本公開內(nèi)容一般涉及用于分析血液樣品的方法和組合物，包括用于檢測未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的酶活性的方法和組合物。在一些實施方案中，作為血液樣品中一種或多種血液傳染性微生物的診斷測試的一部分或與其結(jié)合進(jìn)行G6PD活性的檢測。

背景

本節(jié)中描述的材料不因包括在本節(jié)中而承認(rèn)為現(xiàn)有技術(shù)。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(“G6PD”或“G6PDH”)在細(xì)胞生物化學(xué)中執(zhí)行關(guān)鍵功能。它是氧化戊糖途徑的一部分，其中它通過提供還原當(dāng)量使細(xì)胞上自由基的氧化攻擊最小化。G6PD酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸鹽，從而釋放將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAPD⁺)還原為NAPDH的質(zhì)子。NAPDH引發(fā)一系列下游反應(yīng)，其最終減少自由基氧化劑并使得它們中的許多在細(xì)胞生物化學(xué)中無效。

在人類中，G6PD酶存在于所有細(xì)胞類型中，但其以更高濃度存在于紅血細(xì)胞中，紅血細(xì)胞在它們的主要功能之一中充當(dāng)氧運(yùn)輸載體并因此特別易于受到氧化攻擊的影響。在紅血細(xì)胞中觀察到的高G6PD濃度部分是因為G6PD系統(tǒng)用于防治和預(yù)防不希望的氧化作用。然而，當(dāng)將強(qiáng)氧化劑(例如喹啉類抗瘧疾藥物的成員，包括8-氨基喹啉類藥物)作為瘧疾治療的一部分引入人類時，大大增加了對還原劑的快速產(chǎn)生的需要。

據(jù)報道G6PD缺陷是最常見的人類酶缺陷之一，影響了全世界超過4億人。在這些G6PD缺陷個體中，G6PD酶顯示大大降低的比活性。作為結(jié)果，強(qiáng)氧化劑(例如喹啉型抗瘧疾藥物類別的成員)的施用可能引起嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥，例如溶血性貧血，因為它們的G6DP的低比活性不能產(chǎn)生足夠的還原劑以防止對其紅血細(xì)胞的快速的不想要的氧化作用。因此，在瘧疾感染普遍的地區(qū)和在瘧疾流行期間，需要快速和有效的測試，其將容易地將具有低比活性的G6PD的人與G6PD活性正常的人區(qū)分開，并且將使醫(yī)務(wù)人員能夠確保1)引起氧化應(yīng)激的抗瘧疾藥物僅開具用于具有正?；蚋玫腉6PD比活性的個體，(2)具有G6PD活性的輕度缺陷的個體開具減少的喹啉抗瘧疾藥物的劑量水平，或者，開具替代類型的抗瘧疾藥物，和(3)具有更嚴(yán)重的G6PD活性缺陷的人使用替代類型的抗瘧疾藥物醫(yī)治。

目前對血液樣品中G6PD酶活性的商業(yè)測試主要分為兩大類：(1)能夠提供相對定量結(jié)果但需要昂貴的核心實驗室設(shè)備和血液樣品的顯著稀釋的那些，和(2)涉及測量顯色底物的那些，其可以以較低成本的側(cè)流格式進(jìn)行，但不是提供定量數(shù)據(jù)。例如，血液樣品中的G6PD酶活性可以通過測量輔酶NADP⁺/NADPH的固有吸光度或熒光，或通過監(jiān)測在樣品中顏色作為NADPH濃度的函數(shù)而變化的顯色染料來檢測。這些方法的一個顯著缺點(diǎn)是它們通常需要血液樣品在測定之前經(jīng)歷顯著稀釋，以便將溶液的光密度降低至可以使用標(biāo)準(zhǔn)光譜儀和光學(xué)設(shè)備測量或可以由人眼檢測的范圍。這些方法的另一個缺點(diǎn)是稀釋過程是耗時的，并且涉及潛在感染性血液樣品的額外處理。此外，顯著稀釋全血樣品常常增加樣品數(shù)據(jù)內(nèi)的錯誤概率。

目前可用于測量血液樣品中G6PD酶活性的方法的另一個問題是，它們通常需要通過相同血液樣品中的血紅蛋白含量的單獨(dú)測量來校準(zhǔn)和/或標(biāo)準(zhǔn)化。這是因為大多數(shù)稀釋和測量是相對的而不是絕對的，因此，為了提供實際酶活性的精確定量，通常必須通過儀器分析全血的穩(wěn)定樣品，然后必須調(diào)整結(jié)果以使得值相對于血液中組分的濃度標(biāo)準(zhǔn)化。該過程易于在標(biāo)準(zhǔn)材料的制備中和在其運(yùn)輸和儲存期間的穩(wěn)定性中出現(xiàn)錯誤。

用于測量未稀釋血液樣品中G6PD酶活性的替代方法涉及使用能夠測量高光密度樣品的吸光度的極短光路長度比色皿或儀器。然而，由于為了精確測量樣品的光密度而通常需要與濃縮樣品一起使用的超短路徑比色皿和/或儀器的高昂成本(這將顯著增加商業(yè)測試的成本)，該方法未被用于G6PD商業(yè)測試中。

如上所述，由于瘧疾感染和許多抗瘧疾藥物已被廣泛報道在血細(xì)胞中，特別是在寄生的紅細(xì)胞中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，因此通常與瘧原蟲微生物(瘧疾的最常見的致病體)的診斷測試結(jié)合地進(jìn)行血液樣品中G6PD酶活性的測試。然而，直到目前，這需要兩個單獨(dú)的測試：一個用于瘧疾，另一個用于G6PD酶活性。

因此，本領(lǐng)域需要將包括瘧疾在內(nèi)的發(fā)熱性疾病的診斷與定量G6PD測試整合的護(hù)理點(diǎn)測試。這是因為如果個體是瘧疾陽性，則需要G6PD酶活性狀態(tài)來確定適當(dāng)?shù)闹委熯^程。整合的測試可以提供許多優(yōu)點(diǎn)，包括避免額外診斷測試的成本，避免獲得額外血液樣品的需要，以及更好的工作流程。這確保了在診斷時在開具藥物時可以確定適當(dāng)?shù)闹委熯^程。另外，本領(lǐng)域存在的問題是，瘧疾的靈敏診斷需要最小限度稀釋的血液樣品以避免稀釋病原體，而定量G6PD測試需要高度稀釋的血液樣品以避免使用分析儀器從高光密度樣品測量信號的問題。當(dāng)兩個測試組合成單個測試時，這兩個需求將是沖突的。

在一個方面，本申請公開了用于對最小稀釋的血液樣品進(jìn)行定量G6PD測試的組合物和方法，任選地作為一種或多種血液傳染性微生物例如瘧原蟲微生物的診斷測試的一部分或與其結(jié)合。在一些具體實施方案中，本文公開的G6PD測試方法特別可用于將定量G6PD測試整合到用于檢測血液傳染性微生物(例如瘧疾和其它發(fā)熱性疾病的致病微生物)的多重診斷工作流程中。

概述

本節(jié)提供了本公開內(nèi)容的一般概述，并且不全面涵蓋其全部范圍或其所有特征。

本文公開了檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性的方法，其包括獲得或接收稀釋或最低限度稀釋的血液樣品，并檢測未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中存在的G6PD活性。在一些實施方案中，未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品獲自受試者。在所述方法的一些實施方案中，檢測G6PD活性包括對所述未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品進(jìn)行落射熒光檢測。

根據(jù)本公開內(nèi)容的方法的實現(xiàn)可以包括以下特征中的一個或多個。在一些實施方案中，檢測G6PD活性包括測量對應(yīng)于未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2'-磷酸(“NADP⁺”)至還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2'-磷酸(“NADPH”)的酶促轉(zhuǎn)化的信號。在一些實施方案中，通過監(jiān)測與NADPH相互作用的染料分子的熒光來測量NADP⁺向NADPH的轉(zhuǎn)化。在一些實施方案中，檢測G6PD活性包括測量NADPH熒光。在一些實施方案中，通過在被紫外光激發(fā)時測量NADPH發(fā)射，通過分光光度法進(jìn)行NADPH熒光。在一些實施方案中，NADPH熒光在290-400nm之間的一個或多個波長處被激發(fā)。在一些實施方案中，NADPH熒光在310-380nm之間的一個或多個波長處被激發(fā)。在一些實施方案中，NADPH熒光在330-370nm之間的一個或多個波長處被激發(fā)。在一些實施方案中，在365nm激發(fā)下進(jìn)行NADPH熒光的測量。在本文公開的方法的一些實施方案中，通過衰減全反射(ATR)方法進(jìn)行檢測G6PD活性。在本文公開的方法的一些實施方案中，檢測G6PD活性包括測量對應(yīng)于未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中葡萄糖-6-磷酸(G6P)至6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化的信號。在一些實施方案中，檢測G6PD活性基本上不受溫度波動的影響。在一些實施方案中，檢測G6PD活性基本上不受反應(yīng)中血液濃度波動的影響。

本文公開的一些實施方案涉及用于檢測未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中的G6PD酶活性的方法，其中作為檢測血液樣品中的血液傳染性微生物的診斷方法的一部分或與其結(jié)合進(jìn)行未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中G6PD活性的檢測。在一些實施方案中，在未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品的相同等分試樣上進(jìn)行G6PD活性的檢測和血液傳染性微生物的檢測。在一些實施方案中，血液傳染性微生物選自細(xì)菌、原生動物、霉菌、酵母、絲狀微真菌和病毒。在一些實施方案中，血液傳染性微生物是瘧疾的致病微生物。在一些實施方案中，瘧疾的致病微生物是屬于選自瘧原蟲屬(Plasmodium)、Polychromophilus、Rayella和蜥細(xì)胞蟲屬(Saurocytozoon)的原生動物屬的微生物。在一些實施方案中，瘧疾的致病微生物是屬于選自以下的亞屬的瘧原蟲微生物：Asiamoeba,Bennettinia,Carinamoeba,Giovannolaia,血變形蟲目(Haemamoeba),Huffia,Lacertamoeba,萊佛蘭原蟲(Laverania),Novyella,Paraplasmodium,瘧原蟲屬(Plasmodium),Sauramoeba,和Vinckeia。在一些實施方案中，瘧疾的致病微生物是選自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、諾氏瘧原蟲(Plasmodium knowlesi)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)和間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)的瘧原蟲微生物。

在本文公開的方法的一些實施方案中，未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中血液傳染性微生物的檢測包括測定特異于血液傳染性微生物的至少一種生物標(biāo)志物的水平或存在。在一些實施方案中，所述至少一種生物標(biāo)志物是特異于血液傳染性微生物的抗原。在一些實施方案中，抗原選自醛縮酶(pFBPA)、富含組氨酸的蛋白2(HRP-2)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(pHPRT)、乳酸脫氫酶(pLDH)和磷酸甘油酸酯變位酶(pPGM)。在一些實施方案中，血液傳染性微生物的檢測通過免疫測定進(jìn)行。在一些實施方案中，血液傳染性微生物的檢測通過夾心免疫測定進(jìn)行。在一些實施方案中，用于檢測血液傳染性微生物的免疫測定通過基于微粒的SERS納米標(biāo)簽免疫測定進(jìn)行。在一些實施方案中，用于檢測血液傳染性微生物的基于微粒的SERS納米標(biāo)簽免疫測定是均相免疫測定。在本公開內(nèi)容的各種實施方案中，血液傳染性微生物的檢測可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或其它夾心免疫測定例如基于珠的免疫測定進(jìn)行。

在一些實施方案中，在單一反應(yīng)混合物上同時進(jìn)行G6PD活性的檢測和血液傳染性微生物的檢測。在一些實施方案中，在單一反應(yīng)混合物上順序進(jìn)行G6PD活性的檢測和血液傳染性微生物的檢測。在一些實施方案中，將未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品分成樣品等分試樣，然后進(jìn)行G6PD活性的檢測和血液傳染性微生物的檢測。在一些實施方案中，在空間上分離的樣品等分試樣中進(jìn)行G6PD活性的檢測和血液傳染性微生物的檢測。

本文提供了用于檢測未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性的量的試劑盒，其包含(a)葡萄糖-6-磷酸(G6P)或適用于在未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中使用的G6P替代物；(b)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)或適用于在未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中使用的NADP⁺替代物。在一些實施方案中，本文提供的試劑盒進(jìn)一步包括用于制備促進(jìn)NADP⁺、G6P和G6PD酶在未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中的反應(yīng)的反應(yīng)混合物的說明書。在一些實施方案中，試劑盒還包括用于檢測血液傳染性微生物的免疫測定試劑。在一些實施方案中，未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品來自受試者。在一些實施方案中，受試者患有或疑似患有疾病。在一些實施方案中，所述受試者患有或疑似患有發(fā)熱性疾病。在一些實施方案中，所述疾病由血液傳染性微生物引起。在一些實施方案中，所述疾病是瘧疾。

在本文公開的方法或試劑盒的一些實施方案中，在進(jìn)行分析的血液樣品中，最終反應(yīng)混合物中全血或血液成分的濃度大于0.1％。在一些實施方案中，在進(jìn)行分析的血液樣品中，最終反應(yīng)混合物中全血或血液成分的濃度大于1％。在一些實施方案中，在進(jìn)行分析的血液樣品中，最終反應(yīng)混合物中全血或血液成分的濃度大于大于10％，大于20％，大于25％，大于50％，大于75％，大于80％，大于90％，大于99％，和任選地不大于80％、90％或99％。在一些實施方案中，在進(jìn)行分析的血液樣品中，最終反應(yīng)混合物中全血或血液成分的濃度為0.1％至95％，1％至95％，1％至68％，25％至99％，25％至95％，25％至70％，40％至80％，40％至68％，50％至95％，50％至68％，60％至95％，60％至80％，68％至95％，或68％至90％。在本文公開的方法或試劑盒的一些實施方案中，在進(jìn)行分析的血液樣品中，最終反應(yīng)混合物中的全血或血液成分的濃度是未稀釋或最低限度稀釋的。

前述發(fā)明概述僅是舉例說明性的并且不旨在以任何方式進(jìn)行限制。除了本文所描述的舉例說明性實施方案和特征之外，根據(jù)附圖和詳述和權(quán)利要求，本公開內(nèi)容的其它方面、實施方案、目的和特征將變得完全清楚。

附圖說明

圖1示出了將NADP⁺還原成NADPH以產(chǎn)生熒光信號的過程的實例。

圖2示出了來自與未稀釋血液樣品中的血液傳染性寄生微生物的診斷測定結(jié)合的檢測G6PD酶活性的整合測定法的實施方案的結(jié)果。正常或缺陷性G6PD活性的未稀釋的人血溶血產(chǎn)物對照(Trinity Biotech)用0ng/mL或150ng/mL的間日瘧原蟲(人中的寄生原生動物和瘧疾的致病體)的乳酸脫氫酶(pLDH)抗原加標(biāo)。在存在(150ng/mL；Vivax+)或不存在(0ng/mL；Vivax-)pLDH抗原的情況下測定G6PD酶活性水平(實心條)。使用SERS納米標(biāo)簽免疫測定法進(jìn)行瘧疾檢測測定(虛線條)，其中免疫測定試劑與捕獲抗體泛特異性pLDH抗體或特異于間日瘧原蟲pLDH抗原的檢測抗體綴合?！癮.u”代表任意單位。在所有樣品中血液濃度為9％(即90μL血液/1000μL總測定體積)。

圖3圖示總結(jié)了基于在315nm處NADPH的吸光度，利用當(dāng)產(chǎn)生NADPH時的分光光度測量的變化，測量血液樣品(9％)中G6PD酶活性水平的實驗的實施方案的結(jié)果。來自G6PD正常(G6PD正常)或G6PD缺陷性(G6PD缺陷)人血溶血產(chǎn)物對照樣品(Trinity Biotech)的未稀釋的血樣用0ng/mL或150ng/mL的間日瘧原蟲的乳酸脫氫酶(pLDH)抗原加標(biāo)。在pLDH抗原存在(150ng/mL；瘧疾+)或不存在(0ng/mL；瘧疾-)下測定G6PD酶活性水平。監(jiān)測315nm吸光度5分鐘，并計算該時間段內(nèi)OD的變化。

圖4圖示總結(jié)了在兩個示例性血液濃度下通過落射熒光光譜測定測量G6PD酶活性水平的實驗的實施方案的結(jié)果。該圖顯示了正常和缺陷活性溶血產(chǎn)物血液對照樣品的落射熒光G6PD酶數(shù)據(jù)。使用溶血的血液對照的測定分別以0.33％血液和9.0％血液收集。試劑濃度按照血液濃度成比例地調(diào)整。

圖5圖示說明在68％血液濃度下通過落射熒光光譜測定測量G6PD酶活性水平的實驗的實施方案的結(jié)果。正常、中等和缺陷活性的溶血的血液對照使用落射熒光法在68％血液處測試，并且能夠區(qū)分酶活性。增加測定試劑濃度以確保酶活性而不是試劑濃度是NADP⁺至NADPH的還原的限制因素。

圖6圖示說明在兩個示例性溫度下通過落射熒光光譜測定測量G6PD酶活性水平的實驗的實施方案的結(jié)果。圖6中所示的實驗在25℃和40℃下進(jìn)行，而上面圖4所示的實驗在18℃下進(jìn)行。

圖7A和7B總結(jié)了測量17種臨床血液樣品中G6PD酶活性水平的實驗的實施方案的結(jié)果。通過根據(jù)本文公開的方法在測定溶液中以9％血液的濃度利用落射熒光光譜測定測試(圖7A)或通過商業(yè)Trinity定量測試(圖7B)來測定G6PD活性。在該實驗中，還包括三種G6PD酶活性對照(缺陷，中等和正常)。在落射熒光數(shù)據(jù)中觀察到的負(fù)值被確定是由于用于測試的塑料比色皿的光漂白引起的，而不是生物現(xiàn)象。

圖8是來自154個未稀釋血液樣品的Trinity定量測試和落射熒光測試一致性的實驗的實施方案的圖示。實心三角形：>40％酶活性。實心圓：40-70％酶活性。實心方形：>70％酶活性。在落射熒光數(shù)據(jù)中觀察到的負(fù)值是由于用于測試的塑料比色皿的光漂白引起的，而不是生物現(xiàn)象。在Trinity定量測試中，相對于健康成年男性的報道的平均酶活性(其為7.17IU/g Hb)，將G6PD活性標(biāo)準(zhǔn)化。

圖9是來自154個未稀釋血液樣品的Trinity定量測試和落射熒光測試一致性的實驗的實施方案的圖示。通過(1)Trinity定量測試和(2)落射熒光測試，對每個樣品測定G6PD活性。根據(jù)以下四個方案分析數(shù)據(jù)。左上圖：Trinity定量測試和落射熒光測試均未通過單獨(dú)的血紅蛋白測量來標(biāo)準(zhǔn)化；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.896。右上圖：通過單獨(dú)的血紅蛋白測量對Trinity定量測試進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，而落射熒光測試不通過單獨(dú)的血紅蛋白測量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.968。左下圖：Trinity定量測試不通過單獨(dú)的血紅蛋白測量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，而落射熒光測試通過單獨(dú)的血紅蛋白測量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.671。右下圖：通過單獨(dú)的血紅蛋白測量標(biāo)準(zhǔn)化Trinity定量測試和落射熒光測試；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.893(在去除11.73IU/g Hb的單個離群值時，Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.935)。在落射熒光數(shù)據(jù)中觀察到的負(fù)值被確定是由于用于測試的塑料比色皿的光漂白引起的，而不是生物現(xiàn)象。

詳述

本公開內(nèi)容一般涉及用于分析血液樣品的方法、組合物和試劑盒。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容特別涉及作為用于血液樣品中血液傳染性微生物的存在的免疫測定測試的一部分或與其結(jié)合的用于測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的酶活性的方法、組合物和試劑盒。

在下面的詳述中，參考在本文中形成一個部分的附圖。在詳述、附圖和權(quán)利要求中描述的舉例說明性實施方案不意味著是限制性的。在不脫離本文所提出的主題的精神或范圍的情況下，可以使用其它實施方案，并且可以進(jìn)行其它改變。將容易地理解，如在此一般性描述的和在附圖中示出的，本公開內(nèi)容的實施方案可以以各種各樣的不同配置來布置、替換、組合和設(shè)計，所有這些都被明確地設(shè)想并且構(gòu)成本公開內(nèi)容的一部分。

除非另有明確定義，否則本文使用的所有專門術(shù)語、符號和其它科學(xué)術(shù)語或用辭旨在具有本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容閱讀時通常理解的含義。

A.一些定義

除非上下文另有明確說明，否則單數(shù)形式“一”、“一個/一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代。例如，術(shù)語“一個/一種細(xì)胞”包括一個或多個/一種或多種細(xì)胞，包括其混合物。如本文所使用的，術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)所列項目的任何和所有組合。因此，本文使用的“A和/或B”包括所有以下實施方案：“A”，“B”，“A或B”和“A和B”。還應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在本文中使用時，諸如“包括”、“包含”和/或“含有”的術(shù)語指定所述特征、整數(shù)、步驟、操作、元件和/組件的存在，但不排除一個或多個其它特征、整數(shù)、步驟、操作、元件、組件和/或其群組的存在或添加。因此，所述術(shù)語包括術(shù)語“基本上由...組成”和“由...組成”。

“約”具有其普通含義為大約。如果從上下文中不能另外地明確近似程度，則“約”意指在所有情況下在所提供的值的正或負(fù)10％內(nèi)，或四舍五入到最接近的有效數(shù)字(在所有情況下包括所提供的值)。在提供范圍的情況下，它們包括邊界值。

如本文所使用的，術(shù)語“抗原”是指蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、脂質(zhì)或其它物質(zhì)，其與對其一部分具有特異性的抗體反應(yīng)

術(shù)語“生物樣品”和“測試樣品”是指從任何給定的一個或多個受試者分離的所有生物流體和排泄物。在本公開內(nèi)容的上下文中，這樣的樣品包括但不限于血液，血清，血漿，乳頭抽吸物，尿，精液，精液流體，精漿，前列腺液，排泄物，眼淚，唾液，汗液，活組織檢查，腹水，腦脊液，乳，淋巴，支氣管和其它灌洗樣品，或組織提取物樣品。如本文所用，“血液樣品”包括全血、血漿或血清。通常，全血是在本公開內(nèi)容的上下文中使用的優(yōu)選的測試樣品。

如本文所用，“稀釋劑”是指僅為了稀釋樣品的目的而添加到樣品中的組分，并且不是指添加到混合物中用于分析樣品的試劑(例如抗體，葡萄糖-磷酸(G6P)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)等)。

本文所用的短語“最低限度稀釋”包括完全未稀釋(即未稀釋的)或未顯著稀釋的血液樣品?！白畹拖薅认♂尅焙w具有為稀釋樣品之外的分析目的而添加到樣品中的一種或多種試劑的樣品。例如，在一些實施方案中，最低限度稀釋的樣品具有包含葡萄糖-6-磷酸(G6P)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)或包括添加至樣品的抗體或抗體綴合物的免疫測定試劑的溶液。為了分析目的而添加到樣品中而非用于稀釋樣品的試劑的非限制性實例包括具有效用例如細(xì)胞裂解、pH緩沖、穩(wěn)定劑、抗凝血劑、阻斷不希望的非特異性結(jié)合等的緩沖劑組分。就添加試劑稀釋樣品這一點(diǎn)上(如果有的話)，當(dāng)樣品是“最低限度稀釋”時，這種稀釋對所進(jìn)行的分析沒有顯著影響。因此，在一些實施方案中，本文公開的方法和組合物中使用的試劑包括抗凝劑(例如EDTA，肝素)，并且在一些情況下包括等容球化劑或聚集劑。

此外，在某些情況下(例如，非常快速的分析)，可能不需要添加抗凝血劑，但是在大多數(shù)情況下優(yōu)選這樣做以確保樣品是可接受用于分析的形式。在這方面，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，盡管在本文公開的方法中使用的全血樣品可以是未稀釋的或最低限度稀釋的，但如果需要，可以發(fā)生一定程度的稀釋。這是因為在方法的實踐中，可能希望以液體而不是固體形式加入試劑例如抗凝劑。如本文所述的抗凝全血可以通過在將全血加入到反應(yīng)混合物之前向全血中加入抗凝劑來制備，或者可以在將血液加入到反應(yīng)混合物之前或之后將抗凝劑加入到反應(yīng)混合物中。

無論為分析而添加的試劑的數(shù)量如何，如本文所使用的，“最低限度稀釋”是指進(jìn)行分析的最終反應(yīng)混合物中的全血或血液成分的最終濃度大于0.1％，大于1％，大于5％，大于10％，優(yōu)選大于20％。在一些實施方案中，最低限度稀釋的血液樣品的最終濃度大于20％，大于25％，大于30％，優(yōu)選大于35％，優(yōu)選大于55％，優(yōu)選大于60％，優(yōu)選大于65％。在一些實施方案中，最低限度稀釋的血液樣品的最終濃度大于60％，大于65％，大于70％，優(yōu)選大于75％，優(yōu)選大于80％，優(yōu)選大于85％，優(yōu)選大于90％。在一些實施方案中，最低限度稀釋的血液樣品的最終濃度大于95％、98％、99％或為100％(未稀釋)。在任何這些實施方案中，最終濃度也可以不大于50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或99％。因此，在一些實施方案中，最終濃度在由任何前述下限和上限限定的范圍內(nèi)。例如，在一些實施方案中，最終濃度為0.1％至99％，50％至99％，50％至80％，50％至70％，60％至99％，60％至80％，70％至95％等。

雖然優(yōu)選使用未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品，但使用稀釋的血液樣品也是可以考慮的。因此，可以考慮在本文公開的方法、組合物和試劑盒的一些實施方案中，“未稀釋的”或“最低限度稀釋的”血液樣品可以是血液樣品，其被合適的稀釋劑稀釋，以使得在進(jìn)行分析的最終反應(yīng)混合物中的全血或血液成分的濃度小于80％，50％，25％，5％，1％或0.1％。

如本文所使用的，術(shù)語“落射熒光檢測”、“落射熒光光譜學(xué)”、“落射熒光光譜測定”和“落射熒光照明”是指熒光檢測技術(shù)，其中照明(也稱為“激發(fā)光”)和發(fā)射光行進(jìn)通過相同的物鏡。在一些實施例中，光源可以相對于樣品樣本安裝，以使得激發(fā)光在其朝向樣本的路徑上穿過物鏡，并且發(fā)射光在其朝向檢測器的路徑上穿過物鏡。在一些實施方案中，通過反射或吸收激發(fā)光但將發(fā)射光傳送到檢測器的濾光器和/或二向色鏡使激發(fā)光不能到達(dá)檢測器。在一些實施方案中，使用修改的類落射熒光構(gòu)造，其中激發(fā)光和發(fā)射光行進(jìn)通過兩個單獨(dú)的物鏡。

術(shù)語“瘧疾”是指在許多動物受試者(包括鳥類、爬行動物、人和非人靈長類動物)中發(fā)現(xiàn)的本領(lǐng)域公認(rèn)的感染性疾病，稱為“瘧疾”病癥，其由瘧原蟲屬、Fallisia或蜥細(xì)胞蟲屬的原生動物引起。存在超過100種瘧疾致病微生物物種，其中22種感染非人類靈長類動物，82種是爬行動物和鳥類致病性的。在人類中，術(shù)語瘧疾通常與瘧疾發(fā)熱或沼澤熱可互換使用，是指通常由瘧原蟲屬的寄生蟲(例如惡性瘧原蟲，諾氏瘧原蟲，三日瘧原蟲，卵形瘧原蟲或間日瘧原蟲)引起的感染性疾病。這種寄生蟲通常通過雌性按蚊屬蚊子、感染的血液輸注或經(jīng)胎盤傳播。瘧原蟲寄生蟲侵入并消耗其宿主的紅血細(xì)胞，這導(dǎo)致包括發(fā)燒、貧血的癥狀，在嚴(yán)重的情況下，引起可能導(dǎo)致死亡的昏迷。

術(shù)語“瘧疾診斷抗體”是指能夠結(jié)合與瘧疾寄生蟲感染特異性相關(guān)的蛋白質(zhì)的任何抗體，例如，特異性結(jié)合瘧原蟲乳酸脫氫酶(LDH)多肽的抗pLDH抗體。

如本文所使用的術(shù)語“微生物”具有其在本領(lǐng)域中的常規(guī)含義，并且包括但不限于細(xì)菌、絲狀微真菌、原生動物、酵母、霉菌和病毒。如本文所使用的，“血液傳染性微生物”旨在包括可在血液中發(fā)現(xiàn)的任何微生物。因此，術(shù)語“血液傳染性微生物”包括可導(dǎo)致人類疾病的血液傳染性病原體。當(dāng)通過血液或其它潛在感染的體液從感染者轉(zhuǎn)移到另一個人時，血液傳染性病原體可引起疾病。因此，血液傳染性病原體包括但不限于乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，西尼羅河病毒，瘧疾和梅毒的致病微生物。

如本文所使用的術(shù)語“信號”可以指任何可檢測的參數(shù)。這些參數(shù)的實例包括光學(xué)、電或磁參數(shù)，電流，熒光發(fā)射，紅外發(fā)射，化學(xué)發(fā)光發(fā)射，紫外發(fā)射，光發(fā)射，以及任何上述的吸光度。例如，信號可以以沿著測定裝置的診斷通道的強(qiáng)度相對距離的方式表達(dá)。在另一實例中，可以以強(qiáng)度或強(qiáng)度相對時間的方式來表達(dá)信號。術(shù)語“信號”還可以指缺少可檢測的物理參數(shù)。

如本文所使用的，術(shù)語“受試者”是指動物，包括哺乳動物，優(yōu)選人，其是根據(jù)本文所述的方法測定的血液樣品的來源。根據(jù)本文公開的方法的一些實施方案，術(shù)語“哺乳動物”包括人和非人類，包括但不限于人，非人靈長類動物，犬，貓，鼠，牛，馬和豬。因此，如本文所用，動物可包括家畜和農(nóng)場動物，動物園動物，運(yùn)動或?qū)櫸飫游?，例如鳥，狗，馬，貓，牛，豬，綿羊等。在一些實施方案中，術(shù)語“受試者”是指馴養(yǎng)的非哺乳動物，其中犬，貓，雞，家禽和小爬行動物是最優(yōu)選的。在一些實施方案中，未稀釋的血液樣品優(yōu)選來源于哺乳動物，最優(yōu)選來自人受試者。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，出于任何和所有目的，例如在提供書面描述方面，本文公開的所有范圍還包括其任何和所有可能的子范圍及其子范圍的組合。任何列出的范圍可以容易地被認(rèn)為是充分地描述和實現(xiàn)被分解為至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等的相同范圍。作為非限制性示例，本文討論的每個范圍可以容易地分解為下三分之一，中三分之一和上三分之一。如本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解的，諸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有語言包括所列舉的數(shù)值，并且是指可以隨后分解成如上所述的子范圍的范圍。最后，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，范圍包括每個單獨(dú)的成員。因此，例如，1-3的范圍至少指值1、2或3。類似地，例如具有1-5個物品的組是指具有1、2、3、4或5個物品的組，以此類推。

B.檢測血液樣品中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性

G6PD酶催化葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時將氧化形式的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)還原成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。所產(chǎn)生的NADPH在反應(yīng)期間將在長波UV光(例如340nm激發(fā)/460nm發(fā)射)下發(fā)熒光。圖1示出了將NADP⁺還原為NADPH以產(chǎn)生熒光信號的過程100的實例。當(dāng)葡萄糖-6-磷酸被氧化成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯時，輔酶NADP⁺被還原成NADPH，伴隨相應(yīng)的熒光提高。

本公開內(nèi)容方法的特別的優(yōu)點(diǎn)是，所述方法使得能夠測量樣品中特別是在未稀釋或最低限度稀釋(在最大1000倍的范圍內(nèi)，特別是小于或等于2倍)的全血樣品中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性。

因此，在一些實施方案中，本公開內(nèi)容提供了檢測在未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性的方法。這樣的方法包括例如從受試者、護(hù)士、醫(yī)師或?qū)嶒炇壹夹g(shù)人員獲得或接收未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品，并檢測未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中存在的G6PD活性。在這樣的方法中，檢測G6PD活性包括對未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品執(zhí)行落射熒光光譜學(xué)，以測量G6PD酶將NADP⁺還原為NADPH的速率。

在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，全血樣品可以通過大于1:1000，大于1:100，大于1:20；大于1:10；大于1:5；大于1:1；大于2:1；大于3:1；優(yōu)選大于4:1；優(yōu)選大于5:1；優(yōu)選大于10:1；優(yōu)選大于25:1；更優(yōu)選大于50:1；更優(yōu)選大于80:1；更優(yōu)選大于90:1；和最優(yōu)選大于100:1的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約100:1至75:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，全血樣品可以通過在約1:20至1:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，全血樣品可以通過在約1:1至10:1的范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，全血樣品可以通過在約10:1至25:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，全血樣品可以通過在約20:1至75:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約75:1至100:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約50:1至100:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約25:1至100:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約20:1至100:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約10:1至100:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約10:1至75:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，為了測定G6PD活性，血液樣品可以通過在約20:1至50:1范圍內(nèi)的血液/稀釋劑比率來稀釋。在一些實施方案中，對在經(jīng)歷G6PD活性分析之前未被任何稀釋劑稀釋的全血樣品進(jìn)行G6DP活性的檢測。

在一些實施方案中，G6PD活性的檢測包括直接對血液樣品進(jìn)行落射熒光檢測，所述血液樣品優(yōu)選是最低限度稀釋的。落射熒光檢測(利用透鏡向樣品遞送激發(fā)照明并收集發(fā)射的熒光)提供了一種方法以光學(xué)方式降低有效光路長度，從而允許酶測定在免疫測定所需的升高的血液負(fù)荷下運(yùn)行。通常，較高強(qiáng)度的激發(fā)光用于激發(fā)樣品中的熒光分子，從而使熒光分子發(fā)射熒光。激發(fā)光具有比發(fā)射光更高的能量或更短的波長。在一些實施方案中，二向色鏡或帶通或長通濾光器可以任選地用于在記錄信號之前減少散射的激發(fā)光。

在一些實施方案中，G6PD酶活性的檢測可以通過落射熒光方法進(jìn)行，其中使用二向色分束器和高數(shù)值孔徑透鏡來有效地縮短光路長度，而不是需要更靈敏的檢測器(與測量標(biāo)準(zhǔn)比色皿中高度稀釋樣品的吸光度所需的檢測器靈敏度相比)或短光路長度的一次性測定管、比色皿等。與基于吸光度的儀器測試相比，附加的光學(xué)器件僅增加少量的儀器成本，并且該方法不會對一次性測定管施加嚴(yán)格的短光路長度要求，從而與短光路長度一次性用品相比降低了一次性用品的成本。此外，這種落射熒光方法允許測量高達(dá)60％、65％、68％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的濃度(這是指最終測定中的血液濃度-例如，68％的血液濃度對應(yīng)于每1000μL總測定體積中680μL全血)并且在一些情況下更高的濃度的血液中的G6PD酶活性。這是特別有益的，因為較高濃度可以增加存在的用于免疫測定的靶的濃度，以及通過降低樣品稀釋的要求提供簡化的工作流程。

在一些實施方案中，可通過落射熒光方法進(jìn)行G6PD酶活性的檢測，其中使用利用LED進(jìn)行照明的儀器，分離激發(fā)光和發(fā)射光的二向色分束器，將激發(fā)光聚焦在樣品上并收集來自樣品的發(fā)射光的透鏡，以及標(biāo)準(zhǔn)硅光電二極管檢測器。另外，在一些實施方案中，儀器將包含溫度監(jiān)視器。

另外或可選地，在一些實施方案中，可以通過衰減全反射(ATR)方法進(jìn)行G6PD酶活性的檢測。在ATR方法中，入射光在測定容器和測定溶液的界面處反射至少一次或可選擇地多次。當(dāng)這種情況發(fā)生時，一些入射光以消逝波的形式透過界面進(jìn)入測定溶液。使得光在管和測定溶液界面之間經(jīng)歷多次反射的配置增加了激發(fā)光與樣品相互作用的次數(shù)，潛在地增加了測量的熒光信號。與落射熒光類似，通過使用光學(xué)裝置這些方法可以用于獲得非常短的光路長度，其精確長度由光的波長、測定管和測定溶液的折射率以及激發(fā)光的入射角決定。這些方法還可用于測量吸光度而非熒光信號。

在一些實施方案中，血液樣品中G6PD活性的檢測包括測量直接或間接對應(yīng)于血液樣品中NADP⁺至NADPH的酶促轉(zhuǎn)化的信號，優(yōu)選其中樣品是未稀釋或最低限度稀釋的。本文使用的術(shù)語“信號”可以指任何可檢測的參數(shù)。

C.血液傳染性微生物

在一些實施方案中，本文公開的用于檢測血液樣品(優(yōu)選是未稀釋或最低限度稀釋的)中G6PD活性的方法和組合物可以作為檢測血液樣品中的血液傳染性微生物的診斷方法的一部分或與其結(jié)合進(jìn)行。在一些實施方案中，血液傳染性微生物的檢測在已稀釋的血液樣品上進(jìn)行。在一些實施方案中，血液傳染性微生物的檢測在尚未稀釋即未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品上進(jìn)行。原則上，本文公開的方法和組合物可用于診斷檢測和鑒定任何血液傳染性微生物物種，包括但不限于細(xì)菌，原生動物，霉菌，酵母，絲狀微真菌和病毒。所述方法和組合物優(yōu)選在對健康相關(guān)的病癥和疾病重要或有趣的血液傳染性微生物中使用。如本文所使用的血液傳染性微生物是可以通過血液和其它體液的污染傳播的微生物。在一些實施方案中，本文公開的組合物和方法可優(yōu)選用于檢測通常不通過血液接觸直接傳播而是通過昆蟲或其它載體傳播的微生物物種，因此也被分類為載體傳染性微生物，即使可在血液中發(fā)現(xiàn)致病體。載體傳染性微生物的非限制性實例包括西尼羅河病毒和瘧疾。許多血液傳染性微生物也可以通過其它方式(包括經(jīng)胎盤傳播，高危性活動或靜脈吸毒)傳播。

因此，在一些實施方案中，如本文公開的檢測血液樣品中G6PD酶活性的組合物和方法可以用作血液樣品中一種或多種血液傳染性致病微生物的檢測和/或鑒定的一部分或與其結(jié)合使用?？蛇m當(dāng)檢測的血液傳染性病原微生物的非限制性實例包括例如來自以下屬的任何微生物，所述屬包括但不限于乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，西尼羅河病毒，瘧疾、登革熱、傷寒和梅毒的致病微生物。

在一些實施方案中，檢測和/或鑒定的細(xì)菌致病性物種在以下的屬范圍內(nèi)，所述屬包括但不限于任何芽孢桿菌屬物種，包括炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)；任何鏈球菌屬(Streptococcus)物種，包括肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)，釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)，輕型鏈球菌(Streptococcus mitis)；任何葡萄球菌屬(Staphylococcus)物種，包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和葡萄球狀葡萄球菌(Staphylococcus staphylococci)；任何沙雷氏菌屬(Serratia)物種，包括粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)；任何克雷伯菌/腸桿菌屬(Klebsiella/Enterobacter)物種，包括糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，屎腸球菌(Enterococcus faecium)和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)和流產(chǎn)布魯桿菌(Brucella abortus)的物種也是合適的。

在一些實施方案中，本文公開的組合物和方法優(yōu)選用于檢測和/或鑒定在無形體(Anaplasma)、巴貝蟲(Babesia)、巴爾通體(Bartonella)、埃里希氏體(Ehrlichia)、利什曼原蟲(Leishmania)、支原體(Mycoplasma)和立克次體(Rickettsia)的屬的范圍內(nèi)的血液傳染性生物體。適用于本公開內(nèi)容的方法、組合物和試劑盒的示例性血液傳染性生物體包括但不限于嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasma phagocytophilum)，博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)，漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)，Bartonella washoensis，Ehrlihicha canis，肩板硬蜱(Ixodes scapularis)，Ixodes pacificus，立氏立克次體(Rickettsia rickettsii)。被檢測和/或鑒定的其它示例性細(xì)菌病原性物種是原生動物寄生蟲，例如錐蟲屬(Trypanosoma)的種，例如引起查加斯病或美國昏睡病的克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)，以及引起非洲錐蟲病的布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)。

在一些實施方案中，本文公開的組合物和方法優(yōu)選用于檢測和/或鑒定瘧疾的致病微生物。特別優(yōu)選的是屬于選自瘧原蟲屬、Polychromophilus、Rayella和蜥細(xì)胞蟲屬的寄生原生動物屬的瘧疾致病微生物。在一些實施方案中，特別適用于本文公開的方法和組合物的瘧原蟲屬物種包括巴西瘧原蟲(P.brasilianum)，食蟹獼猴(P.cynomolgi)，P.cynomolgi bastianellii，P.eylesi，惡性瘧原蟲(P.falciparum)，猴瘧原蟲(P.inui)，諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)，P.osmani，卵形瘧原蟲(P.ovale)，P.rhodiani，P.schweitzi，P.semiovale，P.shortii，P.simium和間日瘧原蟲(P.vivax)。在一些特別優(yōu)選的實施方案中，瘧疾的致病微生物選自惡性瘧原蟲，卵形瘧原蟲，諾氏瘧原蟲，卵形瘧原蟲和間日瘧原蟲。

D.免疫測定

在一些實施方案中，血液樣品中G6PD活性的檢測和血液傳染性微生物的檢測可以通過一種或多種免疫測定技術(shù)進(jìn)行。特異性結(jié)合前述致病微生物的抗體是本領(lǐng)域熟知的，是可商購的，或可以使用本領(lǐng)域已知的任何一種方法產(chǎn)生。參見，例如，Harlow等人，同上，1988；和Harlow等人，同上，1999。特異性結(jié)合血液傳染性致病微生物的抗體是本領(lǐng)域熟知的，并且包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體；人抗體，人源化抗體，抗體片段例如Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、合成抗體等。此外，大量特異性結(jié)合NADPH的抗體是本領(lǐng)域已知的，并且是可商購的(來自例如Abbexa，Biorbyt，St John's Laboratory)。

在一些實施方案中，依賴于顆粒(例如磁性顆粒)的許多免疫測定法特別適用于根據(jù)本文公開的方法、組合物和試劑盒診斷檢測微生物物種?；谖⒘５拿庖邷y定通常分為兩個主要類別：均相(無分離)和多相測定。

在一些實施方案中，G6PD活性的檢測和/或血液傳染性微生物的檢測是以均相(無分離)測定形式進(jìn)行的，其中將結(jié)合反應(yīng)物混合和測量，其中在檢測之前沒有任何后續(xù)洗滌步驟。這樣的系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是快速的溶液-相動力學(xué)、簡單的測定形式、更簡單的儀器使用以及由于更少的測定步驟、低體積和低浪費(fèi)而降低成本。均相免疫測定不需要結(jié)合和游離的分析物的物理分離，因此可以比異源免疫測定更快更容易地進(jìn)行。使用小樣品尺寸、低試劑體積和短孵育時間的均相免疫測定系統(tǒng)提供快速的周轉(zhuǎn)時間。均相測定是在高通量篩選平臺例如AlphaScreen、SPA、基于熒光偏振和流式細(xì)胞術(shù)的測定中以及在診斷測定例如以濁度法或比濁法作為檢測方法的顆粒凝集測定中使用的優(yōu)選測定形式。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地理解，可以在單個血液樣品內(nèi)檢測和/或鑒定一種或多種微生物。在一些實施方案中，在相同樣品中依次進(jìn)行兩種或更多種微生物的檢測。在一些實施方案中，在相同樣品中平行進(jìn)行兩種或更多種微生物的檢測。

在一些實施方案中，本文公開的方法包括使用光學(xué)活性指示劑顆粒例如表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)活性納米顆粒的均相免疫測定技術(shù)。拉曼散射是其中激發(fā)光產(chǎn)生具有比典型熒光光譜窄得多的特征的分子的指紋樣振動光譜的光學(xué)現(xiàn)象。可以使用單色或接近單色的遠(yuǎn)紅外或近紅外光(光子能量通常太低而不能激發(fā)生物樣品中的固有背景熒光)激發(fā)拉曼散射。由于拉曼光譜通常覆蓋從300-3500cm^-1的振動能量，可以使用單個光源在單次測量中測量和區(qū)分十幾個(或更多個)標(biāo)簽。此外，在SERS中，非常接近貴金屬表面(金，銀銅)上的納米級粗糙特征的分子在散射效率中產(chǎn)生百萬倍至萬億倍的增加，稱為增強(qiáng)因子(EF)。關(guān)于用于檢測各種類型的樣品中的微生物的SERS-納米標(biāo)簽測定法的合適方法、系統(tǒng)和裝置的進(jìn)一步信息可以在例如Mulvaney等人.Langmuir 19:4784-4790,2003；Modern Techniques in Raman Spectroscopy,John Wiley&Sons Ltd,Chichester,1996；Analytical Applications of Raman Spectroscopy,Blackwell Science Ltd,Malden,Mass.1999；PCT專利公開號WO 2013165615A2,美國專利公開號20120164624A1,和美國專利號6,514,767(其內(nèi)容通過引用整體并入本文)中找到。通常，每個SERS-納米顆粒與對一種或多種感興趣的微生物具有親和性的一種或多種特異性結(jié)合成員(例如抗體)結(jié)合，并因此可以與血液樣品中的特定微生物形成復(fù)合物。因此，光學(xué)活性指示劑顆粒可以是能夠產(chǎn)生可在血液樣品中檢測而無需洗滌步驟的光學(xué)信號的任何顆粒。此外，還與對一種或多種感興趣微生物具有親和力的一種或多種特異性結(jié)合成員(其可以與與指示劑顆粒結(jié)合的特異性結(jié)合成員相同或不同)結(jié)合的磁性捕獲顆?？捎糜诓东@微生物指示劑顆粒復(fù)合物并將復(fù)合物濃縮在測定容器的局部區(qū)域中用于隨后的檢測。在一些實施方案中，可以在其中發(fā)生微生物的活性生長的樣品中進(jìn)行微生物的“實時”檢測和鑒定。在一些實施方案中，均相免疫測定可以以生物含有的方式進(jìn)行，而不使用戶或環(huán)境暴露于樣品(“封閉系統(tǒng)”)，并且可以通過監(jiān)測隨著培養(yǎng)進(jìn)展的時間推移的測定信號來提供連續(xù)不停的自動的微生物檢測和鑒定。檢測和鑒定與微生物培養(yǎng)的組合可以導(dǎo)致更早獲得可行的結(jié)果。

在本文公開的方法的一些實施方案中，捕獲顆粒與抗體綴合以從血液樣品捕獲感興趣的抗原，例如pLDH抗原。檢測顆?？梢允侨绫疚乃龅腟ERS-納米標(biāo)簽顆粒，其也與對感興趣的抗原(例如pLDH抗原)具有結(jié)合親和力的檢測抗體綴合。SERS納米標(biāo)簽包括如本文所述的拉曼報道分子。在感興趣的抗原的存在下，捕獲顆粒和檢測顆粒結(jié)合以形成由一種或多種捕獲顆粒和一種或多種檢測劑顆粒組成的SERS活性免疫復(fù)合物。使用SERS納米標(biāo)簽的均相免疫測定提供作為檢測標(biāo)簽的至少三個固有優(yōu)點(diǎn)。(1)它們可以在近紅外激發(fā)，因此與全血測量兼容。(2)SERS納米標(biāo)簽通常使光漂白最小化，這允許更高的激光功率和更長的數(shù)據(jù)采集時間，從而導(dǎo)致更靈敏的測量。(3)目前存在大量不同的標(biāo)簽，使得能夠?qū)崿F(xiàn)高度多重化測定。

在一些實施方案中，根據(jù)本公開內(nèi)容的血液傳染性微生物的檢測可以直接或間接進(jìn)行。對于在培養(yǎng)物中生長的微生物的直接檢測，與磁性捕獲顆粒和指示劑顆粒相結(jié)合的特異性結(jié)合成員可以對大部分完整的微生物具有親和力(例如通過結(jié)合到微生物的表面)。對于間接檢測，與磁性捕獲顆粒和指示劑顆粒結(jié)合的結(jié)合成員可以對微生物的副產(chǎn)物具有親和力。副產(chǎn)物的實例可以包括但不限于分泌的蛋白質(zhì)、毒素和細(xì)胞壁組分。在一些實施方案中，可以單獨(dú)和/或獨(dú)立地使用直接和間接檢測模式。在一些實施方案中，可以組合使用直接和間接檢測模式。

此外或可選地，G6PD活性的檢測和/或血液傳染性微生物的檢測可以以多相免疫測定形式進(jìn)行，其需要分離游離分析物和未結(jié)合的檢測劑，并且在某些情況下可以比均相測定更為通用。洗滌或物理分離步驟消除大多數(shù)干擾物質(zhì)，并且通常不干擾檢測/定量步驟。逐步多相測定是可能的，其允許更大的樣本大小，其進(jìn)而提高靈敏度并產(chǎn)生比標(biāo)準(zhǔn)測定曲線更寬的動態(tài)范圍。可用于以多相免疫測定形式檢測微生物的方法、系統(tǒng)、試劑和裝置是本領(lǐng)域已知的。許多當(dāng)前可用的臨床分析儀使用磁性微粒進(jìn)行多相診斷測定，以便選擇性地結(jié)合并隨后借助磁場將感興趣的分析物從其周圍基質(zhì)中分離(The Immunoassay Handbook,Nature Publ.,London,2001)?；谶@種形式的示例性分析儀包括來自Bayer Diagnostics的和Bayer Immuno 1^TM，來自Beckman Coulter的和來自Roche Diagnostics的

E.生物標(biāo)志物

本文公開的實施方案涉及用于檢測血液樣品，優(yōu)選未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中的G6PD活性的方法，其中所述G6PD檢測作為用于檢測血液樣品中血液傳染性微生物的診斷方法的一部分或與其結(jié)合進(jìn)行。在優(yōu)選的實施方案中，G6PD活性的測定和用于檢測血液傳染性微生物的診斷方法均是在未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中進(jìn)行的。

本公開內(nèi)容提供了一種或多種生物標(biāo)志物給出個體中瘧疾狀態(tài)的指示的用途，和/或其還可以用于評估適于這樣的個體的治療類型。在一些實施方案中，所述至少一種生物標(biāo)志物是血液傳染性微生物的抗原，其選自次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(pHPRT)，磷酸甘油酸酯變位酶(pPGM)，14-3-3蛋白，熱休克蛋白86，熱休克70kDa蛋白，QF122抗原，烯醇化酶，核糖體磷酸蛋白P0，液泡ATP合成酶催化亞基a，延長因子1α，增殖細(xì)胞核抗原，核糖核苷-二磷酸還原酶大亞基，丙糖磷酸異構(gòu)酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Rab l，熱激蛋白信號肽，PfmpC 1TM螺旋，高遷移率族蛋白，伴侶蛋白cpn60線粒體前體和肌動蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，生物標(biāo)志物選自乳酸脫氫酶，富含組氨酸的蛋白II和pHPRT，

在一些實施方案中，優(yōu)選地，任何生物標(biāo)志物的存都指示/診斷受試者患有瘧疾。在一些實施方案中，如果在血液樣品中發(fā)現(xiàn)一種或多種生物標(biāo)志物存在，則本文公開的方法可以包括推斷受試者患有瘧疾的另一步驟。在一些實施方案中，本文公開的方法可以進(jìn)一步包括將一種或多種生物標(biāo)志物的水平與一種或多種預(yù)定參考值進(jìn)行比較的步驟。在一些實施方案中，可以將一種或多種生物標(biāo)志物的水平與對照樣品，優(yōu)選非感染樣品中的水平進(jìn)行比較，以允許所使用的測試方法中的任何不準(zhǔn)確或背景。

本文公開的方法可用于例如以下的任何一種或多種：診斷瘧疾；就瘧疾患者的預(yù)后提供建議；監(jiān)測疾病進(jìn)展；以及監(jiān)測受試者對特定治療的有效性或反應(yīng)。

與本文公開的瘧疾的檢測組合的用于檢測血液樣品優(yōu)選未稀釋或最低限度稀釋的樣品中的G6PD活性的整合方法可以與臨床癥狀的評估結(jié)合使用，以提供更有效的瘧疾診斷。

F.試劑盒

本文公開的方法可以例如通過利用試劑盒進(jìn)行。本公開內(nèi)容還涉及用于檢測血液樣品中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性的量的試劑盒，優(yōu)選其中所述樣品是未稀釋的或最低限度稀釋的。在一些實施方案中，所述試劑盒包含適當(dāng)包裝的試劑以進(jìn)行本文公開的一種或多種方法，以及任選地可包括以下一種或多種的書面材料：使用說明書，臨床研究的討論，副作用列表，等等。在一些實施方案中，試劑盒包含葡萄糖-6-磷酸(G6P)或G6P替代物；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)；和任選地用于制備促進(jìn)血液樣品中(優(yōu)選未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品中)的NADP⁺、G6P和G6PD的反應(yīng)的反應(yīng)混合物的說明書。在一些實施方案中，試劑盒可以進(jìn)一步包含用于制備促進(jìn)NADP⁺、G6P和G6PD的反應(yīng)的反應(yīng)混合物的緩沖劑和表面活性劑。在一些實施方案中，試劑盒可以進(jìn)一步包含酶變性劑。在一些實施方案中，試劑盒還包含用于制備使用落射熒光光譜學(xué)或檢測分析的樣品的說明書。在另外的實施方案中，試劑盒還包含校準(zhǔn)曲線，其包括NADPH濃度相對吸光度或熒光信號的圖。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒的組分適用于未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品。適用于未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品可包括增加的濃度或體積的G6P和NADP⁺試劑、緩沖劑組分例如裂解或穩(wěn)定劑等。

緩沖劑和/或表面活性劑可以以干燥形式或液體形式提供在容器中。適用于測量G6PD活性的示例性緩沖劑和表面活性劑是本領(lǐng)域已知的，并且在本文中提供于實施例中。緩沖劑通常以至少足以在混合物中產(chǎn)生特定pH的量存在于試劑盒中。在一些實施方案中，緩沖劑作為具有預(yù)選的pH和緩沖劑濃度的儲備溶液提供。在一些實施方案中，還在試劑盒中提供酸和/或堿，以將反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)至所需的pH。試劑盒可以另外包括一種或多種稀釋劑，例如適用于本文公開的一種或多種方法的溶劑。試劑盒可另外包括對酶活性有益的其它組分，例如鹽(例如KCl，NaCl或NaOAc)，金屬鹽(例如Ca₂⁺鹽例如CaCl₂,MgCl₂,MnCl₂,ZnCl₂,或Zn(OAc)，和/或可用于G6PDH酶的其它組分。這些其它組分可以彼此分開提供或以干燥或液體形式混合在一起。在一些實施方案中，試劑盒還包含一次性比色皿。在一些實施方案中，比色皿預(yù)先填充有合適的試劑，包括以下的一種或多種：NADP⁺，G6PD，NaCl，Tris，Triton-X，EDTA，和/或其它緩沖劑，細(xì)胞裂解試劑，或穩(wěn)定化組分。在優(yōu)選實施方案中，試劑盒的組分適用于本文公開的未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品。

可以以干燥或液體形式，與緩沖劑一起或與緩沖劑分開地提供試劑，例如葡萄糖-6-磷酸(G6P)和/或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)。為了促進(jìn)在反應(yīng)混合物中的溶解，可以在與反應(yīng)混合物的其它組分混溶的水溶液、部分水溶液或非水儲備溶液中提供試劑(例如G6P和/或NADP⁺)。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒的組分適用于本文公開的未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品。

在一些實施方案中，試劑盒還包含使用說明書。例如，試劑盒可以包含用于制備促進(jìn)NADP⁺、G6P和G6PD酶的反應(yīng)的反應(yīng)混合物的說明書。在一些實施方案中，試劑盒包含預(yù)先制備的校準(zhǔn)圖，其將允許用戶基于使用用于檢測的落射熒光光譜法和/或吸光度測量確定的NADPH的產(chǎn)生量或產(chǎn)生速率來確定樣品中的G6PD活性。例如，預(yù)先制備的校準(zhǔn)圖可以是NADPH濃度相對熒光或吸光度信號和/或G6PD活性水平的圖。在一些實施方案中，試劑盒包含具有預(yù)定量的G6PD的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以使得用戶可以產(chǎn)生它們自己的校準(zhǔn)圖。在一些實施方案中，試劑盒還包含關(guān)于如何制備校準(zhǔn)圖的說明書。在優(yōu)選的實施方案中，說明書、信息和/或校準(zhǔn)曲線適用于本文公開的未稀釋或最低限度稀釋的血液樣品。

實施例

在以下實施例中進(jìn)一步詳細(xì)公開了另外的實施方案，其不以任何方式意在限制本公開內(nèi)容或權(quán)利要求書的范圍。

實施例1

對未稀釋血液樣品的SERS均相無洗滌測定和G6PD測定

本實施例描述了檢測未稀釋的血液樣品中的G6PD酶活性的實驗，其與間日瘧原蟲(其是瘧疾的血液傳染性致病性病原體)的診斷測定結(jié)合進(jìn)行。

血液樣品：用0ng/mL或150ng/mL的間日瘧原蟲的乳酸脫氫酶(pLDH)抗原加標(biāo)來自G6PD正常或G6PD缺陷受試者的未稀釋的血液樣品。對于每個樣品，將G6PD和HNW試劑與裂解測定緩沖劑和用0或150ng/mL間日瘧原蟲重組LDH抗原的人血液替代樣品(Trinity Biotech)混合。將LDH抗原加入到測定混合物中以使?jié)舛冗_(dá)到9％血液。

均相無洗滌(HNW)測定：如下制備均相無洗滌(HNW)試劑：將SERS標(biāo)簽綴合至抗-間日瘧原蟲LDH抗體，并使用標(biāo)準(zhǔn)綴合化學(xué)技術(shù)將1微米磁珠與抗-泛LDH抗體綴合。

將每個樣品混合物孵育20-30分鐘。隨后，使用磁架將磁珠(和任何珠-抗原-SERS標(biāo)簽免疫復(fù)合物)沉淀，并使用HNW測定測量儀器用近紅外激光器分析沉淀。

G6PD測定：在上述HNW測定之后，收集每個樣品混合物的上清液(即排除了磁珠沉淀的樣品)，將其置于比色皿(VWR 47743-836，Brandtech 759240，或等同物)中，并且通過利用在產(chǎn)生NADPH時的分光光度測量的變化，通過在315nm的UV/可見吸光度測量5分鐘NADPH的產(chǎn)生來監(jiān)測G6PD酶活性。在這些實驗中，按照制造商的建議，從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺，Sigma Aldrich，目錄號N8160-15V)和葡萄糖-6-磷酸(G6P，Sigma Aldrich，目錄號G7879)的儲備溶液制備G6PD試劑溶液。當(dāng)測試臨床樣品時，1瓶NADP⁺通常提供足夠的試劑來測試2個臨床樣品。每瓶NADP⁺內(nèi)容物的再水合是通過向瓶中加入200μl測定緩沖劑(其含有一種或多種合適的穩(wěn)定劑、裂解劑、pH緩沖劑和鹽)，隨后將瓶旋轉(zhuǎn)和傾斜30秒以確保NADP⁺被完全再水合，。再水合的NADP⁺通常在室溫下穩(wěn)定達(dá)3小時。緩沖劑組合物包括有效濃度的氯化鈉、Tris、Triton-X-100、牛血清白蛋白、疊氮化鈉。

在這些實驗中使用的G6PD酶活性溶血的血液正常對照是G6PD正常酶活性對照(G5888，Trinity Biotech)和G6PD缺陷性酶活性對照(G6888，Trinity Biotech)。每個Trinity酶活性對照通過加入0.5mL水再水合。將樣品輕輕旋轉(zhuǎn)10秒，并允許5分鐘進(jìn)行再水合。

對于微量離心管中的每個反應(yīng)，加入以下試劑：300μL測定緩沖劑至新鮮微量離心管，78μL NADP⁺，78μL G6P儲備溶液至微量離心管，和45μL再水合的Trinity酶活性對照。蓋上微量離心管并渦旋1-2秒以徹底混合。然后將微量離心管的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一次性比色皿(VWR 47743-842，Brandtech 759240或等同物)中，并將比色皿放入落射熒光儀器中，確保比色皿上的燒杯符號面向入射光束。在混合后開始G6PD酶/NADP⁺反應(yīng)時，不混合試劑直到恰好數(shù)據(jù)收集之前。將比色皿從儀器中取出并在測定完成時丟棄。

在相同血液樣品上進(jìn)行的G6PD測定和瘧疾檢測測定的結(jié)果總結(jié)在圖2中。在存在(150ng/mL；Vivax+)或不存在(0ng/mL；Vivax-)pLDH抗原的情況下G6PD酶活性的水平由實心條指示。使用對間日瘧原蟲pLDH抗原特異性的單克隆抗體進(jìn)行的瘧疾檢測免疫測定由虛線條指示。

實施例2

通過監(jiān)測未稀釋血液樣品中NADPH的產(chǎn)生來檢測G6PD活性

本實施例描述通過監(jiān)測NADPH產(chǎn)生檢測最低限度稀釋的血液樣品中的G6PD活性的實驗。

在這些實驗中，所有測定在9％血液(即90μL血液/1000μL總測定體積)下進(jìn)行。在實施例1中描述的HNW測定之后，收集每個樣品混合物的上清液(即，排除了磁珠沉淀的樣品)，將其置于比色皿(VWR 47743-836，Brandtech 759240或等同物)中，并且通過利用在產(chǎn)生NADPH時的分光光度測量的變化，通過在315nm的UV/可見吸光度測量5分鐘NADPH的產(chǎn)生來監(jiān)測G6PD酶活性。在315nm而不是340nm處監(jiān)測吸光度，因為光密度太高而不能在340nm NADPH吸收峰讀數(shù)。通過在對應(yīng)于吸收峰的“肩”的315nm處讀數(shù)，更準(zhǔn)確地測量NADPH吸光度。測量樣品混合物中G6PD酶活性水平的實驗結(jié)果圖示總結(jié)于圖3中。來自G6PD正常(G6PD正常)或G6PD缺陷(G6PD缺陷)受試者的未稀釋血液樣品用0ng/mL或150ng/mL間日瘧原蟲的乳酸脫氫酶(pLDH)抗原加標(biāo)。在pLDH抗原存在(150ng/mL；瘧疾+)或不存在(0ng/mL；瘧疾-)下測定G6PD酶活性水平。監(jiān)測315nm吸光度5分鐘，并計算該時間段內(nèi)OD的變化?！癆.U.”：任意單位。

實施例3

在不同血液濃度中G6PD活性的落射熒光檢測

本實施例描述了使用落射熒光顯微技術(shù)檢測三種不同血液濃度中的G6PD酶活性，證明可以在寬范圍的血液負(fù)荷下可靠地進(jìn)行落射熒光G6PD酶測定。在這些實驗中，如上面實施例1所述進(jìn)行G6PD測定。

在一個實驗中，在落射熒光儀器中在9％和0.33％的血液負(fù)荷下測試正常和缺陷溶血血液對照(Trinity Biotech)的G6PD酶活性。試劑濃度按照血液濃度成比例地調(diào)整。。圖4的曲線圖圖示總結(jié)了來自正常和缺陷溶血產(chǎn)物血液對照的血液樣品的落射熒光G6PD酶數(shù)據(jù)。觀察到斜率在兩種血液濃度下幾乎相同，證明本公開內(nèi)容的方法可以在寬范圍的血液濃度下使用。

在另一個實驗中，使用實施例1中所述的落射熒光方法，在落射熒光儀器中在68％的血液負(fù)荷下測量三個溶血的血液對照(正常、中等和缺陷(Trinity Biotech))中的G6PD酶活性。增加測定試劑濃度以確保酶活性而不是試劑濃度是NADP⁺至NADPH的還原的限制因素。如圖5所示，當(dāng)血液濃度高達(dá)68％時，本文公開的落射熒光測定方法仍然可以清楚地區(qū)分正常血液樣品與剩余的兩種樣品(中等和缺陷)。

實施例4

在不同溫度下G6PD活性的熒光檢測

本實施例描述了通過在兩個不同溫度下的熒光檢測來測量G6PD酶活性水平的實驗，說明本文公開的落射熒光方法可以在寬的溫度范圍內(nèi)使用。在此實驗中，通過將落射熒光儀器置于具有加熱和冷卻能力的培養(yǎng)箱中，在18℃和40℃下測試正常酶活性血液樣品的G6PD酶活性。圖6中所示的實驗在25℃和40℃下進(jìn)行，而上文圖2中所示的實驗在18℃下進(jìn)行。觀察到斜率取決于溫度，這與先前報道的G6PD酶活性是溫度依賴性的發(fā)現(xiàn)一致。

實施例5

未稀釋的血液樣品的G6PD活性落射熒光檢測和血紅蛋白測量

本實施例描述了測量大量未稀釋的臨床血液樣品中G6PD酶活性水平的實驗。在這些實驗中，從泰國的發(fā)熱患者獲得抗凝血液樣品，并通過根據(jù)本文公開的方法的落射熒光檢測程序(圖7A)或通過商業(yè)Trinity定量試劑盒(圖7B)測定G6PD活性。

在這些實驗中，如上面實施例1所述進(jìn)行G6PD測定。根據(jù)制造商的建議從NADP⁺和G6P的儲備溶液(Sigma Aldrich)制備G6PD試劑溶液。當(dāng)測試臨床樣品時，1瓶NADP⁺通常提供足夠的試劑來測試2個臨床樣品。每瓶NADP⁺內(nèi)容物的再水合是通過向瓶中加入200μl測定緩沖劑(其含有一種或多種合適的穩(wěn)定劑，裂解劑，pH緩沖劑和鹽)，然后旋轉(zhuǎn)和傾斜瓶子30秒以確保NADP⁺被完全再水合。再水合的NADP⁺通常在室溫下穩(wěn)定達(dá)3小時。將每個臨床樣品渦旋約5秒或直到充分混合。在微量離心管中加入以下試劑：300μL含有有效濃度的氯化鈉、Tris、Triton-X、牛血清白蛋白和疊氮化鈉的測定緩沖劑，78μL NADP⁺溶液，78μL G6P溶液和45μL血液樣品。然后將微量離心管的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一次性比色皿(VWR 47743-842，Brandtech 759240或等同物)中，并將比色皿放入落射熒光儀器中，確保比色皿上的燒杯符號面向入射光束。在混合后開始G6PD酶/NADP⁺反應(yīng)時，不混合試劑直到恰好數(shù)據(jù)收集之前。將比色皿從儀器中取出并在測定完成時丟棄。

圖7總結(jié)了測量17種未稀釋的臨床血液樣品中G6PD酶活性水平的實驗結(jié)果。在該實驗中還包括三種G6PD酶活性對照：G6PD正常酶活性對照(G5888，Trinity Biotech)，G6PD中等酶活性對照(Trinity Biotech G5029)和G6PD缺陷酶活性對照(G6888，Trinity Biotech)。每個Trinity酶活性對照通過加入0.5mL水再水合。將樣品輕輕旋轉(zhuǎn)10秒，并允許5分鐘進(jìn)行再水合。根據(jù)制造商的建議并稍作修改地進(jìn)行Trinity定量測定。根據(jù)制造商推薦的說明書進(jìn)行HemoCue Hb 201⁺(HemoCue，Inc.，Lake Forest，Calif.)測定以測量每個樣品的血紅蛋白度量。

在落射熒光數(shù)據(jù)中觀察到的負(fù)值被確定為是由于用于測試的塑料比色皿的光漂白引起的，而不是生物現(xiàn)象。

圖8是來自154個未稀釋的血液樣品的Trinity定量測試和落射熒光測試一致性的圖示。觀察到，不包括單獨(dú)的血紅蛋白(“Hb”)測量的落射熒光測試將154個樣品中的153個正確分類到正確的酶活性范圍中。在落射熒光數(shù)據(jù)中觀察到的負(fù)值被確定為是由于用于測試的塑料比色皿的光漂白引起的，而不是生物現(xiàn)象。在Trinity定量測試中，相對于健康成年男性的報道的平均酶活性(其為7.17IU/g Hb)，將G6PD活性標(biāo)準(zhǔn)化。

圖9是來自154個未稀釋的血液樣品的Trinity定量測試和落射熒光測試一致性的圖示。根據(jù)以下四個實驗設(shè)置通過(1)Trinity定量測試和(2)落射熒光測試對每個樣品測定G6PD活性。(左上圖)Trinity定量測試和落射熒光測試均未通過單獨(dú)的血紅蛋白測量來標(biāo)準(zhǔn)化；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.896。(右上圖)通過單獨(dú)的血紅蛋白測量對Trinity定量測試進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，而落射熒光測試不通過單獨(dú)的血紅蛋白測量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.968。(左下圖)Trinity定量測試不通過單獨(dú)的血紅蛋白測量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，而落射熒光測試通過單獨(dú)的血紅蛋白測量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.671。(右下圖)通過單獨(dú)的血紅蛋白測量標(biāo)準(zhǔn)化Trinity定量測試和落射熒光測試；Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.893(在去除11.73IU/g Hb的單個離群值時，Pearson相關(guān)系數(shù)＝0.935)。在落射熒光數(shù)據(jù)中觀察到的負(fù)值被確定是由于用于測試的塑料比色皿的光漂白引起的，而不是生物現(xiàn)象。

表1：具有和不具有血紅蛋白測量標(biāo)準(zhǔn)化的154個臨床樣品的Trinity和落射熒光檢測的Pearson相關(guān)系數(shù)

*在單個離群點(diǎn)被去除時此相關(guān)系數(shù)為0.935。

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本文給出的一般方法的討論僅用于舉例說明目的。在審閱本公開內(nèi)容時，其它替代實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的，并且將被包括在本申請的精神和范圍內(nèi)。雖然已經(jīng)關(guān)于其詳細(xì)實施方案描述了一般方法和組合物，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不脫離本公開內(nèi)容的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種改變。本文公開的方法和組合物的優(yōu)點(diǎn)之一是能夠分析血液而不需要稀釋劑。也就是說，在替代實施方案中，本文公開的方法和組合物可以用于已經(jīng)由于各種原因而稀釋的血液，只要樣品的稀釋因子是已知的或可確定的。