本發(fā)明涉及一種對(duì)血液等生物樣品中的分析物進(jìn)行測(cè)定的方法，其是用具有特定成分的緩沖液稀釋生物樣品，由稀釋樣品中的混合溶液對(duì)血漿樣品成分或酶活性進(jìn)行分析的測(cè)定方法。本發(fā)明還涉及一種微量生物樣品成分的分析方法與血細(xì)胞的計(jì)數(shù)測(cè)定，其用規(guī)定緩沖液稀釋未定量的微量血液等生物樣品，由稀釋的樣品混合溶液對(duì)血漿樣品成分的定量和酶活性進(jìn)行分析。
背景技術(shù)：
：患者或受試者為了各種疾病的診斷、治療效果的判斷和健康管理，需要前往醫(yī)療機(jī)構(gòu)或體檢場(chǎng)所，從靜脈采集血液進(jìn)行檢查。但是，為獲知檢查結(jié)果需要長(zhǎng)時(shí)間等待。此外，存在著為檢查而需要請(qǐng)假半天以上工作時(shí)間的問(wèn)題。作為可在任意時(shí)間任意地點(diǎn)都可以進(jìn)行血液檢查的方法，報(bào)道了用加入內(nèi)標(biāo)物的緩沖液稀釋微量血液，由內(nèi)標(biāo)物的稀釋倍數(shù)來(lái)對(duì)稀釋血漿中未知量的存在成分量進(jìn)行定量的方法(例如，參見(jiàn)專利文獻(xiàn)1)。具體而言，作為用規(guī)定緩沖液稀釋微量血液，由稀釋的樣品混合溶液對(duì)血漿樣品成分的定量和酶活性進(jìn)行分析的方法，已知使用甘油-3-磷酸或甘油作為內(nèi)標(biāo)物的方法(例如，參見(jiàn)專利文獻(xiàn)2)。此外，已知血細(xì)胞成分的計(jì)數(shù)測(cè)定中作為其稀釋內(nèi)標(biāo)物而使用酪胺的方法(例如，參見(jiàn)專利文獻(xiàn)3)。另一方面，作為由微量血液進(jìn)行檢查的方法，報(bào)道了作為采集血液的方法而使用濾紙的方法(例如，參見(jiàn)專利文獻(xiàn)4)。通過(guò)利用微量血液，無(wú)需選擇時(shí)間與場(chǎng)所就可以進(jìn)行檢查，期待著能夠有助于出現(xiàn)癥狀前發(fā)現(xiàn)或保持健康?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)2003-161729號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2：日本特開(kāi)2006-322829號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3：日本特開(kāi)2011-112451號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4：日本特開(kāi)平10-104226號(hào)公報(bào)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的問(wèn)題但是，上述現(xiàn)有的稀釋率計(jì)算方法中，作為血漿的稀釋內(nèi)標(biāo)物利用甘油-3-磷酸，但被存在于生物內(nèi)的酶堿性磷酸酶水解，生成甘油。因此，如果添加血液后的保存時(shí)間長(zhǎng)、或者溫度高，則不能得到準(zhǔn)確的血液稀釋率。由此，對(duì)原血漿中的生物成分或酶活性的測(cè)定值的可靠性降低。為解決這種狀況而需要在現(xiàn)有方法中添加酶抑制劑edta。但是，該抑制劑的添加并不能完全抑制酶，因此需要進(jìn)一步添加作為生成物抑制劑的磷酸，由于這兩種物質(zhì)的添加而使天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶或谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性下降。其結(jié)果是需要過(guò)度添加這些酶的活性劑磷酸吡哆醛。作為解決這些問(wèn)題的內(nèi)標(biāo)物，可將膽堿等陽(yáng)離子帶電的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)利用，但觀察到吸附到塑料容器上，存在著不適于長(zhǎng)時(shí)間保存的問(wèn)題。對(duì)于這些物質(zhì)，作為〔專利文獻(xiàn)2〕提出了申請(qǐng)，但分子內(nèi)有芳香環(huán)，因而疏水性高，如果長(zhǎng)期保存于塑料容器中則發(fā)生吸附，存在著不能準(zhǔn)確求出血液的稀釋倍數(shù)的問(wèn)題。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了乙醇胺等化合物作為分子內(nèi)沒(méi)有芳香環(huán)、滲透到血細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)是有效的。這些物質(zhì)基本上不存在于血液中，而且是穩(wěn)定的化合物。此外，能夠溶于內(nèi)標(biāo)液的緩沖液中，不會(huì)因長(zhǎng)期保存而吸附到塑料容器上。為了解決上述問(wèn)題而完成了本發(fā)明，目的在于提供稀釋率計(jì)算方法，該方法能夠簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確地定量從受試者手指等體表采集并稀釋的少量且未知量的全血樣品的成分。此外，專利文獻(xiàn)3中記載的方法，作為內(nèi)標(biāo)物的甘油-3-磷酸作為穩(wěn)定的化合物而一直以來(lái)被利用，但在樣品少時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的稀釋率小，存在著其稀釋倍數(shù)的可靠性降低的問(wèn)題。此外，如專利文獻(xiàn)4中記載的，在濾紙或多孔質(zhì)材料吸收血液后，使其干燥并郵寄，提取血液成分的方法在干燥過(guò)程或郵寄時(shí)成分有時(shí)發(fā)生變性。此外，從干燥樣品提取生物成分的緩沖液為了調(diào)節(jié)ph或生物成分穩(wěn)定化而需要利用添加有naoh或nacl、hcl的緩沖液。因此，樣品組分中最平衡、個(gè)體間差異小的鈉或氯的濃度不能用作對(duì)稀釋的原來(lái)的其他生物成分濃度進(jìn)行校正的外標(biāo)物。另一方面，用緩沖液稀釋的方法用ph7.4的生理?xiàng)l件下的緩沖液保存生物樣品中的生物成分，在輸送中的穩(wěn)定性也優(yōu)異，但添加內(nèi)標(biāo)物緩沖液形成的樣品中內(nèi)標(biāo)物的稀釋率小，添加少量樣品容易產(chǎn)生測(cè)定誤差。本發(fā)明的目的在于提供對(duì)生物樣品中的分析物進(jìn)行定量分析的方法，其是用緩沖液稀釋生物樣品而對(duì)生物樣品中的分析物進(jìn)行分析的方法，其中，對(duì)用緩沖液稀釋生物成分的樣品中的生物成分濃度，由作為外標(biāo)的樣品中恒定的成分的稀釋率來(lái)準(zhǔn)確地求出生物樣品的稀釋倍數(shù)。進(jìn)一步，本發(fā)明的目的在于提供對(duì)生物樣品中的分析物進(jìn)行定量分析的方法，其是用緩沖液稀釋生物樣品而對(duì)生物樣品中的分析物進(jìn)行分析的方法，其中彌補(bǔ)了用內(nèi)標(biāo)物求出生物樣品的稀釋倍數(shù)的方法、用外標(biāo)物求出生物樣品的稀釋倍數(shù)的方法兩者的缺點(diǎn)，準(zhǔn)確地求出生物樣品的稀釋倍數(shù)。解決問(wèn)題的技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明其特征在于，在對(duì)血液等生物樣品中的生物成分進(jìn)行分析時(shí)，1.利用內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行分析、2.利用外標(biāo)物、或者3.利用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物。1.利用內(nèi)標(biāo)物的分析方法(內(nèi)標(biāo)法)本發(fā)明是對(duì)血液等生物樣品中的生物成分進(jìn)行分析的方法，其特征在于，對(duì)添加所述血液等生物樣品的稀釋緩沖液和該稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行分析并計(jì)算稀釋率，計(jì)算血漿、血清或血細(xì)胞生物成分的稀釋率，從而對(duì)所述血液等生物樣品中的血漿、血清或生物樣品中的生物成分進(jìn)行分析。本發(fā)明的血漿樣品生物樣品成分的分析方法中，所述緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物為長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定、不會(huì)吸附到裝入所述緩沖液的容器上的成分，所述內(nèi)標(biāo)物是在所述血液等生物樣品中基本上不含有的物質(zhì)，優(yōu)選能夠用自動(dòng)生化分析裝置等容易且高精度地進(jìn)行分析的物質(zhì)。此外，在本發(fā)明的血漿樣品生物樣品成分的分析方法中，所述緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物為不滲透到所述血細(xì)胞內(nèi)的成分，優(yōu)選能夠準(zhǔn)確反映所述血漿或所述血清的稀釋率的物質(zhì)。同樣在血細(xì)胞數(shù)的計(jì)算方法中，所述緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物為滲透到所述血細(xì)胞內(nèi)的成分，優(yōu)選能夠準(zhǔn)確反映所述全血(血漿和血細(xì)胞)的稀釋率的物質(zhì)。進(jìn)一步，本發(fā)明的生物樣品成分的分析方法中，所述緩沖液相對(duì)于血細(xì)胞膜的滲透壓為250～500mosm/kg，優(yōu)選緩沖液中具有即使與血液混合也不使所述血細(xì)胞發(fā)生溶血的試劑成分。進(jìn)一步此外，本發(fā)明的生物樣品成分的分析方法中，優(yōu)選所述緩沖液中具有不使所述血液中的生物樣品成分發(fā)生變性并能夠穩(wěn)定地保持的組成。進(jìn)一步，本發(fā)明的生物樣品成分的分析方法中，優(yōu)選血漿內(nèi)標(biāo)物含有鋰或麥芽糖。由血漿的稀釋率可以求出血漿濃度，但不能求出血細(xì)胞的體積。如果能求出血液全血(血漿和血細(xì)胞)，則可以進(jìn)行貧血檢查。于是，作為滲透到血細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)標(biāo)物，優(yōu)選含有疏水性且不吸附到塑料的乙醇胺。通過(guò)測(cè)定該內(nèi)標(biāo)可求出整體血液的稀釋率。由血液的血漿稀釋率和整體血液稀釋率可求出血細(xì)胞的容積比率(血細(xì)胞比容值)。即，本發(fā)明如下所述：[1-1]一種使用內(nèi)標(biāo)物的生物樣品成分的分析方法，該方法使用用于加入血液樣品的稀釋緩沖液，分析該稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算血漿或血清的稀釋率，從而對(duì)所述血液樣品中的血漿或血清成分中的生物成分進(jìn)行分析，其中，所述稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物具有不滲透到血細(xì)胞中的性質(zhì)，所述內(nèi)標(biāo)物選自由包括麥芽糖的二糖、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋(píng)果酸、trinder試劑和鋰構(gòu)成的組的物質(zhì)。[1-2]如[1-1]的生物樣品成分的分析方法，其中，稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物為鋰。[1-3]一種使用內(nèi)標(biāo)物的生物樣品成分的分析方法，該方法使用用于加入血液樣品的稀釋緩沖液，分析該稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物，計(jì)算血液的稀釋率，從而對(duì)所述血液樣品中的血細(xì)胞計(jì)數(shù)或血漿的生物成分進(jìn)行分析，其中，所述稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物具有滲透到血細(xì)胞中的性質(zhì)，所述內(nèi)標(biāo)物選自由乙醇胺、己胺、苯乙胺、戊胺、組胺、腐胺、次黃嘌呤、色氨酸、孕烯醇酮和β-谷甾醇構(gòu)成的組的物質(zhì)。[1-4]一種生物樣品成分的分析方法，該方法使用用于加入血液樣品的稀釋緩沖液，分析該稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物，血液或計(jì)算血漿或血清的稀釋率，從而對(duì)所述血液樣品中的血細(xì)胞計(jì)數(shù)或血漿的生物成分或者所述血液樣品中的血漿或血清成分中的生物成分進(jìn)行分析，其中，所述稀釋緩沖液含有：具有不滲透到血細(xì)胞中的性質(zhì)的所述內(nèi)標(biāo)物，所述內(nèi)標(biāo)物選自由鋰、包括麥芽糖的二糖、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋(píng)果酸和trinder試劑構(gòu)成的組的物質(zhì)；以及具有滲透到血細(xì)胞中的性質(zhì)的所述內(nèi)標(biāo)物，所述內(nèi)標(biāo)物選自由乙醇胺、己胺、苯乙胺、戊胺、組胺、腐胺、次黃嘌呤、色氨酸、孕烯醇酮和β-谷甾醇構(gòu)成的組的物質(zhì)。[1-5]如[1-1]的生物樣品成分的分析方法，其中，所述稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物為分子量在500以下的化學(xué)物質(zhì)，且選自于在分子內(nèi)具有選自由硫酸根離子即-so3-、羧酸根離子即-coo-、硫醇基即-sh和季胺即-nh3+的構(gòu)成的組的取代基的化合物。[1-6]如[1-1]的生物樣品成分的分析方法，其中，所述稀釋緩沖液中含有的內(nèi)標(biāo)物為trinder試劑，該trinder試劑為選自由ados(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、adps(n-乙基-n-磺丙基-3-甲氧基苯胺)、alps(n-乙基-n-磺丙基苯胺)、daos(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、hdaos(n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、maos(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺)、toos(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)和tops(n-乙基-n-磺丙基-3-甲基苯胺)構(gòu)成的組的化合物。[1-7]如[1-1]～[1-6]中任一項(xiàng)所述的生物樣品成分的分析方法，其中，所述稀釋緩沖液具有即使與血液混合也不使所述血細(xì)胞發(fā)生溶血的試劑成分。[1-8]如[1-1]～[1-7]中任一項(xiàng)所述的生物樣品成分的分析方法，其中，為了使所述血液中的生物樣品成分不發(fā)生變性并能夠穩(wěn)定地保持，所述稀釋緩沖液中根據(jù)被測(cè)成分而單獨(dú)或多個(gè)組合地含有如下添加物：乙二胺四乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽等螯合劑；硫酸阿米卡星鹽、硫酸卡那霉素鹽、噻苯咪唑、疊氮化鈉等抗菌劑或防腐劑；磷酸吡哆醛、鎂、鋅等輔酶；甘露醇、右旋糖、寡糖等糖類；選自由十二烷基硫酸鈉、汞、肝素構(gòu)成的組的抑制劑。[1-9]如[1-4]的生物樣品成分的分析方法，其特征在于，由所述內(nèi)標(biāo)物的稀釋率計(jì)算血液的血細(xì)胞容積率(血細(xì)胞比容值)。2.利用外標(biāo)物的分析方法(外標(biāo)法)已知血液中的鈉或氯具有非常高的平衡性，個(gè)體間變動(dòng)也小。該鈉的中位值濃度142mmol/l與生物濃度均高，因此即使用緩沖液稀釋，也可以高精度地測(cè)定高稀釋倍數(shù)的樣品濃度。但是，將鈉或氯用作外標(biāo)時(shí)，不能將含鈉或氯的緩沖液用作稀釋用緩沖液。本發(fā)明人首先研究了使用體內(nèi)平衡性高的鈉、氯或蛋白質(zhì)作為外標(biāo)物。為使用這些外標(biāo)物，需要在稀釋生物樣品的緩沖液中避免鈉或氯的存在。之前不存在有在ph7.4附近有緩沖能力且不含有堿(naoh等)的緩沖液。本發(fā)明人嘗試進(jìn)行新型緩沖液的開(kāi)發(fā)，作為不含堿金屬類(naoh等)或氯離子卻表現(xiàn)堿性的化合物，利用了2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基氨基乙醇、n-甲基-d-葡糖胺、二乙醇胺、三乙醇胺等氨基醇化合物。新發(fā)現(xiàn)通過(guò)將這些化合物中與作為生化研究用具有優(yōu)異性能的good's緩沖液，即與作為酸的pka在ph7.4附近的緩沖液的hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、tes(n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、mops(3-嗎啉丙磺酸)、bes(n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)進(jìn)行混合可調(diào)節(jié)至ph7.4。此外，發(fā)現(xiàn)這些緩沖液不含有作為外標(biāo)物一例的鈉或氯，且不對(duì)測(cè)定對(duì)象鈉或氯的測(cè)定體系產(chǎn)生干擾。進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)用這些緩沖液稀釋的成分即使利用自動(dòng)生化免疫分析裝置進(jìn)行的各種測(cè)定法也不產(chǎn)生干擾，而且血細(xì)胞不發(fā)生溶血、生物成分即使在37℃下也能穩(wěn)定地保存。此外，為了測(cè)定用緩沖液稀釋的血漿中的生物成分，緩沖劑成分不會(huì)使這些生物成分發(fā)生變性，不對(duì)穩(wěn)定性帶來(lái)影響。作為其中一例，發(fā)現(xiàn)將2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)與hepes混合并調(diào)節(jié)至ph7.4的緩沖液不對(duì)生物成分給予變性，表現(xiàn)穩(wěn)定，對(duì)這些生物成分的測(cè)定試劑也不產(chǎn)生干擾。還發(fā)現(xiàn)了對(duì)用稀釋用緩沖液稀釋的生物樣品中低濃度鈉進(jìn)行準(zhǔn)確定量的方法。本發(fā)明將在生物樣品中保持恒定濃度的血漿中的鈉等用作外標(biāo)物，這些物質(zhì)為元素，為穩(wěn)定的生物成分。通過(guò)準(zhǔn)確測(cè)定作為用緩沖液稀釋的外標(biāo)物鈉等來(lái)求出血漿的稀釋倍數(shù)，從而可用市售的自動(dòng)生化免疫分析裝置高效地對(duì)采集血液中未知濃度的稀釋血漿生物樣品成分的定量和酶活性進(jìn)行多樣品分析。即，本發(fā)明如下所述。[2-1]一種血液樣品中的分析物的定量分析方法，其是用稀釋用緩沖液稀釋微量血液樣品而對(duì)分析血液中的分析物進(jìn)行定量的方法，所述方法包括使用外標(biāo)物計(jì)算血液樣品的稀釋倍數(shù)，其中，外標(biāo)物是在血液樣品中恒定地以規(guī)定濃度含有的成分，所述稀釋用緩沖液中不含有對(duì)外標(biāo)物的定量產(chǎn)生干擾的成分，所述方法包括對(duì)用稀釋用緩沖液稀釋的血液樣品中的外標(biāo)物濃度進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)它們的測(cè)定值計(jì)算血液樣品的稀釋倍數(shù)。[2-2]一種血液樣品中的分析物的定量分析方法，其包括對(duì)用稀釋用緩沖液稀釋的血液樣品中的外標(biāo)物濃度進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)它們的測(cè)定值計(jì)算血液樣品的稀釋倍數(shù)。[2-3]如[2-1]或[2-2]的定量分析方法，其中，外標(biāo)物選自由鈉、氯、白蛋白和總蛋白構(gòu)成的組。[2-4]如[2-3]的定量分析方法，其中，外標(biāo)物選自由鈉、氯和總蛋白構(gòu)成的組。[2-5]如[2-1]～[2-4]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法，其中，稀釋用緩沖液中含有選自由2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基氨基乙醇、n-甲基-d-葡糖胺、二乙醇胺和三乙醇胺的構(gòu)成的組的氨基醇化合物，以及含有選由于hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、tes(n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、mops(3-嗎啉丙磺酸)和bes(n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)構(gòu)成的組的緩沖劑作為緩沖劑成分，且在ph7.4具有緩沖作用。[2-6]如[2-1]～[2-4]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法，其中，稀釋用緩沖液實(shí)質(zhì)上不含鈉和氯。[2-7]如[2-1]～[2-6]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法，其中，微量血液樣品的稀釋倍數(shù)由下述計(jì)算式(i)的計(jì)算式進(jìn)行計(jì)算，對(duì)稀釋血漿中的分析物進(jìn)行定量，乘以用計(jì)算式(i)求得的稀釋倍數(shù)，從而對(duì)原血漿中的分析物進(jìn)行定量：a：血漿中外標(biāo)物濃度的正常人中位值的吸光度b：稀釋血漿中外標(biāo)物的吸光度x：血漿稀釋倍數(shù)[其中，稀釋血漿是指用稀釋用緩沖液稀釋血液樣品并除去血細(xì)胞得到的血漿]。[2-8]如[2-3]～[2-7]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法，其利用β-半乳糖苷酶的酶活性隨鈉離子濃度而變化，從而能夠由β-半乳糖苷酶的吸光度變化量對(duì)鈉離子濃度進(jìn)行定量，用下述方法測(cè)定用稀釋用緩沖液稀釋的血液樣品中的鈉：用稀釋用緩沖液稀釋生物樣品，進(jìn)一步用純水稀釋，以樣品量的10～30倍體積量添加含β-半乳糖苷酶的緩沖液即第一試劑，在30～45℃下加溫2～20分鐘，以第一試劑量的半量添加含鄰硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷的底物溶液即第二試劑，在主波長(zhǎng)410nm、副波長(zhǎng)658nm處測(cè)定反應(yīng)速度的吸光度。[2-9]一種緩沖液，其是在如[2-1]～[2-8]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法中用于稀釋微量血液樣品的稀釋用緩沖液，所述緩沖液含有選自由2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基氨基乙醇、n-甲基-d-葡糖胺、二乙醇胺和三乙醇胺構(gòu)成的組的氨基醇化合物，以及含有選自由hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、tes(n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、mops(3-嗎啉丙磺酸)和bes(n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)構(gòu)成的組的緩沖劑作為緩沖劑成分，且在ph7.4具有緩沖作用。[2-10]如[2-9]的緩沖液，其實(shí)質(zhì)上不含鈉和氯。3.利用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物的分析方法(雜交法)如上所述，通過(guò)單獨(dú)利用內(nèi)標(biāo)物的分析方法和單獨(dú)利用外標(biāo)物的分析方法，能夠達(dá)到準(zhǔn)確地測(cè)定微量生物樣品中的分析物生物成分。本發(fā)明人為了進(jìn)一步準(zhǔn)確地測(cè)定，對(duì)兼具利用內(nèi)標(biāo)物方法的優(yōu)勢(shì)與利用外標(biāo)物方法二者的優(yōu)勢(shì)，且對(duì)彌補(bǔ)利用內(nèi)標(biāo)物方法的缺點(diǎn)與利用外標(biāo)物方法的缺點(diǎn)的方法進(jìn)行了深入研究。如上所述，通過(guò)使用體內(nèi)平衡性高的鈉、氯、蛋白質(zhì)作為外標(biāo)物，且使用不含利用為外標(biāo)物的物質(zhì)的緩沖液，能夠準(zhǔn)確地測(cè)定。但是，即使在健康人中具有高平衡性的物質(zhì)，因受試者也有偏離健康人濃度范圍的情況，此時(shí)，會(huì)影響到準(zhǔn)確地測(cè)定。另一方面，稀釋用緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物可設(shè)定為高濃度，因此能夠高精度地測(cè)定。但是，生物樣品的量少時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的稀釋變少，導(dǎo)致稀釋倍數(shù)的可靠性降低。此外，作為有機(jī)化合物的內(nèi)標(biāo)物，可利用甘油-3-磷酸為穩(wěn)定的物質(zhì)，作為無(wú)機(jī)物的內(nèi)標(biāo)物，適合利用鋰。本發(fā)明人對(duì)能夠消除單獨(dú)使用外標(biāo)物方法的缺點(diǎn)與能夠消除單獨(dú)使用內(nèi)標(biāo)物方法的缺點(diǎn)的方法開(kāi)發(fā)進(jìn)行了深入研究。本發(fā)明人對(duì)為了消除現(xiàn)有內(nèi)標(biāo)物的缺點(diǎn)而使用穩(wěn)定性高的堿金屬類或?qū)儆趬A土金屬類的元素，作為外標(biāo)物使用體內(nèi)平衡性高的鈉、氯或蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。通過(guò)組合內(nèi)標(biāo)物與生物樣品中的平衡性高的成分的外標(biāo)物并同時(shí)使用，作為測(cè)定精度高的定量法，可以成為彌補(bǔ)使用內(nèi)標(biāo)物方法和使用外標(biāo)物的兩個(gè)定量法缺點(diǎn)且可靠性高的稀釋成分定量法，于是完成了本發(fā)明。本發(fā)明具有如下特征。將生物樣品中保持恒定濃度的血漿中的鈉等用作外標(biāo)物，此外使用血漿中完全不含有或者幾乎不含有的成分作為內(nèi)標(biāo)物即使用不通過(guò)血細(xì)胞膜的鋰等堿金屬類或?qū)儆趬A土金屬類的元素、穩(wěn)定的甘油-3-磷酸作為內(nèi)標(biāo)物，將其添加到緩沖液中。將現(xiàn)有的有機(jī)化合物用作內(nèi)標(biāo)物時(shí)，還有受到生物酶作用的保存穩(wěn)定性的問(wèn)題。此內(nèi)標(biāo)物在緩沖液中長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定，可容易地進(jìn)行定量。此外測(cè)定的生物樣品中的外標(biāo)物的鈉也是元素并因此穩(wěn)定。其結(jié)果可以用市售的自動(dòng)生化免疫分析裝置高效地對(duì)采集血液中的未知濃度的稀釋血漿生物樣品成分的定量和酶活性進(jìn)行多樣品分析。即，本發(fā)明如下所述。[3-1]一種血液樣品中的分析物的定量分析方法，其是用稀釋用緩沖液稀釋樣品而對(duì)分析血液中的分析物進(jìn)行定量的方法，所述方法包括使用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物計(jì)算血液樣品的稀釋倍數(shù)，其中，內(nèi)標(biāo)物以規(guī)定濃度添加到稀釋用緩沖液中，外標(biāo)物是在血液樣品中恒定地以規(guī)定濃度含有的成分，所述稀釋用緩沖液中不含有對(duì)內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物的定量產(chǎn)生干擾的成分，所述方法包括對(duì)用稀釋用緩沖液稀釋的血液樣品中的內(nèi)標(biāo)物濃度與外標(biāo)物濃度進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)它們的測(cè)定值計(jì)算血液樣品的稀釋倍數(shù)。[3-2]一種定量分析方法，其通過(guò)使用所述外標(biāo)物濃度的測(cè)定值對(duì)由所述內(nèi)標(biāo)物濃度的測(cè)定值求得的血液樣品的稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正，從而對(duì)所述血液樣品中的分析物進(jìn)行定量分析。[3-3]如[3-1]或[3-2]的定量分析方法，其中，內(nèi)標(biāo)物為屬于堿金屬類或堿土金屬類的元素，外標(biāo)物選自由鈉、氯、白蛋白和總蛋白構(gòu)成的組。[3-4]如[3-3]的定量分析方法，其中，內(nèi)標(biāo)物為鋰或甘油-3-磷酸，外標(biāo)物為鈉。[3-5]如[3-1]～[3-4]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法，其中，稀釋用緩沖液中含有選自由2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基氨基乙醇、n-甲基-d-葡糖胺、二乙醇胺和三乙醇胺的構(gòu)成的組的氨基醇化合物，以及含有選自由hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、tes(n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、mops(3-嗎啉丙磺酸)和bes(n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)的構(gòu)成的組的緩沖劑作為緩沖劑成分，且具有ph6.5～ph8.0的緩沖作用。[3-6]如[3-5]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法，其中，稀釋用緩沖液實(shí)質(zhì)上不含鈉和氯。[3-7]如[3-1]～[3-6]中任一項(xiàng)所述的定量分析方法，其中，微量血液樣品的稀釋倍數(shù)由下述計(jì)算式(1)～(4)中任一個(gè)計(jì)算式進(jìn)行計(jì)算，對(duì)稀釋血漿中的分析物進(jìn)行定量，乘以用計(jì)算式(1)～(4)中任一個(gè)求得的稀釋倍數(shù)，從而對(duì)原血漿中的分析物進(jìn)行定量：計(jì)算式(1)計(jì)算式(2)計(jì)算式(3)x＝a×(b+d)±b(3)其中，a和b為系數(shù)，預(yù)先獲取b+d與稀釋倍數(shù)的數(shù)據(jù)，制作以x＝a×(b+d)±b表示的標(biāo)準(zhǔn)曲線；以及計(jì)算式(4)x＝a/b'(4)其中，b'＝(a×d)/c，上述各式中，a、b、c、d、b'及x定義如下：a：添加有內(nèi)標(biāo)物的緩沖液中內(nèi)標(biāo)物的吸光度b：稀釋血漿中內(nèi)標(biāo)物的吸光度c：血漿中外標(biāo)物濃度的正常中位值的吸光度d：稀釋血漿中外標(biāo)物的吸光度b'：由外標(biāo)物的吸光度計(jì)算出的稀釋倍數(shù)而得到的稀釋血漿中內(nèi)標(biāo)物的吸光度校正值x：血漿稀釋倍數(shù)[其中，稀釋血漿是指用稀釋用緩沖液稀釋血液樣品并除去血細(xì)胞得到的血漿]。[3-8]如[3-1]～[3-7]的定量分析方法，其利用β-半乳糖苷酶的酶活性隨鈉離子濃度而變化，從而能夠由β-半乳糖苷酶的吸光度變化量對(duì)鈉離子濃度進(jìn)行定量，用下述方法對(duì)作為用稀釋用緩沖液稀釋的血液樣品中外標(biāo)之一的鈉進(jìn)行測(cè)定：用稀釋用緩沖液稀釋生物樣品，進(jìn)一步用純水稀釋，以稀釋樣品量的10～30倍體積量添加含β-半乳糖苷酶的緩沖液即第一試劑，在30～45℃下加溫2～20分鐘，以第一試劑量的半量添加含鄰硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷的底物溶液即第二試劑，在主波長(zhǎng)410nm、副波長(zhǎng)658nm處測(cè)定生成的鄰硝基苯酚的吸光度。[3-9]一種緩沖液，其是在[3-1]～[3-8]的定量分析方法中用于稀釋微量血液樣品的稀釋用緩沖液，所述緩沖液含有選自由2-氨基-2-甲基-1-丙醇、2-乙基氨基乙醇、n-甲基-d-葡糖胺、二乙醇胺和三乙醇胺的構(gòu)成的組的氨基醇化合物，以及含有選自由hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、tes(n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、mops(3-嗎啉丙磺酸)和bes(n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)的構(gòu)成的組的緩沖劑作為緩沖劑成分，且在ph7.4具有緩沖作用。[3-10]如[3-9]的緩沖液，其實(shí)質(zhì)上不含鈉和氯。[3-11]如[3-9]或[3-10]的緩沖液，其用于使用外標(biāo)物的定量分析方法中。[3-12]如[3-9]或[3-10]的緩沖液，其用于使用內(nèi)標(biāo)物的定量分析方法中。發(fā)明效果生物樣品中的分析物生物樣品成分的分析中，通過(guò)利用內(nèi)標(biāo)物或外標(biāo)物求出生物樣品的稀釋倍數(shù)來(lái)對(duì)成分進(jìn)行定量分析，而不是對(duì)微量生物樣品成分的生物樣品樣本量進(jìn)行測(cè)定，從而能夠?qū)ι飿悠烦煞譁?zhǔn)確地進(jìn)行分析測(cè)定。此外，根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于經(jīng)手指等從體內(nèi)采集的微量且未知量的全血樣品等生物樣品的血漿和生物樣品中的任意成分，均可以使用塑料容器簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確地進(jìn)行定量。此外，通過(guò)由血漿稀釋率和全血稀釋率進(jìn)行計(jì)算，可求出作為血液的貧血程度的血細(xì)胞容積比(血細(xì)胞比容值)。進(jìn)一步通過(guò)用全血的內(nèi)標(biāo)物，能夠進(jìn)行血細(xì)胞成分(白細(xì)胞數(shù)：wbc、紅細(xì)胞數(shù)：rbc、血紅蛋白量：hgb、血細(xì)胞比容：hct)的推算。進(jìn)一步，以單獨(dú)內(nèi)標(biāo)物或單獨(dú)外標(biāo)物使用時(shí)，在定量的精度或準(zhǔn)確性上有缺陷。本發(fā)明中，由于同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物這二者來(lái)求出生物樣品的稀釋倍數(shù)，因此由內(nèi)標(biāo)物求得的稀釋倍數(shù)通過(guò)由外標(biāo)物求得的稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正，成為更準(zhǔn)確的值，能夠以更高的精度對(duì)分析物進(jìn)行定量。此外，之前由于不存在有在ph7.4中性附近有緩沖能力且不含鈉或氯的緩沖液，因此不能將作為生物中平衡性高的物質(zhì)的鈉或氯用作外標(biāo)物。本發(fā)明的方法中新開(kāi)發(fā)出通過(guò)使用在ph7.4中性附近具有緩沖能力且不含鈉或氯的緩沖液，可以將平衡性高的鈉或氯用作外標(biāo)物，從而能夠進(jìn)行更高的精度與準(zhǔn)確性高的分析。通過(guò)本發(fā)明的方法，可以使用微量血液(65μl)進(jìn)行生化檢測(cè)13項(xiàng)、腫瘤標(biāo)志物、肝炎檢查等很多檢查。該檢查方法由于不受時(shí)間與場(chǎng)地限制能夠發(fā)現(xiàn)未能接受健康檢查的出現(xiàn)癥狀前的情況。此外，由于可輕松地進(jìn)行檢查所以能夠容易地進(jìn)行健康管理，因此可在疾病嚴(yán)重化前捕捉到體內(nèi)的變化，也有助于節(jié)省國(guó)民醫(yī)療費(fèi)用。附圖說(shuō)明圖1是表示本發(fā)明的生物樣品成分的分析方法中使用的血液組成的示意圖。圖2是表示本發(fā)明的生物樣品成分的分析方法中用規(guī)定緩沖液稀釋血液后狀態(tài)的示意圖。此時(shí)，圖2中表示使用未透過(guò)血液的血細(xì)胞膜而只滲透到血漿中的內(nèi)標(biāo)物時(shí)的說(shuō)明圖。圖3是表示本發(fā)明的生物樣品成分的分析方法中用規(guī)定緩沖液稀釋血液后狀態(tài)的示意圖。圖3是內(nèi)標(biāo)物為具有滲透到血液的血漿和血細(xì)胞內(nèi)部這二者的性質(zhì)時(shí)的說(shuō)明圖。圖4是靜脈血血漿與手指采血稀釋血漿的生化檢測(cè)的相關(guān)圖。圖5是將靜脈采血的添加edta-2na全血與用血液稀釋緩沖液稀釋該全血的稀釋全血分別作為樣品對(duì)白細(xì)胞(wbc)、紅細(xì)胞(rbc)、血紅蛋白濃度(hgb)、血細(xì)胞比容值(hct)、血小板數(shù)(plt)進(jìn)行推算的相關(guān)圖。圖6是用由麥芽糖內(nèi)標(biāo)求得的血漿稀釋率和由乙醇胺求得的全血稀釋率，由計(jì)算式求得的血液中的血細(xì)胞體積所表示的血細(xì)胞比容值與對(duì)全血用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器求得的血細(xì)胞比容值的相關(guān)圖。圖7是表示鈉的酶法測(cè)定的線性圖。圖8是表示氯測(cè)定法的線性圖。圖9是表示鋰濃度與吸光度的線性圖。圖10-1是由雜交法的稀釋血漿測(cè)定值與原血漿測(cè)定值的相關(guān)圖(總蛋白和白蛋白)。圖10-2是由雜交法的稀釋血漿測(cè)定值與原血漿測(cè)定值的相關(guān)圖(ast和alt)。圖10-3是由雜交法的稀釋血漿測(cè)定值與原血漿測(cè)定值的相關(guān)圖(hdl-膽固醇和γgtp)。圖10-4是由雜交法的稀釋血漿測(cè)定值與原血漿測(cè)定值的相關(guān)圖(總膽固醇和甘油三酯)。圖10-5是由雜交法的稀釋血漿測(cè)定值與原血漿測(cè)定值的相關(guān)圖(尿素氮和肌酸酐)。圖10-6是由雜交法的稀釋血漿測(cè)定值與原血漿測(cè)定值的相關(guān)圖(尿酸和血糖)。具體實(shí)施方式1.利用內(nèi)標(biāo)物的分析法(內(nèi)標(biāo)法)本發(fā)明具有以下特征。即，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特征，是對(duì)含有采集的未知濃度血細(xì)胞的生物樣品成分進(jìn)行定量和酶活性分析的方法，準(zhǔn)備作為生物樣品中完全不含有或者幾乎不含有的成分的不通過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物，將其添加到緩沖液中。在添加血液前對(duì)緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物濃度進(jìn)行分析，對(duì)其吸光度與在添加血液后稀釋的緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物濃度進(jìn)行測(cè)定，由此由其吸光度比例求出血液中的血漿稀釋率，從而求出原血漿中的生物成分或酶活性。此時(shí)，所述緩沖液的滲透壓優(yōu)選配制為基本為血液滲透壓。本發(fā)明的方法在求出血漿稀釋倍率時(shí)，無(wú)需求出生物樣品的樣本量。使用內(nèi)標(biāo)物的方法稱為內(nèi)標(biāo)法，例如，將鋰用作內(nèi)標(biāo)物的方法稱為鋰(li)內(nèi)標(biāo)法。上述未知濃度的生物樣品也可以是不含血細(xì)胞的生物樣品(唾液、尿等)。用于這種情況的內(nèi)標(biāo)物，也可以是透過(guò)血細(xì)胞膜的物質(zhì)。作為測(cè)定緩沖液中內(nèi)標(biāo)物濃度的代表性方法，有酶法測(cè)定方法，該方法是向作為底物的該內(nèi)標(biāo)物或由內(nèi)標(biāo)物衍生的物質(zhì)加入氧化酶，由此生成過(guò)氧化氫，在過(guò)氧化物酶存在下，trinder試劑與4-氨基安替比林氧化縮合而得到的醌類色素或nad(p)h、四氮唑鹽的顯色，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定并定量為吸光度。作為其他的內(nèi)標(biāo)物定量方法，有直接測(cè)定內(nèi)標(biāo)物本身的吸光度的方法、通過(guò)使用針對(duì)內(nèi)標(biāo)物的抗體和標(biāo)記抗體的吸光度或者化學(xué)發(fā)光進(jìn)行測(cè)定的方法、色譜法等，可根據(jù)所使用內(nèi)標(biāo)物的定量方法來(lái)得到。為了求出用緩沖液稀釋血液后的血漿成分準(zhǔn)確的稀釋率，需要加入緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物是不存在于生物內(nèi)、或以極微量存在的成分，而且不透過(guò)血細(xì)胞膜、在緩沖液中穩(wěn)定、不吸附到容器上。此外，也需要對(duì)其他生物成分不產(chǎn)生干擾。如圖1所示，已知血液1由液體成分的血漿或血清2、與固體成分的血細(xì)胞3構(gòu)成，而且血細(xì)胞3具有血細(xì)胞膜等固體成分與在其內(nèi)側(cè)有液體成分。通過(guò)向血液1中加入抗凝劑edta-二鈉可阻止血細(xì)胞3的凝固。如果對(duì)該全血進(jìn)行離心則比重高的血細(xì)胞3沉降到最下層，分離上清為血漿。此外，如圖2所示，預(yù)先在容器內(nèi)向緩沖液4中加入不透過(guò)血細(xì)胞膜內(nèi)標(biāo)物5(圖2(a))，從容器上部將采集的血液1引入到緩沖液4與內(nèi)標(biāo)物5的混合層上側(cè)(圖2(b))。于是在用規(guī)定緩沖液4稀釋血液1后時(shí)，原本存在于血漿或血清2中的不透過(guò)血細(xì)胞膜的成分分布到緩沖液4和血漿或血清2中，成為稀釋的血液稀釋溶液6(圖2(c))。此時(shí)，緩沖液4中不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物5按規(guī)定量溶解時(shí)，原本存在于緩沖液中的該內(nèi)標(biāo)物5分布到緩沖液4和血漿或血清2中且被稀釋。只滲透到血漿2中的麥芽糖等被包含作為內(nèi)標(biāo)物5。由于麥芽糖作為陰離子溶解在緩沖液4中，因此溶解在血漿2中，未滲透到血細(xì)胞3內(nèi)。作為為求出血漿成分稀釋率而可添加到緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物是分子量在500以下的化學(xué)物質(zhì)且在分子內(nèi)具有硫酸根離子(-so3-)、羧酸根離子(-coo-)、硫醇基(-sh)、季胺(-nh3+)等取代基的化合物，選自由麥芽糖等二糖、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、4-羥基苯、羥基丁酸、肌酸、蘋(píng)果酸、金屬類(鋰、鈉、鉀、氯)、在分子內(nèi)具有硫酸基的trinder試劑構(gòu)成的組。該trinder試劑為(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)、adps(n-乙基-n-磺丙基-3-甲氧基苯胺)、alps(n-乙基-n-磺丙基苯胺)、daos(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、hdaos(n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、maos(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺)、toos(n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺)和tops(n-乙基-n-磺丙基-3-甲基苯胺)。其中優(yōu)選鋰。圖3中表示內(nèi)標(biāo)物5在全血(血漿2+血細(xì)胞3)中分布的說(shuō)明圖。如圖3所示的內(nèi)標(biāo)物5(例如，乙醇胺)滲透到血漿2與血細(xì)胞3內(nèi)這兩者。預(yù)先在容器內(nèi)向緩沖液4裝入透過(guò)血細(xì)胞膜內(nèi)標(biāo)物5(圖3(a))，從容器上部將采集的血液1引入到緩沖液4與內(nèi)標(biāo)物5的混合層上側(cè)(圖3(b))。于是，當(dāng)用規(guī)定緩沖液4稀釋血液1后，原本存在于血漿或血清2中的透過(guò)血細(xì)胞膜內(nèi)標(biāo)物存在于血細(xì)胞3和血漿或血清2中這二者，均勻分散在血漿或血清2中而構(gòu)成血液稀釋溶液6(圖3(c))。即，如圖3所示時(shí)所使用的內(nèi)標(biāo)物5因?yàn)榉植嫉窖獫{2與血細(xì)胞3內(nèi)這兩者，所以可求出緩沖液4的稀釋倍數(shù)。作為透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物是分子量在500以下的化學(xué)物質(zhì)且具有氨基(-nh2)、烷基(-ch3、-c6h6)、酯基(-coor)、烷氧基(-or)、鹵素(-cl,-br,-i)等疏水性取代基的化合物，可舉出：乙醇胺、己胺、苯乙胺、戊胺、組胺、腐胺、次黃嘌呤、色氨酸、孕烯醇酮、β-谷甾醇等。與這些內(nèi)標(biāo)相對(duì)應(yīng)地可利用氧化酶的酶法測(cè)定進(jìn)行分析。這些內(nèi)標(biāo)物由于分布在血細(xì)胞內(nèi)與血漿內(nèi)，因此可利用來(lái)求出全血(血漿+血細(xì)胞)的稀釋倍數(shù)。稀釋生物成分的緩沖液4可以任意的量與生物樣品混合，需要能夠穩(wěn)定地保存生物樣品中的被測(cè)成分。緩沖液4的成分并不進(jìn)行限定，可舉出：具有緩沖能力的hepes{2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸}緩沖液、aces[n-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸]緩沖液、ada[n-(2-乙酰胺)亞氨基二乙酸]緩沖液、bes[n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基磺酸]緩沖液、bicine[n,n-雙(2-羥乙基)甘氨酸]緩沖液、bis-tris[雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷]緩沖液、caps(n-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)緩沖液、capso(n-環(huán)己基-2-羥基-3-氨基丙磺酸)緩沖液、ches(n-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸)緩沖液、dipso{3-[n,n-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸}緩沖液、epps{3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸}緩沖液、heppso{2-羥基-3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸一水合物}緩沖液、mes(2-嗎啉乙磺酸一水合物)緩沖液、mops(3-嗎啉丙磺酸)緩沖液、mopso(2-羥基-3-嗎啉丙磺酸)緩沖液、pipes[哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)]緩沖液、popso[哌嗪-1,4-雙(2-羥基-3-丙磺酸)二水合物]緩沖液、taps[n-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸]緩沖液、tapso[2-羥基-n-三(羥甲基)甲基-3-氨基磺酸]緩沖液、tes[n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]緩沖液、tricine{n-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸}緩沖液、乙酸緩沖液、磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、硼酸緩沖液、酒石酸緩沖液、磷酸緩沖液生理鹽水等，其濃度并沒(méi)有進(jìn)行特別限定，優(yōu)選0.1～1000mmol/l，特別優(yōu)選10～500mmol/l。緩沖液的ph值并沒(méi)有進(jìn)行特別限定，從稀釋的生物樣品穩(wěn)定性方面考慮，希望在生物樣品原來(lái)的ph值附近，血液、血漿或血清時(shí)，優(yōu)選ph值為6～8。為了在稀釋緩沖液中穩(wěn)定保持被測(cè)成分，也可含有螯合劑、抗菌劑、防腐劑、輔酶、糖類、抑制劑等。作為螯合劑的一例，可舉出：乙二胺四乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽等。作為抗菌劑或防腐劑的一例，可舉出：硫酸阿米卡星鹽、硫酸卡那霉素鹽、噻苯咪唑、疊氮化鈉等。作為輔酶的一例，可舉出：磷酸吡哆醛、鎂、鋅等。作為糖類的一例，可舉出：甘露醇、右旋糖、寡糖等。作為抑制劑的一例，可舉出：十二烷基硫酸鈉、汞、肝素等。穩(wěn)定劑可根據(jù)被測(cè)成分以多種組合進(jìn)行添加。用緩沖液稀釋血液、血漿或血清，將ast(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和alt(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)作為被測(cè)成分時(shí)，優(yōu)選緩沖液中含有乙二胺四乙酸鹽和磷酸吡哆醛。此時(shí)的緩沖液中希望含有乙二胺四乙酸鹽為0.1～5.0mmol/l、磷酸吡哆醛為0.01～0.20mmol/l，特別是優(yōu)選含有乙二胺四乙酸0.5～3.0mmol/l、磷酸吡哆醛0.02～0.10mmol/l。加入到緩沖液的內(nèi)標(biāo)物要求如下：在生物內(nèi)不存在或極微量、不對(duì)生物成分產(chǎn)生干擾、在緩沖液內(nèi)穩(wěn)定、不吸附到保存容器上、可利用能高精度測(cè)定的檢測(cè)系統(tǒng)等。此外，在稀釋血液時(shí)，需要不發(fā)生血細(xì)胞溶血的滲透壓，優(yōu)選250～500mosm/kg的滲透壓。表1示出了作為緩沖液的一例，含有如下成分的緩沖液的組成：不透過(guò)血細(xì)胞膜內(nèi)標(biāo)物之一的肌氨酸和透過(guò)血細(xì)胞膜內(nèi)標(biāo)物之一的乙醇胺。[表1]含有麥芽糖、乙醇胺的緩沖液組成物質(zhì)名稱濃度hepes100mm麥芽糖3.87mm乙醇胺4.37mm氯化鈉154mmedta-2na1.34mm磷酸吡哆醛0.03mm阿米卡星0.0012％ph7.4其中，hepes為n-2-羥乙基哌嗪-n’-2-乙磺酸。不通過(guò)血細(xì)胞膜內(nèi)標(biāo)物之一的肌氨酸的測(cè)定試劑如表2所示。[表2]麥芽糖測(cè)定試劑其中，toos為n-乙基-n-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉二水合物。麥芽糖的測(cè)定方法步驟如下所示。麥芽糖測(cè)定時(shí)，使用上述的r1和r2。1.混合7.0μl的混合生物樣品和90μl的r1，37℃下放置5分鐘。2.在545/658nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。――a1(吸光度)3.混合30μl的r2，37℃下放置5分鐘。4.在545/658nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。――a2(吸光度)吸光度可以表示為測(cè)定值之差。因此，一般而言吸光度可得到為δa＝a2-a1。通過(guò)血細(xì)胞膜內(nèi)標(biāo)物之一的乙醇胺的測(cè)定試劑如表3所示。[表3]乙醇胺測(cè)定試劑其中，daos為n-乙基-n(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺鈉鹽。乙醇胺的測(cè)定方法步驟如下所示。乙醇胺測(cè)定時(shí)，使用上述的r1和r2。1.混合11μl的混合生物樣品和90μl的r1，37℃下放置5分鐘。2.在596/805nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。――a3(吸光度)3.混合45μl的r2，37℃下放置5分鐘。4.在546/884nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。――a4(吸光度)吸光度可以表示為測(cè)定值之差。因此，一般而言吸光度可得到為δa＝a4-a3。已知吸光度與濃度的關(guān)系由朗伯比爾(lambert-beer)定律表示為a＝ε×c×l。其中，a(吸光度)、ε(摩爾吸光系數(shù))、c(溶液的摩爾濃度)、l(光程長(zhǎng))。吸光度(a)與溶液的摩爾濃度(c)呈正比例關(guān)系，通過(guò)使用測(cè)定已知濃度的溶解溶質(zhì)的溶液而得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，一般而言可計(jì)算未知樣品中溶質(zhì)的濃度。如圖1所示，已知血液1由液體成分的血漿2或者血清、與固體成分的血細(xì)胞3構(gòu)成，進(jìn)一步血細(xì)胞具有血細(xì)胞膜等固體成分與在其內(nèi)側(cè)的液體成分。血液通過(guò)加入抗凝劑的edta-二鈉可阻止血細(xì)胞凝固。如果離心該全血?jiǎng)t比重較大的血細(xì)胞沉降到最下層，上清中為分離出的血漿。此外，如圖2所示，用規(guī)定緩沖液4稀釋血液1時(shí)，原本存在于血漿2或血清中的不透過(guò)血細(xì)胞膜的成分，分布到緩沖液4和血漿2、或者血清中，由此被稀釋。此時(shí)，不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物5以規(guī)定量溶解到緩沖液4中時(shí)，原本存在于緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物，分布到緩沖液和血漿或血清中，由此被稀釋。該內(nèi)標(biāo)表示為只滲透到血漿中的麥芽糖等內(nèi)標(biāo)。由于麥芽糖在緩沖液溶解為陰離子，因此溶解于血漿中，并不滲透到血細(xì)胞內(nèi)。即，緩沖液4中的不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物5的初始濃度(c0)由添加血液而向濃度(c1)變化。通過(guò)此c0和c1而計(jì)算出血漿或血清的稀釋率(r1)＝c0/(c0-c1)。將緩沖液量作為v0、將血漿或血清添加到緩沖液的總量作為v1。其中，原本存在于血漿或血清中的不透過(guò)血細(xì)胞膜的成分的稀釋率，因?yàn)榕c血漿2或血清的稀釋率相等，因此由r1＝(v0+v1)/v1＝c0/(c0-c1)而計(jì)算出。用規(guī)定緩沖液4稀釋血液1時(shí)，透過(guò)血細(xì)胞膜的成分分布到緩沖液和血漿或血清和血細(xì)胞中，因此被稀釋。此時(shí)，透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物以規(guī)定量溶解到緩沖液中時(shí)，原本存在于緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物分布到緩沖液和血漿或血清和血細(xì)胞中，由此被稀釋。如果作為血細(xì)胞膜體積(v2)、血細(xì)胞內(nèi)體積(v3)，則即緩沖液中的透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物的初始濃度(c2)由添加血液而向濃度(c3)變化。由該c2和c3可計(jì)算血液整體的稀釋率(r2)＝(v0+v1+v2+v3)/(v1+v2+v3)＝c2/(c2-c3)。其中，原本存在于血漿或血清和血細(xì)胞液體中的透過(guò)血細(xì)胞膜的成分的稀釋率，因?yàn)榕c血液整體的稀釋率相等，因此由r2＝(v0+v1+v2+v3)/(v1+v2+v3)＝c2/(c2-c3)而計(jì)算出。上述在下面表4中所示的情形下均可利用。[表4]進(jìn)一步，用含有不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物的溶液稀釋生物樣品時(shí)，如果含有內(nèi)標(biāo)物的溶液容量(v0)為規(guī)定量，則可由不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物計(jì)算出的不透過(guò)血細(xì)胞膜的生物樣品成分的稀釋率(r1)計(jì)算不透過(guò)血細(xì)胞膜的生物樣品的容量(v1)。即，可由v1＝v0/(r1-1)計(jì)算。此外，用含有透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物5的溶液稀釋生物樣品時(shí)，如果含有內(nèi)標(biāo)物的溶液容量(v0)為定量，則可由透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物計(jì)算出的血液的稀釋率(r2)計(jì)算血液的容量(v1+v2+v3)。即，可由v1+v2+v3＝v0/(r2-1)計(jì)算。用含有不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物與透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物的溶液稀釋生物樣品時(shí)，可通過(guò)由v0與r1求得的v1、由v0與r2求得的v1+v2+v3的兩式，計(jì)算v2+v3＝(v1+v2+v3)-v1＝v0/(r2-1)-v0/(r1-1)。另外，已知血細(xì)胞由65％的液體和35％的固體構(gòu)成。根據(jù)v2/(v2+v3)＝0.65v2＝0.65×{v0/(r2-1)-v0/(r1-1)}v3＝0.35×v2/0.65v3＝0.35×{v0/(r2-1)-v0/(r1-1)}因此，用含有不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物的溶液、含有透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物的溶液、或者含有不透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物與透過(guò)血細(xì)胞膜的內(nèi)標(biāo)物的溶液稀釋生物樣品時(shí)，由v0、r1、r2可計(jì)算v1、v2、v3。進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)v0、r1、r2、v1、v2、v3進(jìn)行組合，可計(jì)算：血漿或血清的量(v1)血漿或血清的稀釋率(r1)血漿或血清和血細(xì)胞液體的量(v1+v2)血液整體的稀釋率(r2)血液量(v1+v2+v3)血液的稀釋率{(v0+v1+v2+v3)/(v1+v2+v3)}血細(xì)胞量(v2+v3)血細(xì)胞的稀釋率{(v0+v2+v3)/(v2+v3)}血細(xì)胞液體的量(v2)血細(xì)胞液體的稀釋率{(v0+v2)/v2}血細(xì)胞固體的量(v3)血細(xì)胞固體的稀釋率{(v0+v3)/v3}血細(xì)胞比容值(％){(v2+v3)/(v1+v2+v3)×100(％)}或1-(血液稀釋率-1)/(血漿稀釋率-1)緩沖液的量(v0)緩沖液相對(duì)于血漿或血清的稀釋率{(v0+v1)/v0}緩沖液相對(duì)于血漿或血清和血細(xì)胞液體的稀釋率{(v0+v1+v2)/v0}緩沖液相對(duì)于血液的稀釋率{(v0+v1+v2+v3)/v0}緩沖液相對(duì)于血細(xì)胞液體的稀釋率{(v0+v2)/v0}緩沖液相對(duì)于血細(xì)胞固體的稀釋率{(v0+v3)/v0}緩沖液相對(duì)于血細(xì)胞的稀釋率{(v0+v2+v3)/v0}等?？赏ㄟ^(guò)將v0、r1、r2、v1、v2、v3單獨(dú)或組合而計(jì)算而得的項(xiàng)目并不限定于上述的舉例。2.利用外標(biāo)物的分析法(外標(biāo)法)本發(fā)明是在用緩沖液稀釋血液等生物樣品后對(duì)生物樣品中應(yīng)該定量的分析物進(jìn)行定量的方法，其特征在于，用生物樣品成分的外標(biāo)物求出生物樣品的稀釋倍數(shù)，由該稀釋倍數(shù)對(duì)生物樣品中的分析物進(jìn)行定量。本發(fā)明的方法中在求出生物樣品的稀釋倍率時(shí)，不必求出生物樣品的樣本量。使用外標(biāo)物的方法稱為外標(biāo)法，例如，將鈉用作外標(biāo)物的方法稱為鈉(na)外標(biāo)法。使用生物成分中含有的恒定成分的外標(biāo)物求出稀釋倍數(shù)。本發(fā)明中作為分析對(duì)象的生物樣品，可舉出：血液、血清、血漿、尿、唾液、淋巴液、脊髓液、間質(zhì)液、汗等生物樣品，其中優(yōu)選血液、血清、血漿。特別是本發(fā)明的優(yōu)選方式中、從受試者采集微量血液，用緩沖液稀釋后，通過(guò)過(guò)濾器或離心分離將血細(xì)胞進(jìn)行分離，使用得到的血漿或血清對(duì)分析物進(jìn)行測(cè)定。此外，本發(fā)明由于使用稀釋用緩沖液稀釋生物樣品，因此生物樣品為微量即可。特別是生物樣品為血液時(shí)，可使用200μl以下的微量血液樣品對(duì)分析物進(jìn)行測(cè)定。生物樣品的來(lái)源并不限定于人類，也可以是動(dòng)物類、魚(yú)類、鳥(niǎo)類等。例如，作為動(dòng)物類，可舉出：馬、牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、小鼠、熊、熊貓等。作為分析對(duì)象的生物樣品成分并不受限定，生物樣品中含有的所有物質(zhì)均作為分析對(duì)象。例如，可舉出：用于臨床診斷的血液中的生化檢測(cè)項(xiàng)目、腫瘤標(biāo)志物或肝炎標(biāo)志物等各種疾病的標(biāo)志物等，可舉出：蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)、低分子化合物等。此外，測(cè)定不僅是物質(zhì)的濃度，具有酶等活性的物質(zhì)的活性也是測(cè)定對(duì)象。各分析物的測(cè)定可以用公知的方法進(jìn)行。外標(biāo)物包含在生物樣品中為高平衡性的物質(zhì)，即，是生物樣品中濃度的生理性變動(dòng)小的物質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)選在人類個(gè)體間生物樣品中濃度之差小的物質(zhì)。作為這樣的物質(zhì)，可舉出：鈉(na+)、氯(cl-)、蛋白質(zhì)。作為蛋白質(zhì)，例如可舉出血液中含有的高平衡性的白蛋白或血清中總蛋白等。其中，特別優(yōu)選平衡性高且個(gè)體間變動(dòng)小的鈉。人類血漿中的鈉濃度的正常值、即健康人的血漿中的鈉濃度約為135～145mmol/l(meq/l)，中位值約為142mmol/l。95％的受試者中血漿中鈉濃度包含在正常范圍內(nèi)。2.5％的受試者中為低于該值的低濃度，2.5％的受試者中為高于該值的高濃度。由用緩沖液稀釋后的外標(biāo)物濃度與健康人的血漿中鈉濃度的平均值可以求出用作樣本的生物樣品的稀釋倍數(shù)。此外，作為生物樣品，在使用除了血液、血清、血漿以外的生物樣品時(shí)，可以由各生物樣品中的鈉濃度的中位值求出稀釋倍數(shù)。作為外標(biāo)物，由于使用生物樣品中含有的物質(zhì)，因此作為稀釋生物樣品的緩沖液，需要使用不含有外標(biāo)物、或者即使含有外標(biāo)物也在稀釋生物樣品后的混合物中以不對(duì)外標(biāo)物測(cè)定產(chǎn)生影響程度的極微量的濃度含有的緩沖液。此外，需要使用不含有對(duì)外標(biāo)物測(cè)定有妨礙的物質(zhì)、或者即使含有也在稀釋生物樣品后的稀釋溶液中以不對(duì)外標(biāo)物測(cè)定產(chǎn)生影響程度的極微量的濃度含有的緩沖液。將不含有這些物質(zhì)、或者即使含有也在稀釋生物樣品后的混合物中以不對(duì)外標(biāo)物測(cè)定產(chǎn)生影響程度的極微量的濃度含有的緩沖液稱為實(shí)質(zhì)上不含所述物質(zhì)的緩沖液。例如，本發(fā)明的方法中使用的稀釋用緩沖液中的鈉濃度為100nmol/l以下。例如，作為外標(biāo)物，使用鈉或氯時(shí)，需要生物樣品的稀釋用緩沖液中不含鈉或氯、或者即使含有也為極微量。進(jìn)一步，由于鈉對(duì)屬于堿金屬類的元素或?qū)儆趬A土金屬類的元素的定量產(chǎn)生影響，因此需要生物樣品的稀釋用緩沖液中不含鈉、或者即使含有也為極微量。此外，為了測(cè)定生物樣品中的目標(biāo)分析物，并為了防止目標(biāo)分析物的分解或變性，生物樣品的稀釋用緩沖液需要接近于生物樣品的ph，為ph6.5～ph8.0的緩沖液，優(yōu)選ph7.0～ph7.5，進(jìn)一步優(yōu)選ph7.4。進(jìn)一步在本發(fā)明中，為了測(cè)定用緩沖液稀釋的血液中的生物成分，緩沖液成分不能對(duì)這些待測(cè)定的生物成分的變性或穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。由于之前不存在在ph7.4前后具有緩沖能力且不含鈉或氯的緩沖液，因此不能將鈉或氯用作外標(biāo)物。本發(fā)明中，新開(kāi)發(fā)出在ph7.4前后具有緩沖能力且不含鈉或氯的緩沖液，能夠?qū)⑩c或氯用作外標(biāo)物。可舉出將作為這樣的不含鈉、氯、堿金屬類元素和堿土金屬類元素的堿性物質(zhì)，有2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)、2-乙基氨基乙醇、n-甲基-d-葡糖胺、二乙醇胺、三乙醇胺等氨基醇化合物類與作為呈酸性的化合物的good's緩沖液(兩性離子緩沖液)，即pka為ph7.4附近的緩沖液的hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)(pka＝7.55)、tes(n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)(pka＝7.50)、mops(3-嗎啉丙磺酸)(pka＝7.20)或bes(n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)(pka＝7.15)進(jìn)行組合并混合的緩沖液。其中，優(yōu)選2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)與hepes、tes、mops或bes的組合，進(jìn)一步優(yōu)選2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)與hepes的組合。為了制備上述緩沖液，氨基醇與good's緩沖液的濃度比為1：2～2：1，優(yōu)選以1：1.5～1.5：1、進(jìn)一步優(yōu)選以1：1的濃度比進(jìn)行混合即可。緩沖液的濃度并不進(jìn)行限定，氨基醇或good's緩沖液的濃度為0.1～1000mm/l，優(yōu)選1～500mm/l，進(jìn)一步優(yōu)選10～100mm/l。緩沖液中為了保持分析物穩(wěn)定，也可以含有螯合劑、表面活性劑、抗菌劑、防腐劑、輔酶、糖類、抑制劑等。作為螯合劑，可舉出：乙二胺四乙酸鹽(edta)、檸檬酸鹽、草酸鹽等。作為表面活性劑，例如可舉出：陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑或非離子表面活性劑。作為防腐劑，例如可舉出：疊氮化鈉或抗生素等。作為輔酶，可舉出：磷酸吡哆醛、鎂、鋅等。作為糖類，可舉出：甘露醇、右旋糖、寡糖等。作為抑制劑，可舉出：十二烷基硫酸鈉、汞、肝素等。特別是通過(guò)添加甘露醇與磷酸吡哆醛可以使血細(xì)胞膜或酶穩(wěn)定，通過(guò)添加3～4種的抗生素或抗菌劑，可以在手指采血時(shí)抑制從手指表面混入的一部分細(xì)菌的增殖，能夠穩(wěn)定由細(xì)菌引起的生物成分的分解。在生物樣品中使用全血時(shí)，由于稀釋的血液中的血細(xì)胞成分需要經(jīng)過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，因此緩沖液的滲透壓使用與血液同等(285mosm/kg)或其以上的滲透壓，可防止血細(xì)胞的溶血。滲透壓可通過(guò)對(duì)待測(cè)定的生物成分定量不產(chǎn)生影響的鹽類、糖類等、緩沖液等調(diào)節(jié)至等滲。本發(fā)明也包含由本發(fā)明的方法為了使用生物樣品的稀釋倍數(shù)而使用的上述緩沖液。也可以利用公知的方法測(cè)定外標(biāo)物的氯(cl-)、蛋白質(zhì)。例如，氯有測(cè)定吸光度的方法，這是因?yàn)榈矸勖竿ㄟ^(guò)氯離子活化，因此可由其反應(yīng)速度進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)可通過(guò)縮二脲法、考馬斯亮藍(lán)法(bradford法)、lowry法等進(jìn)行測(cè)定。白蛋白的測(cè)定可通過(guò)色素法的溴甲酚綠法(bcg法)進(jìn)行測(cè)定。用緩沖液稀釋的測(cè)定用作外標(biāo)的生物樣品中鈉的方法有火焰光度計(jì)、原子吸收光譜法、離子選擇電極法等。本發(fā)明中作為生物樣品使用血液時(shí)，從手指采集微量血液并用緩沖液稀釋的樣品僅為150μl左右，由于測(cè)定生化成分、免疫檢查項(xiàng)目為10項(xiàng)以上，因此需要使用數(shù)μl微量的樣品測(cè)定外標(biāo)物的鈉。此外，由于需要分析大量的樣品，因此需要能適用于市售的自動(dòng)生化免疫分析裝置。鈉測(cè)定中，通過(guò)鈉離子而使酶半乳糖苷酶的酶活性活化。由此，本發(fā)明中，作為鈉測(cè)定法，開(kāi)發(fā)出使用用數(shù)μl緩沖液稀釋的非常低濃度鈉(24mmol/l以下)樣品進(jìn)行測(cè)定的酶法測(cè)定。該酶法測(cè)定中，稀釋的生物樣品的微量鈉測(cè)定利用通過(guò)鈉活化β-半乳糖苷酶，并利用用緩沖液稀釋的樣品的鈉濃度與半乳糖苷酶活性呈正比例關(guān)系進(jìn)行測(cè)定。該方法可適用于自動(dòng)生化免疫分析裝置，在用于鈉測(cè)定而不需要其他測(cè)定儀器的方面具有高效性且經(jīng)濟(jì)性。所述鈉測(cè)定法中，用稀釋用緩沖液稀釋血液等生物樣品，進(jìn)一步用純水稀釋，以稀釋樣品的10～30倍體積量添加含β-半乳糖苷酶緩沖液即第一試劑，30～45℃下加溫2～20分，以第一試劑的半量添加含有鄰硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷的底物溶液即第二試劑，在主波長(zhǎng)410nm、副波長(zhǎng)658nm處測(cè)定吸光度。更詳細(xì)地，用稀釋用緩沖液稀釋血液等生物樣品，進(jìn)一步用純水稀釋至5倍程度，向稀釋的生物樣品與緩沖液混合物1～10μl，優(yōu)選3μl中添加作為第一試劑的含β-半乳糖苷酶緩沖液30～100μl，優(yōu)選為52μl，使含β-半乳糖苷酶緩沖液和稀釋的生物樣品與緩沖液混合物的容積比為10～30，優(yōu)選為15～25。接著，30～45℃下、優(yōu)選37℃下加溫2～20分、優(yōu)選加溫5分，接著添加作為第二試劑的含鄰硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷底物溶液25μl。然后，可以通過(guò)在主波長(zhǎng)410nm、副波長(zhǎng)658nm處測(cè)定吸光度對(duì)鈉濃度進(jìn)行測(cè)定。求出本發(fā)明的生物樣品的稀釋倍數(shù)的方法希望按照如下的方式。將生物樣品10～200μl添加到緩沖液50～500μl中并混合。此時(shí)，緩沖液的容積優(yōu)選為生物樣品容積的3～4倍以上。例如，生物樣品為血液時(shí)，將微量血液樣品65μl添加到緩沖液280μl中并混合。生物樣品為血液時(shí)，在稀釋后除去紅細(xì)胞、白細(xì)胞等血細(xì)胞。血細(xì)胞可利用過(guò)濾器除去，也可以用離心分離除去稀釋血液樣品。用除去血細(xì)胞的稀釋血漿樣品對(duì)分析物進(jìn)行測(cè)定。將微量血液樣品65μl添加到緩沖液280μl中時(shí)，由于血液樣品65μl含有約30μl的血漿，因此血漿被稀釋至約10倍。作為生物樣品使用血液時(shí)，如果血液與稀釋用緩沖液按照如下混合即可：換算為血漿，血漿被稀釋至5～20倍、優(yōu)選為5～16倍、進(jìn)一步優(yōu)選為5～10倍、特別是優(yōu)選為8～10倍左右。另外，同時(shí)測(cè)定稀釋血漿樣品中的外標(biāo)物濃度。由外標(biāo)物濃度求出血液的稀釋倍數(shù)，可通過(guò)稀釋血漿樣品的分析物的測(cè)定值乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算血液中的分析物濃度。作為生物樣品使用血液時(shí)，用稀釋用緩沖液稀釋血液后，因?yàn)槌パ?xì)胞，所以留下的樣品為血漿，將其稱為稀釋血漿。因此，此時(shí)稱為求出血漿的稀釋倍數(shù)。血漿的稀釋倍數(shù)可通過(guò)用外標(biāo)物利用計(jì)算式(i)的下述計(jì)算方法而求出。在如下說(shuō)明的方法中，用稀釋用緩沖液稀釋血液，使用用過(guò)濾器過(guò)濾而得到的血漿樣品。計(jì)算方法1：a：血漿中外標(biāo)物濃度的正常中位值的吸光度、b：稀釋血漿中的外標(biāo)物的吸光度、x：血漿稀釋倍數(shù)作為外標(biāo)物使用鈉時(shí)，求出鈉的吸光度即可。作為血漿中鈉濃度的正常中位值的吸光度，使用鈉142mmol/l的吸光度即可。3.利用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物的測(cè)定法(雜交法)本發(fā)明是在用緩沖液稀釋血液等生物樣品后對(duì)生物樣品中應(yīng)該定量的分析物進(jìn)行定量的方法，其特征在于，使用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物求出生物樣品的稀釋倍數(shù)，由該稀釋倍數(shù)對(duì)生物樣品中的分析物進(jìn)行定量。本發(fā)明的方法在求出生物樣品的稀釋倍率時(shí)，不需要求出生物樣品的樣本量。同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物求出稀釋倍數(shù)，外標(biāo)物對(duì)由內(nèi)標(biāo)物的稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正，用于準(zhǔn)確地求出稀釋倍數(shù)。使用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物二者求出本發(fā)明的生物樣品的稀釋倍數(shù)的方法，因此也稱為雜交法。在只使用內(nèi)標(biāo)物求出生物樣品的稀釋倍數(shù)時(shí)，由于用添加有內(nèi)標(biāo)物的稀釋用緩沖液對(duì)生物樣品進(jìn)行稀釋，因此生物樣品的量少時(shí)，稀釋倍數(shù)會(huì)過(guò)大，導(dǎo)致由內(nèi)標(biāo)物濃度求得的稀釋倍數(shù)可靠性降低。本發(fā)明的雜交法中，對(duì)于使用這樣的內(nèi)標(biāo)物的方法的缺點(diǎn)可通過(guò)使用外標(biāo)物進(jìn)行彌補(bǔ)。此外，如后述，有時(shí)生物樣品中含有用作內(nèi)標(biāo)物的物質(zhì)，使原本生物樣品中具有的外標(biāo)物的濃度的正常值發(fā)生偏離。即使在這樣的情況下，雜交法可以彌補(bǔ)各自方法的缺點(diǎn)，求出準(zhǔn)確得稀釋倍數(shù)。作為本發(fā)明的分析對(duì)象的生物樣品，可使用上述“2.利用外標(biāo)物的分析法(外標(biāo)法)”中記載的生物樣品，生物樣品的來(lái)源也如上述2(外標(biāo)法)所示。分析對(duì)象生物樣品成分也將上述2(外標(biāo)法)中記載的分析對(duì)象生物樣品成分作為對(duì)象。內(nèi)標(biāo)物添加到用于生物樣品稀釋的緩沖液中達(dá)到規(guī)定濃度而使用。作為內(nèi)標(biāo)物，使用如下物質(zhì)：生物樣品中完全不含有、或者即使含有也為極微量的物質(zhì)、不對(duì)生物樣品中分析物的測(cè)定產(chǎn)生干擾的物質(zhì)、受到生物樣品中生物酶的作用不發(fā)生分解的物質(zhì)、緩沖液中穩(wěn)定的物質(zhì)、不透過(guò)血細(xì)胞膜且血細(xì)胞中不含有的物質(zhì)、不吸附到緩沖液的保存容器上的物質(zhì)、可利用能高精度測(cè)定的檢測(cè)系統(tǒng)的物質(zhì)。作為這樣的物質(zhì)，可舉出上述“1.利用內(nèi)標(biāo)物的分析法(內(nèi)標(biāo)法)”中記載的物質(zhì)，其中優(yōu)選即使在以添加到緩沖液中的狀態(tài)下長(zhǎng)時(shí)間保存也穩(wěn)定的屬于堿金屬或堿土金屬的元素且在天然的生物樣品中不含有的物質(zhì)。作為屬于堿金屬的元素，可舉出：li(鋰)、rb(銣)、cs(銫)、fr(鈁)，作為屬于堿土金屬的元素，可舉出：sr(鍶)、ba(鋇)、ra(鐳)，其中優(yōu)選li。另外，也可以使用日本特開(kāi)2003-161729號(hào)公報(bào)中記載的甘油-3-磷酸。向用于稀釋內(nèi)標(biāo)物的生物樣品的緩沖液的添加濃度，如果是稀釋后可測(cè)定內(nèi)標(biāo)物濃度的濃度則沒(méi)有限定。例如，如果以0.1～1000mm/l、優(yōu)選以0.1～100mm/l、進(jìn)一步優(yōu)選以0.5～10mm/l的濃度添加就可以。例如，將鋰用作內(nèi)標(biāo)物時(shí)，向用于稀釋生物樣品的緩沖液中以上述濃度添加鋰就可以。由用緩沖液稀釋后的生物樣品稀釋液中的內(nèi)標(biāo)物濃度與添加到用于稀釋的緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物濃度，可以求出用作樣本的生物樣品的稀釋倍數(shù)。向含有內(nèi)標(biāo)物的緩沖液中添加樣品時(shí)的樣品稀釋倍數(shù)的范圍并沒(méi)有限定，為5～20倍、優(yōu)選5～15倍。外標(biāo)物為含有在生物樣品中，平衡性高的物質(zhì)，即生物樣品中濃度的生理性變動(dòng)小的物質(zhì)，進(jìn)一步優(yōu)選人類個(gè)體間生物樣品中濃度差小的物質(zhì)。作為這樣的物質(zhì)，可舉出：鈉(na+)、氯(cl-)、蛋白質(zhì)。作為蛋白質(zhì)，例如可舉出血液中含有的平衡性高的白蛋白或血清中總蛋白等。其中，特別優(yōu)選平衡性高且個(gè)體間變動(dòng)小的鈉。人類血漿中的鈉濃度的正常值，即健康人血漿中的鈉濃度約為135～145mmol/l(meq/l)，正常中位值約為142mmol/l。95％的受試者中血漿中鈉濃度包含在正常范圍內(nèi)。2.5％的受試者中為低于正常范圍的低濃度，2.5％的受試者中為高于正常范圍的高濃度。由用緩沖液稀釋后的外標(biāo)物濃度與健康人血漿中鈉濃度的平均值，可求出用作樣本的生物樣品的稀釋倍數(shù)。此外，作為生物樣品，使用除了血液、血清、血漿以外的生物樣品時(shí)，由各生物樣品中的鈉濃度的中位值可求出稀釋倍數(shù)。由用緩沖液稀釋后的生物樣品中的內(nèi)標(biāo)物濃度與添加到用于稀釋的緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物濃度，可求出用作樣本的生物樣品的稀釋倍數(shù)，進(jìn)一步，使用稀釋后的生物樣品中的外標(biāo)物濃度與生物樣品中含有的外標(biāo)物濃度，通過(guò)對(duì)由內(nèi)標(biāo)物濃度計(jì)算出的稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正，可求出更準(zhǔn)確的稀釋倍數(shù)。作為外標(biāo)物，由于使用生物樣品中含有的物質(zhì)，因此作為稀釋生物樣品的緩沖液，需要使用如下緩沖液：不含有外標(biāo)物、或者即使含有外標(biāo)物也在稀釋生物樣品后的混合物中以不對(duì)外標(biāo)物測(cè)定產(chǎn)生影響程度的極微量的濃度含有的緩沖液。此外，需要使用如下緩沖液：不含有對(duì)外標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定有妨礙的物質(zhì)、或者即使含有外標(biāo)物也在稀釋生物樣品后的混合物中以不對(duì)內(nèi)標(biāo)物或外標(biāo)物的測(cè)定產(chǎn)生影響程度的極微量的濃度含有的緩沖液。將不含有這些物質(zhì)、或者即使含有也在稀釋生物樣品后的混合物中以不對(duì)內(nèi)標(biāo)物或外標(biāo)物的測(cè)定產(chǎn)生影響程度的極微量的濃度含有的緩沖液稱為實(shí)質(zhì)上不含所述物質(zhì)的緩沖液。例如，本發(fā)明的方法中使用的稀釋用緩沖液中的鈉濃度為100nmol/l以下。例如，作為外標(biāo)物使用鈉或氯時(shí)，需要生物樣品的稀釋用緩沖液中不含有鈉或氯、或者即使含有也為極微量。此外，作為內(nèi)標(biāo)物因?yàn)槭褂脤儆趬A金屬類的元素或?qū)儆趬A土金屬類的元素，所以生物樣品的稀釋用緩沖液需要不含有用作內(nèi)標(biāo)物的屬于堿金屬類的元素和屬于堿土金屬類的元素、以及近似于這些的物質(zhì)、或者即使含有也為極微量。進(jìn)一步，鈉由于對(duì)屬于堿金屬類的元素或?qū)儆趬A土金屬類的元素的定量產(chǎn)生影響，因此需要生物樣品的稀釋用緩沖液中不含有鈉、或者即使含有也為極微量。此外，由于測(cè)定生物樣品中的目標(biāo)分析物，因此為了防止目標(biāo)分析物的分解或變性，生物樣品的稀釋用緩沖液需要為接近于生物樣品的ph的ph6.5～ph8.0的緩沖液，優(yōu)選為ph7.0～ph7.5，進(jìn)一步優(yōu)選為ph7.4。進(jìn)一步，本發(fā)明中由于測(cè)定用緩沖液稀釋的血液中的生物成分，因此緩沖液成分不能對(duì)這些待測(cè)定的生物成分的變性或穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。由于之前不存在在ph7.4前后具有緩沖能力且不含有鈉或氯的緩沖液，因此不可能將鈉或氯用作外標(biāo)物。本發(fā)明中新開(kāi)發(fā)出在ph7.4前后具有緩沖能力且不含有鈉或氯的緩沖液，能夠?qū)⑩c或氯用作外標(biāo)物?？膳e出：作為這樣的不含有鈉、氯、堿金屬類元素和堿土金屬類元素的堿性化合物，將2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)、2-乙基氨基乙醇、n-甲基-d-葡糖胺、二乙醇胺、三乙醇胺等氨基醇化合物類與作為呈酸性的good's緩沖液(兩性離子緩沖液)，即pka為ph7.4附近緩沖液的hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)(pka＝7.55)、tes(n-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)(pka＝7.50)、mops(3-嗎啉丙磺酸)(pka＝7.20)或bes(n,n-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)(pka＝7.15)進(jìn)行組合并混合的緩沖液。其中，優(yōu)選2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)與hepes、tes、mops或bes的組合，進(jìn)一步優(yōu)選2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)與hepes的組合。為了制備上述緩沖液，氨基醇與good's緩沖液的濃度比為1：2～2：1、優(yōu)選以1：1.5～1.5：1、進(jìn)一步優(yōu)選以1：1的濃度比進(jìn)行混合即可。緩沖液的濃度并不進(jìn)行限定，氨基醇或good's緩沖液的濃度為0.1～1000mm/l，優(yōu)選1～500mm/l，進(jìn)一步優(yōu)選10～100mm/l。緩沖液中為了保持分析物的穩(wěn)定，也可以含有螯合劑、表面活性劑、抗菌劑、防腐劑、輔酶、糖類、抑制劑等。作為螯合劑，可舉出：乙二胺四乙酸鹽(edta)、檸檬酸鹽、草酸鹽等。作為表面活性劑，例如可舉出：陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑或非離子表面活性劑。作為防腐劑，例如可舉出：疊氮化鈉或抗生素等。作為輔酶，可舉出：磷酸吡哆醛、鎂、鋅等。作為糖類，可舉出：甘露醇、右旋糖、寡糖等。作為抑制劑，可舉出：十二烷基硫酸鈉、汞、肝素等。特別是通過(guò)添加甘露醇與磷酸吡哆醛可使血細(xì)胞膜或酶穩(wěn)定，通過(guò)添加3～4種的抗生素或抗菌劑，在手指采血時(shí)可抑制從手指表面混入的一部分的細(xì)菌增殖，能夠穩(wěn)定由細(xì)菌引起的生物成分的分解。生物樣品中使用全血時(shí)，由于需要用過(guò)濾器對(duì)稀釋的血液中的血細(xì)胞成分進(jìn)行過(guò)濾，因此緩沖液的滲透壓可通過(guò)使用與血液同等(285mosm/kg)或其以上的滲透壓來(lái)防止血細(xì)胞溶血。滲透壓可通過(guò)對(duì)待測(cè)定的生物成分的定量不產(chǎn)生影響的鹽類、糖類等、緩沖液等調(diào)節(jié)為等滲。本發(fā)明也包含由本發(fā)明的雜交法為了使用生物樣品的稀釋倍數(shù)而使用的上述緩沖液。該緩沖液不僅用于本發(fā)明的雜交法，也可以用于使用外標(biāo)的定量分析方法(外標(biāo)法)、使用內(nèi)標(biāo)的定量分析方法(內(nèi)標(biāo)法)。內(nèi)標(biāo)物的堿金屬類元素或堿土金屬類元素可以利用公知的方法進(jìn)行測(cè)定。例如，添加屬于堿金屬類的元素或?qū)儆趬A土金屬類的元素與形成螯合物的物質(zhì)，測(cè)定形成的螯合物的吸光度即可。作為堿金屬類元素或堿土金屬類元素與形成螯合物的物質(zhì)，例如可舉出被多價(jià)鹵素取代的卟啉化合物(例如，多氟卟啉)等卟啉衍生物。此外，可通過(guò)原子吸光度法測(cè)定元素自身的吸光度。具體而言，作為內(nèi)標(biāo)物添加到緩沖液中鋰的測(cè)定可利用螯合物比色法(鹵素卟啉螯合物法：全氟-5,10,15,20-四苯基-21h,23h-卟啉)用自動(dòng)生化分析裝置進(jìn)行。通過(guò)該方法，可容易地以微量樣品測(cè)定很多樣本。外標(biāo)物的氯(cl-)、蛋白質(zhì)也可以用上述2(外標(biāo)法)中記載的公知的方法進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的方法中，也可以使用作為內(nèi)標(biāo)物使用鋰等堿金屬類元素或堿土金屬元素，而且作為外標(biāo)物使用鈉(na+)、氯(cl-)或蛋白質(zhì)等生物樣品中含有的物質(zhì)的兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的雜交法求出稀釋倍數(shù)，用外標(biāo)物對(duì)用內(nèi)標(biāo)物求得的稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正，可求出準(zhǔn)確的稀釋倍數(shù)。作為用于改善躁癥和躁郁癥的躁狂狀態(tài)的藥品，使用碳酸鋰。對(duì)于需要治療的受試者，碳酸鋰每天給藥數(shù)百mg～一千數(shù)百mg。因此，正在接受碳酸鋰給藥的受試者的生物樣品中含有鋰，只將鋰作為內(nèi)標(biāo)使用時(shí)，不能求出準(zhǔn)確的稀釋倍數(shù)。另一方面，鈉如前所述在正常人的血液中濃度的正常范圍約為135～145mmol/l(meq/l)，約5％的受試者中即使是正常人也偏離正常值，約2.5％的受試者中即使是正常人也為低于上述正常值的低濃度，約2.5％的受試者中即使是正常人也為高于上述正常值的高濃度。這樣的受試者中，只將鈉用作外標(biāo)時(shí)，不能求出準(zhǔn)確地稀釋倍數(shù)。如上所述，即使受試者在將鋰等堿金屬類元素或堿土金屬元素作為藥品而被給藥時(shí)，或者血液中的鈉(na+)、氯(cl-)或蛋白質(zhì)的濃度偏離正常值時(shí)，由于通過(guò)外標(biāo)物對(duì)使用內(nèi)標(biāo)物求出的稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正，因此能夠彌補(bǔ)兩者的缺點(diǎn)，可求出準(zhǔn)確地生物樣品的稀釋倍數(shù)。求出本發(fā)明得生物樣品的稀釋倍數(shù)的方法希望按照如下方式進(jìn)行。在預(yù)先以規(guī)定濃度添加內(nèi)標(biāo)物的緩沖液50～500μl中添加生物樣品10～200μl并混合。此時(shí)，緩沖液容積優(yōu)選為生物樣品容積的3～4倍以上。例如，生物樣品為血液時(shí)，在添加內(nèi)標(biāo)的緩沖液280μl中添加微量血液樣品65μl并混合。生物樣品為血液時(shí)，稀釋后除去紅細(xì)胞、白細(xì)胞等血細(xì)胞。也可以利用過(guò)濾器除去血細(xì)胞，也可以用離心分離除去稀釋的血液樣品。使用除去血細(xì)胞的稀釋血漿樣品，測(cè)定分析物。在內(nèi)標(biāo)添加緩沖液280μl中添加微量血液樣品65μl時(shí)，由于血液樣品65μl中含有約30μl的血漿，因此血漿稀釋約10倍。作為生物樣品使用血液時(shí)，血液與稀釋用緩沖液按照如下混合即可：換算為血漿，血漿稀釋5～20倍，優(yōu)選為5～16倍、進(jìn)一步優(yōu)選為5～10倍、特別是優(yōu)選為8～10倍左右。另外，同時(shí)測(cè)定稀釋血漿樣品中的內(nèi)標(biāo)物濃度與外標(biāo)物濃度?？捎蓛?nèi)標(biāo)物濃度和外標(biāo)物濃度求出血液的稀釋倍數(shù)，并通過(guò)稀釋血漿樣品的分析物的測(cè)定值乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算血液中的分析物濃度。作為生物樣品使用血液時(shí)，用稀釋用緩沖液稀釋血液后，由于除去血細(xì)胞，所以留下的樣品為血漿，從而將其稱為稀釋血漿。因此，此時(shí)稱為求出血漿的稀釋倍數(shù)。血漿的稀釋倍數(shù)使用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物可通過(guò)如下3種計(jì)算方法求出。下面在說(shuō)明的方法中，使用用添加有內(nèi)標(biāo)物的稀釋用緩沖液稀釋血液并用過(guò)濾器過(guò)濾而得到的血漿樣品。作為內(nèi)標(biāo)物使用鋰，作為外標(biāo)物使用鈉。計(jì)算方法1a：添加內(nèi)標(biāo)物的緩沖液中內(nèi)標(biāo)物的吸光度b：稀釋血漿中內(nèi)標(biāo)物的吸光度c：血漿中外標(biāo)物濃度的正常中位值的吸光度d：稀釋血漿中的外標(biāo)物的吸光度x：血漿稀釋倍數(shù)其中，稀釋血漿是指用稀釋用緩沖液稀釋血液樣品，除去血細(xì)胞而得到的血漿。作為內(nèi)標(biāo)物使用鋰，作為外標(biāo)物使用鈉時(shí)，鋰的濃度，例如可以表示為用螯合物比色法等測(cè)定鋰濃度時(shí)得到的吸光度。此外，鈉的濃度，可以表示為用酶法測(cè)定等測(cè)定時(shí)的吸光度。血漿中鈉濃度的正常中位值為正常人的中位值，作為血漿中鈉濃度的正常中位值的吸光度，使用鈉142mmol/l的吸光度即可。該值為已知的值。下面的計(jì)算方法2和3中也相同。由緩沖液的血漿的稀釋倍數(shù)x可以由下述計(jì)算式(1)或計(jì)算式(2)求出。對(duì)稀釋血漿中的分析物的生化成分的測(cè)定濃度或酶活性進(jìn)行定量，該定量值乘以由計(jì)算式(1)或計(jì)算式(2)求得的稀釋倍數(shù)，可以對(duì)原血漿中的分析物進(jìn)行定量。計(jì)算方法2b：稀釋血漿中內(nèi)標(biāo)物的吸光度d：稀釋血漿中的外標(biāo)物的吸光度x：血漿稀釋倍數(shù)血漿的稀釋倍數(shù)可以由下述計(jì)算式(3)求出。x＝a×(b+d)±b(3)(a和b為系數(shù))計(jì)算方法2中預(yù)先獲取b+d與稀釋倍數(shù)的數(shù)據(jù)，先制成由x＝a×(b+d)±b表示的回歸直線。對(duì)稀釋血漿中的分析物的生化成分的測(cè)定濃度或酶活性進(jìn)行定量，該定量值乘以由計(jì)算式(3)求得的稀釋倍數(shù)，可以對(duì)原血漿中的分析物進(jìn)行定量。計(jì)算方法3a：添加內(nèi)標(biāo)物的緩沖液中內(nèi)標(biāo)物的吸光度b：稀釋血漿中內(nèi)標(biāo)物的吸光度c：血漿中外標(biāo)物濃度的正常中位值的吸光度、d：稀釋血漿中的外標(biāo)物的吸光度b'：通過(guò)由外標(biāo)物的吸光度計(jì)算出的稀釋倍數(shù)對(duì)稀釋血漿中內(nèi)標(biāo)物的吸光度的校正值x：血漿稀釋倍數(shù)內(nèi)標(biāo)物(例如，鋰)與外標(biāo)物(例如，鈉)的稀釋倍數(shù)x如果假定為相同，則可得到下式。x＝a/b＝c/d通過(guò)外標(biāo)物(例如，鈉)的稀釋倍數(shù)對(duì)內(nèi)標(biāo)物(例如，鋰)的吸光度變化量校正值b'由下式求出。(b')＝(a×d)/c通過(guò)用內(nèi)標(biāo)物(例如，鋰)的吸光度變化量校正值b'除a，求出由外標(biāo)物(例如，鈉)校正的內(nèi)標(biāo)物(例如，鋰)稀釋倍數(shù)。x＝a/b'(4)對(duì)稀釋血漿中的分析物的生化成分的測(cè)定濃度或酶活性進(jìn)行定量，該定量值乘以由計(jì)算式(4)求得的稀釋倍數(shù)，可以對(duì)原血漿中的分析物進(jìn)行定量。實(shí)施例下面，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。1.利用內(nèi)標(biāo)的分析法(內(nèi)標(biāo)法)[實(shí)施例1-1]在將麥芽糖作為內(nèi)標(biāo)物添加到稀釋緩沖液的血液稀釋緩沖液200μl中加入添加edta-2na的全血樣品60μl，對(duì)50例的靜脈血液樣品進(jìn)行研究。對(duì)未稀釋的全血離心而得到的血漿的測(cè)定值與稀釋的血漿的測(cè)定值乘以內(nèi)標(biāo)稀釋倍數(shù)而求得的稀釋血漿測(cè)定值的相關(guān)進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖1所示在酶活性(谷丙轉(zhuǎn)氨酶：alt，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶：ggt)、脂質(zhì)檢查(甘油三酯：tg、ldl-膽固醇、葡萄糖、血紅蛋白a1c)的檢查中均得到良好的相關(guān)性。[實(shí)施例1-2]在將分布于血細(xì)胞和血漿中內(nèi)標(biāo)的乙醇胺添加到稀釋緩沖液而成的血液稀釋緩沖液200μl中加入添加edta-2na的全血樣品60μl，對(duì)50例的靜脈血液樣品進(jìn)行研究。分別將靜脈采血的添加edta-2na全血與用血液稀釋緩沖液稀釋該全血的稀釋全血作為樣品，推算白細(xì)胞(wbc)、紅細(xì)胞(rbc)、血紅蛋白濃度(hgb)、血細(xì)胞比容值(hct)、血小板數(shù)(plt)的相關(guān)圖如圖5所示。由此除了血小板數(shù)，可看到良好的相關(guān)性。[實(shí)施例1-3]使用由麥芽糖內(nèi)標(biāo)求得的血漿稀釋率和由乙醇胺求得的全血稀釋率，并由計(jì)算式求得的表示血液中的血細(xì)胞體積的血細(xì)胞比容值與對(duì)全血用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器求得的值的相關(guān)進(jìn)行了考察。結(jié)果如圖6所示。具有良好的相關(guān)性且實(shí)用性。2.利用外標(biāo)物的分析法(外標(biāo)法)[實(shí)施例2-1]使用微量血液樣品的定量分析(1)外標(biāo)物(鈉)的測(cè)定和稀釋倍數(shù)的計(jì)算在緩沖液280μl中添加微量血液樣品65μl并混合，用過(guò)濾器過(guò)濾血細(xì)胞，將稀釋血漿作為樣品用自動(dòng)生化分析裝置測(cè)定外標(biāo)物和生物成分的各濃度。作為血液樣品的稀釋用緩沖液，使用將2-氨基-2-甲基-1-丙醇和hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)組合并混合而成的ph7.4的緩沖液。使用的緩沖液的組成如表5所示。[表5]用鈉外標(biāo)物的稀釋用緩沖液的組成作為外標(biāo)物，使用包含于血液樣品中的鈉。稀釋血漿的微量鈉測(cè)定開(kāi)發(fā)出利用通過(guò)鈉活化β-半乳糖苷酶，并利用用緩沖液稀釋的樣品的鈉濃度與半乳糖苷酶活性呈正比例關(guān)系的酶法測(cè)定。鈉測(cè)定試劑的組成如表6所示。[表6]用鈉外標(biāo)物的稀釋用緩沖液的組成使用如表6所示的鈉測(cè)定試劑，進(jìn)行如下測(cè)定。如果在稀釋緩沖液280μl中添加全血65μl，則全血中的血漿(約30μl)稀釋約10倍。在用純水稀釋該稀釋血漿4.5倍后的3μl中加入β-半乳糖苷酶緩沖液(第一試劑)52μl，37℃下加溫5分鐘，加入底物溶液鄰硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷(第二試劑)26μl，使用日本電子株式會(huì)社的jca-bm6050型自動(dòng)生化分析裝置，通過(guò)在主波長(zhǎng)410nm、副波長(zhǎng)658nm處測(cè)定吸光度來(lái)求得每分鐘的吸光度速度變化。圖1中示出了顯示鈉濃度與吸光度變化量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)到24mmol/l的線性并可確認(rèn)鈉的定量性。(2)外標(biāo)物(氯)的測(cè)定使用如下試劑：1)第一試劑：在ph6.0、0.1mol/lmes/naoh緩沖液中含有來(lái)源于胰腺的淀粉酶2u/ml和10mmol/ledta的溶液2)第二試劑：5mmol/l2-氯-4-硝基苯基麥芽糖溶液氯測(cè)定法如下所示。在樣品5μl中加入第一試劑150μl，在37℃下加溫5分鐘后，加入第二試劑50μl后，求得在405nm處從1分鐘后到2分鐘的吸光度變化。圖8中示出了顯示氯濃度與吸光度變化量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)微量血液樣品與靜脈血漿的相關(guān)性表7中示出了血漿測(cè)定值與由外標(biāo)物(鈉)的稀釋倍率求得的稀釋血漿測(cè)定值的相關(guān)統(tǒng)計(jì)值。測(cè)定使用日本電子株式會(huì)社的jca-bm6050型自動(dòng)分析裝置。表示將142mmol/l的鈉測(cè)定吸光度(a)與稀釋血漿的鈉吸光度(b)由下式(i)求得的稀釋倍數(shù)(x：8倍稀釋)，利用該稀釋倍數(shù)求得的稀釋血漿的生化檢測(cè)數(shù)據(jù)(稀釋血漿測(cè)定值)與血漿數(shù)據(jù)(血漿測(cè)定值)的相關(guān)性。各檢查項(xiàng)目的血漿測(cè)定用常用方法進(jìn)行測(cè)定。此外，稀釋血漿的測(cè)定通過(guò)常用方法增加樣品的容量并在最優(yōu)化的條件下進(jìn)行測(cè)定。如表7所示的生化檢測(cè)13項(xiàng)的相關(guān)性為良好，能夠由微量血液得到原血漿中的生化檢測(cè)數(shù)據(jù)。[表7]與用鈉外標(biāo)法的血漿的相關(guān)性3.利用內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物的分析法(雜交法)[實(shí)施例3-1]使用微量血液樣品的定量分析(1)內(nèi)標(biāo)物(鋰、甘油-3-磷酸)和外標(biāo)物(鈉)的測(cè)定和稀釋倍數(shù)的計(jì)算在添加內(nèi)標(biāo)物的緩沖液280μl中添加微量血液樣品65μl并混合，用過(guò)濾器過(guò)濾血細(xì)胞，將稀釋血漿作為樣品用自動(dòng)生化分析裝置測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和外標(biāo)物以及生物成分的各濃度。作為血液樣品的稀釋用緩沖液，使用將2-氨基-2-甲基-1-丙醇和hepes(2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)組合并混合而成的ph7.4的緩沖液。添加所用內(nèi)標(biāo)物的緩沖液的組成如表8所示。[表8]添加鈉內(nèi)標(biāo)物的稀釋用緩沖液的組成作為內(nèi)標(biāo)物使用鋰，稀釋用緩沖液中添加1mm/l的氯化鋰。作為外標(biāo)物，使用血液樣品中含有的鈉。緩沖液中作為內(nèi)標(biāo)物而添加的鋰的測(cè)定通過(guò)螯合物比色法(鹵素卟啉螯合物法：全氟-5,10,15,20-四苯基-21h,23h-卟啉)進(jìn)行測(cè)定。稀釋血漿的微量鈉測(cè)定開(kāi)發(fā)出利用通過(guò)鈉活化β-半乳糖苷酶，并利用用緩沖液稀釋的樣品的鈉濃度與半乳糖苷酶活性呈正比例關(guān)系的酶法測(cè)定。鈉測(cè)定試劑的組成如表9所示。[表9]鈉測(cè)定試劑的組成使用表9所示的鈉測(cè)定試劑，進(jìn)行如下測(cè)定。在稀釋緩沖液280μl中添加全血65μl，全血中的血漿(約30μl)稀釋約10倍。在用純水稀釋該稀釋血漿4.5倍后的3μl中加入β-半乳糖苷酶緩沖液(第一試劑)52μl，37℃下加溫5分鐘，加入底物溶液鄰硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷(第二試劑)26μl，用日本電子株式會(huì)社的jca-bm6050型自動(dòng)生化分析裝置，通過(guò)在主波長(zhǎng)410nm、副波長(zhǎng)658nm處測(cè)定吸光度，求得每分鐘的吸光度速度變化。表示鈉濃度和吸光度變化量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)到24mmol/l的線性并可確認(rèn)鈉的定量性。[表10]鋰的測(cè)定法使用表10的測(cè)定試劑按照如下方法進(jìn)行鋰的測(cè)定。在稀釋緩沖液280μl中添加全血65μl，全血中的血漿(約30μl)稀釋約10倍。用日本電子株式會(huì)社的jca-bm6050型自動(dòng)生化分析裝置，在用純水稀釋該稀釋血漿4.5倍稀釋后的5μl中加入螯合物試劑(第一試劑)55μl，37℃下加溫10分鐘，通過(guò)在主波長(zhǎng)545nm、副波長(zhǎng)596nm處測(cè)定吸光度而求得。表示鋰濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9所示。得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)到1mmol/l的線性并可確認(rèn)鋰的定量性。將甘油-3-磷酸作為內(nèi)標(biāo)物時(shí)的測(cè)定法在稀釋緩沖液280μl中添加全血65μl，全血中的血漿(約30μl)稀釋約10倍。用日本電子株式會(huì)社的jca-bm6050型自動(dòng)生化分析裝置，在用純水稀釋該稀釋血漿4.5倍稀釋后的9μl中加入第一試劑(過(guò)氧化物酶)50μl，37℃下加溫5分鐘，加入第二試劑(甘油-3-磷酸氧化酶)25μl，在5分鐘后，通過(guò)在主波長(zhǎng)596nm、副波長(zhǎng)884nm處測(cè)定吸光度而求得。得到經(jīng)過(guò)原點(diǎn)到4mmol/l的線性并可確認(rèn)甘油-3-磷酸的定量性。甘油-3-磷酸測(cè)定法使用如表11所示的試劑成分。[表11]甘油-3-磷酸的測(cè)定法(2)微量血液樣品與靜脈血漿的相關(guān)性使用日本電子株式會(huì)社的jca-bm6050型自動(dòng)分析裝置進(jìn)行測(cè)定的血漿與稀釋血漿的生化檢測(cè)項(xiàng)目測(cè)定值的相關(guān)圖如圖10-1～10-6所示。將稀釋用緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物(鋰)的測(cè)定吸光度(a)與血漿添加后的內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定吸光度(b)、以及142mmol/l的鈉測(cè)定吸光度(c)與稀釋血漿的鈉吸光度(d)通過(guò)下述計(jì)算式(1)求得雜交中稀釋倍數(shù)(x：8倍稀釋)，將利用該稀釋倍數(shù)求得的稀釋血漿的生化檢測(cè)數(shù)據(jù)(稀釋血漿測(cè)定值)表示于y軸、將血漿數(shù)據(jù)(血漿測(cè)定值)表示于x軸。各檢查項(xiàng)目的血漿測(cè)定用常用方法進(jìn)行測(cè)定。此外，稀釋血漿的測(cè)定通過(guò)常用方法增加樣品的容量并在最優(yōu)化的條件下進(jìn)行測(cè)定。如圖10-1～10-6所示的生化檢測(cè)13項(xiàng)的相關(guān)性為良好，能夠由微量血液得到原血漿中的生化檢測(cè)數(shù)據(jù)。表12中表示同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物(鋰)和外標(biāo)物(鈉)的雜交法的血漿測(cè)定值與稀釋血漿測(cè)定值的相關(guān)統(tǒng)計(jì)值。[表12]同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物(鋰)和外標(biāo)物(鈉)的雜交法的相關(guān)性[實(shí)施例3-2]血漿與稀釋血漿的生化檢測(cè)項(xiàng)目測(cè)定值的相關(guān)使用日本電子株式會(huì)社的jca-bm6050型自動(dòng)分析裝置進(jìn)行測(cè)定的血漿與稀釋血漿的生化檢測(cè)項(xiàng)目測(cè)定值的相關(guān)性如表13所示。將稀釋用緩沖液中的內(nèi)標(biāo)物(甘油-3-磷酸)的測(cè)定吸光度(a)與血漿添加后的內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定吸光度(b)、以及142mmol/l的鈉測(cè)定吸光度(c)與稀釋血漿的鈉吸光度(d)通過(guò)實(shí)施例3-1的計(jì)算式(1)求得雜交中稀釋倍數(shù)(x：8倍稀釋)，將利用該稀釋倍數(shù)求得的稀釋血漿的生化檢測(cè)數(shù)據(jù)(稀釋血漿測(cè)定值)表示于y軸、將血漿數(shù)據(jù)(血漿測(cè)定值)表示于x軸。各檢查項(xiàng)目的血漿測(cè)定用常用方法進(jìn)行測(cè)定。此外，稀釋血漿的測(cè)定通過(guò)常用方法增加樣品的容量并在最優(yōu)化的條件下進(jìn)行測(cè)定。如表13所示的生化檢測(cè)13項(xiàng)的相關(guān)性為良好，能夠由微量血液得到原血漿中的生化檢測(cè)數(shù)據(jù)。表13中表示同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物(甘油-3-磷酸)和外標(biāo)物(鈉)的雜交法的血漿測(cè)定值與稀釋血漿測(cè)定值的相關(guān)統(tǒng)計(jì)值。[表13]甘油-3-磷酸和鈉的雜交法與血漿測(cè)定法的相關(guān)性[實(shí)施例3-3]同時(shí)使用內(nèi)標(biāo)物(li)和外標(biāo)物(na)的檢查數(shù)據(jù)對(duì)測(cè)定誤差與精度產(chǎn)生的影響(1)作為外標(biāo)物使用血漿鈉時(shí)對(duì)稀釋倍數(shù)產(chǎn)生的影響正常人的血漿鈉濃度在個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間的生理性變動(dòng)非常小，其標(biāo)準(zhǔn)范圍(正常范圍)為135～145mmol/l。利用此正常人的中位值的142mmol/l值，對(duì)用稀釋用緩沖液稀釋血液樣品并除去血細(xì)胞而得到的稀釋血漿中的鈉濃度，用高靈敏度的酶法進(jìn)行測(cè)定則可高精度地測(cè)定至0～30mmol/l。此外，即使將標(biāo)準(zhǔn)范圍上下限的135mmol/l和145mmol/l的樣品以142mmol/l為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)稀釋倍數(shù)進(jìn)行校正，可以在±2％的誤差范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。但是，大于如表14所示的標(biāo)準(zhǔn)范圍上下限值的正常人分別存在于全體的2.5％，因此136mmol/l與148mmol/l的血漿中分別有產(chǎn)生±4％以上誤差的問(wèn)題點(diǎn)。在同時(shí)使用將鋰作為內(nèi)標(biāo)物求出稀釋倍數(shù)的方法和將鈉作為外標(biāo)物求出稀釋倍數(shù)的方法的雜交法中，如表14所示的±4％以上誤差可降低到一半。表14中稀釋倍數(shù)欄的“na外標(biāo)”表示只基于外標(biāo)物的鈉濃度求得的稀釋倍數(shù)，“na-li校正：雜交法校正”表示基于外標(biāo)物的鈉濃度和內(nèi)標(biāo)物的鋰濃度二者求得的稀釋倍數(shù)。“雜交法校正”中的稀釋倍數(shù)使用實(shí)施例3-1的計(jì)算式(1)計(jì)算。單獨(dú)鈉的稀釋倍數(shù)和雜交的稀釋倍數(shù)的兩個(gè)方法中對(duì)用血漿膽固醇的測(cè)定值產(chǎn)生的誤差如表14所示?？芍ㄟ^(guò)使用雜交法使誤差降低一半。[表14]作為外標(biāo)物使用血漿鈉時(shí)對(duì)稀釋倍數(shù)產(chǎn)生的影響(2)作為內(nèi)標(biāo)物使用鋰時(shí)對(duì)稀釋倍數(shù)產(chǎn)生的影響稀釋血液的緩沖液中添加鋰作為內(nèi)標(biāo)物時(shí)，根據(jù)血液中的血漿量稀釋鋰濃度，由于求出血漿稀釋倍數(shù)的方法到8～10倍程度，血漿添加量較多，因此添加前與添加后的濃度差較大，稀釋倍數(shù)的重現(xiàn)性為變動(dòng)系數(shù)2％以下。但是，在12～16倍由于血漿的添加量減少，因此稀釋倍數(shù)提高至變動(dòng)系數(shù)4％～5％。由如表15所示的雜交法校正的12倍至16倍的稀釋倍數(shù)約為3％，血液不易采集，即使受試者得到精度良好的數(shù)據(jù)。血漿膽固醇為210mg/dl的受試者稀釋16倍時(shí)，作為內(nèi)標(biāo)物只使用內(nèi)標(biāo)物的鋰計(jì)算稀釋倍數(shù)，由于校正測(cè)定值時(shí)產(chǎn)生199～221mg/dl的變動(dòng)，因此判斷為高脂血癥(220mg/dl以上)的受試者。表15中，“l(fā)i內(nèi)標(biāo)”表示只根據(jù)內(nèi)標(biāo)物鋰的濃度求得的稀釋倍數(shù)，“na外標(biāo)”表示只根據(jù)外標(biāo)物鈉的濃度求得的稀釋倍數(shù)，“雜交法校正”表示根據(jù)外標(biāo)物鈉的濃度和內(nèi)標(biāo)物鋰的濃度二者求得的稀釋倍數(shù)?！半s交法校正”中的稀釋倍數(shù)使用實(shí)施例3-1的計(jì)算式(1)計(jì)算。另一方面，同時(shí)使用作為內(nèi)標(biāo)物的鋰與作為外標(biāo)物的鈉計(jì)算稀釋倍數(shù)，并對(duì)測(cè)定值進(jìn)行校正時(shí)為204～216mg/dl，判斷為正常人。因此，通過(guò)使用雜交法的校正，可以得到高精度的測(cè)定值。[表15]對(duì)作為內(nèi)標(biāo)物鋰與外標(biāo)物鈉以及雜交法的稀釋倍數(shù)產(chǎn)生重現(xiàn)性(cv％)的影響對(duì)血漿稀釋倍數(shù)為6～16倍中作為內(nèi)標(biāo)物鋰與外標(biāo)鈉以及雜交法中的稀釋倍數(shù)產(chǎn)生重現(xiàn)性(cv％)的影響如表15所示。雜交法與單獨(dú)內(nèi)標(biāo)法的重現(xiàn)性相比顯示出良好的重現(xiàn)性。工業(yè)上的可利用性本發(fā)明對(duì)于通過(guò)如上述受試者的手指等由體內(nèi)采集的微量且未知量的全血樣品等生物樣品的血漿和生物樣品中的任意成分也能夠簡(jiǎn)單且準(zhǔn)確地定量。此外可以求出作為血液的貧血程度的血細(xì)胞容積比(血細(xì)胞比容值)。由此，即使受試者本身也能進(jìn)行，雖然血液等微量采集，而且從采集起經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間后也能夠?qū)κ茉囌叩难旱炔杉纳飿悠窚?zhǔn)確地進(jìn)行分析。由此，能夠有效地用于受試者的健康診斷中，工業(yè)上的可利用性高。進(jìn)一步，由于本發(fā)明的微量血液采集方法不受血液采集的時(shí)間與場(chǎng)所限制，能夠應(yīng)用于沒(méi)有時(shí)間前往醫(yī)療機(jī)構(gòu)的情況、災(zāi)害時(shí)、遠(yuǎn)程醫(yī)療、健康管理等，可早期發(fā)現(xiàn)癥狀發(fā)生前的人等，也有助于醫(yī)療費(fèi)的降低。此外能夠高效地用市售的自動(dòng)生化分析裝置對(duì)大量樣品進(jìn)行測(cè)定。也可以用于測(cè)定的檢查數(shù)據(jù)通過(guò)發(fā)送到智能手機(jī)來(lái)對(duì)日常性的健康管理或疾病的早期發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)中。符號(hào)說(shuō)明1：血液2：血漿(血清)3：血細(xì)胞4：緩沖液5：內(nèi)標(biāo)物6：血液稀釋溶液當(dāng)前第1頁(yè)12