相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求享有在2014年07月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/026,984和在2014年08月07日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/034,504的優(yōu)先權(quán)。上述專利申請的內(nèi)容以引用的方式全部并入本申請。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)聚集是影響蛋白質(zhì)制備，特別是生物學(xué)上的長期穩(wěn)定性的主要問題。通常，聚集體源自在制劑中存在的少量變性或部分變性的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)構(gòu)象傾向于聚集，例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的疏水核心逐漸暴露于溶劑時。變性蛋白質(zhì)的聚集逐漸使蛋白質(zhì)的平衡向增加數(shù)量的變性和最終聚集的變性蛋白質(zhì)移動。在其他情況下，天然狀態(tài)本身可以顯示聚集的傾向，由于連接的小分子藥物通常是高度疏水的，這在抗體藥物偶聯(lián)物(adc’s)中是一種加劇的傾向。

因此，存在用于識別和表征蛋白質(zhì)聚集過程新方法和系統(tǒng)的需求。這樣的方法和系統(tǒng)將在(1)鑒定和選擇具有最小化聚集和延長長期穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)制劑和(2)鑒定具有最低聚集傾向的蛋白質(zhì)變體中提供了極大的益處。本申請解決了這種需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及在盡可能早的時間中確定和表征蛋白質(zhì)聚集過程的方法和系統(tǒng)以及這些新方法和系統(tǒng)的用途，于(1)鑒定和選擇具有最小化聚集和延長長期穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)制劑，和(2)鑒定具有最低聚集傾向的蛋白質(zhì)變體。

本發(fā)明的第一方面涉及基于所述溶液的蛋白質(zhì)濃度的溶液中用于蛋白質(zhì)聚集的量或分?jǐn)?shù)的方法。該方法包括以下步驟：(1)提供包含增加濃度的蛋白質(zhì)的若干第一溶液；(2)測量若干第一溶液中每個溶液的可觀察的特征；(3)基于可觀察的屬性，確定若干第一溶液中每種濃度下蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg；(4)創(chuàng)建δg與每種濃度的蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性；和(5)使用相關(guān)性來確定被聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)和/或被變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)。

如本文所述，“變性”是這樣的過程，其中蛋白質(zhì)通過施加一些外部應(yīng)力或試劑，例如強酸或堿、濃縮的無機鹽、有機溶劑、輻射或熱，從而失去存在于其天然狀態(tài)中的四級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)。常用的化學(xué)變性劑包括尿素和鹽酸胍?；罴?xì)胞中的蛋白質(zhì)變性可導(dǎo)致細(xì)胞活性的破壞和可能的細(xì)胞死亡。在體內(nèi)或體外，變性蛋白質(zhì)可以表現(xiàn)出寬范圍的特征，從構(gòu)象變化和溶解性的降低到由于疏水基團(tuán)的暴露導(dǎo)致的聚集。在該過程中，未折疊的蛋白質(zhì)的暴露的疏水部分可以與其它未折疊的蛋白質(zhì)的暴露的疏水部分相互作用，自發(fā)地導(dǎo)致蛋白聚集。

如本文所述，“蛋白質(zhì)聚集”是蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外(包括體外)聚集(即，積累和簇集)的現(xiàn)象。當(dāng)藥學(xué)上可接受的制劑中的蛋白質(zhì)聚集時，制劑的有效劑量減少，并且它們可能引起不希望的免疫應(yīng)答。蛋白質(zhì)可以在其天然狀態(tài)或變性狀態(tài)下聚集。

δg，通過評估蛋白質(zhì)對增加量的物理或化學(xué)變性劑的抗性來測量以確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和/或構(gòu)象穩(wěn)定性的熱力學(xué)參數(shù)。物理因子是溫度或壓力。在這種情況下，通過逐漸增加蛋白質(zhì)溶液的溫度或壓力來實現(xiàn)變性。化學(xué)因子是變性劑分子，如尿素或鹽酸胍。在這種情況下，蛋白質(zhì)變性通過逐漸增加變性劑的濃度來實現(xiàn)。蛋白質(zhì)的變性伴隨著蛋白質(zhì)的一些可觀察的特征的變化。這些變化的分析用于評估δg。在實施方式中，若干溶液將不含有化學(xué)變性劑或化學(xué)變性劑的濃度不足以產(chǎn)生可檢測水平的變性蛋白質(zhì)。

在一些實施方式中，可觀察的特征是熒光性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性時，蛋白質(zhì)的某些可測量的特征也會改變。一個這樣的特征是蛋白質(zhì)的熒光性。熒光性可以是蛋白質(zhì)固有的，例如通過天然熒光的氨基酸，例如色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸，或者可以于蛋白質(zhì)是外來的，例如通過包含熒光標(biāo)記的探針?？梢允褂闷渌绢I(lǐng)域已知的方法來檢測蛋白質(zhì)的變性狀態(tài)和/或允許測定δg。除了熒光光譜學(xué)之外，有許多物理可觀察的特征和其使用的儀器，其對蛋白質(zhì)的變性程度敏感。這些可觀察的特征可以通過各種技術(shù)測量，包括但不限于uv/vis光譜、圓二色性、核磁共振(nmr)、紅外光譜(ir)和差示掃描量熱法等。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：(1)提供包括增加濃度的蛋白質(zhì)的若干至少第二溶液；(2)測量若干至少第二溶液中的每種溶液的可觀察的特征；(3)基于可觀察的特征，確定若干至少第二溶液中每種濃度的蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg；(4)創(chuàng)建于每個若干至少第二溶液的δg與蛋白質(zhì)的每種濃度之間的相關(guān)性；和(5)使用相關(guān)性來確定若干至少第二溶液中聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)和/或變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)。

在實施方式中，所述方法包括將若干第一溶液中每種濃度的蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg與若干至少第二種溶液中每種濃度的蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg進(jìn)行比較的步驟。

在一些實施方式中，若干至少第二溶液包括若干第二溶液。在一些實施方式中，若干至少第二溶液包括若干第二溶液和若干第三溶液。在一些實施方式中，若干至少第二溶液包括若干第二溶液、若干第三溶液和若干第四溶液。在一些實施方式中，若干至少第二溶液包括若干第二溶液、若干第三溶液、若干第四溶液和若干第五溶液。在一些實施方式中，若干至少第二溶液包括若干第二溶液、若干第三溶液、若干第四溶液、若干第五溶液和更若干溶液(例如，若干第六溶液、若干第七溶液、若干第八溶液、若干第九溶液、若干第十溶液、若干第二十溶液，若干第四十溶液、若干第六十溶液、若干第八十溶液、若干第一百溶液，以及其間的若干任意數(shù))。實施方式包括多于一百個溶液。

若干溶液可以與另一若干溶液在一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、和八個)條件或因素上不同，其可以被調(diào)整用于制定溶液。在一些實施方式中，條件或因素選自由緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成、賦形劑濃度、化學(xué)變性劑組成和化學(xué)變性劑濃度構(gòu)成的組。在一些實施方式中，若干溶液僅在一個條件或因子上不同于另一若干溶液。在一些實施方式中，若干溶液僅在緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成、賦形劑濃度、化學(xué)變性劑組成或化學(xué)變性劑濃度不同于另一若干溶液。在一些實施方式中，若干至少第二溶液中的每一種僅在緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成、賦形劑濃度、化學(xué)變性劑組成或化學(xué)變性劑濃度方面不同于若干第一溶液。在一些實施方式中，每種若干至少第二溶液僅在化學(xué)變性劑濃度不同于若干第一溶液。在一些實施方式中，每種若干至少第二溶液包含比若干第一溶液更高濃度的化學(xué)變性劑。在一些實施方式中，若干第一溶液不包含化學(xué)變性劑或產(chǎn)生不可檢測量的或不可檢測分?jǐn)?shù)的變性蛋白質(zhì)的一定量的化學(xué)變性劑。

若干溶液的每種溶液可以與若干溶液中的另一溶液在一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、和八個)條件或因子上不同，其可以被調(diào)整用于制定溶液(例如，本文所述的條件或因子)。在一些實施方式中，若干溶液中的每種溶液的不同不超過三種條件(例如，無條件、一種條件、兩種條件和三種條件)，所述條件選自緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成、賦形劑濃度、化學(xué)變性劑組成和化學(xué)變性劑濃度的組。

在非限制性實施方式中，若干第一溶液中的每種溶液可以具有5.7的ph，包含0.9％nacl和3m尿素，并且若干至少第二溶液中的每種溶液具有6.7的ph，包含0.9％nacl和3m尿素，唯一的區(qū)別是若干第一溶液和若干至少第二溶液之間的ph。在另一個非限制性實施方式中，若干第一溶液中的每種溶液可具有5.7的ph，包含1.2％nacl和3m尿素，并且若干至少第二溶液中的每種溶液具有6.7的ph，包含0.9％nacl和4m尿素，其中差異是若干第一溶液和若干至少第二溶液之間的ph和變性劑(即尿素)的濃度。圖16顯示了可用于本發(fā)明的示例性溶液。

如本文所述，“增加濃度”是指本申請的若干溶液(例如，若干第一溶液、若干第二溶液、若干第三溶液等)中的溶液具有一定濃度范圍的從最低濃度增加到最高濃度的組分(例如，蛋白質(zhì))。例如，若干溶液中的溶液各自地包含0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml和1mg/ml濃度的蛋白質(zhì)。

兩個或更多的若干溶液可以包含相同濃度的蛋白質(zhì)的溶液。在一些實施方式中，若干第一溶液和若干至少第二溶液包含相同濃度的蛋白質(zhì)的溶液。在一些實施方式中，若干第一溶液和若干第二溶液包含相同濃度的蛋白質(zhì)的溶液。在非限制性實施方式中，若干第一溶液包括蛋白質(zhì)的濃度為0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml和1mg/ml的溶液，并且若干至少第二溶液包括所述蛋白質(zhì)的濃度的溶液，其對應(yīng)于若干第一溶液中的濃度，即各自為0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml和1mg/ml。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括產(chǎn)生蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg和一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個和八個)條件或因子之間相關(guān)性的步驟，其可以被調(diào)整用于制定溶液(例如，本文所述的條件或因素)針對若干第一溶液中的每個溶液以及若干至少第二溶液中的每個溶液。

在實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括提供的若干溶液(即“化學(xué)變性劑溶液”)具有相同濃度的蛋白質(zhì)(和/或其他組成成分)和增加濃度的化學(xué)變性劑(例如尿素和鹽酸胍)。確定化學(xué)變性劑的增加濃度對δg，對變性蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)，和/或聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)的相關(guān)性(例如通過測量可觀察的特征，其能夠監(jiān)測蛋白質(zhì)變性)。在非限制性實施方式中，若干溶液包括具有相同濃度的蛋白質(zhì)和尿素濃度在0和10μm之間，例如0m、1m、2m、3.0m、3.25m、3.5m、3.75m、4m、6m和8m的溶液。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括比較每種濃度的蛋白質(zhì)的δg值以確定蛋白質(zhì)是以其天然狀態(tài)聚集還是以變性狀態(tài)聚集的步驟。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括測定每種不同濃度的變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)的步驟。在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括測定每個不同濃度的聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)的步驟。在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括測定變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)和每種不同濃度聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)的步驟。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括在若干第一溶液中聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)，和/或變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)，與在若干至少第二溶液中聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)，或變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括產(chǎn)生聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)和一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個和八個)條件或因子之間相關(guān)性的步驟，所述條件或因子可以被調(diào)整來制定溶液(例如，本文所述的條件或因子)用于若干第一溶液中的每個溶液以及若干至少第二溶液中的每個溶液。在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括產(chǎn)生變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)與一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個和八個)條件或因子之間相關(guān)性的步驟，所述條件或因子可以被調(diào)整來制定溶液(例如，本文所述的條件或因子)用于若干第一溶液中的每個溶液以及若干至少第二溶液中的每個溶液。在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括產(chǎn)生聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)與變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)，以及一個或多個(例如一個、兩個、三個，四個、五個、六個、七個和八個)條件或因子之間的相關(guān)性的步驟，所述條件或因子可以被調(diào)整來制定溶液(例如，本文所述的條件或因子)用于若干第一溶液中的每個溶液以及若干至少第二溶液中的每個溶液。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括使用聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)與變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)，以及一個或多個(例如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個和八個)條件或因子之間的相關(guān)性，其可以被調(diào)整來制定溶液(例如，本文所述的條件或因子)，來測定用于最小化聚集和/或變性蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)的一個或多個(例如一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個和八個))條件或因子。

在一些實施方式中，所述方法可以檢測2ng/ml或更少的變性的蛋白質(zhì)(例如，0.5ng/ml至1.5ng/ml，0.75ng/ml至1.25ng/ml，小于1ng/ml，以及其間的每種濃度)和/或測定2ng/ml或更少的聚集的蛋白質(zhì)(例如，0.5ng/ml至1.5ng/ml，0.75ng/ml至1.25ng/ml，小于1ng/ml，以及其間的每種濃度)。

δg可以在24小時內(nèi)測定(例如，小于20小時、小于18小時、小于15小時、小于12小時、小于10小時、小于8小時、小于6小時、小于4小時、小于3小時、小于2小時、小于1小時，以及每次時間之間)。

在一些實施方式中，變性的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)以及聚集的蛋白質(zhì)的量和/或分?jǐn)?shù)可以在24小時內(nèi)測定(例如，小于20小時、小于18小時、小于15小時、小于12小時、小于10小時、小于8小時、小于6小時、小于4小時、小于3小時、小于2小時、小于1小時，以及每次時間之間)。

若干溶液可包括至少3至20種溶液(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20溶液)，每種溶液包含不同濃度的蛋白質(zhì)。若干溶液中的每種溶液可以包括小于200mg/ml的蛋白質(zhì)(例如小于100mg、小于50mg/ml、小于20mg/ml、小于10mg/ml、小于5mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、以及其間的任何濃度)。在一些實施方式中，溶液包含0.1μg/ml至小于2mg/ml的蛋白質(zhì)(例如，小于0.2μg/ml、小于0.5μg/ml、小于1μg/ml、小于2μg/ml、小于3μg/ml、小于4μg/ml、小于5μg/ml、小于10μg/ml、小于20μg/ml、小于50μg/ml、小于100μg/ml、小于200μg/ml、小于500μg/ml、小于1mg/ml，以及其間的任何濃度)。

一種或多種若干溶液可以經(jīng)受以促進(jìn)蛋白質(zhì)變性和/或聚集的條件。在一些實施方式中，變性由化學(xué)變性劑(例如，尿素和鹽酸胍)誘導(dǎo)。在一些實施方式中，變性通過加熱誘導(dǎo)。在一些實施方式中，變性由化學(xué)變性劑與熱的組合誘導(dǎo)。

在實施方式中，本文所述的方法在體外，間接體內(nèi)或直接體內(nèi)進(jìn)行。在實施方式中，本文所述的方法在體外進(jìn)行，即在設(shè)計的和制備的非天然存在的溶液中進(jìn)行。在實施方式中，溶液中每種組分/因子和每種組分/因子的量被預(yù)先選擇并組合以產(chǎn)生溶液。

在一些實施方式中，所述方法可以進(jìn)一步包括測定蛋白質(zhì)的濃度的步驟，其中溶液中δg對蛋白質(zhì)濃度的依賴性最小化。在實施方式中，所述方法還包括鑒定使δg最大化并使δg的蛋白質(zhì)濃度依賴性最小化的蛋白質(zhì)濃度的步驟。

在實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括使用δg與若干第一溶液中每種濃度的蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性，以確定在所述若干第一溶液中所述變性的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)和聚集的所述變性的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)的步驟。在實施方式中，該方法進(jìn)一步包括使用δg與若干至少第二溶液中每種濃度的蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性，以確定在所述若干至少一個溶液中變性的所述蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)和聚集的所述變性的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)的步驟。實施方式進(jìn)一步包括比較若干第一溶液中聚集的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)或變性的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)與若干至少第二溶液中聚集的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)或變性的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)。

在實施方式中，所述方法還進(jìn)一步包括選擇一種或多種條件進(jìn)一步最大化δg和最小化δg的蛋白質(zhì)濃度依賴性的步驟，所述條件選自由緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成和賦形劑濃度構(gòu)成的組。

上述方面還提供了制備蛋白質(zhì)制劑(例如，藥學(xué)上可接受的蛋白質(zhì)制劑)的方法，所述蛋白質(zhì)制劑具有在溶液中δg對蛋白質(zhì)濃度依賴性最小的蛋白質(zhì)濃度。在實施方式中，制劑具有使蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg最大化并使δg的蛋白質(zhì)濃度依賴性最小化的蛋白質(zhì)濃度。在實施方式中，制劑具有蛋白質(zhì)濃度并且包括使蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg最大化并使δg蛋白質(zhì)濃度依賴性最小化的一種或多種條件(選自緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成和賦形劑濃度)。在實施方式中，選擇蛋白質(zhì)制劑包括選擇使聚集的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)最小化和/或使變性的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)最小化的一種或多種條件和蛋白質(zhì)的濃度的步驟。

本發(fā)明一個方面是具有如通過本文所述的方法測定的一種或多種條件(選自緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成和賦形劑濃度)和所述濃度的蛋白質(zhì)(其使蛋白質(zhì)濃度依賴性δg最小化和/或使聚集的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)最小化)的蛋白質(zhì)制劑(例如藥學(xué)上可接受的蛋白質(zhì)制劑)。在實施方式中，制劑包括具有使蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg最大化并使δg的蛋白質(zhì)濃度依賴性最小化的蛋白質(zhì)的濃度和一種或多種條件。蛋白質(zhì)制劑可以包括一種或多種條件和蛋白質(zhì)的濃度，其使聚集的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)最小化和/或使變性的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)最小化。

如本文所述，藥學(xué)上可接受的蛋白質(zhì)制劑是液體(例如，水性)制備的蛋白質(zhì)制劑，其對于患者例如動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類是穩(wěn)定的(儲存和在體內(nèi))和可接受的。藥學(xué)上可接受的蛋白質(zhì)制劑是將蛋白質(zhì)與多種化合物組合以確保儲存后穩(wěn)定的活性藥物。這些包括但不限于增溶劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、填充劑、粘度增強劑/還原劑、表面活性劑、螯合劑、配體和佐劑。

本發(fā)明另一方面涉及用于確定若干蛋白質(zhì)的變體中穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的變體方法，其包括以下步驟：(1)提供包括增加濃度的第一蛋白質(zhì)變體的若干第一溶液；(2)測量若干第一溶液中的每個溶液的可觀察的特征；(3)基于可觀察的特征，確定若干第一溶液中每個濃度下第一蛋白質(zhì)變體的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg；(4)創(chuàng)建δg與第一蛋白質(zhì)變體的每個濃度之間的相關(guān)性；和(5)使用相關(guān)性來確定聚集的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)(6)提供包括增加濃度的至少第二蛋白質(zhì)變體的若干至少第二溶液；(7)測量若干至少第二溶液中的每個溶液的可觀察的特征；(8)基于可觀察的特征，確定若干至少第二溶液中每個濃度下至少第二蛋白質(zhì)變體的構(gòu)象穩(wěn)定性的δg；(9)創(chuàng)建δg與至少第二蛋白質(zhì)變體的每個濃度之間的相關(guān)性，以及(10)使用相關(guān)性來確定聚集的蛋白質(zhì)的量或分?jǐn)?shù)，所述蛋白質(zhì)變體具有最大化的δg和最小化的δg的蛋白質(zhì)濃度依賴性和/或具有較少量或部分的聚集的蛋白質(zhì)被確定為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)變體。在實施方式中，所述第一溶液中的每種溶液在選自緩沖液組成、緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成、賦形劑濃度、化學(xué)變性劑和化學(xué)變性劑濃度組成的組，并且不同于所述若干至少第二溶液中的每種溶液在一種或多種條件，所述條件選自緩沖液組成，緩沖液強度、ph、離子強度、賦形劑組成、賦形劑濃度、化學(xué)變性劑組成和化學(xué)變性劑濃度的組。在實施方式中，若干第一溶液中的每種溶液至少在化學(xué)變性劑濃度不同，并且若干至少第二溶液中的每種溶液至少在化學(xué)變性劑濃度方面不同。

蛋白質(zhì)變體是在一個或多個氨基酸方面不同，并且這種差異可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(例如，變性和/或聚集的趨勢)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)變體的非限制性實施方式包括從不同雜交瘤克隆獲得的單克隆抗體。蛋白質(zhì)變體也可以是糖基化不同的蛋白質(zhì)和已經(jīng)通過小分子的連接(例如共價連接)被修飾的蛋白質(zhì)；抗體藥物偶聯(lián)物是這種修飾的蛋白質(zhì)的實例。

如在本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明確規(guī)定，否則單數(shù)形式“一”，“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)指示物。

除非特別說明或從上下文顯而易見，否則如本文所使用的，術(shù)語“或”被理解為包括性的，并且涵蓋“或”和“和”兩者，除非上下文另有明確指示。

除非特別說明或從上下文顯而易見，如本文所使用的，術(shù)語“約”理解為在本領(lǐng)域的正常耐受范圍內(nèi)，例如在平均值的2個標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。大約可以理解為在10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％表示值。除非另有說明，本文提供的所有數(shù)值都用術(shù)語“約”修飾。

本文所述的任何方面或?qū)嵤┓绞娇膳c本文所公開的任何其它方面或?qū)嵤┓绞浇M合。雖然已經(jīng)結(jié)合其詳細(xì)的描述說明了本公開，但是前面的描述旨在說明而不是限制本公開的范圍，本公開的范圍由所附權(quán)利要求的范圍限定。其他方面，優(yōu)化和修改在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然與本文所述的那些類似或等同的其它探針、組合物、方法和試劑盒可用于本發(fā)明的實踐，但是本文描述了優(yōu)選的材料和方法。應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，而不旨在是限制性的。

本文提及的專利和科學(xué)文獻(xiàn)建立了本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的知識。所有美國專利和本文引用的公開或未公布的美國專利申請通過引用并入本文。本文引用的所有公開的外國專利和專利申請通過引用并入本文。本文引用的所有其它公開的參考文獻(xiàn)、文獻(xiàn)、手稿和科學(xué)文獻(xiàn)通過引用并入本文。

從前面的描述中，顯而易見的是，可以對本文描述的本發(fā)明進(jìn)行變化和修改以采用它用于各種用途和條件。這些實施方式也在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

附圖說明

專利或申請文件包含至少一張彩色圖。具有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的副本將由官方根據(jù)請求并支付必要的費用后提供。

圖1顯示了天然(紅色)和變性(綠色)(未折疊或部分未折疊)狀態(tài)之間的蛋白質(zhì)的構(gòu)象平衡。在一些條件下，變性狀態(tài)(以及天然狀態(tài))可能表現(xiàn)出自締合或聚集的趨勢。

圖2顯示了δg對蛋白質(zhì)濃度的依賴性，其提供蛋白質(zhì)在其天然狀態(tài)或其變性狀態(tài)下聚集的傾向的定量評估。

圖3顯示了影響δg的因素。

圖4：(a)包括δg和hiv-1蛋白酶濃度之間的關(guān)系的圖。hiv-1蛋白酶的δg隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而增加。(b)包括顯示δg和α-胰凝乳蛋白酶濃度之間的關(guān)系的圖。α-胰凝乳蛋白酶的δg隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而降低。

圖5包括了顯示δg和曲妥珠單抗?jié)舛戎g的關(guān)系的圖。顯示了來自兩種制劑的數(shù)據(jù)：曲妥珠單抗在5％葡萄糖溶液(藍(lán)色)和曲妥珠單抗在0.9％nacl溶液(綠色)中。曲妥珠單抗的δg隨著5％葡萄糖溶液中蛋白質(zhì)濃度的增加而增加。

圖6包括了顯示δg和西妥昔單抗?jié)舛?a)之間，變性西妥昔單抗的分?jǐn)?shù)與西妥昔單抗?jié)舛?b)之間，聚集的西妥昔單抗的分?jǐn)?shù)和西妥昔單抗?jié)舛?c)之間以及聚集的變性西妥昔單抗的分?jǐn)?shù)和西妥昔單抗?jié)舛萪)之間關(guān)系的圖。對于每一組，用于以藍(lán)色顯示的數(shù)據(jù)的溶液與補充有300mml-精氨酸的用紅色顯示的數(shù)據(jù)的溶液相同。(a)顯示西妥昔單抗的δg隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而降低。

圖7包括了顯示了在兩種制劑中測試單克隆抗體的研究的數(shù)據(jù)的圖。該圖顯示了δg與單克隆抗體濃度(a)之間，變性單克隆抗體部分和單克隆抗體濃度(b)之間，聚集的單克隆抗體部分和單克隆抗體濃度(c)之間，聚集的變性單克隆抗體的部分和單克隆抗體的濃度(d)之間關(guān)系的圖。(a)顯示單克隆抗體的δg隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而降低。

圖8顯示了δg和單克隆抗體-a的蛋白質(zhì)濃度(左上)之間，變性的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a的濃度(右上)之間，聚集的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a濃度(左下)之間，對于單克隆抗體-a的ph6.25的制劑的聚集變性單克隆抗體a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a的濃度(右下)之間關(guān)系的圖。

圖9顯示了δg和單克隆抗體-a的蛋白質(zhì)濃度(左上)之間，變性的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a的濃度(右上)之間，聚集的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a濃度(左下)之間，對于單克隆抗體-a的ph6.75的制劑的聚集變性單克隆抗體a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a的濃度(右下)之間關(guān)系的圖。

圖10顯示了δg和單克隆抗體-a的蛋白質(zhì)濃度(左上)之間，變性的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a的濃度(右上)之間，聚集的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a濃度(左下)之間，對于單克隆抗體-a的ph7.75的制劑的聚集變性單克隆抗體a的分?jǐn)?shù)和單克隆抗體-a的濃度(右下)之間關(guān)系的圖。

圖11是8至10的三種制劑的δg的覆蓋圖。該圖顯示了單克隆抗體-a的δg隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而降低。

圖12是8至10的三種制劑的變性的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)的覆蓋圖。

圖13是8至10的三種制劑的聚集的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)的覆蓋圖。

圖14是8至10的三種制劑的聚集的，變性的單克隆抗體-a的分?jǐn)?shù)的覆蓋圖。

圖15顯示了基于制劑的ph和蛋白質(zhì)濃度的δg變化的圖。理想的蛋白質(zhì)制劑具有相對于溶劑的最大的δg，相對于時間的恒定的δg，以及相對于蛋白質(zhì)濃度的恒定的δg。疊加在曲線圖上的是具有特定ph的制劑的δg相對于蛋白質(zhì)濃度圖；鑒定在疊加圖(左箭頭)上的蛋白質(zhì)濃度是具有最大δg，但是顯著的蛋白質(zhì)濃度依賴性，并且鑒定在疊加圖(右箭頭)上的蛋白質(zhì)濃度具有最小的蛋白質(zhì)濃度依賴性。更后的蛋白質(zhì)濃度被認(rèn)為是“多參數(shù)最佳條件”。

圖16顯示了可以包括在本發(fā)明中的溶液和若干溶液的非限制性實施方式的圖。

具體實施方式

本發(fā)明涉及在盡可能早的時間中確定和表征蛋白質(zhì)聚集過程的方法和系統(tǒng)以及這些新方法和系統(tǒng)的用途，用于(1)鑒定和選擇具有最小化聚集和延長長期穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)制劑，和(2)鑒定具有最低聚集傾向的蛋白質(zhì)變體。

本發(fā)明提供了允許快速(例如，在24小時內(nèi))定量測定聚集的蛋白質(zhì)的量的方法。這種新方法基于蛋白質(zhì)的吉布斯能量穩(wěn)定性(δg)的濃度依賴性。對在不同蛋白質(zhì)濃度下測量δg提供了計算在變性或天然狀態(tài)中聚集的蛋白質(zhì)的量的必要信息。通常，如果δg隨蛋白質(zhì)濃度降低，則發(fā)生變性狀態(tài)下的聚集，而如果δg隨蛋白質(zhì)濃度增加，則發(fā)生天然狀態(tài)下的聚集。如果δg不隨蛋白質(zhì)濃度變化，則沒有聚集的趨勢。參見圖2。由于δg測量蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，其后目標(biāo)是確定最大化δg和同時最小化δg的濃度依賴性的最佳制劑或最佳蛋白質(zhì)變體。參見圖3。本文公開了δg的濃度依賴性的定量分析和在制備蛋白質(zhì)溶液之后很快估計聚集的方法。早期的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和聚集趨勢的知識提供了旨在確定最小化蛋白質(zhì)的聚集和延長蛋白質(zhì)的長期穩(wěn)定性的具體措施的關(guān)鍵信息。

使天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最大化并且防止聚集或其它不期望的過程的條件的確定，對于蛋白質(zhì)治療劑、蛋白質(zhì)制劑、過程開發(fā)條件、質(zhì)量控制以及堿性蛋白質(zhì)的科學(xué)發(fā)展是必需的。

在蛋白質(zhì)治療領(lǐng)域中，存在兩個階段，其中鑒定聚集趨勢是關(guān)鍵的：(1)選擇用于發(fā)展(通常稱為發(fā)展性評估)的最佳蛋白質(zhì)變體和(2)確定能確保最長的保質(zhì)期的制劑條件。生物制劑的長期穩(wěn)定性通常受到緩慢降低天然蛋白質(zhì)濃度的變性蛋白質(zhì)聚集體的出現(xiàn)和緩慢生長的阻礙。這個過程不僅減少了生物活性蛋白質(zhì)的量，因此降低了治療效力，而且可以引起不期望的不良反應(yīng)，包括免疫應(yīng)答。確定最佳蛋白質(zhì)變體或最佳制劑需要的能力來測量變性蛋白質(zhì)的濃度和以及時的方式聚集的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)。使用該信息，可以快速確定具有最佳穩(wěn)定性和聚集屬性的蛋白質(zhì)變體或制劑。

在這里，考慮兩種不同類型的蛋白質(zhì)：傾向于以其變性狀態(tài)聚集的蛋白質(zhì)和傾向于以其天然狀態(tài)聚集的蛋白質(zhì)。

i.變性狀態(tài)聚集

在制劑或蛋白質(zhì)溶液制備后立即直接測量變性蛋白質(zhì)的個數(shù)是極其困難的。新鮮制劑中變性蛋白質(zhì)的個數(shù)非常小(通常小于總蛋白的0.01％)，其通過常規(guī)技術(shù)下會逃逸檢測。盡管這一事實，變性蛋白質(zhì)的聚集是長期穩(wěn)定性的主要障礙，因為它緩慢生長并最終破壞蛋白質(zhì)原料的存活力。常用的評估變性狀態(tài)聚集的方法，如加速穩(wěn)定性或強制降解測定，本質(zhì)上旨在加速變性和聚集群體的積累至可測量水平。這些方法需要幾個月，并且不完全可靠，因為用于加速聚集的一些應(yīng)力不能模仿真實的生活情況。在蛋白質(zhì)溶液制備之后立即確定變性蛋白質(zhì)個數(shù)的替代方法依賴于天然和變性構(gòu)象之間的結(jié)構(gòu)平衡的評價。測定吉布斯能量穩(wěn)定性(δg^o)允許計算溶液中變性蛋白質(zhì)的量非常低的水平(小于總蛋白質(zhì)的0.001％)。此外，由于聚集和構(gòu)象平衡是熱力學(xué)相關(guān)聯(lián)的，我們將展示δg^o的蛋白質(zhì)濃度依賴性提供了評價制劑中蛋白質(zhì)聚集程度的關(guān)鍵信息。

圖1顯示了溶液中經(jīng)歷的基本的熱力學(xué)平衡的蛋白質(zhì)。天然狀態(tài)(紅色)與變性狀態(tài)(綠色)平衡存在，其具有以最終不可逆方式聚集的傾向。變性蛋白質(zhì)(fdenat)的個數(shù)或分?jǐn)?shù)等于變性蛋白質(zhì)(非聚集的和聚集的)的總濃度除以總蛋白質(zhì)濃度：

其中j是變性聚集體的平均低聚度。

在不存在聚集的情況下，等式1簡化為公知的等式：

其在任何恒定溫度下僅僅是吉布斯能量穩(wěn)定性(δg^o)的函數(shù)。k是也用δg^o定義的平衡常數(shù)等式2可以容易地推廣到蛋白質(zhì)表現(xiàn)出多個轉(zhuǎn)變的情況，因為每個轉(zhuǎn)變被描述類似于等式1或2。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的聚集或自締合不存在時，變性的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)與蛋白質(zhì)濃度無關(guān)，因為其僅取決于δg^o(等式2的右手側(cè))。

如果發(fā)生聚集，則情況不同，因為聚集是濃度依賴的現(xiàn)象。不受理論束縛，變性蛋白的聚集將增加k的值，而天然的聚集將降低其值；這些變化影響δg^o的大小。評價聚集或自締合的存在或不存在的實驗測試是評價不同蛋白質(zhì)濃度下的δg^o。如果δg^o與濃度無關(guān)，則不存在聚集。如果δg^o隨濃度降低，則存在變性的蛋白質(zhì)的聚集，而如果δg^o隨濃度增加，則存在天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集。

用于實驗測定δg^o的一種方法是差示掃描量熱法(dsc)。該方法涉及蛋白質(zhì)的熱變性。由于許多蛋白質(zhì)，特別是包含絕大多數(shù)生物制劑的單克隆抗體的熱變性是不可逆過程，因此dsc不能用于測量此類蛋白質(zhì)的熱力學(xué)穩(wěn)定性。因此，dsc的使用限于表現(xiàn)出可逆溫度變性的那些蛋白質(zhì)。

用于實驗測定δg^o的公認(rèn)方法包括用化學(xué)變性劑例如尿素和鹽酸胍測量蛋白質(zhì)的變性。吉布斯能量已經(jīng)通過實驗顯示對化學(xué)變性劑濃度是簡單線性依賴性的：

δg＝δg^o-m[變性劑](3)

其中δg^o是在零化學(xué)變性劑濃度下的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的吉布斯能量；即在沒有化學(xué)變性劑的實驗溫度和溶劑條件下蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。m是m值。

抗體的化學(xué)變性在溫度變性不發(fā)生的條件下通常是可逆的，因此允許δg^o測定?；瘜W(xué)變性可以在不同的蛋白質(zhì)濃度下進(jìn)行，因此允許直接測量δg^o的濃度依賴性。

吉布斯能量的濃度依賴性

如果變性狀態(tài)具有聚集的傾向(圖1)，則聚集過程可以根據(jù)表觀聚集常數(shù)來描述，其中j是聚集體的平均低聚度。這里，表觀或觀察到的平衡常數(shù)kapp定義為變性蛋白質(zhì)(非聚集的+聚集的)的總濃度與天然蛋白質(zhì)的濃度的比率：

相應(yīng)地，表觀吉布斯能量變?yōu)椋?/p>

在等式5中，等于外推至零蛋白質(zhì)濃度的吉布斯能量的值(實際上，聚集中不存在足夠低的濃度)。等式5表示變性狀態(tài)的聚集將導(dǎo)致測量的吉布斯能量，δgapp，作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)降低，并且降低的幅度與聚集常數(shù)和聚集體的平均尺寸成比例。如果蛋白質(zhì)以天然狀態(tài)聚集，則δgapp的濃度依賴性將通過與等式5類似的等式來描述，除了負(fù)號將由加號代替。在這種情況下，測量的吉布斯能量，δgapp，將隨著蛋白質(zhì)的濃度增加。

圖4b顯示了δg和α-胰凝乳蛋白酶濃度的實驗濃度依賴性。α-胰凝乳蛋白酶的δg隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而降低；因此，α-胰凝乳蛋白酶是在其變性狀態(tài)下聚集的蛋白質(zhì)。類似地，在圖6a中，顯示了δgapp對西妥昔單抗的實驗濃度依賴性。在這種情況下，δgapp如在變性狀態(tài)中聚集的蛋白質(zhì)所預(yù)期的隨著蛋白質(zhì)的濃度降低。

聚集的蛋白質(zhì)的個數(shù)

根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)方程計算聚集的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)：

根據(jù)等式5，顯然如果其濃度依賴性是已知的，則術(shù)語jkj[d]^j-1可以僅僅根據(jù)測量的δg來表示：

其中方程7允許估計聚集的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)，而不需要知道游離變性濃度([d])，聚集常數(shù)和平均聚集度。以類似的方式，變性的蛋白質(zhì)fdenat的分?jǐn)?shù)可以表示為：

在典型的制劑情況下，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是天然構(gòu)象，因此變性蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)非常小。對于其中δg為8kcal/mol量級的典型蛋白質(zhì)，變性分?jǐn)?shù)為10^-6的量級。從長期穩(wěn)定性的觀點來看，臨界量是聚集的變性的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)(fagg的fdenat)。聚集的變性的蛋白質(zhì)即使最初的量非常小，也將作為在延長的時間段內(nèi)將使平衡向變性的和聚集的蛋白質(zhì)的量增加的低點。這種漸進(jìn)聚集的過程將最終使得溶液無用或在治療上不可行。聚集的變性的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)由下式給出：

圖6b至d顯示了可以從圖6a中的西妥昔單抗的數(shù)據(jù)分析中獲得的三個部分的個數(shù)。類似地，圖7a顯示δgapp對單克隆抗體的實驗濃度依賴性，圖7b至d顯示了可從圖7a中的數(shù)據(jù)的分析獲得的三個部分的個數(shù)。此外，圖8至圖11顯示了δgapp對單克隆抗體-a的實驗濃度依賴性，圖8至圖10和圖12至圖14顯示了從實驗數(shù)據(jù)的分析獲得的三個部分的個數(shù)。

如圖所示，變性的蛋白質(zhì)和聚集的蛋白質(zhì)的量非常小，如在新鮮制備的溶液中所預(yù)期的。變性的部分的量約為10^-6。這些低量不可能用常規(guī)技術(shù)(例如，尺寸排阻色譜和光散射)測量，但可以從δgapp精確計算。從長期穩(wěn)定性的觀點來看，重要的觀察的是大多數(shù)變性蛋白質(zhì)聚集體。即使在0.18mg/ml的相對低的濃度下，超過95％的變性的蛋白質(zhì)也聚集。具有高聚集傾向的變性的蛋白質(zhì)將最終耗盡天然和活性蛋白質(zhì)的個數(shù)并導(dǎo)致差的長期穩(wěn)定性。

成功的制劑策略是使變性的蛋白質(zhì)的量最小化并同時使聚集的變性的蛋白質(zhì)的比例最小化。從熱力學(xué)角度看，策略意味著同時最大化δgapp和最小化其蛋白質(zhì)的濃度依賴性。參見圖15

根據(jù)上述方法，對于已變性狀態(tài)聚集的蛋白質(zhì)，具有相對于溶劑的最大δg，相對于時間的恒定δg，以及相對于蛋白質(zhì)濃度的δg(即，最小蛋白質(zhì)濃度依賴性)的理想的蛋白質(zhì)制劑可以被測定。同樣，根據(jù)上述方法，對于在變性狀態(tài)下聚集的蛋白質(zhì)，具有相對于溶劑的最大δg，相對于時間的恒定δg，以及相對于其它蛋白質(zhì)的變體的蛋白質(zhì)濃度的δg(即，最小蛋白質(zhì)濃度依賴性)的蛋白質(zhì)變體可以被測定。

ii.天然狀態(tài)聚集

如果天然狀態(tài)具有聚集的傾向(圖1，左側(cè))，則聚集過程可以根據(jù)表觀聚集常數(shù)kn,i,來描述，類似于上面針對變性狀態(tài)聚集其中i是天然狀態(tài)聚集體的平均低聚度。在這種情況下，表觀或觀察到的平衡常數(shù)kapp定義為變性蛋白質(zhì)的總濃度與天然蛋白質(zhì)的濃度(非聚集和聚集)的比率：

相應(yīng)地，表觀吉布斯能量變?yōu)椋?/p>

在等式11中，等于外推到零蛋白質(zhì)濃度的吉布斯能量的值(實際上，不聚集中不存在足夠低的濃度)。等式11表示天然狀態(tài)的聚集將導(dǎo)致測量的吉布斯能量，δgapp，作為蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)增加，并且增加的幅度與聚集常數(shù)和聚集體的平均尺寸成比例。該等式類似于等式5，除了負(fù)號被加號替代。

天然狀態(tài)聚集蛋白的個數(shù)

根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)方程計算聚集的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)：

如在變性聚集的情況下，如果其濃度依賴性已知，則術(shù)語ikn，i[n]^i-1可以僅僅根據(jù)測量的δg來表示：

其中等式13類似于等式7，并且其允許估計天然狀態(tài)聚集蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)，而不需要知道聚集常數(shù)和平均聚集度。以類似的方式，變性蛋白質(zhì)，fdenat，的分?jǐn)?shù)可以表示為：

在典型的制劑情況下，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是天然構(gòu)象，因此變性蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)非常小。對于其中δg為8kcal/mol量級的典型蛋白質(zhì)，變性分?jǐn)?shù)為10^-6數(shù)量級。從長期穩(wěn)定性的觀點來看，臨界量是聚集的變性蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)(fagg的fdenat)。

圖4a顯示了δg對hiv-1蛋白酶濃度的實驗濃度依賴性；hiv-1蛋白酶的δg隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增加；因此，hiv-1蛋白酶是在其天然狀態(tài)下是二聚體的蛋白質(zhì)。圖5顯示了曲妥珠單抗的δgapp的實驗濃度依賴性，已知其在5％葡萄糖存在下容易聚集。在這種情況下，δgapp隨著蛋白質(zhì)的濃度增加，如對于以天然狀態(tài)聚集的蛋白質(zhì)所預(yù)測的。

成功的制劑策略是使變性蛋白質(zhì)的量最小化并同時使聚集的變性蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)最小化。從熱力學(xué)角度來看，策略意味著同時最大化δgapp和最小化其蛋白質(zhì)濃度依賴性的策略。

根據(jù)上述方法，對于以天然狀態(tài)聚集的蛋白質(zhì)，具有相對于溶劑的最大δg，相對于時間的恒定δg，以及相對于蛋白質(zhì)濃度的δg(即，最小蛋白質(zhì)濃度依賴性)的理想蛋白質(zhì)制劑可以被測定。同樣，根據(jù)上述方法，對于在天然狀態(tài)下聚集的蛋白質(zhì)，具有相對于溶劑的最大δg，相對于時間的恒定δg，以及相對于其它蛋白質(zhì)的變體的蛋白質(zhì)濃度的δg(即，最小蛋白質(zhì)濃度依賴性)的蛋白質(zhì)變體可以被測定。

本發(fā)明的系統(tǒng)可以包括具有控制器的裝置，該控制器具有處理單元和存儲元件。存儲元件可以是ram、dram、rom、閃存rom、eerom、磁介質(zhì)或適于保持計算機可讀數(shù)據(jù)和指令的任何其它介質(zhì)。指令可以是執(zhí)行至少本文所述的任何方程的計算所必需的指令。處理單元可以是專用微控制器，個人計算機或任何其他合適的計算設(shè)備。此外，該設(shè)備具有泵或虹吸系統(tǒng)，其允許其以精確量從多個井中提取液體，并且優(yōu)選在另一個井中將這些液體混合在一起。該裝置還具有測量和記錄制劑的熒光的裝置，例如通過使用套管將液體吸入市售的熒光檢測器中。該裝置還包括一個或多個致動器，其可以將套管從一個位置移動到另一個位置，以便從第一井吸取流體并將流體排出到第二井中。這些插管可用于制備產(chǎn)生變性圖所需的制劑，并制備蛋白在緩沖液中的制劑。

先前已經(jīng)描述了本發(fā)明中有用的方法，系統(tǒng)和裝置，例如在美國專利8,859,295、美國專利8,609,040、美國專利9,029,163和美國專利2012/0045846中，其各自通過引用的方式全部并入本申請。

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