胞的尺寸、滲透性、和可極化性、細胞浸沒的介質的可極化性、電場頻率、和其他因素。因此，相同的電極可在不同條件下吸引或排斥特定細胞。任何電極，包括固定金屬電極或二維電極陣列，可用于生成電場，雖然優(yōu)選一個電極是光電導的，如下文所述。

在一些實施方式中，光電子鑷子(oet)可用于提供介電電泳捕集勢。oet技術在例如chiou等，nature436：370-372(2005)；ohta等，ieeejournalofselectedtopicsinquantumelectronics13：235-243(2007)；wu，naturephotonics5：322-324(2011)；和wo2010/115167a2中詳細描述。所有這些文獻以參考的方式并入本文中。簡言之，將光電導電極(在一些情況中包括光電晶體管)和透明電極置于流動腔室的相反側并且在它們之間施加交流電偏壓。光，例如，來自發(fā)光二極管的非相干光，然后導到光電導電極上，并且在透明電極和該電極的照射區(qū)域之間生成不均勻電場?？墒褂脭底治㈢R裝置(dmd)微顯示器來生成任意形狀的圖案化圖像，例如，圓圈或方形，其可用光源透射到光電導電極上。因此，非均勻電場的形狀，和由此的捕集勢可反映該圖像的形狀。通過對dmd微顯示進行重編程，該圖像可動態(tài)重新定形以一致地操縱多個細胞。例如，該細胞可被驅趕或移動穿過流動腔室的表面，或者一個細胞可被釋放而其他細胞保持固定。另外，可基于其可極化性和克勞休斯-莫索締因子(clausius-mossottifactor)的偏差區(qū)分不同類型的細胞，和不同生理狀態(tài)的細胞(例如，活和死)。

在一些實施方式中，捕集勢產生自光場梯度?？赏ㄟ^入射到流動腔室上并且各自用高數值孔徑物鏡緊密聚焦的一個或多個激光束來提供這種捕集勢。捕集勢被稱為光學阱。各光束可在聚焦處捕集細胞，部分由于細胞散射和激光折射。激光光學元件和流動腔室可設置成將激光束的焦點置于流動腔室表面附近。因此，當打開激光時，捕集勢可將細胞抓出流動腔室中的水性介質并將其固定到表面上。一旦與表面接觸，該細胞可粘貼或粘附于該表面，使得同時通過細胞與表面之間的相互作用和捕集勢來限制細胞的運動。

光學阱的物理和各種實施方式描述于，例如，neuman和block，reviewofscientificinstruments75：2787-2809(2004)，和grier，nature424：21-27(2003)。使用光學阱來固定在溶液中懸浮的顆粒的方法描述于題為“雜交單分子成像分選器”的共同待審的共同轉讓的美國專利申請?zhí)?3/340,504。這些文獻通過引用納入本文。

在本發(fā)明的方法中，2個或更多個統(tǒng)稱為光學鑷子的光學阱可用于獨立或一致地操縱流動腔室中的多個細胞。例如，可關閉一個阱使細胞流走，同時可打開另一個阱來固定細胞。或者，可使用2個阱來將2個細胞推向對方或相同方向。單激光束可產生2個或更多個光學阱，例如，通過正交極化將束分成2個路徑。該路徑可使用鏡、透鏡、光學調制器、光學偏轉器、電機械裝置和/或擋板獨立地引導和調整。也可使用衍射光學元件或通過從多個位置中的一個或多個激光束對光分時產生光學阱的多重陣列，稱為全息光學鑷子。本文使用的光學阱可具有任何所需形狀或模式結構。也可根據需要控制阱。例如，可通過計算機控制用于生成阱的光學元件，并且可使用照相機或顯微鏡來監(jiān)測流動腔室以追蹤細胞并且提供用于控制阱的輸入。

任意本文所述的捕集勢可用于選擇性釋放以及固定流動腔室的內表面上的細胞。在一些情況中，如當細胞非粘附時，可簡單通過移去捕集勢從內表面選擇性釋放細胞。在沒有捕集勢的情況下，由于布朗運動或液體流動，在細胞和內表面之間保留的任何相互作用可弱于作用于細胞上的力。因此，這些相互作用可被自發(fā)打破，并且可將細胞從其捕獲的位置處運出并通過流動腔室。當使用光電子鑷子提供捕集勢時，可通過關閉入射到光電導電極上的光來去除勢，從而去除流動腔室內的不均勻電場?；蛘?，透射到光電導電極上的圖像可重新成形，使得非均勻電場不再捕獲待釋放的細胞。當使用一種或多種光學阱形式的激光束提供捕集勢時，可通過阻斷激光或引導其遠離細胞來去除特定細胞周圍的勢。

也可通過施加捕集勢來選擇性釋放流動腔室表面上固定的細胞，使得該細胞從表面上拖走。當細胞粘貼或粘附表面時，可使用這種釋放機制，使得移去用于固定的任何捕集勢不足以實現釋放。如果需要，針對選擇性釋放，可在之后使用相同類型的用于固定的捕集勢。例如，在oet的情況中，可改變電場頻率，使得作用于細胞上的力的方向被逆轉。因此，初始被拉向光電導電極的細胞(在“正oet”下)可相反被排斥(在“負oet”下)，并且推離該電極最接近的表面。在光學捕集的情況中，可改變激光束和流動腔室的相對位置，使得光束聚焦移離表面并且移向流動腔室內部。因此，拉掉固定于表面的細胞并插入通過流動腔室的流體流。一旦細胞從表面上解放，可阻斷激光束。

設置用于固定和選擇性釋放的捕集勢可以是方便且直接的，并且提供了以高度精確性和控制來操縱單個細胞的方式。然而，會認識到使用捕集勢選擇性釋放細胞不需要通過用相同的捕集勢固定該細胞來進行，或完全不需要捕集勢來進行。例如，細胞可通過非特異性相互作用或細胞粘附固定在流動腔室的表面上，然后在所需的時間上使用負oet來選擇性釋放。一般而言，可以任意所需順序打開或關閉或重新設置本發(fā)明的方法使用的捕集勢以固定和釋放細胞。

可通過以任意方向向該細胞施加力使用捕集勢來固定或選擇性釋放細胞。例如，捕集勢可以與細胞固定的表面平行的方向，以及(或者)與該表面垂直的方向上向細胞施加力。用于介電電泳的電極，包括至少一個光敏電極，可互相相鄰鋪設或集成在流動腔室的內表面上。照射該表面同時在電極之間施加交流電偏壓產生與該表面平行的產生，其可向電極附近固定的細胞上施加橫向力。用于該過程的系統(tǒng)被稱為橫向場光電子鑷子(loet)，并且在ohta等，ieeejournalofselectedtopicsinquantumelectronics13：235-243(2007)和他處中詳細描述?？墒褂霉鈱W阱通過將該阱置于細胞附近或剛好離開流動腔室的表面來向固定的細胞施加橫向力。

在本發(fā)明方法的一些實施方式中，使用光催化選擇性釋放細胞，這種現象綜述于linsebigler等，chemicalreviews95：735-758(1995)和他處。該細胞首先使用任何所需機制或過程固定在含有光催化材料的流動腔室的內表面上。光催化材料的非限制性示例是二氧化鈦(tio2)。為了釋放感興趣的細胞，用短波(即，藍或近紫外)光照射這些細胞附近的表面部分。合適的波長包括例如388nm或418nm，雖然技術人員將認識到超過400nm的波長對細胞產生較少的損傷。優(yōu)選地，當內表面出現在流動腔室的壁上時，入射光來源于相對于內表面的壁的相反側。因此，光在擊打光催化材料之前沒有通過細胞，并且降低了因直接接觸光導致的對細胞的損傷。

短波長光激活了光催化材料，其在感興趣細胞和表面附近釋放羥基和質子。釋放的物質可反應并破壞將細胞錨定至表面的化學部分，導致細胞脫離。在一些情況中，光催化材料的激活和細胞脫離伴隨著ph變化。流動腔室的內表面也可包括含有ph-敏感性或者可與羥基有反應性的試劑的基質層，并且可通過二次反應破壞錨定部分。光源優(yōu)選是準直的，并且當射入流動腔室的內表面上時對著該表面的小面積。因此，一次只有少量的細胞暴露于光源，并且通過將光源靶向或掃過感興趣的細胞來實現選擇性釋放。

在一些實施方式中，也可使用光催化來選擇性殺死細胞?？赏ㄟ^暴露于由激活的光催化材料釋放的羥基或這些基團的二次反應的副產物而殺死細胞。細胞可同時殺死并釋放，或者出于區(qū)分感興趣細胞和不感興趣細胞的目的殺死。將認識到需要選擇性釋放和/或殺死固定的細胞的條件取決于光催化材料、任何基質層、細胞本身、和固定模式的特性。

本發(fā)明的方法可使用任何細胞類型。該細胞可以是例如，原核、真核、植物、動物、哺乳動物或人。細胞可以是粘附的或非粘附的。將認識到不同的細胞類型對于操作、培養(yǎng)和接種而言有不同要求，并且可固定在表面上并隨后在不同條件下釋放。例如，不同細胞類型顯示出寬范圍的電可極化性，將光反射到不同角度，并且對于流體剪切力和羥基有不同敏感性。因此，本發(fā)明方法的詳細內容取決于運輸通過流動腔室的細胞類型。在一些實施方式中，來自多個細胞的所有細胞衍生自相同的物種、個體、器官、或組織。

在本發(fā)明的方法中，可使用任何流體，其允許在流動腔室中固定和選擇性釋放細胞，并且以下游分析所需的生理狀態(tài)遞送細胞?？墒褂玫牧黧w的示例包括水、鹽水、緩沖液、細胞生長或培養(yǎng)基、血漿、或血清。在一些實施方式中，液體經選擇與流動腔室中的細胞大致等滲以防止膨脹或收縮。當以電場梯度提供捕集勢以固定或選擇性釋放細胞時，可選擇流動腔室中的液體以具有相對于細胞質的所需電導率。例如，液體可含有不帶電的滲透物(例如，蔗糖和右旋糖)并且具有比大部分細胞類型低的電導率，使得可使用正oet操縱該細胞。

細胞可在固定、選擇性釋放和運輸通過流動腔室期間浸入相同液體，或者可在不同步驟使用不同液體。例如，當細胞固定在流動腔室表面上時，在選擇性釋放細胞之前可用新液體置換流動腔室的表面上存在的液體。這種新液體可進而用流過流動腔室以運輸釋放的細胞的液體置換。因此，使液體流過流動腔室可包括置換或“追加”之前釋放的細胞懸液。然而，在其他實施方式中，同時發(fā)生選擇性釋放和流動。液體可根據流動腔室構造的適合和需要導入、移出、和流過流動腔室。

細胞從流動腔室的表面選擇性釋放可利用上述的任意機制，并且可根據需要計量。例如，細胞可一次釋放一個或分組釋放。在一些實施方式中，同時釋放多個細胞中的至多2、5或10個細胞?？膳c液體流速一起設置釋放時間以實現運輸通過流體腔室的細胞的所需頻率。在一些實施方式中，頻率保持得足夠低以使細胞在下游單獨觀察或分析，并且檢測細胞間的差異。在細胞已經運輸通過流動腔室并離開流動腔室之后可根據需要處理它們。例如，可用藥物裂解、處理，或任選地詢問細胞。

流動腔室可以是較大液體操作系統(tǒng)的部分，如微流體裝置或流式細胞儀。在一些實施方式中，流動腔室包括內表面下游的出口，所述內表面上固定細胞。液體流過流動腔室并且流向出口，并且將從表面選擇性釋放的細胞運輸至出口?？捎嬃考毎倪x擇性釋放，使得釋放的細胞一次一個到達出口?；蛘?，可進行計量，使得至多2、5或10個細胞同時到達出口。

流動腔室可具有任何需要的幾何形狀或尺寸，并且可由任何方便的材料制成。在一些實施方式中，多個細胞初始固定的內表面，或流動腔室的相反側上的表面，是透明的。當以光學阱施加捕集勢時，需要至少一個透明表面使激光透過流動腔室。透明表面一般也可用于本發(fā)明的方法中用于觀察固定的細胞?？墒褂眠@種觀察來選擇釋放的細胞或確定細胞在表面上的位置，使得可恰當引導用于生成捕集勢或誘導光催化的光。任意合適設備，包括但不限于顯微鏡、照相機、檢測器或圖像處理器可與流動腔室偶聯以便于對表面上細胞的觀察。

可使用任何基礎或標準來選擇釋放的細胞。例如，可從表面釋放大于特定尺寸的細胞并且可保留較小的細胞。因此可釋放初始固定在表面上的所有細胞，或根據需要僅釋放亞組。也可以任意順序釋放細胞。例如，確定缺少感興趣性質的細胞可首先釋放并且設置在下游，并且然后具有該性質的細胞可釋放并另外分析?；蛘撸_定為最感興趣的細胞可首先釋放，較不感興趣的細胞之后釋放或完全不釋放，取決于首先釋放的細胞的下游分析結果。

在一些實施方式中，本發(fā)明還包括檢測來自固定在流動腔室的內表面上的一個或多個細胞的信號，并且基于該信號選擇性釋放細胞的步驟。該信號可產生自熒光或顏色標簽，例如，并且可產生自結合至細胞表面的標簽?；蛘?，信號可產生自染料對細胞脂膜的滲透并且反映了膜的完整性?？蓮膯蝹€細胞檢測到的其他類型的信號將對于本領域技術人員而言是顯而易見的。在各種實施方式中，信號反映了一個或多個細胞的細胞周期階段、活力、或細胞類型，或一個或多個細胞中的基因表達?？墒褂萌魏畏奖愕倪^程和設備從固定的細胞檢測信號。根據需要，這些信號可與釋放細胞的裝置偶聯，如用于施加捕集勢或誘導光催化的光源，并且可用于自動化釋放。

iv.系統(tǒng)

本文還提供了用于進行上述方法的系統(tǒng)。系統(tǒng)可包括流動腔室以及對于將細胞固定在流動腔室的內表面上、從該表面選擇性釋放細胞、和使液體流過流動腔室以運輸釋放的細胞所需或方便的任何裝置。這些裝置可包括光源和光敏材料(例如，電極)，如上所述，用于施加捕集勢或誘導光催化，加上任何相關的光學元件、電子元件、能源、控制器、處理器、硬件、或軟件。該系統(tǒng)也可包括與流動腔室連接的液體操作組件，和用于當細胞固定在流動腔室中時或在選擇性釋放之后觀察、分析或檢測來自細胞的信號的設備。如果需要，光源和設備可操作地偶聯，并且用于固定和選擇性釋放細胞的過程可自動化。在閱讀上述公開之后，本申請范圍內的系統(tǒng)的其他特征和著力點將顯而易見。

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可獲得本發(fā)明的多種修改形式和變化形式而不背離本發(fā)明的精神和范圍，這對于本領域技術人員而言是顯見的。本文所述的的具體實施方式僅起示例作用，且不意于構成任何方式的限制。本說明書和實施例應僅視為示例性的，本發(fā)明真正的范圍和精神由所附權利要求書來說明。