本發(fā)明涉及一種適于改進對不同物種如何相互作用的檢測的固體支撐件。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于分析儀器的固體支撐件，其依賴于檢測原理，包括在所述區(qū)域的測量過程中在區(qū)域附近減少液體。甚至更具體地，本發(fā)明涉及改進分子(小化學(xué)結(jié)構(gòu)或大分子如蛋白質(zhì))如何與不同分子相互作用的檢測，其中分子中的一個附著到固體支撐件上。

背景技術(shù)：

有許多方法和裝置可用于檢測不同物種如何相互作用。在生物化學(xué)領(lǐng)域，一種常用的測量是確定抗體與抗原的相互作用有多強，以便更好地理解免疫過程。在藥物發(fā)現(xiàn)中，進行類似的測量以確定小分子與疾病相關(guān)靶標(biāo)的相互作用有多強，以便更好地理解小分子是否值得作為潛在藥物進一步研究。

用于測量不同物種的相互作用的一種特定類型的方法和裝置公開在wo2005080967中，其通過引用并入本文。這種目前可以商品名ligandtracer商購獲得的裝置能夠測量一系列物種之間的相互作用。在wo2005080967中，描述了該裝置可以測量放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)如何與活的貼壁細胞相互作用。在科學(xué)文獻中，目前存在這樣的裝置的示例，其監(jiān)測懸浮液中的病毒與貼壁細胞之間、懸浮細胞與貼壁細胞之間、小分子與貼壁細胞之間、溶液中的蛋白質(zhì)與吸附到磁珠(其繼而通過永久磁鐵錨定)的蛋白質(zhì)之間的相互作用以及化學(xué)物質(zhì)從固體納米顆粒的解離，這里僅舉幾個說明性示例。

通常，當(dāng)所述固體支撐件和所述液體接觸時，根據(jù)wo2005080967的裝置是適用于檢測附著或定位在固體支撐件(靶標(biāo))上的物種與液體中的物種(配體)之間的相互作用的裝置。在固體支撐件上，第一物種(靶標(biāo))可以附著在一個或多個非重疊的限定區(qū)域中。存在能夠檢測附著到固體支撐件的所述物種與包含在所述液體中的所述物種之間的相互作用的檢測器。該裝置的特征在于適于在所述固體支撐件的限定區(qū)域中臨時減少在檢測過程中所述支撐件與其接觸的液體的量的機構(gòu)；并且至少一個限定區(qū)域不具有附著的感興趣物種，以便形成用于檢測的參考區(qū)域。優(yōu)選地，如wo2005080967中所述的固體支撐件是能夠保持限制在其邊界內(nèi)的液體(諸如培養(yǎng)皿)的基本上平坦的皿，但是能夠限制液體的任何其它種類的貯器或容器也是可能的。檢測器可以例如是閃爍檢測器或熒光檢測器，但是許多其它類型的檢測器也是可能的。該裝置連接到計算機，用于使檢測器輸出與固體支撐件取向同步。wo2005080967中的本發(fā)明的關(guān)鍵特征在于，在進行所述測量之前，暫時減少覆蓋支撐件的限定部分的液體的量。液體的臨時減少包括在所述限定區(qū)域中的至少一個附近的液體量的減少，而不改變與所述固體支撐件接觸的液體的總量。在固體支撐件的不發(fā)生相互作用的不同部分上進行參考測量，所述部分限定參考區(qū)域。適當(dāng)?shù)?，計算靶?biāo)和參考測量之間的差。暴露、測量和減少液體量的步驟的順序優(yōu)選地大約每分鐘重復(fù)一次，并且在重復(fù)所述步驟順序之前，所述配體的濃度增加有限量。

用于實現(xiàn)液體量減少的一種方法是通過使支撐件以偏離水平線的角度取向，以提供所述支撐件的升高部分和下部分，使得升高部分將被比下部分少的液體覆蓋，并且其中支撐件以預(yù)定速度旋轉(zhuǎn)。通過來回傾斜固體支撐件來實現(xiàn)用于減少液體量的另選方法。

如在wo2005080967中所述的固體支撐件通常是容器。在該容器中存在兩個或更多個限定區(qū)域。置于容器中的一種液體和所述液體接觸所有限定區(qū)域。至少一個限定區(qū)域始終保留用于參考目的。靶標(biāo)在限定區(qū)域上的附著可以以多種方式進行。細胞可以直接在限定的區(qū)域上生長。限定區(qū)域可以涂覆有已知增強細胞附著的蛋白質(zhì)。限定區(qū)域可以涂覆有已知結(jié)合用于靶標(biāo)的附著的特定分子的蛋白質(zhì)。一種這樣的蛋白質(zhì)是強烈結(jié)合生物素的鏈霉親和素。然后可以方便地將生物素化的靶標(biāo)(例如生物素化的dna)作為靶標(biāo)附著到限定區(qū)域。限定區(qū)域的表面可以被化學(xué)改性以使得靶標(biāo)的共價附著成為可能。將靶標(biāo)直接被動吸附到限定區(qū)域上也是可能的。限定區(qū)域的表面不一定是實心和平坦的。具有附著的生物聚合物(例如聚乙二醇或葡聚糖)的多孔表面或表面可能是有利的，因為增加的靶密度使得更高的信號稱為可能。

在“biochemicalandbiophysicalresearchcommunications428(生物化學(xué)和生物物理研究通訊)(2012)74-79”中公開了可以將永磁體放置在限定區(qū)域下方以將磁性顆粒錨定在限定區(qū)域中。

當(dāng)前的裝置被設(shè)計用于使一種或多種物種(一個或多個靶標(biāo))附著到固體支撐件上，并將其它物種(或配體)保持在溶液或懸浮液中。目前，常規(guī)培養(yǎng)皿用作固體支撐件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明包括新型固體支撐件的開發(fā)，其具有擴展測量在類似于wo2005080967中描述的裝置中的物種之間的相互作用的可能性的特征。

在第一方面，公開了一種用于測量兩種不同物種的相互作用的固體支撐裝置。該裝置包括至少一個隔室，每個隔室能夠?qū)⒁后w保持在其邊界內(nèi)。此外，每個隔室包括至少兩個非重疊的限定區(qū)域，其中至少一個被指定為參考區(qū)域。固體支撐件的特征在于，當(dāng)固體支撐件放置在水平位置時，通過分隔件將一個隔室內(nèi)的限定區(qū)域分隔開，所述分隔件為流體從一個限定區(qū)域流動到另一個區(qū)域提供屏障，但是分隔件被配置成，當(dāng)固體支撐件被置于非水平位置時，允許流體從一個限定區(qū)域流動到另一個限定區(qū)域。

在一個實施例中，固體支撐裝置還包括至少兩個獨立的隔室。

在另一個實施例中，固體支撐裝置的分隔件是在隔室內(nèi)延伸的細長脊，以便以相同尺寸的分區(qū)來細分隔室。

在另一個實施例中，固體支撐裝置具有在裝置中心的升高部分和從裝置的周邊延伸到所述升高部分的分隔件。

在又一個實施例中，固體支撐裝置還包括在支撐件的外側(cè)上的不均勻間隔的凹槽，其適于與保持件上的相應(yīng)的銷配合，由此所述裝置僅以一種方式可附接到所述保持件。

在另一個實施例中，固體支撐裝置中的分隔件由固體材料制成。

在又一個實施例中，固體支撐裝置中的分隔件作為疏水區(qū)域提供在限定區(qū)域之間。

固體支撐裝置中的分隔件還可以由能夠屏蔽熒光或放射性標(biāo)記的發(fā)射的材料制成，或者包括用于容納屏蔽材料的狹縫。標(biāo)識結(jié)構(gòu)可以進一步放置在固體支撐裝置的外部。

在第二方面，公開了檢測固體支撐件上的物種與液體中的物種之間的相互作用的方法。該方法包括具有至少兩個獨立容器的固體支撐件，容器中的每個具有至少兩個非重疊限定區(qū)域。第一物種附著在限定區(qū)域中的至少一個上。至少一個限定區(qū)域是固體支撐件的沒有感興趣的物種附著到限定參考區(qū)域的所述部分的區(qū)域。對于每個容器中的每個限定部分，相互作用的檢測包括將限定部分暴露于包含第二物種的液體，以便覆蓋固體支撐件的限定部分，此后暫時減少與保持所述第一物種的限定部分接觸的所述液體的量，所述減少被執(zhí)行使得當(dāng)所述固體支撐件水平靜止放置時，保留在限定區(qū)域上的液體的量小于存在于限定區(qū)域附近的液體的量的10％，并且最后執(zhí)行能夠檢測由臨時減少量的液體覆蓋的所述限定部分的所述第一和所述第二物種之間的相互作用的測量。重復(fù)暴露于液體、減少液體量和進行測量的步驟，以便產(chǎn)生時間分辨測量，并且液體的暫時減少包括在所述限定區(qū)域中的至少一個附近的液體量的減少而不改變與所述固體支撐件中的所述容器中的任一個接觸的液體的總量。通過旋轉(zhuǎn)具有偏離水平方向的取向的固體支撐件，使得固體支撐件的一部分浸沒在所述液體中，來提供液體的暫時減少并且固體支撐件在每次檢測之間旋轉(zhuǎn)超過120度。

附圖說明

為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)在將參考附圖通過示例的方式詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選和另選實施例，其中：

圖1示出了合適的固體支撐件；

圖2示出了合適的固體支撐件；

圖3示出了合適的固體支撐件；

圖4示出了合適的固體支撐件300如何在測量裝置中定向；

圖5示出了合適的固體支撐件；

圖6示出了合適的固體支撐件；

圖7示出了合適的固體支撐件；

圖8示出了合適的固體支撐件；

圖9示出了圖8所示類型的多個固體支撐件的組裝；

圖10示出了合適的固體支撐件；以及

圖11示出了合適的固體支撐件和來自在同一固體支撐件中使用兩種獨立液體進行的測量的結(jié)果。

圖12示出了合適的固體支撐件和來自在同一固體支撐件中使用兩種獨立液體進行的測量的結(jié)果。

圖13示出了合適的固體支撐件和來自當(dāng)改變旋轉(zhuǎn)方案時在同一固體支撐件中使用兩種獨立液體進行的測量的結(jié)果。

圖14示出了獲得的信號，其作為從來自限定區(qū)域保持靶標(biāo)的信號減去來自限定參考區(qū)域的信號向每個隔室呈現(xiàn)。

具體實施方式

為了本申請的目的，并且為了清楚起見，進行了以下定義：

水平位置被定義為距標(biāo)稱水平線5度或更小，并且傾斜被定義為大于5度的斜率。

附著到固體支撐件上的物種表示為“靶標(biāo)”或“第一物種”，存在于液體中的物種表示為“配體”或“第二物種”?？赡艿奈锓N(即靶標(biāo)和配體)包括但不限于組織樣品、細胞、細菌、病毒、固體顆粒、大分子(例如蛋白質(zhì)、dna、rna)和其它化合物。優(yōu)選的配體包括大分子(例如蛋白質(zhì)、dna、rna)、可溶解于液體中的其它化合物和任何物種。

固體支撐件被定義為能夠保持限制在其邊界內(nèi)的一種或多種液體的基本上平坦的皿(諸如培養(yǎng)皿)，但是能夠限制液體的任何其它種類的貯器或容器也是可能的。

隔室被定義為可以正好保持限定在其邊界內(nèi)的一種液體的容器。通常，現(xiàn)有技術(shù)的固體支撐件具有至少一個隔室。根據(jù)本發(fā)明的固體支撐件具有兩個或更多個隔室。

限定區(qū)域被定義為隔室的局部區(qū)域或區(qū)，其中每個限定區(qū)域覆蓋小于隔室區(qū)域的50％。隔室具有至少兩個非重疊的限定區(qū)域。至少一個限定區(qū)域被保留用于附接靶標(biāo)(也稱為活動區(qū)域)，并且至少一個限定區(qū)域被保留用于參考目的。沒有任何東西附著到或者有一個不相關(guān)的靶標(biāo)附著到參考區(qū)域。

本發(fā)明旨在提高不同物種之間的相互作用的表征的效率。具體地，本發(fā)明旨在提高在使用與wo2005080967中描述的裝置類似的裝置的情況下，不同物種之間的相互作用的表征的效率。

當(dāng)所述載體和所述液體接觸時，wo2005080967中描述的裝置能夠檢測附著到支撐件的物種(靶標(biāo))與液體中的物種(配體)之間的相互作用。存在固體支撐件，第一物種可以在其上附著在其上的一個或多個非重疊的限定區(qū)域中；能夠檢測附著到固體支撐件的所述物種與包含在所述液體中的所述物種之間的相互作用的檢測器。該裝置的特征在于，適于在所述支撐件的限定區(qū)域中暫時減小在檢測過程中所述支撐件與之接觸的液體量的機構(gòu)；并且限定區(qū)域中的至少一個不具有附著的感興趣物種，以便形成用于檢測的參考區(qū)域。

為了使固體支撐件在wo2005080967中描述的裝置的上下文中起作用，所述固體支撐件應(yīng)當(dāng)基本上是平坦的，并且必須能夠保持限制在其邊界內(nèi)的液體。固體支撐件還必須包括至少非重疊的限定區(qū)域，其至少一個這樣的限定區(qū)域用于參考目的。根據(jù)wo2005080967，該裝置將在檢測在所述限定區(qū)域中存在標(biāo)記物種的期間，暫時減少限定區(qū)域附近的液體。用于實現(xiàn)暫時減少的在限定區(qū)域附近的液體量的一種可能的方法是，使用圓形固體支撐件并將其放置在傾斜且緩慢旋轉(zhuǎn)的支撐件保持件上，并將檢測器安裝在支撐件的升高部分上。通過沿著圓形支撐件的邊緣放置限定區(qū)域，每個限定的區(qū)域可以通過支撐件保持件的旋轉(zhuǎn)而放置在檢測器附近，而大部分液體將保持在固體支撐的下端。用于實現(xiàn)暫時減少在限定區(qū)域附近的液體量的另一種可能的方法是使用放置在傾斜平臺上的固體支撐件。在檢測期間，平臺升高支撐件的一部分，其中多個限定區(qū)域以不重疊的方式定位，以便暫時將液體移動到下端。檢測器安裝在升高區(qū)域上以檢測在不同限定區(qū)域上存在標(biāo)記物種的目的。

ligandtracer，根據(jù)wo2005080967中描述的原理操作的裝置的當(dāng)前使用通常涉及使用兩個限定區(qū)域，其中一個限定區(qū)域是參考。在極少情況下，已經(jīng)公開了使用三個或四個限定區(qū)域(參見例如如在appliedradiationandisotopes68(2010)2372-2376中出版的larsgedda和合作者的報告“real-timeimmunohistochemistryanalysisofembeddedtissue(嵌入組織的實時免疫組織化學(xué)分析)”，上述文獻以引用方式并入本文)。在所有情況下，常規(guī)陪替氏培養(yǎng)皿已用作固體支撐件，并且恰好一種液體在任何時間點與固體支撐件接觸。這可能是一個限制，因為有時期望同時檢測不同物種(或配體)與細胞系、或者不同配體濃度的相同物種的相互作用。在其它情況下，期望同時檢測更大數(shù)量的細胞系和多種不同物種或多種不同濃度的一種物種的相互作用。根據(jù)本發(fā)明，可以制備固體支撐件，其(a)使得在同一固體支撐件內(nèi)處理多個限定區(qū)域的操作程序更簡單，和(b)平行測量，以克服所識別的限制。

因此，要克服的問題是引入至少兩個不同的獨立隔室，每個隔室將不同的液體以可用于根據(jù)wo2005080967中描述的原理操作的裝置中的方式相同的方式保持在相同的固體支撐件中(其中描述每個固體支撐件僅一種液體)。從技術(shù)上講，有兩個問題需要克服。第一個問題涉及檢測在每個隔室中的限定區(qū)域上發(fā)生的多個分子相互作用的能力。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，這可以通過將兩個容器成形為半圓形，并將它們連接以形成一個圓形固體支撐結(jié)構(gòu)，然后在傾斜取向的緩慢旋轉(zhuǎn)期間沿著固體支撐的邊緣檢測來克服。然而，兩個隔室相對于這種固體支撐件的旋轉(zhuǎn)軸線是非對稱的這一事實引入了另一個問題，即在檢測之前從限定區(qū)域獲得均勻的液體排出。然而，根據(jù)本發(fā)明，甚至可以通過重新設(shè)計固體支撐件在測量之前如何旋轉(zhuǎn)而獲得均勻排出。

在圖1中，示出了適用于類似ligandtracer儀器中的新型固體支撐件。支撐件100是類似圓形培養(yǎng)皿的容器，即具有大致圓形的幾何形狀，使得每個隔室具有圓形部段的形狀。

所述皿具有除了皿的中心之外的基本平坦的底部，其中底部可以升高。該皿包括兩物種型的分隔件。存在用于分離液體的目的的第一(高)分隔件111，即，使得可以在相同的固體支撐件中的不同隔室中使用完全獨立的液體。一個隔室被指示為條紋區(qū)域123。由所述第一(高)分隔件限制的每個區(qū)域具有至少一個第二(低)分隔件112。第二(低)分隔件的目的是當(dāng)固體支撐件置于水平位置時簡化限定區(qū)域的分離。任選的中心突起113使得可以減小限定區(qū)域的尺寸。當(dāng)將皿放置在水平位置時，因此可以將不同的液體放置在由低分隔件和中心突起限制的局部隔室中。通常，固體支撐件的第二(低)分隔件是在隔室內(nèi)延伸的細長脊，以便以相同大小的分區(qū)來細分隔室。在局部隔室中，通常存在一個限定區(qū)域。當(dāng)放置在水平位置時，局部隔室應(yīng)當(dāng)保持至少10微升和至多30毫升的液體。在儀器的當(dāng)前形式中，每個局部隔室應(yīng)該保持在50微升和1毫升的液體之間，這取決于限定區(qū)域的大小。一般來說，優(yōu)選設(shè)計固體支撐件，使得每個局部隔室具有能夠在適當(dāng)位置保持約0.3mm厚的均勻分布的液體層的屏障。甚至更優(yōu)選設(shè)計固體支撐件以保持1mm厚的液體層，或甚至3mm厚的液體層，或10mm厚。這意味著例如不同類型的細胞可以在不同的局部隔室中培養(yǎng)，或不同的蛋白質(zhì)可以吸附到不同局部隔室的底部的表面。

當(dāng)放置在類似于裝置的裝置中時，皿將以傾斜的取向緩慢旋轉(zhuǎn)，其中檢測器安裝在固體支撐件的升高部分上。在傾斜取向的下部位置，第二(低)分隔件足夠低，以允許液體接觸由所述低屏障分隔開的所有限定區(qū)域。在圖1所示的示例性固體支撐件中，每個容器準(zhǔn)備用于兩個限定區(qū)域。對于容器中的兩個，限定區(qū)域用虛線圓119、120、121、122示出。在每個隔室內(nèi)，必須存在一個用于參考使用的限定區(qū)域，并且另一個附著有感興趣物種。不管它們屬于哪個隔室，所有限定區(qū)域通常位于距圓形固體支撐件的中心大致相同的距離處。皿可以任選地具有間隙或凹槽或其它幾何結(jié)構(gòu)114、115、116，其以不規(guī)則圖案設(shè)置在外周邊上，使得固體支撐件可以以正好一個取向放置在保持件中。

如果使用固體支撐件的裝置配備有包括定向成配合在凹槽114、115、116中的三個銷的實心支撐件保持件，則可以以完全一種方式將所述固體支撐件放置在所述保持件中。更一般地，固體支撐件可以在支撐件的外側(cè)上具有任何數(shù)量的非均勻間隔的凹槽或非對稱的幾何圖案，其適于與保持件上的相應(yīng)的銷或結(jié)構(gòu)配合，由此固體支撐件只以一種方式可附接到保持件。

固體支撐件可以任選地具有標(biāo)識特征，這使得可以檢測哪物種型的皿已經(jīng)放置在皿保持件中。這種標(biāo)識特征可以是能夠由機械開關(guān)或光學(xué)開關(guān)感測的脊117形式的機械。

脊設(shè)置在實心支撐結(jié)構(gòu)的外周邊上，但是為了提供“標(biāo)稱”直徑，在設(shè)置脊部的區(qū)域中，壁118制造得更薄。因此，脊從周邊延伸到與固體支撐件的外徑整體相對應(yīng)的程度。

通過將脊117設(shè)置在凹槽115和凹槽116之間的不同位置處，皿的標(biāo)識可以通過脊的位置來表示。通過使用多個標(biāo)識特征，數(shù)字簽名可以結(jié)合在固體支撐件上。例如，使用八個這樣的標(biāo)識特征，脊將允許256個唯一組合(一個字節(jié)的信息)。還可以在固體支撐件的外側(cè)上附上條形碼，以使固體支撐件的光學(xué)識別成為可能。在類似ligandtracer的裝置中使用如圖1中所述的固體支持體將導(dǎo)致同時進行多個獨立測量的可能性。

使用橫截面草圖130描述圖1所示的固體支撐件的近似尺寸，其描述了定義為a的部分。近似尺寸如下：

外徑od(131)：30-300mm

中心突起直徑cd(132)0–0.95*od

實心支撐件高度sh(133)3-50mm

中心突起高度ch(134)0–0.7*sh

高分隔件的高度類似于sh，低分隔件的高度通常類似于ch，但可以更高。

在通常意義上，圖1所示的固體支撐件是基本上圓形的固體支撐件，其包括多于一個的隔室，所述隔室相對于旋轉(zhuǎn)軸線以規(guī)則的方式分布，所述隔室具有基本上相同的幾何形狀，并且每個隔室從旋轉(zhuǎn)軸線的角度看是不對稱的。這意味著存在于一個隔室中的液體將以不同的圖案在所述隔室內(nèi)移動，這取決于所述隔室是從下端朝向抬高端旋轉(zhuǎn)還是沿另一方向旋轉(zhuǎn)。不均勻的液體運動模式可能在檢測期間導(dǎo)致困難，如下所述，但是這些困難可以通過使用本發(fā)明來克服。

如圖1所述的固體支撐件可以被修改以包括不同數(shù)量的隔室(從一個隔室到多于100個隔室)，其中每個隔室被分成至少兩個局部隔室。在圖2中，示出了另一個非限制性示例。固體支撐件200具有四個隔室(其中一個顯示為條紋區(qū)域213)，隔室由第一(高)分隔件(其中一個指示為項目212)分開，每個隔室具有兩個第二(低)分隔件211/隔室，將每個隔室分成三個限定區(qū)域221、221、223。截面圖像230描述了定義為a的截面。這種類型的固體支撐件將使得可以進行四次獨立測量，每次使用一個參考區(qū)域和包含潛在不同的感興趣物種的兩個限定區(qū)域。

在圖3中，示出了完全不同類型的固體支撐件300。非限制性示例性支撐件300具有微板的近似幾何形狀。為了比較，微板具有近似尺寸128mm*85mm*15mm。因此，本裝置具有大致矩形的幾何形狀。

圖3中的支撐件具有適用于在根據(jù)wo2005080967的裝置中使用的六個隔室(其中一個被虛線畫為項目301)，其使用前述的用于在檢測期間暫時減少液體的傾斜方法。隔室是細長的并且延伸穿過裝置，并且在每個隔室的一端處有升高區(qū)域333。每個這樣的隔室具有外周邊311和分隔隔室301的第一(高)分隔件314以及至少一個第二(低)分隔件312，其中分隔件將隔室分隔成兩個細長的“盲”臂(一個臂顯示為項目302)，在所述臂在一端303處流體連通，并且在相對端中具有死端(deadend)304的意義上，臂是“盲”的。應(yīng)當(dāng)注意，雖然這些分隔件被示出為與分隔各個隔室的分隔件314是基本上相同的高度，但是它們僅需要足夠高以在所述區(qū)域的制備期間為限定區(qū)域之間的流體流動提供屏障(比較與圖1和圖2相關(guān)的描述)。每個臂包括一個限定區(qū)域321、322，其位于沒有連接的端部。支撐件具有基本上平坦的底部，除了在臂連接的區(qū)域中的略微升高的區(qū)域313。當(dāng)水平放置時，不同的液體可以放置在不同的臂中，由臂連接附近的升高的底部保持分開。這使得可以在限定區(qū)域處在不同的臂中培養(yǎng)不同的細胞。然而，可以使用沒有升高區(qū)域313的這種類型的固體支撐件，但是需要在固體支撐件輕微傾斜的情況下進行細胞培養(yǎng)，以便保持臂連接的區(qū)域略微升高，并且在不同的臂分開。當(dāng)放置在規(guī)則傾斜的臺上時，當(dāng)連接點在下端時，液體將聚集在連接點，在整個隔室中提供一種均勻的液體，同時減少在其中進行檢測的升高的非連接臂中的液體量。這在圖4中示出，其中旋轉(zhuǎn)軸線403可導(dǎo)致限定區(qū)域端部402的升高或臂連接端部401的升高。當(dāng)死端升高時，能夠檢測所有限定區(qū)域中物種的存在的檢測器404安裝在固體支撐件的“死”端402附近，參見410。如420所示，通過抬高臂連接端401將液體返回到限定區(qū)域，如420中所示。如圖3所示類型的固體支撐件的近似尺寸如下：

長度le(331)：30-300mm

寬度wi(332)：0.1-1.0*le

升高區(qū)域er(333)：0-0.8*wi

總高度th(334)：3-50mm

高度eh(336)：0.1mm-0.9*cd

隔室深度cd(337)：0.1-0.9999*th

當(dāng)來回傾斜支撐件時，隔室中的均勻液體將接觸隔室內(nèi)的所有連接的臂，而液體將在檢測過程中暫時減少?？梢灾苽湓诟羰覂?nèi)具有不同數(shù)量的連接臂的支撐件，以及放置在同一固體支撐件中的多個獨立隔室。后者意味著在根據(jù)wo2005080967的傾斜裝置中的測量期間，可以同時進行多個獨立的測量。

可以使用圖3所示類型的不同類型的類似固體支撐件。一個非限制性替代方案是圖5所示的固體支撐件，其中示出包括四個隔室(其中一個指示為條紋區(qū)域504)的微板狀支撐件(500)，每個隔室具有三個臂501、502、503。

在圖6中，示出了又一種可能類型的固體支撐件600。它是具有由一個第一(高)分隔件601分隔開的兩個隔室的圓形培養(yǎng)皿狀固體支撐件。存在具有至少兩個限定區(qū)域的內(nèi)隔室ic，在圖6中的實施例中，存在四個限定區(qū)域，其中的兩個區(qū)域602、604用虛線圓標(biāo)記。內(nèi)隔室ic在610處以水平虛線突出顯示。存在具有與內(nèi)部隔室ic大致相同數(shù)量的限定區(qū)域的外部隔室oc。在固體支撐件600的情況下，在外部隔室oc中有四個限定區(qū)域，其中兩個被示為虛線圓603、605。外部隔室在620中以豎直虛線突出顯示。無論它們屬于哪個隔室，所有限定區(qū)域都位于距固體支撐件中心大約相同的距離處，如用四個箭頭606所示。為了在固體支撐件被置于水平位置時可以在限定區(qū)域中使用不同液體，固體支撐件的最外部分和中心具有略微升高的底部，如630中的虛線區(qū)域所示。在類似于600的固體支撐件中，針對類型100的固體支撐件(圖1)所討論的第二(低)低分隔件的作用由連接到曲線高分隔件601的升高區(qū)域630提供，導(dǎo)致限定區(qū)域(示例為602-605)在各個隔室內(nèi)彼此分隔開。在所有限定區(qū)域所處的升高區(qū)域之間的區(qū)域具有基本平坦的底部。

wo2005080967的方法和裝置經(jīng)常被配置為使用至少一種標(biāo)記的物種。標(biāo)記通常是放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。在檢測一個限定區(qū)域中的標(biāo)記物種的過程中，檢測器可需要與源自任何其它限定區(qū)域的信號屏蔽(或準(zhǔn)直)。當(dāng)前使用的屏蔽通常安裝在檢測器上。然而，可以在固體支撐件中集成屏蔽以改善總屏蔽。在放射性標(biāo)記的情況下改善屏蔽的一種可能的方法是在固體支撐件保持件上包括金屬脊。固體支撐件可以配備有所述金屬脊配合在其中的槽。對于如熒光檢測的光學(xué)檢測方法，可以使用非透明材料來阻擋雜散光，以與用于金屬屏蔽的方式類似的方式安裝。一種可能的固體支撐件，其中屏蔽圓形固體支撐件中限定區(qū)域的可能性示于圖7a中。固體支撐件700類似于圖1所示的固體支撐件，除了分隔件。高分隔件701和低分隔件702兩者都較寬，但是隔室(條紋區(qū)域703中所示的隔室)類似于圖1中的支撐件。如視圖710中被示出為沿著線a-a的截面，分隔件具有凹槽或狹縫711，其中可以安裝合適的屏蔽。理論上可以在屏蔽材料中制造完整的固體支撐件，但這通常是不期望的。在將支撐件用于細胞培養(yǎng)的情況下，期望使用透明材料，使得可以在常規(guī)顯微鏡中研究細胞培養(yǎng)物，這使得使用黑色塑料來屏蔽來自完整皿中不希望區(qū)域的熒光發(fā)射不太具有吸引力。一些屏蔽材料是進一步有毒的，例如通常用于放射性屏蔽的鉛由于鉛的毒性將不與細胞培養(yǎng)相容。類似類型的準(zhǔn)直可以包括在用于適合于固體支撐件(如圖4和圖5所示的那些)的傾斜裝置的矩形固體支撐件中。在圖7b所示的這種構(gòu)造中，流體連接的端部751通過曲線通道752連接到每個死端臂753。曲線通道需要被配置為阻擋任何光線或放射性。曲線通道設(shè)計760和761都被設(shè)計成防止任何射線(由虛線表示)穿過通道。曲線通道762將不起作用，因為存在通過通道的非屏蔽方式。

合適的固體支撐件的另一個示例在圖8中示出。示例性固體支撐件800是圖1所示的固體支撐件的一個隔室。因此，在800個四個這樣的固體支撐件的情況下，固體支撐件800是圓形支撐件的區(qū)段，其中多個區(qū)段一起形成圓形單元。固體支撐件800具有至少一個低分隔件801，可以任選地具有高分隔件，以及任選地具有中心突起802。尺寸類似于圖1所示的支撐件100的實施例所公開的尺寸。為了清楚起見，提供了沿線a-a810和b-b820的截面圖。當(dāng)在類似ligandtracer的儀器中使用支撐件800時，多個支撐件同時放置在儀器中。如圖9所示，將需要類型800的四個支撐件901、902、903、904以在固體支撐件保持件911上完成固體支撐件的圓形組件，固體支撐件保持件911在視圖910中示出，其中固體支撐件904已經(jīng)略微移動以增強可見性。

固體支撐件中的分隔件通常是由與固體支撐件的其余部分相同的材料制成的物理分隔件。然而，可以在屏蔽材料中制造分隔件。此外，由于低分隔件的目的是當(dāng)固體支撐件被放置在水平位置時分離不同限定區(qū)域上的液體，所以低分隔件不需要是壁狀固體分配器。例如，可以使用疏水分隔件，諸如印刷的硅樹脂圖案，其通過表面張力的差異而不是使用物理屏障來分離限定區(qū)域上的液體。當(dāng)用疏水分隔件傾斜固體支撐件時，靠近支撐件最低端的液體的量足夠大，足以使重力迫使液體通過疏水屏障，并且因此使疏水屏障像固體屏障一樣工作。

除了固體支撐件600之外，本申請中描述的所有固體支撐件可以具有任何數(shù)目的分隔件、隔室或容器。例如，可以使用僅具有低分隔件的固體支撐件1000，如圖10所示，其具有適于使用多種物種的一個隔室(在1000的情況下為6個限定區(qū)域)。然而，典型的固體支撐件將具有1-6個獨立的隔室，并且每個獨立的隔室可以具有由低分隔件以以下方式分隔開的2-100個不同的限定區(qū)域：當(dāng)固體支撐件被置于水平位置時，允許在每個獨立隔室中分離液體，但是當(dāng)固體支撐件被置于傾斜位置時允許隔室中的液體混合。圖6所示類型的固體支撐件恰好具有兩個隔室，但是每個隔室的限定區(qū)域的數(shù)目可以在2至20之間變化。

本專利申請中描述的固體支撐件有兩個基本功能。第一個功能是由低分隔件提供的功能。也就是說，分隔隔室內(nèi)的限定區(qū)域的低分隔件足夠高以在置于水平位置時保持液體分隔，但是當(dāng)固體支撐件被置于用于相互作用檢測的裝置中并經(jīng)受傾斜動作時允許來自同一容器中所有限定區(qū)域的液體混合。在不同的細胞在不同的限定區(qū)域中生長的情況下，或者當(dāng)不同的蛋白質(zhì)被吸附到不同的限定區(qū)域時，這簡化了固體支撐件的制備，同時使得可以在測定期間在隔室中使用一種均勻的液體。對于圓形固體支撐件，例如像圖1中的支撐件一樣，重要的是，盡管低分隔件能夠在水平位置保持已知量的液體，但是當(dāng)被置于傾斜位置時，相同量的液體應(yīng)當(dāng)穿過在某些位置處的低屏障。當(dāng)處于傾斜和旋轉(zhuǎn)取向時，當(dāng)?shù)头指艏幱谧畹臀恢脮r，或者當(dāng)處于傾斜和旋轉(zhuǎn)取向(其中液體穿過靠近固體支撐件中心的低分隔件)時，當(dāng)?shù)头指艏幱谧罡呶恢脮r，液體可以穿過低分隔件，當(dāng)與機械特征結(jié)合以僅允許一個取向時，使得能夠精確檢測每個限定區(qū)域，因為支撐件保持件和固體支撐件之間的幾何關(guān)系是已知的，并且該裝置連接到用于同步檢測器輸出與固體支撐件取向的計算機。因此，可以使用已知的支撐件取向和計算機控制的旋轉(zhuǎn)來精確地將每個限定區(qū)域定位在用于檢測的檢測器下方。對于長方形固體支撐件，例如像圖3所示的那樣，當(dāng)固體支撐件的連接臂的部分傾斜到下端時，相同隔室內(nèi)的液體將混合。這個特征是必要的，因為在測量第一物種如何與第二物種相互作用的過程中，重要的是相同的液體與同一隔室內(nèi)的所有限定區(qū)域接觸。第二個基本功能是在一個固體支撐件內(nèi)可以形成多個隔室。要實施固體支撐件的測量原理需要有一種液體接觸隔室內(nèi)的所有和至少兩個限定區(qū)域，并且在檢測過程中在限定區(qū)域附近的液體暫時減少。為了保持這個原理，在同一隔室內(nèi)必須有容易分隔的限定區(qū)域。

當(dāng)固體支撐件中的每個隔室相對于旋轉(zhuǎn)軸線基本上對稱或基本上重復(fù)時，在檢測期間液體的暫時減少通常被簡化。例如，圖6所示的固體支撐件的隔室相對于旋轉(zhuǎn)軸線是對稱的。這意味著當(dāng)固體支撐件600以非水平取向以緩慢的速度旋轉(zhuǎn)時，當(dāng)?shù)竭_最高位置時，所有限定區(qū)域?qū)⒕哂谢旧舷嗤囊后w排出圖案。相比之下，圖1所示的固體支撐件的隔室相對于旋轉(zhuǎn)軸線不是對稱的。因此，當(dāng)以傾斜取向順時針旋轉(zhuǎn)固體支撐件100時，限定區(qū)域119將到達限定區(qū)域120之前的最高位置，并且隔室中的液體將具有比從120開始更多的時間從限定區(qū)域119排出，因為119位于上游。為了從這兩個限定區(qū)域獲得合理相似的液體排出(這是使用一個限定區(qū)域作為參考所必需的)，旋轉(zhuǎn)必須以緩慢的速度進行，大約每分鐘0.1-3轉(zhuǎn)。在諸如圖3或圖5所示的矩形固體支撐件的情況下，臂相對于旋轉(zhuǎn)軸線以重復(fù)的方式出現(xiàn)。在旋轉(zhuǎn)軸線是水平的假設(shè)下，當(dāng)從連接點處于下端的位置傾斜矩形固體支撐件時，大約相同量的液體將進入每個臂。與旋轉(zhuǎn)軸線的水平方向的任何偏離將導(dǎo)致比進入相鄰的上部定位的臂更多的液體進入下部定位的臂，這可能進而導(dǎo)致所連接的臂中的液體的不均勻分布的排出，導(dǎo)致檢測期間液體的不同的暫時減少。

可以克服當(dāng)使用具有多個隔室的圓形固體支撐件(例如如圖1所示的那樣)時可能出現(xiàn)的不均勻的暫時減少液體的技術(shù)難度。如果固體支撐件100放置在傾斜的緩慢旋轉(zhuǎn)的支撐件保持件上，并且液體被放置在隔室中的一個中，則接近最高部分的兩個限定區(qū)域中的第一個上將具有比第二限定區(qū)域少的液體殘留。這是因為在向上旋轉(zhuǎn)的第一半期間，液體將穿過低分隔件，但是被捕獲在高分隔件上，有效地將液體保持在第二限定區(qū)域上比在第一限定區(qū)域上更長的時間。結(jié)果是從參考區(qū)域減去信號可能是系統(tǒng)錯誤的?？朔@個問題的一種可能的方法是在每次測量之間旋轉(zhuǎn)固體支撐件約一圈。例如，可以快速旋轉(zhuǎn)3/4或7/8圈，然后等待幾秒鐘以使液體從最高位置排出，最后進行測量。也可以在每次測量之間旋轉(zhuǎn)5/4或9/8個圈。通常，為了減少液體的不均勻排出，在進行測量之前，必須將皿旋轉(zhuǎn)90度以上(優(yōu)選地120度以上，甚至更優(yōu)選地180度以上)，因為在這樣的旋轉(zhuǎn)之后變高的限定區(qū)域?qū)⒃跈z測之前的短時間內(nèi)放置在靠近較低位置。從一般的角度來看，當(dāng)固體支撐件具有總共n個限定區(qū)域(分布在m個不同隔室上并且每個隔室至少兩個限定區(qū)域，即m*2≤n)時，有利的是旋轉(zhuǎn)至少(n/2+1)/n*360度。通常適合旋轉(zhuǎn)(n-1)/n*360度或(n+1)/n*360度。

因此，從現(xiàn)有技術(shù)(wo2005080967)中描述的單一液體固體支撐件到具有多于一個隔室(每個隔室具有至少兩個限定區(qū)域，并且其中隔室相對于旋轉(zhuǎn)軸線不對稱)的固體支撐件的看起來簡單的開發(fā)，引入了需要克服的創(chuàng)新的上述不均勻液體排出圖案中的困難問題。不均勻的液體排出是一種欺騙問題，因為在理想條件下，不均勻排出的效果小。理想條件構(gòu)成了附著到隔室中的限定區(qū)域之一的大量靶標(biāo)(感興趣的物種)，溶液中的物種與靶標(biāo)、溶液中的高度純化的物種之間的強相互作用的組合，使得可忽略量的可檢測標(biāo)記物存在于液體中，最后在溶液中存在低濃度的物種。在這種情況下，分子相互作用理論表明溶液中大比例的標(biāo)記物種確實結(jié)合到靶標(biāo)上，這意味著存在于液體暫時減少后剩余的薄液體層中的溶液中未結(jié)合物種的信號，在與來自結(jié)合物種的信號進行比較時是較小者。在這種情況下，不平衡的液體排出對最終結(jié)果具有小到中等的影響。然而，一旦發(fā)生非理想條件，液體排出成為要考慮的誤差源。

一種潛在的非理想條件是溶液中的物種與靶標(biāo)之間的低結(jié)合強度(也稱為低親和力)。在低親和力下，液體中必須存在較高濃度的物種以發(fā)生相互作用，并且結(jié)合物種的分?jǐn)?shù)小。在低親和力條件下，存在于液體暫時減少后剩余的薄液體層中的未結(jié)合物種的信號將類似于或甚至大于來自結(jié)合物種的信號，并且這里不均勻的排放可影響或甚至破壞測量相互作用的可能性。

另一種潛在的非理想條件是當(dāng)溶液中的物種的標(biāo)記包括差的純化步驟或甚至省略的純化步驟時。在一些情況下，溶液中物種的可用性有限，并且少量物種難以以有效的方式純化。在這種情況下，存在于在液體暫時減少之后剩余的薄液體層中的溶液中的未結(jié)合物種的信號可以類似于或甚至大于來自結(jié)合物種的信號(取決于凈化程度)，并且這里不均勻排放可影響或甚至破壞測量相互作用的可能性。

另一種潛在的非理想條件是當(dāng)以同時標(biāo)記不相關(guān)蛋白質(zhì)的方式進行物種的標(biāo)記時。例如，通常在含有牛血清白蛋白(bsa)的溶液中儲存物種，其中bsa用作保護劑。然后標(biāo)記這樣的溶液，物種和bsa將攜帶標(biāo)記。這種標(biāo)記液體的純化將可能從樣品中除去未偶聯(lián)的熒光團，但可能不會將bsa與物種分離(除非bsa和物種的分子量有很大不同)。在這種情況下，獲得了用于分子相互作用的非理想條件。

另一種潛在的非理想條件是當(dāng)物種部分變性時，即物種由一部分功能性蛋白質(zhì)和一部分變性蛋白質(zhì)組成。在這種情況下，活性物種的濃度低于物種的總濃度，如在jmolrecognit.1999sep-oct；12(5)：300-9中發(fā)布的zeder-lutzg和共同作者的“activeconcentrationmeasurementsofrecombinantbiomoleculesusingbiosensortechnology(使用生物傳感器技術(shù)的重組生物分子的活性濃度測量)”中所討論的，上述文獻以引用方式并入本文。對相互作用測量的實際效果與上述涉及不相關(guān)蛋白質(zhì)的實驗效果相同，其中在這種情況下蛋白質(zhì)的變性部分對應(yīng)于前述情況下的不相關(guān)蛋白質(zhì)。

一些非理想條件是不可能預(yù)先確定的。這意味著在測量情況下，不能充分處理不均勻液體排出的方法可能會由于非理想條件而錯過真實的相互作用。這對于弱的低親和力相互作用尤其如此。

實例1

為了舉例說明本發(fā)明原理的功能，通過使用規(guī)則的未處理的聚苯乙烯培養(yǎng)皿(直徑為87mm，高度為約15mm)并添加由環(huán)氧樹脂膠制成的分隔件來制造圓形固體支撐件。制造的皿1100具有與培養(yǎng)皿大致相同高度的一個第一(高)分隔件1101，所述高分隔件將培養(yǎng)皿分成兩個獨立的隔室(其中一個表示為條紋區(qū)域1104)。每個隔室具有一個低分隔件1102和兩個從皿底部延伸大約2mm的中心突起1103。在皿中有四個限定區(qū)域(1111、1112、1113和1114)。當(dāng)置于水平位置時，將含有小鼠單克隆抗體(mmab)的液體加入到兩個限定區(qū)域(1111和1113)，以便用mmab涂覆表面。同時，將另外兩個限定區(qū)域(1112和1114)與含有牛血清白蛋白(bsa)的液體接觸，以便用bsa涂覆這些限定區(qū)域，其中bsa用作參考區(qū)域。12小時后，用封閉緩沖液洗滌隔室以涂覆任何剩余的表面(例如高分隔件的中心突起和內(nèi)側(cè))，隨后洗滌以除去任何未吸附的mmab。這意味著在該實例中，mmab是第一物種或靶標(biāo)。接下來，將固體支撐件置于ligandtracergreen中的傾斜且旋轉(zhuǎn)的細胞培養(yǎng)皿支撐件中。將補充有0.1％bsa的1ml磷酸鹽緩沖液加入到兩個隔室中的每一個。當(dāng)定向為使得高分隔件是水平的時，下隔室中的液體在如液體池的表面所示的最低位置中的底部上方達到大約10mm，如虛線1120，高于低分隔件的高度。對于較高的隔室，液體在高分隔件1101上的底部上方延伸幾毫米，如液體池的表面所示為虛線1121。這使得各個隔室中的液體在整個測定中可保持均勻，因為一旦每次旋轉(zhuǎn)，任何隔室將位于最低位置。在該傾斜和旋轉(zhuǎn)取向中，儀器的檢測器被設(shè)置為以在約45秒內(nèi)產(chǎn)生所有限定區(qū)域的一個完整測量的方式記錄熒光染料的量。在每次測量之間將皿旋轉(zhuǎn)四分之一(90度)。首先，允許儀器在大約20分鐘期間僅在隔室中存在緩沖液的情況下收集基線數(shù)據(jù)。在基線讀數(shù)之后，將熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(fgmab)加入到隔室1131中：在一個隔室(具有限定區(qū)域1113和1114的隔室)中加入fgmab以提供10nm的終濃度，并且在另一個隔室中加入fgmab以提供1nm的終濃度。這意味著在該實施例中fgmab是第二物種或配體。在約6小時內(nèi)跟蹤fgmab和mmab的相互作用的形成。然后(1132)停止儀器，從隔室吸出液體，并且向每個隔室中加入不含fgmab的1ml緩沖液。然后重新啟動儀器，讓其運行過夜。得到的結(jié)合曲線對應(yīng)于來自活性(mmab)限定區(qū)域的信號減去相應(yīng)的參考區(qū)域。因此，曲線1141是來自1113的信號減去來自1114的信號，曲線1142對應(yīng)于來自1111的信號減去來自1112的信號。在更高濃度(10nm)下的fgmab的結(jié)合給出比在更低濃度1nm)濃度1142下的fgmab的結(jié)合高的信號1141。

該實例說明可以產(chǎn)生具有兩個不同隔室的固體支撐件，并使用它進行真實的生物化學(xué)測量。每個隔室具有低分隔件和中心突起，以使得可以在涂覆過程期間分隔限定區(qū)域，但是分隔件足夠低以允許添加的液體在被放置于ligandtracer儀器中的傾斜皿架上時穿過低分隔件。該實施例使用接近理想條件進行。

實例2

本實例使用與實例1相同的實驗條件進行。實例1和實例2之間的區(qū)別在于fgmab的順序、定時和量。使用接近理想條件進行實例2。在該實例中，兩個隔室表示為a和b。圖12示出了所獲得的信號，其作為從來自保持靶標(biāo)的限定區(qū)域的信號(在這種情況下為感興趣的物種，mmab)中減去來自限定參考區(qū)域的信號對每個隔室呈現(xiàn)。來自隔室a的信號顯示為實線曲線，并且來自隔室b的信號顯示為虛線曲線。

在隔室a中，在t＝0.75小時時加入6.7nmfgmab，這導(dǎo)致清晰的結(jié)合信號1201。在t＝3小時時用純緩沖液替換溶液，得到穩(wěn)定信號1202。再次在t＝5.5h一次加入6.7nmfgmab，這導(dǎo)致增加的信號1203。

在t＝1.75小時和t＝4.25小時1211之間，在隔室b中跟隨6.7nmfgmab的結(jié)合。在t＝4.25和5.5小時1212之間測量解離(濃度＝0nm)。在5.5小時時，將20nmfgmab添加到隔室b中，導(dǎo)致快速增加的信號1213。

在不存在fgmab的隔室中沒有觀察到信號增加，即在兩個隔室之間沒有抗體溶液交叉的跡象。因此，該實施例表明，在接近理想條件下，可以以獨立的方式測量兩個不同隔室中的相互作用，即具有不同的液體和它們自己限定區(qū)域。

實例3

除了以下變化之外，使用與實例1相同的實驗條件進行該實例。在測量期間的固體支撐件的旋轉(zhuǎn)在測量期間有規(guī)律地改變。該皿在每次測量之間旋轉(zhuǎn)四分之一(90度)，或四分之三((4-1)/4*360度＝270度)旋轉(zhuǎn)。在該實例中，兩個隔室表示為a和b。在隔室a中，使用接近理想條件進行測量。在隔室b中，使用非理想條件進行測量，通過用熒光團標(biāo)記的不相關(guān)蛋白質(zhì)補充液體，以提高液體中的熒光總量。這種熒光團的添加存在與(a)標(biāo)記后溶液中的物種的較差的純化和(b)標(biāo)記期間存在的蛋白質(zhì)相同的問題。

圖13示出了所獲得的信號，其作為從來自保持靶(在這種情況下為感興趣的物種，mmab)的限定區(qū)域的信號中減去來自限定參考區(qū)域的信號對每個隔室呈現(xiàn)。來自隔室a的信號被顯示為實線曲線1310，并且來自隔室b的信號被顯示為虛線曲線1320。用水平線1301表示皿旋轉(zhuǎn)四分之一(90度)的時間段。在大約40分鐘時，將6nm的fgmab加入到兩個隔室中的每一個。在接近理想條件的隔室a中，檢測到結(jié)合相同，而與皿如何旋轉(zhuǎn)無關(guān)。在具有非理想條件的隔室b中，結(jié)合曲線1310偏離在實施四分之一旋轉(zhuǎn)的時間期間在理想條件1320下獲得的曲線。添加的無關(guān)蛋白的量與加入的fgmab的量大致相同，這表明僅需要少量額外的不相關(guān)蛋白來誘導(dǎo)非理想條件和在用非對稱隔室檢測期間的相應(yīng)問題。

該實例表明，當(dāng)測量多隔室培養(yǎng)皿中的分子相互作用時，通常發(fā)生的非理想條件可能不利地影響結(jié)果的質(zhì)量，或甚至可能破壞測量分子相互作用的能力。

實例4

該實例描述了本發(fā)明應(yīng)用于基于細胞的相互作用分析的一種可能的應(yīng)用。已知表達her2受體的skov-3型細胞在1100型固體支撐件的限定區(qū)域1111和1113上生長。為了參考目的，將限定區(qū)域1112和1114留空。在細胞牢固附著于固體支撐件之后，將其置于ligandtracergrey裝置中。向每個隔室中加入約1ml的rpmi細胞培養(yǎng)基。

在初始基線測量后，將用碘125標(biāo)記并在標(biāo)記后純化的抗體曲妥珠單抗以1nm的濃度加入一個隔室，并以4nm的濃度加入另一個隔室。以時間分辨的方式跟蹤標(biāo)記的曲妥珠單抗的結(jié)合，獨立于保持不同濃度的曲妥珠單抗的兩個隔室。輸出顯示具有較高濃度的曲妥珠單抗的隔室在結(jié)合過程的初始階段將具有更陡的向上斜率。

當(dāng)重復(fù)該測量時，曲妥珠單抗用碘125標(biāo)記，但是標(biāo)記的等分試樣不純化。使用如上所述用skov-3細胞制備的固體支撐件重復(fù)測量，并且向各個隔室加入1和4nm抗體。如果在每個檢測事件之間以四分之三((4-1)/4*360度＝270度)旋轉(zhuǎn)進行測量，則結(jié)果更類似于來自純化抗體的測量結(jié)果，而不是僅使用一個每個檢測事件之間的四分之一(90度)旋轉(zhuǎn)。

關(guān)于如何進行細胞培養(yǎng)和抗體標(biāo)記方案的細節(jié)可參見barta和共同作者的出版物“proteininteractionswithher-familyreceptorscanhavedifferentcharacteristicsdependingonthehostcellline(與her家族受體的蛋白質(zhì)相互作用可根據(jù)宿主細胞系具有不同的特征)”，出版于internationaljournalofoncology40：1677-1682，2012，上述文獻以引用方式并入本文。

實例5

除了以下變化之外，使用與實例1相同的實驗條件進行該實例。培養(yǎng)已知表達表皮生長受體的a431細胞以在限定區(qū)域1111和1113中形成細胞的粘附層。參考區(qū)域1112和1114沒有附著細胞。在該實施例中，低分隔件是通過使用具有疏水液體的筆產(chǎn)生的疏水屏障。向每個隔室中加入約1ml細胞培養(yǎng)物rpmi培養(yǎng)基。已知結(jié)合表皮生長受體的熒光標(biāo)記的西妥昔單抗用作配體(溶液中的物種)。在測量期間固體支撐件的旋轉(zhuǎn)在測量期間有規(guī)律地改變。該皿在每次測量之間旋轉(zhuǎn)四分之一(90度)，或四分之三((4-1)/4*360度＝270度)。在該實例中，兩個隔室表示為a和b。在隔室a中，使用接近理想條件進行測量。在隔室b中，使用非理想條件進行測量，通過用熒光團標(biāo)記的不相關(guān)蛋白質(zhì)補充液體，以提高液體中的熒光總量。這種熒光團的添加存在與(a)標(biāo)記后溶液中的物種的較差的純化和(b)標(biāo)記期間存在的蛋白質(zhì)相同的問題。

圖14示出了所獲得的信號，其作為從來自限定區(qū)域保持靶標(biāo)(在這種情況下為感興趣的物種，a431細胞)的信號中減去來自限定參考區(qū)域的信號對每個隔室呈現(xiàn)。來自隔室a的信號被顯示為實線曲線1410，來自隔室b的信號被顯示為虛線曲線1420。用水平線1401表示皿被旋轉(zhuǎn)四分之一(90度)的時間段。在80分鐘和120分鐘之間進行基線測量，即在加入熒光標(biāo)記的西妥昔單抗之前。在約130分鐘時，將6nm的熒光標(biāo)記的西妥昔單抗加入到兩個隔室中的每一個。在接近理想條件的室a中，基線不受旋轉(zhuǎn)方法的改變干擾，但是當(dāng)比較在四分之一旋轉(zhuǎn)和四分之三旋轉(zhuǎn)時測量的基線時，在室b中可見明顯的差異。在結(jié)合期間，隔室a和b對于四分之三旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生類似的結(jié)果。在四分之一旋轉(zhuǎn)期間，理想和非理想條件都偏離使用三分之一旋轉(zhuǎn)的結(jié)果。

該實例表明，當(dāng)測量多隔室培養(yǎng)皿中細胞上的分子相互作用時，通常發(fā)生的理想和非理想條件都可能負面影響結(jié)果的質(zhì)量，或甚至可能破壞測量分子相互作用的能力。