本申請要求2014年7月1日提交的臨時申請62/019,830的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。
引言
人們使用一批殺傷正在生長和分裂的細胞并以多種方式發(fā)揮功能的治療劑來治療癌癥。常見的化療劑集合已被單獨或聯(lián)合使用了數(shù)十年，且該常見的試劑集合已成為臨床腫瘤學(xué)實踐中傳統(tǒng)且常規(guī)的癌癥治療手段。這些傳統(tǒng)的化療劑通過殺傷所有快速分裂的細胞來發(fā)揮作用，快速分裂是大多數(shù)癌細胞的主要特性之一。這類試劑包括直接損傷dna的烷化劑；阻止微管形成的紫杉烷；干擾dna和rna復(fù)制的抗代謝物；干擾dna復(fù)制所涉及酶的蒽環(huán)類藥物(抗腫瘤抗生素)；阻止dna復(fù)制的拓撲異構(gòu)酶抑制劑；阻止酶生成細胞繁殖所需蛋白質(zhì)的衍生自天然產(chǎn)物的生物堿和其他化合物；導(dǎo)致dna交聯(lián)以抑制dna復(fù)制和/或dna合成的基于鉑的藥物。這些化療劑類別是基于其抑制癌細胞生長的基本功能原創(chuàng)性開發(fā)的，而對其靶向作用模式知之甚少。由于他們不是為特異性靶向和直接抑制已知蛋白質(zhì)而開發(fā)的，這些試劑在歷史書并未被視作“靶向”癌癥治療劑。然而，自其開發(fā)開始，這些試劑類別中的每一個的生物化學(xué)功能是熟知的且其每一個均被發(fā)現(xiàn)對于特定的蛋白質(zhì)、酶或核酸具有“靶向”作用。這些化療劑的“靶標”也是熟知的且因此基于某一給定癌癥中是否存在這些特異性“靶標”來選擇針對該癌癥的最有效的化療劑。該實施方式描述了測試患者來源的生物樣品中是否存在這些化療生物標志物的特定方法。
當一個或多個特異性靶蛋白質(zhì)給出哪一種或多種化療劑應(yīng)用于治療癌癥以抑制癌生長的指標時，癌癥療法的靶向方法是最有利的。該實施方式提供了用于一種或多種srm/mrm測定的肽和肽序列，這些測定用于定量確定直接在來自癌癥患者的患者來源的生物樣品中表達、過表達或不表達的化療蛋白質(zhì)指標，用于改進的針對癌癥療法的治療決定。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
提供了來源于以下蛋白質(zhì)的亞序列的特定肽：ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a。ent1也稱為平衡型核苷轉(zhuǎn)運蛋白1且在本文中稱作ent1。ercc1也稱為dna切除修復(fù)蛋白質(zhì)ercc-1且在本文中稱作ercc1。folr1也稱為葉酸受體α且在本文中稱作folr1。rrm1也稱為核糖核苷二磷酸還原酶大亞基且在本文中稱作rrm1。tubb3也稱為微管蛋白β-3鏈蛋白質(zhì)且在本文中稱作tubb3。topo1也稱為dna拓撲異構(gòu)酶1且在本文中稱作topo1。topo2a也稱為dna拓撲異構(gòu)酶2α且在本文中稱作topo2a。
各種來源于蛋白質(zhì)的肽的肽序列和碎片/過渡離子可具體用于基于質(zhì)譜的選擇性反應(yīng)監(jiān)測(srm)中，其也稱為多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)測定，且在后文中稱作srm/mrm。描述了用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)及其同種型的定量srm/mrm分析的肽的用途。
可使用一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種，或五種或六種srm/mrm測定來測量來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的一種或多種特異性肽的相對或絕對定量水平，并由此提供通過質(zhì)譜測量從生物樣品中獲得的給定蛋白質(zhì)制備物中每一種那些蛋白質(zhì)的總量的方法。所有或一部分來自那些蛋白質(zhì)的可用肽也可在單個srm/mrm測定中同時分析或可在單個srm/mrm測定的任意組合中分析。各肽提供了通過質(zhì)譜測量獲自生物樣品的給定蛋白質(zhì)制備物中各相應(yīng)蛋白質(zhì)總量的潛在方法。
更具體地，本發(fā)明所述srm/mrm測定可直接測量由從諸如福爾馬林固定的癌癥患者組織的患者組織樣品(例如，切除的腫瘤和活檢切片)取得的細胞制備的復(fù)雜蛋白質(zhì)裂解物樣品中的那些肽。由福爾馬林固定的組織制備蛋白質(zhì)樣品的方法描述在美國專利第7,473,532號中，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。該專利描述的方法可使用獲自表達病理學(xué)公司(expressionpathologyinc.)(馬里蘭州羅克維爾)的liquidtissue試劑和方案方便地進行。
對從癌癥患者處手術(shù)移出的組織進行甲醛/福爾馬林固定是病理學(xué)實踐中已經(jīng)接受的常規(guī)方法。結(jié)果是，甲醛/福爾馬林固定石蠟包埋的組織是來自那些患者的最廣泛可得的組織形式。甲醛/福爾馬林固定通常使用甲醛水溶液，其在本文中稱作福爾馬林?！?00％”福爾馬林由甲醛在水中的飽和溶液(約40體積％福爾馬林或37重量％)組成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的穩(wěn)定劑，通常為甲醇。保藏組織的最常用方式是將整個組織在通常稱為10％中性緩沖福爾馬林的甲醛水溶液中長時間(8小時至48小時)浸泡，接著在室溫下將固定的整個組織包埋在石蠟中以便長期儲存。因此，分析福爾馬林固定的癌癥組織的分子分析方法將是用于分析癌癥患者組織的最被接受且大量利用的方法。
srm/mrm測定的結(jié)果可用于關(guān)聯(lián)自其中收集并保藏組織(生物樣品)的患者或受試者的具體組織樣品(例如癌癥組織樣品)內(nèi)任意或所有這些蛋白質(zhì)的準確且精確的定量水平，此外還可關(guān)聯(lián)這些蛋白質(zhì)的潛在同種型的準確且精確的定量水平。這不僅提供關(guān)于癌癥的診斷信息，而且容許醫(yī)師或其它醫(yī)療專業(yè)人員確定用于患者或?qū)ο蟮倪m當療法。提供關(guān)于在患病組織或另一患者/對象樣品中蛋白質(zhì)表達水平的診斷和治療重要信息的這一測定稱為伴隨診斷測定。例如，這一測定可設(shè)計用于診斷癌癥的階段、程度或組織學(xué)特征并確定將最有效地組織癌細胞生長從而使得患者或?qū)ο笞羁赡軕?yīng)答的治療劑。更具體地，對來自患者的癌細胞中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種進行檢測和/或定量可提供某些蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)可顯示應(yīng)遵循哪種或哪幾種治療方案。
發(fā)明詳述
本發(fā)明所述的測定定量或測量來自包括ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的特定未修飾的肽的相對或絕對水平并且還可測量來自那些蛋白質(zhì)的特定修飾的肽的相對或絕對水平。修飾的示例包括在這些肽上存在的磷酸化氨基酸殘基和糖基化氨基酸殘基。蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)同種型的相對定量水平可通過srm/mrm方法確定，例如通過比較srm/mrm特征峰面積(signaturepeakarea)(例如，特征峰面積或積分的片段離子強度)來確定?？稍诓煌瑯悠?例如，對照樣品和由患者或?qū)ο蠼M織制備的樣品)中測定單個ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的相對水平?；蛘撸诟鞣N肽具有其自己的特異性srm/mrm特征峰的情況下，可以比較多種一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a特征肽的多個srm/mrm特征峰面積。通過比較峰面積，可以測定一種生物樣品中或一種或多種額外或不同的生物樣品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)和潛在蛋白質(zhì)同種型含量的相對水平。以此方式，可在相同實驗條件下跨越多個(例如，兩個、三個、四個、五個或更多個)生物樣品測定來自那些蛋白質(zhì)的具體一種或多種肽的相對含量并從而測定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)及其潛在同種型的相對含量。另外，確定單一樣品內(nèi)來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的一種或多種給定肽的相對定量的方法可以是通過srm/mrm方法比較該肽的特征峰面積與同一來自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中的來自不同的一種或多種蛋白質(zhì)的其他和不同的一種或多種肽的特征峰面積。使用這類方法，可測定來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的具體肽的含量，并繼而測定各相應(yīng)蛋白質(zhì)及其潛在同種型的含量，該測定的方式是一種蛋白質(zhì)相對于同一樣品或不同樣品中的另一種蛋白質(zhì)。由于單個一種或多種肽的相對定量可相對于樣品內(nèi)或樣品間的另外一種或多種肽的含量來進行測定，因此可以測定所存在肽的相對含量(例如通過測定一種相對于另一種的峰面積)，這與生物樣品中蛋白質(zhì)的絕對重量：體積或重量：重量含量無關(guān)。因此可使用來自生物樣品的蛋白質(zhì)制備物中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的含量來測定多種樣品之中或之間的那些蛋白質(zhì)的含量。不同樣品之間單個特征峰面積的相對定量數(shù)據(jù)通常標準化至單位樣品中所分析蛋白質(zhì)的含量(例如，使用樣品的總蛋白質(zhì)濃度和所分析的體積來標準化樣品)。可跨越來自單個樣品中同時存在的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)和多個蛋白質(zhì)的許多肽和/或跨越許多樣品來進行相對定量，從而進一步了解相對蛋白質(zhì)含量，即相對于其他肽/蛋白質(zhì)的一種肽/蛋白質(zhì)。
ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的絕對定量水平通過例如srm/mrm方法確定，通過該方法將來自在一種生物樣品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的單個肽的srm/mrm特征峰面積與一種或多種內(nèi)標物的已知含量的srm/mrm特征峰面積相比較，這些內(nèi)標物以已知含量“摻入”樣品中(例如，同位素標記的標準品)。在一個實施方式中，該內(nèi)標物為合成形式的完全相同的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽，其含有用一種或多種重同位素標記的一個或多個氨基酸殘基。合成這類同位素標記的內(nèi)標物，使得通過質(zhì)譜分析時產(chǎn)生可預(yù)測且一致的srm/mrm特征峰，其與天然ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽特征峰不同且截然不同并可用作比較峰。因此，當內(nèi)標物以已知含量摻入來自生物樣品的蛋白質(zhì)或肽制備物中并通過質(zhì)譜分析時，將天然肽的srm/mrm特征峰面積與內(nèi)標肽的srm/mrm特征峰面積相比較。該數(shù)值比較允許計算來自生物樣品的原始蛋白質(zhì)制劑中存在的天然肽的絕對摩爾濃度和/或絕對重量，從中可測定相應(yīng)蛋白質(zhì)的濃度或重量。片段肽的絕對定量數(shù)據(jù)通常根據(jù)每種樣品中所分析的蛋白質(zhì)的含量來顯示。絕對定量可跨越許多肽進行(其允許定量測定單個樣品中同時存在的多種蛋白質(zhì)(例如，兩種、三種、四種、五種等))和/或跨越多種樣品進行，從而了解單個生物樣品中和/或整個單個樣品的組中的絕對蛋白質(zhì)含量。在一個實施方式中，可使用gyai等在美國專利7,501,286中描述的肽標準品來進行蛋白質(zhì)的定量。
本文中，術(shù)語定量、量化、測量或度量指測定分析物的相對或絕對水平，該分析物是例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、標準品(例如內(nèi)標物)。本發(fā)明所述的測定可用于在使用例如患者來源或?qū)ο髞碓吹慕M織(如福爾馬林固定的組織)時輔助確定癌癥階段。本發(fā)明所述的srm/mrm測定還可用于輔助確定哪種治療劑將最有利地用于治療該患者或?qū)ο蟆?/p>
為檢測與本發(fā)明所述的癌癥相關(guān)蛋白質(zhì)的水平，可對經(jīng)由移出部分或全部腫瘤的手術(shù)或經(jīng)由為了確定疑似疾病的存在與否而進行的活檢方法從患者或?qū)ο笠瞥龅囊伤瓢┬越M織或癌性組織進行分析。分析這些組織的樣品以確定是否存在所懷疑的疾病。分析這些組織的樣品以確定患者或?qū)ο蟮臉悠分惺欠翊嬖趀nt1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以及存在何種形式的這些蛋白質(zhì)。此外，可確定這些蛋白質(zhì)中一種或多種的表達水平并將其與在健康組織中發(fā)現(xiàn)的“正?！被騾⒖妓较啾容^。在健康組織中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的正?；騾⒖妓娇蓙碓从诶鐩]有癌癥的一個或多個個體的相關(guān)組織?；蛘?，可通過分析未受癌癥影響的相關(guān)組織(例如，同一器官的一部分)來獲得具有癌癥的個體的正?；騾⒖妓健?/p>
蛋白質(zhì)或肽的水平或含量可定義為通過srm/mrm測定確定的蛋白質(zhì)或肽的量(表示為摩爾、質(zhì)量或重量)。該水平或含量可標準化至分析的裂解物中蛋白質(zhì)或另一種成分的總體水平或含量(例如，表示為微摩爾/微克蛋白質(zhì)或微克/微克蛋白質(zhì))或甚至標準化至單位重量基礎(chǔ)上的dna含量(例如，微摩爾或微克/微克dna)。此外，蛋白質(zhì)或肽的水平或含量可以體積基礎(chǔ)測定，例如表示為微摩爾或納克/微升。通過srm/mrm測定確定的蛋白質(zhì)或肽的水平或含量還可標準化至所分析細胞的數(shù)目。涉及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以及這些蛋白質(zhì)的同種型的信息可用于輔助確定癌癥的階段或等級，方法為關(guān)聯(lián)或比較ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)及其同種型或片段肽的水平與正常組織中觀察到的水平。一旦確定癌癥的組織學(xué)階段和/或等級和/或ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)表達特征，則可將該信息與經(jīng)開發(fā)以特異性治療癌癥組織的(化學(xué)和生物)治療劑的列表相匹配，該癌癥組織的特征是例如所測定的一種或多種蛋白質(zhì)(例如ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a)的異常表達。匹配來自特定個體的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)測定的信息與特異性靶向表達ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的細胞/組織的治療劑列表代表了治療癌癥的個性化用藥方法。本發(fā)明所述的測定方法使用來自患者或?qū)ο笞陨斫M織的蛋白質(zhì)的分析作為診斷和治療決定的來源，從而形成個性化用藥方法的基礎(chǔ)。
肽生成
原則上說，通過任何特異性已知的蛋白水解過程制備的來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的任何預(yù)測的肽均可用作替代性報告子以測定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的豐度。在一個實施方式中，使用特異性已知的一種或多種蛋白酶(例如一種或多種胰蛋白酶和/或胞內(nèi)蛋白酶lys-c)消化樣品。蛋白水解處理得到的一種或多種肽可在諸如基于質(zhì)譜的srm/mrm測定的合適測定中用作替代性報告子來測定一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的豐度。類似地，也可使用已知在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)中被修飾的位點處含有一個氨基酸殘基的任何預(yù)測的肽序列來測定樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)的修飾程度。
ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a片段肽可通過多種方法來產(chǎn)生，包括使用在美國專利7,473，532中提供的liquidtissuetm方案。liquidtissuetm方案和試劑能夠通過對組織/生物樣品中的蛋白質(zhì)進行蛋白水解消化來由福爾馬林固定的石蠟包埋組織生成適用于質(zhì)譜分析的肽樣品。在liquidtissuetm方案中，將組織/生物制備物在緩沖液和升高的溫度中保持延長的一段時間(例如，約80℃至約100℃，持續(xù)約10分鐘至約4小時的時間)以逆轉(zhuǎn)或釋放蛋白質(zhì)交聯(lián)。所采用的緩沖液為中性緩沖液(例如，基于tris的緩沖液或含有去垢劑的緩沖液)且優(yōu)選不干擾質(zhì)譜分析的緩沖劑。隨后，將組織/生物樣品用包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶lys-c的一種或多種蛋白酶處理足以破壞所述生物樣品的組織和細胞結(jié)構(gòu)并使所述樣品液化的時間(例如，在約37℃至約65℃的溫度下持續(xù)約30分鐘至約24小時的時間)。加熱和蛋白水解的結(jié)果為液態(tài)可溶性可稀釋的生物分子裂解物。在一組實施方式中，選自胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶lys-c的兩種或更多種蛋白酶被用于生物樣品的蛋白水解處理。
肽分離和測定
一旦制備好裂解物，就可對樣品中的肽應(yīng)用多種促進其分析和測量(定量)的技術(shù)。當通過質(zhì)譜進行分析時，可使用一種或多種色譜方法以促進分析。
在一個實施方式中，在通過質(zhì)譜儀器分析前通過液相色譜(lc)對肽進行分離。例如，可使用picofrit(100μmid/10μmtipid，新目標公司(newobjective))柱在nanoacquitylc系統(tǒng)(沃特斯公司(waters)，馬薩諸塞州米爾福德)或easy-nlcii(賽默飛世爾科技公司(thermoscientific)，加利福尼亞州圣地亞哥)上分離肽，該柱使用jupiterproteo
在另一個實施方式中，通過親和技術(shù)分離肽，例如基于免疫的純化(如免疫親和色譜)、離子選擇性介質(zhì)上的色譜，或在肽被修飾時通過使用適當介質(zhì)進行分離，該介質(zhì)是例如用于分離碳水化合物修飾的肽的凝集素。在另一個實施方式中，使用了siscapa方法，其在質(zhì)譜分析前進行肽的免疫分離。該siscapa技術(shù)描述于例如美國專利號7,632,686。在另一個實施方式中，可在通過質(zhì)譜進行分析前使用凝集素親和方法(例如親和純化和/或色譜)來從裂解物中分離肽。分離肽組的方法(包括基于凝集素的方法)描述于例如geng等j.chromatographyb，752：293-306(2001)。免疫親和色譜技術(shù)、凝集素親和技術(shù)和其他形式的親和分離和/或色譜(如反相、基于大小的分離、離子交換)可以合適的組合使用以促進通過質(zhì)譜對肽進行分析。
令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的許多潛在肽序列并不適合在基于質(zhì)譜的srm/mrm測定中使用或者在基于質(zhì)譜的srm/mrm測定中使用時是失效的，其原因不明。具體而言，發(fā)現(xiàn)在來自福爾馬林固定、石蠟包埋的組織的liquidtissuetm裂解物中無法有效檢測或根本無法檢測到許多來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽。由于不可能預(yù)測最適合mrm/srm測定的肽，因此必須通過實驗在實際的liquidtissuetm裂解物中鑒定修飾的和未修飾的肽以開發(fā)針對ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的可靠且準確的srm/mrm測定。不希望受任何理論約束，但認為一些肽可能例如難以通過質(zhì)譜檢測，因為它們不會良好地電離或生成與其它蛋白質(zhì)不同的片段，肽也可能無法在分離(例如，液相色譜)中良好地解析，或者附著到玻璃或塑料器具上。因此，可在由福爾馬林固定的組織樣品制備的liquidtissuetm裂解物中檢測的來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的那些肽(例如，表1和2中的肽)是在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)srm/mrm測定中可針對其使用srm/mrm測定的肽。在一個實施方式中，在單個樣品中同時分離ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)時使用的蛋白酶將是胰蛋白酶。
在本發(fā)明所述多個實施方式中發(fā)現(xiàn)的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽(例如，表1和/或表2)通過胰蛋白酶消化復(fù)雜的liquidtissuetm裂解物內(nèi)的所有蛋白質(zhì)而來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)，該裂解物由從福爾馬林固定的癌癥組織中取得的細胞制備。除非另外指出，否則在各種情況下，該蛋白酶都為胰蛋白酶。liquidtissuetm裂解物隨后通過質(zhì)譜分析以確定通過質(zhì)譜檢測并分析的來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的那些肽。用于質(zhì)譜分析的具體優(yōu)選的肽亞組的鑒定基于：1)在liquidtissuetm裂解物的質(zhì)譜分析中電離的來自蛋白質(zhì)的一種或多種肽的實驗確定，和2)肽在制備liquidtissuetm裂解物中使用的方案和實驗條件下繼續(xù)存在的能力。后一性質(zhì)的范圍不僅是肽的氨基酸序列，而且是肽內(nèi)的修飾的氨基酸殘基在樣品制備期間以修飾的形式繼續(xù)存在的能力。
從福爾馬林(甲醛)固定的組織中直接取得的細胞的蛋白質(zhì)裂解物使用liquidtissuetm試劑和方案制備，liquidtissuetm試劑和方案要求經(jīng)由組織顯微解剖將細胞收集到樣品管中，接著在liquidtissuetm緩沖液中對細胞加熱延長的一段時間。一旦負面地影響到福爾馬林誘導(dǎo)的交聯(lián)，則使用蛋白酶(例如包括但不限于胰蛋白酶)以可預(yù)測的形式消化組織/細胞至完全消化。通過用蛋白酶消化完整的多肽將各蛋白質(zhì)裂解物而轉(zhuǎn)化成肽的集合。分析(例如，通過離子阱質(zhì)譜)各liquidtissuetm裂解物以對肽進行多重全局性蛋白組學(xué)研究，其中數(shù)據(jù)表示為來自各蛋白質(zhì)裂解物中存在的所有細胞蛋白質(zhì)的可通過質(zhì)譜鑒定的盡可能多的肽的鑒定結(jié)果。通常采用離子阱質(zhì)譜或能夠進行全局性概要分析的另一形式的質(zhì)譜來鑒定來自單一復(fù)雜蛋白質(zhì)/肽裂解物的盡可能多的肽以用于分析。盡管可在包括maldi、離子阱或三重四極質(zhì)譜的任何類型的質(zhì)譜上開發(fā)并進行srm/mrm測定，但通常認為對于srm/mrm測定而言最有利的儀器平臺是三重四極質(zhì)譜儀器平臺。
一旦在所采用的條件下在單一裂解物的單一ms分析中鑒定出盡可能多的肽，則整理肽的列表并將其用于確定在該裂解物中檢測到的蛋白質(zhì)。對于多種liquidtissuetm裂解物重復(fù)該過程，并將非常大的肽列表整理成單一數(shù)據(jù)集?？蓪⒃擃愋偷臄?shù)據(jù)集視為代表可在分析的生物樣品類型中(蛋白酶消化之后)、特別是在生物樣品的liquidtissuetm裂解物中檢測到的肽，且因此包括諸如ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的具體蛋白質(zhì)的肽。
在一個實施方式中，ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a胰蛋白酶肽被鑒定為可用于測定以下肽的絕對或相對含量：ent1(例如，ncbi登錄號q99808、seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7)，ercc1(例如，ncbi登錄號p07992、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16)，folr1(例如，ncbi登錄號p15328、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20)，rrm1(例如，ncbi登錄號p23921、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37)，topo1(例如，ncbi登錄號p11387、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56、seqidno：57、seqidno：58)，topo2a(例如，ncbi登錄號p11388、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70、seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101)和/或tubb3(例如，ncbi登錄號q13509、seqidno：102、seqidno：103)，其各自列于表1。那些肽各自在由福爾馬林固定、石蠟包埋的組織制備的liquidtissuetm裂解物中通過質(zhì)譜檢測。因此，表1中的各肽或那些肽的任意組合(例如，一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或十種或更多種表1中那些肽)是用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的定量srm/mrm測定的候選物，包括直接在福爾馬林固定的患者或?qū)ο蠼M織中進行測定。
表1
表1中列出的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a胰蛋白酶肽包括從包括前列腺、結(jié)腸和乳腺的不同人類器官的多種不同福爾馬林固定的組織的多種liquidtissuetm裂解物中檢測到的那些。那些肽各自被視為可用于福爾馬林固定的組織中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的定量srm/mrm測定。這些實驗的進一步數(shù)據(jù)分析表明，并沒有優(yōu)先觀察到來自任何特定器官位點的任何特定肽。因此，這些肽中的每一種都被認為是適合對來自來源于任何生物樣品或體內(nèi)的任何器官位點的任何福爾馬林固定的組織的liquidtissuetm裂解物進行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm/mrm測定。
在另一個實施方式中，srm/mrm測定使用topo2a和topo1各自的一種或兩種肽(例如，來自表1中列舉的肽)。在另一個實施方式中，srm/mrm測定使用ent1、ercc1、folr1、rrm1和/或tubb3各自的一種或兩種肽(例如，來自表1中列舉的肽)。
在其他實施方式中，使用srm/mrm測定測量ent1和ercc1蛋白質(zhì)之一或全部兩種并測定folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)中的一種、兩種、三種或四種。在這類實施方式的一個實施例中，通過srm/mrm測定測量folr1、rrm1蛋白質(zhì)之一或全部兩種的至少一種肽或至少兩種肽(例如表1中列舉的folr1、rrm1肽)；且測定ent1、ercc1、tubb3、topo1和/或topo2a中任意一種、兩種、三種或四種的至少一種肽或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。在這類實施方式的另一個實施例中，通過srm/mrm測定測量ent和rrm1蛋白質(zhì)之一或全部兩種的至少一種或至少兩種肽(例如表1中列舉的肽)；且測定ercc1、folr1、tubb3、topo1和/或topo2a中任一種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。本發(fā)明提供了包含肽的組合物，這些肽經(jīng)同位素標記但其他均與本發(fā)明提供的這些實施方式中任一種所示的一種或多種肽相同，且下文描述了其制備物應(yīng)用，特別是用作質(zhì)譜標準品。
在一個實施方式中，通過不依賴質(zhì)譜的方法測定一種或多種表1中的肽或那些肽的任意組合(例如，一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種)，該方法包括但不限于免疫方法(例如western印記或elisa)。在一個實施方式中，使用福爾馬林固定的組織進行測定。無論如何獲得涉及肽(絕對或相對)含量的信息，該信息均可用于本發(fā)明所述任意方法，包括顯示(診斷)患者或?qū)ο笾邪┌Y的存在、確定癌癥的階段/等級/狀態(tài)、提供預(yù)后，或確定針對患者或?qū)ο蟮闹委焺┗蛑委煼桨浮?/p>
在其他實施方式中，通過不依賴質(zhì)譜的方法測定ent1和ercc1蛋白質(zhì)之一或全部兩種，并測定folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)中的一種、兩種、三種或四種，該方法包括但不限于免疫方法(例如western印記或elisa)。在這類實施方式的一個實施例中，測定了ent1和ercc1蛋白質(zhì)之一或全部兩種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的ent1和ercc1肽)；且測定了folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)中的任意一種、兩種、三種或四種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。在這類實施方式的另一個實施例中，測定了folr1和rrm1蛋白質(zhì)之一或全部兩種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的folr1和rrm1肽)；且測定了ent1、ercc1、tubb3、topo1和topo2a蛋白質(zhì)中任一種的至少一種或至少兩種肽(例如，表1中列舉的肽)。
在進行srm/mrm測定時一個重要的考慮因素為可用于肽分析的儀器的類型。盡管可在包括maldi、離子阱或三重四極質(zhì)譜儀的任何類型的質(zhì)譜儀上開發(fā)并進行srm/mrm測定，但目前用于srm/mrm測定的最有利的儀器平臺通常被認為是三重四極儀器平臺。該類型的質(zhì)譜常被視作最適用于分析可由來自細胞內(nèi)含有的所有蛋白質(zhì)的數(shù)萬至數(shù)百萬個單個肽組成的很復(fù)雜的蛋白質(zhì)裂解物內(nèi)的單個分離的靶標肽。
為了對來源于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的各種肽最有效地實施srm/mrm測定，需要在分析中利用除了肽序列之外的信息。該額外信息可用于引導(dǎo)并指導(dǎo)質(zhì)譜(例如，三重四極質(zhì)譜)對特異性靶標肽進行正確且集中的分析，從而可有效地進行測定。
關(guān)于靶標肽總體和關(guān)于特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息可包括各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子和各過渡離子的離子類型中的一種、兩種、三種、四種或更多種?？捎糜陂_發(fā)針對ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm/mrm測定的額外肽信息示于表2中，其針對表1中列舉的十二(12)種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽?？芍苽?、獲得針對表2中顯示的肽進行描述的該額外信息并將其應(yīng)用到來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的任意其它肽的分析中，包括通過其他蛋白酶或蛋白酶組合(例如胰蛋白酶和/或lysc)生成的那些肽。
表2
在一些實施方式中，適用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的測定的肽(例如表1所示和sedidno.1-103所示的肽)可含有肽序列內(nèi)部的額外蛋白水解位點，其在被切割時將生成子肽(sub-peptide)。這類子肽可通過評估針對所需蛋白酶的蛋白水解切割位點的經(jīng)鑒定肽的序列來識別。在一個實施方式中，胰蛋白酶肽可包括額外的內(nèi)部胰蛋白酶切割位點，其可在由胰蛋白酶進行進一步切割后生成子肽。
在另一個實施方式中，胰蛋白酶肽可含有蛋白酶的內(nèi)部位點，該蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc，其可導(dǎo)致在由胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc中的任意一種、兩種或更多種切割后形成子肽。在另一個實施方式中，lysc肽可含有其他蛋白酶的內(nèi)部位點，該其他蛋白酶是例如gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶，其可導(dǎo)致在由gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或胰蛋白酶中的任意一種、兩種或更多種切割后形成子肽。應(yīng)理解，這類子肽，且具體而言是seqidno.1-103所示肽中任意一種或多種的胰蛋白酶、gluc、aspn、胰凝乳蛋白酶和/或lysc切割片段，列入且包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明所列實施方式包括組合物，其包含一種或多種表1和2中的肽且可任選地包含經(jīng)同位素標記但其他方面與一種或多種表1和2中的肽相同的肽。在一些實施方式中，這些組合物包含一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或全部一百零三(103)種表1和2中的肽。這類組合物可任選地包括肽、多肽或蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含經(jīng)同位素標記但其他方面與一種或多種表1和表2中的肽相同的肽。使用包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種或更多種表1和2中肽的經(jīng)同位素標記的合成或天然肽、多肽或蛋白質(zhì)時，蛋白酶處理釋放經(jīng)同位素標記但其他方面與表1和2中的肽相同的肽。
例如，可使用同位素標記的氨基酸在程序化的細胞裂解物或組織培養(yǎng)物中制備這類同位素標記的生物或生物合成肽。各同位素標記的肽可使用一種或多種同位素標記，這些同位素獨立地選自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其組合。無論是否經(jīng)同位素標記，包含來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的肽的組合物均無需含有所有來自該蛋白質(zhì)的肽(例如完整的胰蛋白酶肽組)。在一些實施方式中，這些組合物不含有來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的組合形式的所有肽，且具體而言不含有所有表1和表2中出現(xiàn)的肽。包含肽的組合物可以是干燥或凍干的材料、液體(如水性)溶液或懸浮液、陣列或印記的形式。
在一個實施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息包括以下一種或多種、兩種或更多種，或三種或更多種：各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的lysc蛋白水解所得肽的各過渡離子的離子類型。
在另一個實施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息包括以下一種或多種、兩種或更多種，或三種或更多種：各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的胰蛋白酶蛋白水解所得肽的各過渡離子的離子類型。
在另一個實施方式中，涉及特定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的額外信息包括以下一種或多種、兩種或更多種，或三種或更多種：各肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、m/z過渡離子，以及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的胰蛋白酶和/或lysc蛋白水解所得肽的各過渡離子的離子類型。在一個實施方式中，來自各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的單個胰蛋白酶和/或lysc蛋白水解肽以及相關(guān)額外信息被用于診斷確定(diagnosticdetermination)。
具體實施方式
本發(fā)明的具體實施方式如下。
1.一種測量生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平的方法，包括使用質(zhì)譜檢測和/或定量由所述生物樣品制備的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量；并計算所述樣品中修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平；且所述含量是相對含量或絕對含量。
2.實施方式1的方法，還包括在檢測和/或定量一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量前對所述蛋白質(zhì)消化物進行分級的步驟。
3.實施方式2的方法，其中所述分級步驟選自凝膠電泳、液相色譜、毛細管電泳、納米反向液相色譜、高效液相色譜或反向高效液相色譜。
4.實施方式1-3中任一項的方法，其中所述生物樣品的所述蛋白質(zhì)裂解物通過liquidtissuetm方案制備。
5.實施方式1-3中任一項的方法，其中所述蛋白質(zhì)消化物包括蛋白酶消化物。
6.實施方式5的方法，其中所述蛋白質(zhì)消化物包括胰蛋白酶和/或lysc消化物。
7.實施方式1-6中任一項的方法，其中所述質(zhì)譜包括串聯(lián)質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、三重四極質(zhì)譜、maldi-tof質(zhì)譜、maldi質(zhì)譜和/或飛行時間質(zhì)譜。
8.實施方式7的方法，其中使用的質(zhì)譜模式是選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)、多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)和/或多選擇反應(yīng)監(jiān)測(msrm)，或其任意組合。
9.實施方式1-8中任一項的方法，其中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包含seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56.seqidno：57、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102和seqidno：103所示的氨基酸序列。
10.實施方式1-9中任一項的方法，其中該生物樣品是血液樣品、尿樣品、血清樣品、腹水樣品、疲液樣品、淋巴液、唾液樣品、細胞或?qū)嶓w組織。
11.實施方式1-10中任一項的方法，其中該生物樣品是福爾馬林固定的組織。
12.實施方式1-11中任一項的方法，其中該生物樣品是石蠟包埋的組織。
13.實施方式1-12中任一項的方法，其中該生物樣品是獲自腫瘤的組織。
14.實施方式13的方法，其中該腫瘤是原發(fā)性腫瘤。
15.實施方式13的方法，其中該腫瘤是繼發(fā)性腫瘤。
16.實施方式1-15中任一項的方法，還包括定量修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽。
17(a).實施方式1-16中任一項的方法，其中定量ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括比較一種生物樣品中包含ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的約8至約45各氨基酸殘基的氨基酸序列的一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量與不同和單獨的樣品或生物樣品中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量。
17(b).實施方式1-16中任一項的方法，其中定量ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括比較一種生物樣品中包含ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的約8至約45個氨基酸殘基的氨基酸序列的一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量與不同和單獨的樣品或生物樣品中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量，所述片段肽示于seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16、seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21、seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26、seqidno：27、seqidno：28、seqidno：29、seqidno：30、seqidno：31、seqidno：32、seqidno：33、seqidno：34、seqidno：35、seqidno：36、seqidno：37、seqidno：38、seqidno：39、seqidno：40、seqidno：41、seqidno：42、seqidno：43、seqidno：44、seqidno：45、seqidno：46、seqidno：47、seqidno：48、seqidno：49、seqidno：50、seqidno：51、seqidno：52、seqidno：53、seqidno：54、seqidno：55、seqidno：56.seqidno：57、seqidno：58、seqidno：59、seqidno：60、seqidno：61、seqidno：62、seqidno：63、seqidno：64、seqidno：65、seqidno：66、seqidno：67、seqidno：68、seqidno：69、seqidno：70seqidno：71、seqidno：72、seqidno：73、seqidno：74、seqidno：75、seqidno：76、seqidno：77、seqidno：78.seqidno：79、seqidno：80、seqidno：81、seqidno：82、seqidno：83、seqidno：84、seqidno：85、seqidno：86、seqidno：87、seqidno：88、seqidno：89、seqidno：90、seqidno：91、seqidno：92、seqidno：93、seqidno：94、seqidno：95、seqidno：96、seqidno：97、seqidno：98、seqidno：99、seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102和seqidno：103。
18.實施方式17(a)或17(b)的方法，其中定量一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括通過與添加的已知含量的內(nèi)標肽比較來測定生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽中每一種的含量，其中該生物樣品中的各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽與具有相同氨基酸序列的添加的內(nèi)標肽相比較。
19.實施方式18的方法，其中該內(nèi)標肽是同位素標記的肽。
20.實施方式19的方法，其中該同位素標記的內(nèi)標肽包含選自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其組合的一種或多種重穩(wěn)定同位素。
21.實施方式1-20中任一項的方法，其中檢測和/或定量該蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量表示存在修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以及與患者或?qū)ο笾邪┌Y的相關(guān)性。
22.實施方式21的方法，還包括關(guān)聯(lián)所述檢測和/或定量該蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的和/或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量或所述ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量的結(jié)果與癌癥的診斷階段/等級/狀態(tài)。
23.實施方式22的方法，其中關(guān)聯(lián)所述檢測和/或定量該蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量或所述ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量的結(jié)果與癌癥的診斷階段/等級/狀態(tài)與檢測和/或定量其他蛋白質(zhì)或來自其他蛋白質(zhì)的肽的含量以多重方式聯(lián)用，從而提供關(guān)于癌癥的診斷階段/等級/狀態(tài)的額外信息。
24.實施方式1-23中任一項的方法，還包括針對患者或?qū)ο筮x擇治療，所述生物樣品獲自所述患者或?qū)ο螅鲋委熁谝环N或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的存在、不存在或含量或者ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量。
25.實施方式1-24中任一項的方法，還包括向患者或?qū)ο蠼o予治療有效量的治療劑，所述生物樣品獲自所述患者或?qū)ο螅渲薪o予的治療劑和/或治療劑的含量基于一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量或ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的含量。
26.實施方式24和25的方法，其中該治療或該治療劑針對表達ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的癌細胞。
27.實施方式1-27的方法，其中該生物樣品是經(jīng)處理的福爾馬林固定的腫瘤組織，所述處理用于使用liquidtissuetm方案和試劑定量一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量。
28.實施方式1-28中任一項的方法，其中所述一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽是一種或多種表1中的肽。
29.一種組合物，其包含一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或十種或更多種表1中的肽和/或其抗體。
30.實施方式30的組合物，其包含一種或多種、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種，或十種或更多種表2中的肽和/或其抗體。
示例性srm/mrm測定方法
下文所述的方法用于：1)鑒定可用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的基于質(zhì)譜的srm/mrm測定的來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的候選肽，2)針對來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的靶標肽開發(fā)單個srm/mrm測定或多種srm/mrm測定，和3)將定量測定應(yīng)用于癌癥診斷和/或最佳療法的選擇。
1.ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm/mrm候選片段肽的鑒定：
a.使用一種或多種蛋白酶(可能包括或可能不包括胰蛋白酶)消化蛋白質(zhì)，從而由福爾馬林固定的生物樣品制備liquidtissuetm蛋白質(zhì)裂解物
b.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析liquidtissuetm裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的所有片段肽，其中單個片段肽不含任何諸如磷酸化或糖基化的肽修飾
c.在離子阱串聯(lián)質(zhì)譜上分析liquidtissuetm裂解物中的所有蛋白質(zhì)片段并鑒定來自帶有諸如磷酸化或糖基化殘基的肽修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的所有片段肽
d.可測量由完整的全長ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)通過具體消化方法可能產(chǎn)生的所有肽，但用于開發(fā)srm/mrm測定的優(yōu)選肽為在由福爾馬林固定的生物樣品制備的復(fù)雜liquidtissuetm蛋白質(zhì)裂解物中通過質(zhì)譜直接鑒定的那些
e.在分析來自福爾馬林固定的生物樣品的liquidtissuetm裂解物時將在患者或?qū)ο蠼M織中特異性修飾(磷酸化、糖基化等)并在質(zhì)譜中電離化且因此可被檢測的肽鑒定為用于測定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的肽修飾的候選肽
2.來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的質(zhì)譜測定
a.將針對liquidtissuetm裂解物中鑒定的單個片段肽的三重四極質(zhì)譜上的srm/mrm測定應(yīng)用于來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的肽
i.針對包括但不限于以下實驗的最佳色譜條件確定片段肽的最佳保留時間：凝膠電泳、液相色譜、毛細管電泳、納米反向液相色譜、高效液相色譜或反向高效液相色譜
ii.確定肽的單同位素質(zhì)量、各肽的前體電荷狀態(tài)、各肽的前體m/z值、各肽的m/z過渡離子和各片段肽的各過渡離子的離子類型以開發(fā)用于各肽的srm/mrm測定。
iii.隨后可使用來自(i)和(ii)的信息在三重四極質(zhì)譜上進行srm/mrm測定，其中各肽均具有特征性且獨特的srm/mrm特征峰，該特征峰精確地限定在三重四極質(zhì)譜上進行的獨特的srm/mrm測定
b.進行srm/mrm分析使得來自srm/mrm質(zhì)譜分析的獨特srm/mrm特征峰面積的函數(shù)形式的所檢測的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的含量可指示特定蛋白質(zhì)裂解物中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的相對含量和絕對含量。
iv.相對定量可通過以下實現(xiàn)：
1.通過比較以下數(shù)值來確定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來自一種福爾馬林固定的生物樣品的liquidtissuetm裂解物中檢測到的給定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面積與來自至少第二、第三、第四或更多的福爾馬林固定的生物樣品的至少第二、第三、第四或更多的liquidtissue裂解物中相同ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a片段肽的相同srm/mrm特征峰面積
2.通過比較以下數(shù)值來確定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：來自一種福爾馬林固定的生物樣品的liquidtissue裂解物中檢測到的給定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面積與由來源于不同且單獨的生物來源的其它樣品中的其它蛋白質(zhì)的片段肽發(fā)展的srm/mrm特征峰面積，其中針對肽片段的兩種樣品之間的srm/mrm特征峰面積的比較標準化至各樣品中分析的蛋白質(zhì)的含量。
3.通過比較以下數(shù)值來確定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的增加或減少的存在量：給定ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a肽的srm/mrm特征峰面積與來自福爾馬林固定的生物樣品的相同liquidtissue裂解物內(nèi)的不同蛋白質(zhì)來源的其它片段肽的srm/mrm特征峰面積，從而將ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的變化水平標準化至多種細胞條件下都不改變其表達水平的其它蛋白質(zhì)的水平。
4.這些測定可應(yīng)用于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中以與確定未修飾的肽的相對含量相同的方式確定修飾的肽的相對水平。
v.給定肽的絕對定量可通過比較以下數(shù)值來實現(xiàn)：來自單個生物樣品中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的給定片段肽的srm/mrm特征峰面積與摻入來自生物樣品的蛋白質(zhì)裂解物中的內(nèi)部片段肽標準物的srm/mrm特征峰面積
1.內(nèi)標物為測量中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的經(jīng)標記的合成形式。將該標準物以已知量摻入樣品中，并可單獨地確定生物樣品中的天然肽片段和內(nèi)部片段肽標準物的srm/mrm特征峰面積，接著比較兩個峰面積
2.這可應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中這些修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且其中可以與確定未修飾的肽的絕對水平相同的方式來確定修飾的肽的絕對水平。
3.將片段肽定量應(yīng)用于癌癥診斷和治療
a.進行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對和/或絕對定量并說明證實了患者或?qū)ο竽[瘤組織中的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)表達與階段/等級/狀況的先前確定的關(guān)聯(lián)性，如同在癌癥領(lǐng)域中充分理解的那樣
b.進行ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽水平的相對和/或絕對定量并說明與來自不同治療策略的臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)性，其中該關(guān)聯(lián)性已經(jīng)在該領(lǐng)域中說明或可在將來說明(通過針對患者或?qū)ο笕夯騺碜阅切┗颊呋驅(qū)ο蟮慕M織的關(guān)聯(lián)性研究)。一旦通過該測定證實了先前確立的關(guān)聯(lián)性或?qū)淼贸龅年P(guān)聯(lián)性，則該測定方法可用于確定最佳治療策略
內(nèi)標物可以是來自正被測量的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的片段肽的經(jīng)標記合成形式(或包含蛋白水解后釋放的片段肽的經(jīng)標記合成形式的蛋白質(zhì)或多肽)。該標準物以已知含量摻入樣品中，且可單獨確定生物樣品中內(nèi)部片段肽標準物和天然片段肽的srm/mrm特征峰面積，隨后比較這兩個峰面積。這可應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化，且可以與測定未修飾肽的絕對水平相同的方式測定修飾的肽的絕對水平。
通過在離子阱和三重四極質(zhì)譜上分析所有肽來開發(fā)特定肽相關(guān)的特定且獨特的特性。該信息包括該肽的單同位素質(zhì)量、其前體電荷狀態(tài)、前體m/z值、該前體的過渡m/z值和各鑒定的過渡離子的離子類型。該信息必須針對在來自福爾馬林固定的樣品/組織的liquidtissue裂解物中直接存在的每個和每一個候選srm/mrm肽通過實驗進行測定；原因在于，有趣的是，并非所有來自蛋白質(zhì)的肽都可使用本發(fā)明所述的srm/mrm在這類裂解物中檢測，表明未檢測的肽無法被視為開發(fā)用于定量來自福爾馬林固定的樣品/組織的liquidtissue裂解物中直接存在的肽/蛋白質(zhì)的srm/mrm測定的候選肽。
在三重四極質(zhì)譜上進行特定肽的具體srm/mrm測定。通過具體的srm/mrm測定分析的實驗樣品是例如從福爾馬林固定和石蠟包埋的組織中制備的liquidtissue蛋白質(zhì)裂解物。來自這類測定的數(shù)據(jù)顯示存在針對福爾馬林固定的樣品中該肽的獨特srm/mrm特征峰。
該肽的特定過渡離子特性被用于定量測量福爾馬林固定的生物樣品中具體的肽。這些數(shù)據(jù)顯示該肽的絕對含量，顯示為每微克所分析蛋白質(zhì)裂解物中肽的摩爾含量的函數(shù)形式。
基于福爾馬林固定的患者來源或?qū)ο髞碓唇M織的分析進行的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)水平的評估可提供涉及具體患者或?qū)ο蟮脑\斷、預(yù)后和治療上相關(guān)的信息。本發(fā)明描述了一種測量生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)水平的方法，包括使用質(zhì)譜檢測和/或定量由所述生物樣品制備的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量；和計算所述樣品中修飾的或未修飾的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平；且其中所述水平是相對水平或絕對水平。在相關(guān)的實施方式中，定量一種或多種ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽包括通過與添加的已知含量的內(nèi)標肽相比較來測定生物樣品中各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽的含量，其中該生物樣品中各ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)片段肽與具有相同氨基酸序列的內(nèi)標肽相比較。在一些實施方式中，該內(nèi)標物是同位素標記的內(nèi)標肽，其包含一種或多種選自18o、17o、34s、15n、13c、2h或其組合的重穩(wěn)定同位素。
本發(fā)明所述的測定生物樣品中ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)(或作為其替代物的片段肽)的水平的方法可用作患者或?qū)ο笾邪┌Y的診斷學(xué)指示物。在一個實施方式中，ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)水平的測量結(jié)果可用于確定癌癥的診斷階段/等級/狀態(tài)，方法為關(guān)聯(lián)(如比較)組織中發(fā)現(xiàn)的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平與正常和/或癌性或癌前組織中發(fā)現(xiàn)的ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的水平。
僅有的正在使用的檢測福爾馬林固定的患者樣品中特定蛋白質(zhì)水平的方法是免疫組化(ihc)。該方法在來自患者腫瘤組織樣品的單個組織切片上一次僅分析一種蛋白質(zhì)。因此，為分析多種蛋白質(zhì)樣品，必須同時測量多個組織切片，這費時且費力。ihc使用抗體檢測靶蛋白質(zhì)的存在，且任何ihc實驗中都因為抗體與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的潛在可能性而存在巨大的固有潛在信號背景。此外，ihc充其量不過是半定量的。由于這些問題，ihc無法同時提供多種蛋白質(zhì)的客觀定量分析。當前的實施方式能夠使用單個患者組織樣品切片以100％測定特異性同時提供ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的客觀定量，在節(jié)約大量時間和金錢的同時提供更富有價值的涉及ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)表達的數(shù)據(jù)。
該多重srm/mrm測定還可包括在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)以外同時分析其他額外蛋白質(zhì)，包括藥物靶蛋白質(zhì)如egfr、igf-1r和cmet。這是有價值的，因為額外蛋白質(zhì)的分析還顯示哪些額外蛋白質(zhì)可用于治療具體癌癥?；陬~外示例性藥物靶蛋白質(zhì)分析的額外蛋白質(zhì)的示例包括靶向egfr受體的愛必妥(erbitux)、靶向igf-1r的figitumumab，以及靶向c-met和血管內(nèi)皮生長因子受體2(vegfr-2)的foretinib。
因為核酸和蛋白質(zhì)兩者都可由相同的liquidtissuetm生物分子制備物分析，所以可以由用于蛋白質(zhì)分析的相同樣品中的核酸生成關(guān)于疾病診斷和藥物治療決定的額外信息。例如，如果ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)由某些細胞以增加的水平表達，當通過srm測定時，數(shù)據(jù)可提供關(guān)于細胞的狀態(tài)及其不受控制地生長的潛在性、潛在的抗藥性和癌癥發(fā)展的信息。同時，可從相同的liquidtissuetm生物分子制備物中存在的核酸中獲得關(guān)于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a基因和/或核酸及其編碼的蛋白質(zhì)的狀況的信息(例如，mrna分子及其表達水平或剪接變化)，可在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm分析的同時對其進行評價。可在ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)的srm分析的同時對不來自ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a且存在于相同生物分子制備物中的任何基因和/或核酸進行評價。在一個實施方式中，關(guān)于ent1、ercc1、folr1、rrm1、tubb3、topo1和/或topo2a蛋白質(zhì)和/或一種、兩種、三種、四種或更多種額外的蛋白質(zhì)的信息可通過檢查編碼那些蛋白質(zhì)的核酸來評價。那些核酸可例如通過以下方法中的一種或多種、兩種或更多種或三種或更多種檢查：測序方法、聚合酶鏈式反應(yīng)方法、限制性片段多態(tài)性分析、插入、缺失的鑒定，和/或是否存在突變的確定，包括但不限于單堿基對多態(tài)性、轉(zhuǎn)換、顛換或其組合。
上述說明書以及方法和組合物的示例性實施方式說明了本發(fā)明的范圍。然而，由于變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的，本發(fā)明不限于上文所述的具體實施方式。
序列表
<110>愛科譜迅病理研究公司(expressionpathologyinc)
<120>針對化療靶標的srm測定
<130>01152-8034
<160>103
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>15
<212>prt
<213>智人(homosapiens)
<400>1
aspalaglnalaseralaalaproalaalaproleuprogluarg
151015
<210>2
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>2
ileproglnservalarg
15
<210>3
<211>20
<212>prt
<213>智人
<400>3
ileleuglyserleuvalalaileleuleuvalpheleuilethrala
151015
ileleuvallys
20
<210>4
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>4
leugluglyproglygluglngluthrlys
1510
<210>5
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>5
leuaspleuileserlys
15
<210>6
<211>11
<212>prt
<213>智人
<400>6
serserilealaglyserserthrtrpgluarg
1510
<210>7
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>7
trpleuproserleuvalleualaarg
15
<210>8
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>8
serasnserileilevalserproarg
15
<210>9
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>9
glyasnprovalleulys
15
<210>10
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>10
tyrhisasnleuhisproasptyrilehisglyarg
1510
<210>11
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>11
valleuleuvalglnvalaspvallys
15
<210>12
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>12
aspproglnglnalaleulys
15
<210>13
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>13
tyrleugluthrtyrlys
15
<210>14
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>14
leugluglnaspphevalserarg
15
<210>15
<211>21
<212>prt
<213>智人
<400>15
thraspserglnthrleuleuthrthrpheglyserleugluglnleu
151015
ilealaalaserarg
20
<210>16
<211>11
<212>prt
<213>智人
<400>16
leupheaspvalleuhisglupropheleulys
1510
<210>17
<211>5
<212>prt
<213>智人
<400>17
ilealatrpalaarg
15
<210>18
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>18
glulysproglyprogluasplys
15
<210>19
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>19
aspvalsertyrleutyrarg
15
<210>20
<211>5
<212>prt
<213>智人
<400>20
serasntrphislys
15
<210>21
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>21
hisproasptyralaileleualaalaarg
1510
<210>22
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>22
ilealavalserasnleuhislys
15
<210>23
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>23
serthrleuaspilevalleualaasnlys
1510
<210>24
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>24
leuasnseralaileiletyrasparg
15
<210>25
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>25
aspphesertyrasntyrpheglyphelys
1510
<210>26
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>26
valservalglyilehislys
15
<210>27
<211>16
<212>prt
<213>智人
<400>27
gluaspileaspalaalailegluthrtyrasnleuleusergluarg
151015
<210>28
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>28
aspaspserilegluglyiletyraspthrleulys
1510
<210>29
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>29
tyrvalaspglnglyglyasnlys
15
<210>30
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>30
leutyralasertyrglulys
15
<210>31
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>31
serasnglnglnasnleuglythrilelys
1510
<210>32
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>32
leualagluvalthrlys
15
<210>33
<211>13
<212>prt
<213>智人
<400>33
tyrprophegluseralaglualaglnleuleuasnlys
1510
<210>34
<211>15
<212>prt
<213>智人
<400>34
gluglnglyprotyrgluthrtyrgluglyserprovalserlys
151015
<210>35
<211>15
<212>prt
<213>智人
<400>35
valleuserglyglupheglnilevalasnprohisleuleulys
151015
<210>36
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>36
thrvaltrpgluileserglnlys
15
<210>37
<211>21
<212>prt
<213>智人
<400>37
glyalapheileaspglnserglnserleuasnilehisilealaglu
151015
proasntyrglylys
20
<210>38
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>38
hisserasnsergluhislys
15
<210>39
<211>11
<212>prt
<213>智人
<400>39
gluasnglypheserserproproglnilelys
1510
<210>40
<211>13
<212>prt
<213>智人
<400>40
aspgluprogluaspaspglytyrphevalproprolys
1510
<210>41
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>41
leuglugluglugluaspglylys
15
<210>42
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>42
valprogluproaspasnlys
15
<210>43
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>43
trptrpgluglugluarg
15
<210>44
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>44
tyrprogluglyilelys
15
<210>45
<211>16
<212>prt
<213>智人
<400>45
glyprovalphealaproprotyrgluproleuprogluasnvallys
151015
<210>46
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>46
phetyrtyraspglylys
15
<210>47
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>47
alaglugluvalalathrphephealalys
1510
<210>48
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>48
alaglnthrglualaarg
15
<210>49
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>49
valproserproproproglyhislys
15
<210>50
<211>16
<212>prt
<213>智人
<400>50
valthrtrpleuvalsertrpthrgluasnileglnglyserilelys
151015
<210>51
<211>24
<212>prt
<213>智人
<400>51
valgluhisileasnleuhisprogluleuaspglyglnglutyrval
151015
valglupheasppheleuglylys
20
<210>52
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>52
glnprogluaspaspleupheasparg
15
<210>53
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>53
leuasnthrglyileleuasnlys
15
<210>54
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>54
gluleuthralaproaspgluasnileproalalys
1510
<210>55
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>55
gluglnleualaaspalaarg
15
<210>56
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>56
leugluvalglnalathrasparg
15
<210>57
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>57
glnilealaleuglythrserlys
15
<210>58
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>58
trpglyvalproileglulys
15
<210>59
<211>11
<212>prt
<213>智人
<400>59
serglnserserthrserthrthrglyalalys
1510
<210>60
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>60
serseraspgluserasnpheaspvalproproarg
1510
<210>61
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>61
glytyraspseraspprovallys
15
<210>62
<211>14
<212>prt
<213>智人
<400>62
valproaspgluglugluasnglugluseraspasnglulys
1510
<210>63
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>63
gluglngluleuaspthrleulys
15
<210>64
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>64
serproseraspleutrplys
15
<210>65
<211>16
<212>prt
<213>智人
<400>65
gluaspleualathrpheileglugluleuglualavalglualalys
151015
<210>66
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>66
glnaspgluglnvalglyleuproglylys
1510
<210>67
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>67
valilehisgluglnvalasnhisarg
15
<210>68
<211>15
<212>prt
<213>智人
<400>68
glypheglnglnileserphevalasnserilealathrserlys
151015
<210>69
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>69
hisvalasptyrvalalaaspglnilevalthrlys
1510
<210>70
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>70
leuvalaspvalvallys
15
<210>71
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>71
glyglyvalalavallys
15
<210>72
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>72
alaglnvalglnleuasnlys
15
<210>73
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>73
leuaspaspalaasnaspalaglyglyarg
1510
<210>74
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>74
thrleualavalserglyleuglyvalvalglyarg
1510
<210>75
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>75
tyrglyvalpheproleuarg
15
<210>76
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>76
ilevalglyleuglntyrlys
15
<210>77
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>77
asntyrgluaspgluaspserleulys
15
<210>78
<211>16
<212>prt
<213>智人
<400>78
glyleuleuileasnpheilehishisasntrpproserleuleuarg
151015
<210>79
<211>11
<212>prt
<213>智人
<400>79
pheleugluglupheilethrproilevallys
1510
<210>80
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>80
serserthrproasnhislys
15
<210>81
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>81
glyleuglythrserthrserlys
15
<210>82
<211>16
<212>prt
<213>智人
<400>82
tyrserglyprogluaspaspalaalaileserleualapheserlys
151015
<210>83
<211>25
<212>prt
<213>智人
<400>83
leuleuglyleuprogluasptyrleutyrglyglnthrthrthrtyr
151015
leuthrtyrasnasppheileasnlys
2025
<210>84
<211>12
<212>prt
<213>智人
<400>84
gluleuileleupheserasnseraspasngluarg
1510
<210>85
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>85
pheleutyraspaspasnglnarg
15
<210>86
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>86
ileproasnpheaspvalarg
15
<210>87
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>87
gluilevalasnasnilearg
15
<210>88
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>88
thrtrpthrglnthrtyrlys
15
<210>89
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>89
thrproproleuilethrasptyrarg
15
<210>90
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>90
glutyrhisthraspthrthrvallys
15
<210>91
<211>5
<212>prt
<213>智人
<400>91
valglyleuhislys
15
<210>92
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>92
tyraspthrvalleuaspileleuarg
15
<210>93
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>93
aspphephegluleuarg
15
<210>94
<211>10
<212>prt
<213>智人
<400>94
gluvalthrphevalproglyleutyrlys
1510
<210>95
<211>13
<212>prt
<213>智人
<400>95
ilepheaspgluileleuvalasnalaalaaspasnlys
1510
<210>96
<211>17
<212>prt
<213>智人
<400>96
valthrileaspprogluasnasnleuileseriletrpasnasngly
151015
lys
<210>97
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>97
glyileprovalvalgluhislys
15
<210>98
<211>6
<212>prt
<213>智人
<400>98
asnglytyrglyalalys
15
<210>99
<211>8
<212>prt
<213>智人
<400>99
phethrvalgluthralaserarg
15
<210>100
<211>9
<212>prt
<213>智人
<400>100
alatyraspilealaglyserthrlys
15
<210>101
<211>7
<212>prt
<213>智人
<400>101
valpheleuasnglyasnlys
15
<210>102
<211>17
<212>prt
<213>智人
<400>102
metserserthrpheileglyasnserthralaileglngluleuphe
151015
lys
<210>103
<211>25
<212>prt
<213>智人
<400>103
leualathrprothrtyrglyaspleuasnhisleuvalseralathr
151015
metserglyvalthrthrserleuarg
2025