本說明書涉及卵巢癌的診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物(diagnosticandprognosticbiomarker)的領(lǐng)域。特別地，其提供了用于評估受試者是否處于發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險或正在遭受卵巢癌的新型體外篩查方法。另外，可以將本生物標(biāo)記物用于評價存活預(yù)后(survivalprognosis)、治療效力和卵巢癌的腫瘤切除的成功率的方法。通過測量生物標(biāo)記物在血清或血漿中的濃度可以將本發(fā)明的生物標(biāo)記物用于確定所述生物標(biāo)記物在腫瘤中的濃度。
背景技術(shù)：
：卵巢癌是低發(fā)病率但是存活率不良的異質(zhì)性疾病(heterogeneousdisease)。根據(jù)2012年世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計數(shù)值，評估世界范圍內(nèi)存在239000個新的卵巢癌病例，代表女性所有癌癥的4％。根據(jù)該統(tǒng)計數(shù)值，在2012年，152000例死亡是由卵巢癌引起的。卵巢癌是女性癌癥死亡中第八大常見的原因，以及較大比例的新的卵巢癌發(fā)生在人口發(fā)展水平高或非常高的國家。發(fā)病率在北歐和東歐、北美洲和大洋洲最高，而在非洲和亞洲大部分趨向于相對低。然而，在20世紀(jì)90年代和21世紀(jì)，例如中國的發(fā)病率急劇升高。(世界衛(wèi)生組織世界癌癥報告2014)。最常見的卵巢癌是卵巢惡性腫瘤，其包括五種主要亞型，并且其中高級漿液性惡性腫瘤(serouscarcinoma)是最常見的一種(占病例的約70％)。早期診斷對于患者的存活率是關(guān)鍵性的，因?yàn)?，例如I期患者的5年存活率是約90％，而對于IV期患者，其僅是約20％。然而，卵巢癌的診斷是困難的，以及僅當(dāng)進(jìn)行到最后階段時該疾病趨向于引起患者的癥狀，并且另外，癥狀經(jīng)常與其他疾病的那些類似。因此，新的診斷工具(其可以在早期檢測卵巢癌)對于成功治療卵巢癌患者是重要的。之前檢測卵巢癌的方法依賴于蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物分析和成像方法。目前用于卵巢癌的主要診斷方法包括骨盆檢查、CA-125血液測試和經(jīng)陰道超聲。CA-125和HE4是USFDA批準(zhǔn)的用于監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展，而非篩查的唯一兩種生物標(biāo)記物。由若干蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物組成的多變量指數(shù)測定(multivariateindexassay)OVA1自2009年被FDA批準(zhǔn)用于骨盆腔腫塊的分類(Nguyenetal.,Women'sHealth,2013,9(2),171-187)。已經(jīng)報告了CA-125是用于卵巢癌的總存活率的和無進(jìn)展存活率(progressionfreesurvival)的預(yù)后因素，而且研究表明存在矛盾的結(jié)果。CA-125水平在患有晚期上皮卵巢癌的約90％患者中升高，但是僅在患有I期疾病的50％患者中升高(Gupta&Lis,JournalofOvarianCancer,2009,2:13)。因此，黃金標(biāo)準(zhǔn)CA-125對于檢測晚期疾病的患者是相對良好的，但是CA-125在其他患者中缺乏靈敏度并且其在存活率預(yù)測中的作用存在一定的爭議。與蛋白質(zhì)相比，嘗試將包括代謝物和脂質(zhì)的小分子用作診斷工具，因?yàn)樗鼈冎苯臃从承玛惔x的變化，已知該變化早在腫瘤開始和進(jìn)展的早期就已經(jīng)出現(xiàn)。特定路徑的基因表達(dá)或蛋白水平的小的變化可以導(dǎo)致小分子代謝物和脂質(zhì)濃度的大的改變，因?yàn)榭梢詫⑺鼈兊乃揭暈槭巧锫窂降幕钚缘姆糯筝敵?。盡管有一些嘗試尋找用于卵巢癌的小分子生物標(biāo)記物，但是之前的公開沒有提供已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)踐的來自血清的簡單的和可靠的小分子卵巢癌生物標(biāo)記物。WO2009151967描述了多種用于卵巢癌診斷的新陳代謝生物標(biāo)記物候選和機(jī)器學(xué)習(xí)分類運(yùn)算法則。WO2012038525A1描述了多種作為各種卵巢癌的生物標(biāo)記物的磷脂。WO2013016700描述了使用質(zhì)譜分析(MS)或核磁共振(NMR)的數(shù)據(jù)來產(chǎn)生用于上皮卵巢癌的預(yù)測模型的分類運(yùn)算法則的用途。在描述卵巢癌的潛在的生物標(biāo)記物候選物的其他公開中也應(yīng)用了NMR技術(shù)，如WO2011041892和US2005170441。然而，之前的研究中的限制通常是大量生物標(biāo)記物的描述，不能使用來自癌癥患者的其他信息將其縮小，如血清和腫瘤組織之間的生物標(biāo)記物水平的相互關(guān)系的預(yù)知或探究。此外，沒有公開的文獻(xiàn)表明可以怎樣組合單種代謝物或代謝物連同蛋白質(zhì)標(biāo)記物的組合的信息來給出卵巢癌患者的更精確的診斷和預(yù)后方法。因此，關(guān)注的一系列小分子對于更好的卵巢癌診斷將是極度有用的。定義3,4-DHBA-3,4-二羥基丁酸3-HBA-3-羥基丁酸AUC-曲線下的面積CA-125-癌癥抗原125，惡性腫瘤抗原125，糖抗原125GC-氣相色譜法GCxGC-二維氣相色譜法HE4-人附睪蛋白質(zhì)4LC-液相色譜法lysoPC-溶血卵磷脂MS-質(zhì)譜分析NMR-核磁共振PC-卵磷脂PE-磷脂酰乙醇胺ROC-接受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic)SM-鞘磷脂(sphingomyelin)TAG-三酰甘油酯TOF-飛行時間(time-of-flight)WHO-世界衛(wèi)生組織附圖說明圖1公開了對照組(沒有惡性腫瘤)以及在手術(shù)期間具有或不具有完全的腫瘤減少的卵巢癌患者的血清中，目前識別的小分子生物標(biāo)記物的濃度?？傮w上，小分子生物標(biāo)記物示出了漸進(jìn)的趨勢，因?yàn)闈舛仍趯φ战M中最低以及在手術(shù)期間的腫瘤切除不完全的患者中最高。該趨勢尤其適用于二羥基丁酸和三羥基丁酸。鞘磷脂(SM)則表現(xiàn)出相反的趨勢，其中濃度在沒有惡性腫瘤的受試者中最高以及在沒有完全的腫瘤減少的卵巢癌患者中最低。CA-125和3-羥基丁酸在對照和惡性腫瘤患者之間示出了明顯的差異，但是在兩種情況下(在具有或不具有腫瘤減少的患者中)沒有顯著的差異，這間接地暗示這些分子沒有表現(xiàn)出與存在于患者中的腫瘤塊的量的明顯的關(guān)聯(lián)。在表2示中出了，在惡性腫瘤(相對于對照)中以及，在完全的腫瘤減少(相對于不完全的腫瘤減少比較)中的這些分子的每種的t測試值和log2倍數(shù)變化。圖2公開了當(dāng)與對照組相比時卵巢癌患者的血清中的三酰甘油酯(TAG)的變化。在圖中，每個圓點(diǎn)代表一種TAG分子，其示出了t測試中組之間的統(tǒng)計上顯著的結(jié)果，以及x軸表示每種TAG的脂肪酰基側(cè)鏈中的碳的總數(shù)。在卵巢癌患者的血清中，TAG的分布存在明顯的變化。除一種脂質(zhì)之外，與不具有惡性腫瘤的受試者相比，在脂肪?；鶄?cè)鏈中具有53個或更少碳的所有TAG在卵巢癌患者中降低。相反，除兩種脂質(zhì)之外，當(dāng)與對照組相比時，在脂肪?；鶄?cè)鏈中具有54個或更多碳的所有TAG在卵巢癌患者中升高。圖3公開了當(dāng)預(yù)測具有惡性的卵巢腫瘤的患者時的接受者操作特征(ROC)曲線。交叉驗(yàn)證模型使得將數(shù)據(jù)組隨機(jī)分到訓(xùn)練(2/3樣品)和驗(yàn)證(1/3樣品)組1000次，并在驗(yàn)證組(validation)中測試訓(xùn)練組(trainingset)中的構(gòu)造模型。線代表平均值，以及箱圖代表所有運(yùn)行的可變性。表3呈現(xiàn)了曲線(AUC)下的平均面積值和它們的95％置信區(qū)間。圖和AUC值表明當(dāng)模型包含CA-125連同3-羥基丁酸和3,4-二羥基丁酸(其中具有或或不具有合并至模型的SM(d18:1/24:0))時，實(shí)現(xiàn)了最大的值和最精確的預(yù)測。CA-125連同圖中所示的三種SM產(chǎn)生的模型稍好于僅合并CA-125的模型。結(jié)論是當(dāng)與僅來自CA-125的信息相比時，將來自小分子生物標(biāo)記物的信息合并至CA-125濃度，增加了靈敏度和預(yù)測的特異性。圖4公開了用于分類I期和II期患者與沒有惡性腫瘤的對照受試者的模型的ROC曲線。數(shù)據(jù)僅包含患I期和II期卵巢癌的7位患者，并且該患者群體的CA-125的AUC值比預(yù)期的高。然而，盡管有這些限制，3-羥基丁酸(3-HBA)示出了較高的AUC值(表4示出了所有值)，并且尤其是包含來自CA-125連同3-羥基丁酸和3,4-二羥基丁酸(3,4-DHBA)的信息的模型示出了組的幾乎完全的分離。該結(jié)果給出了證明，即在具有或不具有合并至模型的CA-125的信息的情況下，小分子生物標(biāo)記物可用于診斷早期卵巢癌患者。圖5公開了每種小分子生物標(biāo)記物和CA-125的Kaplan-Meier曲線。該圖示出了當(dāng)將患者分為兩個組時，對于每種分子的總存活率：具有低于或等于所有樣品的中值的濃度的那些和具有高于所有樣品的中值的濃度的那些。表2示出了這些結(jié)果的p值。顯而易見的是對于大部分的小分子生物標(biāo)記物，血清中的濃度越高表示總存活率越低。然而，對于鞘磷脂(SM)，一般而言，血清中的濃度越低表示總存活率越低。CA-125沒有示出與患者的總存活率的任何關(guān)聯(lián)，并且因此與CA-125相比，小分子生物標(biāo)記物是優(yōu)異的預(yù)后標(biāo)記物。圖6公開了直觀化選定的小分子生物標(biāo)記物的組織和血清濃度之間的相互關(guān)系的散布圖。表5示出了統(tǒng)計結(jié)果，其示出了Spearman和Pearson相互關(guān)系分析中的p和R2值。圖7公開了簡單的示意圖，其示出了人體中的酮體的化學(xué)反應(yīng)。3-羥基丁酸可以在可逆反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸，乙酰乙酸在不可逆反應(yīng)中可以轉(zhuǎn)化為丙酮。本研究的結(jié)果示出了卵巢癌患者的血清中的3-羥基丁酸和乙酰乙酸的濃度較高。根據(jù)這些反應(yīng)，丙酮的濃度也升高是合乎邏輯的。具體實(shí)施方式本發(fā)明通過量化定義的分子種類和它們的組合鑒定了小分子卵巢癌生物標(biāo)記物。重要地，本發(fā)明示出了已經(jīng)處于單種濃度的水平的值。本發(fā)明還首次提供了一組可以單獨(dú)或組合使用的生物標(biāo)記物，來通過測量在血液或甚至呼吸中的濃度確定它們在卵巢癌腫瘤中的濃度，從而簡化測量。本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)了用于卵巢癌的新型小分子生物標(biāo)記物。具體地，發(fā)現(xiàn)的是每種標(biāo)記物在來自具有卵巢癌的受試者的樣品中表現(xiàn)出濃度的特征升高或降低，并且它們可用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途。本生物標(biāo)記物是敏感的和特異性的，并且它們可用于診斷和預(yù)后測試。該生物標(biāo)記物可特別用于早期卵巢癌，如I期或II期卵巢癌。另外，對于卵巢癌診斷，大部分的本發(fā)明生物標(biāo)記物還與患者的存活率有關(guān)，并因此它們在預(yù)測患者具有惡性卵巢腫瘤中以及在預(yù)測這些患者的預(yù)后中具有雙重作用。本發(fā)明因此代表了超過目前用于診斷和/或預(yù)測卵巢癌的現(xiàn)有方法的重要優(yōu)勢。因此，用于卵巢癌的本發(fā)明的小分子生物標(biāo)記物允許更好地診斷或評估發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險。進(jìn)一步地，本標(biāo)記物在具有卵巢癌的患者中的治療效力和腫瘤切除的確定中得到應(yīng)用。雖然根據(jù)本發(fā)明可以僅使用單種小分子生物標(biāo)記物且足以提供可靠的結(jié)果，但是優(yōu)選的是使用若干生物標(biāo)記物來增加評估的可靠性。進(jìn)一步地，可以將來自小分子生物標(biāo)記物的預(yù)測或預(yù)后信息與用于卵巢癌的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，如CA-125組合用于早期或晚期評估。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于評估受試者是否處于發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險或正在遭受卵巢癌的體外篩查的方法，包括由受試者的樣品確定至少一種小分子生物標(biāo)記物的濃度，其中，當(dāng)與對照樣品比較時，樣品的濃度的升高或降低表示受試者遭受卵巢癌或具有增加的發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險；(1)其中，與對照比較，濃度升高的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由二羥基丁酸和三羥基丁酸組成的組；和/或(2)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由鞘磷脂組成的組；和/或(3)其中，與對照比較，濃度升高的至少一種小分子生物標(biāo)記物是具有總共包含至少54個碳原子的酰基側(cè)鏈的長鏈甘油三酯；和/或(4)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種小分子生物標(biāo)記物是具有總共包含小于54個碳原子的酰基側(cè)鏈的甘油三酯；和/或(5)其中，與對照比較，濃度升高的至少一種小分子生物標(biāo)記物是己二酸。在實(shí)施方式中，用于評估受試者是否處于發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險中或正在遭受卵巢癌的方法進(jìn)一步包括由樣品確定至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物，其中，當(dāng)與對照樣品比較時，生物標(biāo)記物的濃度的升高表示受試者遭受卵巢癌或具有增加的發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險；(a)其中，與對照比較，濃度升高的至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物選自由羥基酸(醇酸，hydroxyacid)和己二酸組成的組；和/或(b)其中，與對照比較，濃度升高的至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物選自由羥基丁酸和酮體組成的組。在實(shí)施方式中，用于評估受試者是否處于發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險中或正在遭受卵巢癌的方法包括進(jìn)行第(1)、(2)、(3)、(4)、(5)項(xiàng)中的任一項(xiàng)的確定；或第(1)、(2)、(3)、(4)、(5)項(xiàng)中的任一項(xiàng)以及第(a)或(b)項(xiàng)中的任一項(xiàng)的確定。在另一實(shí)施方式中，確定第(1)、(2)、(a)和(b)項(xiàng)；第(1)、(2)、(3)、(a)和(b)項(xiàng)；或第(1)至(5)、(a)和(b)項(xiàng)。與僅使用一種小分子生物標(biāo)記物相比，使用多種小分子生物標(biāo)記物增加了評估的可靠性。在實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包括確定血液中針對卵巢癌的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，如CA-125或HE4的水平，以及其中，增加的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物連同目前鑒定的小分子生物標(biāo)記物確定(biomarkerdetermination)表明受試者具有增加的發(fā)展卵巢癌或遭受卵巢癌的風(fēng)險。因此，可以將目前識別的生物標(biāo)記物與CA-125生物標(biāo)記物組合使用以通過組合至少一種小分子生物標(biāo)記物和CA-125生物標(biāo)記物兩者的分析來改善確定的可靠性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法確定CA-125。優(yōu)選地，由與用于確定小分子生物標(biāo)記物相同的樣品確定CA-125。在實(shí)施方式中，確定卵巢癌蛋白標(biāo)記物，如CA-125或HE4和3-羥基丁酸，并且其中蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物和3-羥基丁酸的濃度的升高表示發(fā)展卵巢癌或遭受卵巢癌的增加的風(fēng)險。組合分析增強(qiáng)了CA-125蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物對于早期和晚期卵巢癌篩查和預(yù)后的特異性和靈敏度。CA-125和3-羥基丁酸的組合對于早期卵巢癌是特別有用的。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了評估受試者是否具有針對卵巢癌的降低的存活預(yù)后的方法，包括測量來自受試者的樣品中的至少一種小分子生物標(biāo)記物的水平，其中，相對于對照樣品中對應(yīng)的小分子生物標(biāo)記物的水平，至少一種小分子生物標(biāo)記物的水平的升高表示受試者具有針對卵巢癌的不良的存活預(yù)后，并且其中，該至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由二羥基丁酸、三羥基丁酸、羥基酸、己二酸、羥基丁酸和酮體組成的組；和/或相對于對照樣品中對應(yīng)的小分子生物標(biāo)記物的水平，至少一種小分子生物標(biāo)記物的水平的降低表示受試者具有針對卵巢癌的不良的存活預(yù)后，并且其中，至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由鞘磷脂組成的組。當(dāng)針對癌癥患者進(jìn)行不同類型的治療和它們的持續(xù)時間的評估和判定時，對于遭受卵巢癌的患者來說可靠的預(yù)后是重要的。另外，預(yù)后影響在治療之后的后續(xù)事項(xiàng)(follow-up)的強(qiáng)度。最后，盡可能精確地評估疾病的預(yù)后對于患者和它們的健康來說是重要的。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用于評估接受了腫瘤療法的受試者中的卵巢癌腫瘤切除的成功率的體外方法，包括由受試者的血液樣品測量至少一種小分子生物標(biāo)記物的水平，其中，相對于對照樣品中的對應(yīng)的小分子生物標(biāo)記物的水平，至少一種小分子生物標(biāo)記物的水平的升高或降低表示腫瘤切除是成功的，并且(1)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由二羥基丁酸和三羥基丁酸組成的組；和/或(2)其中，與對照比較，濃度升高的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由鞘磷脂組成的組；和/或(3)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種小分子生物標(biāo)記物是具有總共包含至少54個碳原子的?；鶄?cè)鏈的長鏈甘油三酯；和/或(4)其中，與對照比較，濃度升高的至少一種小分子生物標(biāo)記物是具有總共包含小于54個碳原子的?；鶄?cè)鏈的甘油三酯；和/或(5)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種小分子生物標(biāo)記物是己二酸。在實(shí)施方式中，用于評估卵巢癌腫瘤切除的成功率的方法進(jìn)一步包括由樣品確定至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物，其中，當(dāng)與對照樣品相比時，生物標(biāo)記物的濃度的降低表示腫瘤切除是成功的；(a)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物選自由羥基酸和己二酸組成的組；和/或(b)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物選自由羥基丁酸和酮體組成的組。在實(shí)施方式中，用于評估卵巢癌腫瘤切除的成功率的方法包括進(jìn)行第(1)、(2)、(a)和(b)項(xiàng)、或第(1)至(5)、(a)和(b)項(xiàng)的確定。監(jiān)測腫瘤切除成功是治療的一個重要的方面，并且這提供了關(guān)于進(jìn)一步操作或治療所需要的有價值的信息。因此，基于以上評估的結(jié)果，治療之后可以是進(jìn)一步的操作或藥物療法。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了評估受試者中的卵巢癌療法的效力的體外方法，包括由受試者的樣品確定至少一種小分子生物標(biāo)記物的濃度，其中，當(dāng)與對照樣品比較時，樣品的濃度的升高或降低表示療法的效力；(1)其中，將其濃度與對照比較的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由二羥基丁酸和三羥基丁酸組成的組；和/或(2)其中，將其濃度與對照比較的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由鞘磷脂組成的組；和/或(3)其中，將其濃度與對照比較的至少一種小分子生物標(biāo)記物是具有總共包含至少54個碳原子的?；鶄?cè)鏈的長鏈甘油三酯；和/或(4)其中，將其濃度與對照比較的至少一種小分子生物標(biāo)記物是具有總共包含小于54個碳原子的酰基側(cè)鏈的甘油三酯；和/或(5)其中，將其濃度與對照比較的至少一種小分子生物標(biāo)記物是己二酸；(a)其中，將其濃度與對照比較的至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物選自由二羥基酸和己二酸組成的組；和/或(b)其中，與對照比較，濃度降低的至少一種另外的小分子生物標(biāo)記物選自由羥基丁酸和酮體組成的組；并且其中，(1)、(3)、(5)、(a)和(b)中的至少一個的升高或(2)或(4)的降低表明治療無效；和/或(1)、(3)、(5)、(a)和(b)中的至少一個的降低或(2)或(4)的降低表示治療有效。在該方法中，通過以下的目前識別的小分子生物標(biāo)記物監(jiān)測療法的效力。選擇的生物標(biāo)記物反映卵巢癌的進(jìn)展，并當(dāng)癌癥響應(yīng)該療法時，所選擇的生物標(biāo)記物接近針對對照樣品確定的濃度。因此，可以基于受試者定制療法使得僅繼續(xù)表現(xiàn)出積極應(yīng)答并因此發(fā)現(xiàn)為有效的療法，以及中止表現(xiàn)出沒有應(yīng)答并因此發(fā)現(xiàn)為無效的療法。在評價受試者中的卵巢癌療法的效力的體外方法的實(shí)施方式中，小分子生物標(biāo)記物是3-羥基丁酸，并且另外確定CA-125，其中，3-羥基丁酸或CA-125中任一項(xiàng)的升高表示治療無效以及3-羥基丁酸或CA-125中任一項(xiàng)的降低表示治療有效。在實(shí)施方式中，療法可以包括通常給予具有卵巢癌的受試者的任何治療，如但不限于化療、放射療法、激素療法、抗血管生成劑療法、靶定同源重組缺陷的療法、抗體療法或其他利用卵巢癌特異性信號路徑的定向療法。治療可以包括對惡性組織的代謝具有直接影響的治療。卵巢癌療法可以包括給予影響脂質(zhì)代謝的藥物試劑。根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了確定受試者的卵巢組織中的代謝物的濃度的體外方法，包括確定由受試者獲得的血液樣品中的代謝物的濃度；比較代謝物的血液濃度與對照樣品中的濃度，其中，與對照樣品相比，代謝物的水平的升高表示受試者在卵巢組織中具有升高的代謝物濃度；并且其中，代謝物選自由3-羥基丁酸、2-羥基丁酸、3,4-二羥基丁酸、SM(d18:1/21:0)、SM(d18:1/14:0)、己二酸、4-羥基苯乳酸(hydroxyphenyllacticacid)、2,4-二羥基丁酸、3-羥基異戊酸和2,3-二羥基丁酸組成的組。在實(shí)施方式中，在卵巢組織中確定的該濃度的代謝物選自由2-羥基丁酸和/或3-羥基丁酸組成的組。通常使用試驗(yàn)來進(jìn)行生物標(biāo)記物的確定?？梢杂枚喾N化學(xué)品和高分辨率分析技術(shù)進(jìn)行測定，視情況而定。根據(jù)本方法的合適的分析技術(shù)包括，但不限于質(zhì)譜分析(MS)和核磁共振(NMR)?？梢詫⒛軌蛉芙鈫蝹€小分子生物標(biāo)記物的任何高分辨率技術(shù)用于收集關(guān)于討論的生物標(biāo)記物的信息，如生物樣品如血清、血漿、組織、尿液或唾液的生物標(biāo)記物狀況(profile)的濃度。優(yōu)選地，使用質(zhì)譜分析收集信息?？梢詫S分析與另一種高效分離方法，如氣相色譜法(GC)二維氣相色譜法(GCxGC)、液相色譜法(LC)、高效液相色譜法(HPLC)或超高效液相色譜法(UPLC)偶聯(lián)。來自受試者的樣品和對照樣品可以是血清樣品、血漿樣品、唾液樣品或尿液樣品。血清和血漿樣品是優(yōu)選的。通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可以制備樣品?？商鎿Q地，來自受試者和對照樣品兩者的樣品也可以是組織樣品，例如卵巢組織樣品。根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明的方法提供用于測量血漿樣品或血清樣品中的小分子生物標(biāo)記物的水平，而不需要在檢測之前分離或濃縮脫落的腫瘤細(xì)胞。在實(shí)施方式中，樣品是非沉積的樣品。在另一實(shí)施方式中，血漿樣品基本不含殘留的細(xì)胞。在又一實(shí)施方式中，用凝結(jié)激活劑處理血液樣品并通過離心分離血清，可選地隨后在分析之前凍融。在另一實(shí)施方式中，在質(zhì)譜分析之前，用來自樣品的溶劑或溶劑混合物提取樣品的小分子生物標(biāo)記物。合適的溶劑包括有機(jī)溶劑，如甲醇、氯仿/甲醇或其他類似的溶劑。在另一實(shí)施方式中，在質(zhì)譜分析之前衍生小分子生物標(biāo)記物。在實(shí)施方式中，衍生(derivatization)包括用有機(jī)溶劑提取，在降低的壓力下蒸發(fā)溶劑并衍生。在另一實(shí)施方式中，在通過使用除去細(xì)胞的過濾器確定小分子生物標(biāo)記物之前，過濾樣品。在實(shí)施方式中，將具有30kDa的截留值的過濾器用于除去細(xì)胞。在又一實(shí)施方式中，使用除去蛋白質(zhì)的過濾器。在實(shí)施方式中，在過濾之后重組樣品。在另一實(shí)施方式中，在確定小分子生物標(biāo)記物之前，稀釋樣品或重組的樣品。在實(shí)施方式中，在確定小分子生物標(biāo)記物之前，將樣品以至少1:2稀釋。在另一實(shí)施方式中，將防腐劑或內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)添加到樣品中。本發(fā)明的小分子卵巢癌生物標(biāo)記物使得能夠容易、可靠和早期地預(yù)測卵巢癌。這將有助于，例如早期干涉、較少的癥狀發(fā)展和患病以及降低的發(fā)病率。本生物標(biāo)記物還使得能夠容易監(jiān)測卵巢癌的進(jìn)展，因?yàn)樵诓恍枰占M織樣品的情況下可以在血清樣品上進(jìn)行分析。在某些實(shí)施方式中，卵巢癌是早期卵巢癌。作為小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的羥基酸優(yōu)選包含選自由4-羥基苯乳酸和3-羥基異戊酸組成的組中的至少一種化合物。作為小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的二羥基丁酸優(yōu)選包含選自由2,4-二羥基丁酸、3,4-二羥基丁酸和2,3-二羥基丁酸組成的組中的至少一種化合物。作為小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的三羥基丁酸優(yōu)選包含選自由2,3,4-三羥基丁酸組成的組中的至少一種化合物。作為小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的鞘磷脂優(yōu)先選自鞘磷脂，其具有d18:1類鞘氨醇堿、可選地具有含有14-24個碳原子和0-1個雙鍵的酰胺連接的脂肪酸。更加優(yōu)選地，鞘磷脂選自由SM(d18:1/14:0)、SM(d18:1/20:1)、SM(d18:1/21:0)、SM(d18:1/22:0)、SM(d18:1/22:1)、SM(d18:1/23:0)、SM(d18:1/24:0)組成的組。作為小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的羥基丁酸和酮體優(yōu)選地包含選自由2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、丙酮和乙酰乙酸組成的組中的化合物。作為小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的長鏈甘油三酯包含具有至少54個碳原子的總酰基鏈長度的化合物。作為小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的短鏈甘油三酯包含具有不多于53個碳原子的總酰基鏈長度的化合物。對照可以是由單個健康個體或具有良性腫瘤或其他引起與卵巢癌類似的癥狀的醫(yī)學(xué)病癥的受試者或發(fā)展惡性組織之前的相同的受試者確定的濃度。對照還可以是這樣的樣品，其代表來自健康的個體的普遍群體的樣品的組合。可替換地，對照可以是涉及之前確定的、計算的或推斷的樣品中的生物標(biāo)記物的一組數(shù)據(jù)，或可能還有待于確定、計算或推斷，或也可以從文獻(xiàn)中獲得。當(dāng)由血清樣品作為用于卵巢癌的生物標(biāo)記物分析3-羥基丁酸、2-羥基丁酸、3,4-二羥基丁酸、2,4-二羥基丁酸、2,3-二羥基丁酸、SM(d18:1/21:0)、SM(d18:1/14:0)、己二酸、4-羥基苯乳酸和3-羥基異戊酸時，發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)它們的濃度遵循在癌癥組織中確定的濃度。因此，通過確定它們在血清中的濃度可以確定這些化合物在卵巢組織中的濃度。通過使用來自血清的樣品能夠確定腫瘤內(nèi)生物標(biāo)記物的濃度具有直接由血液樣品監(jiān)測腫瘤內(nèi)的代謝的優(yōu)勢。這可以在不成像或手術(shù)的情況下監(jiān)測腫瘤的大小和在身體中的轉(zhuǎn)移。另外，小分子代謝物可以用作治療療效的標(biāo)記物，以及多種治療選擇如何影響腫瘤細(xì)胞的代謝。根據(jù)第六方面，提供了用于評估受試者是否處于發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險或正在遭受卵巢癌的體外篩查的方法，包括確定呼吸中的揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOC)的濃度，其中，當(dāng)與對照樣品比較時，呼吸中的VOC的濃度的升高表示受試者遭受卵巢癌或具有增加的發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險?？梢岳缤ㄟ^質(zhì)譜法、傳感器陣列(sensorassay)和電子鼻、激光吸收光譜或離子遷移率光譜法檢測揮發(fā)性有機(jī)化合物，如丙酮，以及，例如已經(jīng)報告了健康的個人應(yīng)當(dāng)在它們的呼吸中具有低于0.9ppm的丙酮水平。本發(fā)明人在體液中識別了卵巢癌的小分子生物標(biāo)記物，其可以揮發(fā)或在化學(xué)反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性化合物，并且因此由于它們趨向于，例如從血液移到肺的呼氣中還可以從呼吸中被檢測到。因此，根據(jù)本發(fā)明的任何易揮發(fā)的生物標(biāo)記物如丙酮，具有在受試者的呼吸中測量的水平高于在對照中測量的水平時，表示發(fā)展卵巢癌的風(fēng)險增加。在示例性的實(shí)施方式中，與對照比較，濃度升高的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由2,4-二羥基丁酸、3,4-二羥基丁酸、2,3-二羥基丁酸、2,3,4-三羥基丁酸、4-羥基苯乳酸、3-羥基異戊酸、己二酸、2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、乙酰乙酸和丙酮組成的組。在示例性的實(shí)施方式中，與對照比較，濃度降低的至少一種小分子生物標(biāo)記物選自由SM(d18:1/14:0)、SM(d18:1/20:1)、SM(d18:1/21:0)、SM(d18:1/22:0)、SM(d18:1/22:1)、SM(d18:1/23:0)和SM(d18:1/24:0)組成的組。在示例性的實(shí)施方式中，以上方法包括確定選自由以上在第(1)-(5)、(a)和(b)項(xiàng)中列出的生物標(biāo)記物組成的組中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種小分子生物標(biāo)記物。在示例性的實(shí)施方式中，通過使用質(zhì)譜分析、核磁共振波譜法、熒光光譜法或雙偏振干涉、免疫測定、酶測定、比色測定、熒光測定、快速測試、呼吸測試和/或通過能夠特異結(jié)合生物標(biāo)記物的結(jié)合部分(bindingmoiety)確定生物標(biāo)記物濃度。在另一方面，提供了藥物在用于治療需要其的受試者的卵巢癌或其一種或多種并發(fā)癥中的用途，該方法包括使用用于卵巢癌治療的有效的藥物，其中，使用根據(jù)本發(fā)明的第四方面的用于評價治療效力的以上方法來評價通過藥物的治療效力。在示例性的實(shí)施方式中，以引起腫瘤中的至少一種小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的濃度從初始水平變化至對照樣品的濃度的劑量給予藥物，并且其中，使用根據(jù)以上方法的方法確定至少一種小分子卵巢癌生物標(biāo)記物的濃度。實(shí)施例提供了以下實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明的各個方面。它們不旨在限制本發(fā)明，本發(fā)明通過所附權(quán)利要求限定。實(shí)施例1材料和方法描述研究群組和樣品在2000年09月至2011年02年之間在Charite醫(yī)科大學(xué)(柏林，德國)從手術(shù)前的初級卵巢癌患者以及從沒有卵巢癌的患者收集血清樣品。倫理委員會批準(zhǔn)了該樣品用于研究的用途。在手術(shù)之前或在隨后的治療、樣品收集以及臨床和手術(shù)數(shù)據(jù)的文檔編制期間，得到患者告知同意書。將驗(yàn)證的文檔編制系統(tǒng)用于記錄手術(shù)數(shù)據(jù)。沒有卵巢癌的研究群體由具有引起與卵巢癌類似的癥狀的良性腫瘤、子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤(uterus)、子宮附件炎和其他病癥的患者組來組成。使用包含凝結(jié)激活劑(Vacutainer,BD,Medical-PharmaceuticalSystem,FranklinLakes,NJ)的血清管在TumorBankOvarianCancer項(xiàng)目(http://toc-network.de)內(nèi)收集血液。在室溫下使收集的血液凝結(jié)30分鐘至2小時，以及在1200g下通過離心分離血清15分鐘。等分血清并將其存儲在-80℃。在手術(shù)時收集腫瘤組織樣品并在切除15分鐘內(nèi)立即將其冷凍在液氮中，然后存儲在-80℃。所有組織樣品都經(jīng)歷組織病理學(xué)說評估以驗(yàn)證組織亞類型和高組織質(zhì)量(tissuequality)，并且僅將呈現(xiàn)適當(dāng)?shù)哪[瘤面積的試樣包括在代謝和脂質(zhì)分析中。GCxGC-TOF方法通過用Retsch均化器(3分鐘，20Hz)均勻化3-4mg組織來制備腫瘤樣品。將樣品均勻化到0.9％NaCl中，并調(diào)節(jié)體積以得到0.05mg/μl的濃度。將400μl甲醇和5μl標(biāo)準(zhǔn)混合物(纈氨酸-d8，37.6mg/l)、十七烷酸(186.5mg/l)、琥珀酸-d4(62.9mg/l)添加到70μl勻漿液中。對于血清樣品，將400μl甲醇和10μl標(biāo)準(zhǔn)混合物(纈氨酸-d8，37.6mg/l)、十七烷酸(186.5mg/l)、琥珀酸-d4(62.9mg/l)、谷氨酸-d5(103.5mg/l)添加到30μl樣品中。渦旋樣品2分鐘。在室溫下30分鐘之后，在10000rpm下離心樣品5分鐘。將200μl的上清液移至GC小瓶中并在氮?dú)庀抡舭l(fā)至干燥。用25μl(MOX)(45℃，60分鐘)和25μl(MSTFA)(45℃，60分鐘)和50μl己烷與保留化合物(retentionindexcompound)衍生化樣品，并將注射標(biāo)準(zhǔn)物(4,4'-二溴八氟聯(lián)苯)添加到樣品中。對于分析，使用配備有低溫調(diào)節(jié)器的LecoPegasus4DGCxGC-TOFMS儀器(LecoCorp.,St.Joseph,Ml)。該儀器的GC部分是Agilent6890氣相色譜儀(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)，其配備有分離/不分離(split/splitless)注射器。第一尺寸色譜柱是具有0.18mm的內(nèi)徑和0.18μm的固定相膜厚度的10-mRxi-5MS毛細(xì)管柱，以及第二尺寸色譜柱是具有100μm的內(nèi)徑和0.1μm的膜厚度的1.5mBPX-50毛細(xì)管柱。將甲基去活的保留缺口(methyldeactivatedretentiongap)(1.5mx0.53mmi.d.)用于第一柱的前面。將高純度氦用作恒定壓力模式(40psig)下的載氣。在第二尺寸中使用4-s分離時間(separationtime)。用100光譜/秒在45-700amu下測量MS光譜。在240℃下將不分離注射(1.0μl)用于注射。溫度程序如下：第一尺寸柱式加熱爐線性變化開始于50℃，保持2分鐘，之后將溫度以7℃/min的速率程序升溫至240℃，以及進(jìn)一步以25℃/min至300℃，然后保持在該溫度下3分鐘。將第二尺寸柱溫保持比對應(yīng)的第一尺寸柱高15℃。程序升溫速率和保持時間對于兩個柱相同。將ChromaTOF供應(yīng)商軟件(LECO)用于內(nèi)部樣品數(shù)據(jù)處理，以及自行研制的Guineu(Castilloetal.,2011,AnalChem)用于樣品的排列、歸一化和峰匹配。首先基于在運(yùn)行的所有樣品的總分布中檢測到的峰數(shù)過濾峰。通過校正內(nèi)標(biāo)C17:0進(jìn)行未校正的代謝物的歸一化。手動檢查每個血清樣品中的27種代謝物以及每個腫瘤組織樣品中的29種代謝物用于正確的積分和識別。針對NIST05質(zhì)譜資料庫搜索來自GC*GC-TOFMS分析的其他質(zhì)譜。LC-MS方法通過用Retsch均化器(3分鐘，20Hz)均勻化2-3mg組織來制備腫瘤樣品。將樣品均勻化到0.9％NaCl中，并調(diào)節(jié)體積以得到約0.05mg/μl的濃度。在添加內(nèi)標(biāo)與0.5-1μg/樣品的濃度水平的Cer(d18:1/17:0)、PC(17:0/0:0)、PC(17:0/17:0)、PE(17:0/17:0)和TG(17:0/17:0/17:0)的混合物之后，用氯仿：甲醇(2:1；250μl)提取樣品。渦旋樣品2分鐘，在RT下培育30分鐘并在7800g下離心3分鐘。在UPLC-MS分析之前，將0.5μg/樣品濃度水平的包含PC(16:1-D3/0:0)、PC(16:1/16:1-D6)和TG(16:0/16:0/16:0-13C3)的標(biāo)記的脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合物添加到分離的脂質(zhì)提取物(100μl)中。將10μl血清樣品用于分析，以及通過添加內(nèi)標(biāo)與0.2μg/樣品的濃度水平的DG(17:0/17:0/0:0)、CE(19:0)、Cer(d18:1/17:0)、MG(17:0/0:0/0:0)、PA(17:0/17:0)、PC(17:0/0:0)、PC(17:0/17:0)、PE(17:0/17:0)、PG(17:0/17:0)和TG(17:0/17:0/17:0)的混合物，用氯仿：甲醇(2:1，100μl)提取來制備樣品。渦旋樣品2分鐘，在RT下培育30分鐘并在7800g下離心3分鐘。在UPLC-MS分析之前，將0.5μg/樣品濃度水平的包含PC(16:1-D3/0:0)、PC(16:1/16:1-D6)和TG(16:0/16:0/16:0-13C3)的標(biāo)記的脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合物添加到分離的脂質(zhì)提取物(60μl)中。來自腫瘤和血清樣品的脂質(zhì)提取物在與AcquityUltraPerformanceLCTM(UPLCTM)組合的WatersQ-TofPremier質(zhì)譜儀上分析。柱是AcquityUPLCTMBEHC182.1×100mm，顆粒1.7μm。溶劑體系包含：A)水(1％1MNH4Ac，0.1％HCOOH)和B)乙腈/異丙醇(1:1，1％1MNH4Ac，0.1％HCOOH)。梯度起始于65％A/35％B，在2分鐘內(nèi)達(dá)到80％，在7分鐘內(nèi)達(dá)到100％B，并保持接下來的7分鐘。在以下運(yùn)行之前，存在5分鐘的再平衡步驟。流動速率是0.400ml/min以及注射量是1.0μl。將利血平(reserpine)用作鎖定噴射的參考化合物。使用ESI以積極模式進(jìn)行脂質(zhì)剖析，并在m/z300-1200的質(zhì)量范圍下用0.2秒的掃描持續(xù)時間采集數(shù)據(jù)。使用MZmine2軟件(http://mzmine.sourceforge.net/)處理數(shù)據(jù)，以及該處理包括峰的排列、峰積分、歸一化和峰識別。脂質(zhì)識別是基于內(nèi)部的頻譜資料庫。使用內(nèi)標(biāo)(其代表存在于樣品中的脂質(zhì)的類別)歸一化數(shù)據(jù)：通過將每種識別的脂質(zhì)的強(qiáng)度除以其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)的強(qiáng)度，以及將其與標(biāo)準(zhǔn)的濃度相乘歸一化每種識別的脂質(zhì)的強(qiáng)度。用PC(17:0/0:0)歸一化除膽甾醇酯之外的所有單?；|(zhì)，如單?；视土字?，用PC(17:0/17:0)歸一化除氨乙醇磷脂之外的所有二?；|(zhì)，用Cer(d18:1/17:0)歸一化所有神經(jīng)酰胺，用PE(17:0/17:0)歸一化所有二酰基氨乙醇磷脂，用TG(17:0/17:0/17:0)歸一化三酰甘油酯，以及用血清中的ChoE(19:0)和組織樣品中的TG(17:0/17:0/17:0)歸一化膽甾醇酯。用以下歸一化其他(未識別的)分子物質(zhì)：PC(17:0/0:0)，停留時間<300s；PC(17:0/17:0)，停留時間在300s和410s之間；以及TG(17:0/17:0/17:0)，停留時間更長。用樣品的重量歸一化腫瘤樣品。統(tǒng)計學(xué)分析針對沒有惡性病(對照組)的100個受試者以及158個卵巢癌患者血清樣品得到來自GCxGC-TOF方法的數(shù)據(jù)。另外，針對具有匹配的血清樣品的112個卵巢癌患者得到來自腫瘤組織分析的數(shù)據(jù)。針對沒有惡性病的100個受試者以及158個卵巢癌患者血清樣品得到來自LC-MS方法的結(jié)果。另外，針對具有匹配的血清樣品的134個卵巢癌患者得到來自腫瘤組織分析的數(shù)據(jù)?？色@得145個卵巢癌患者和73個沒有惡性病的受試者的CA-125數(shù)據(jù)。使用3.1.0版本的R進(jìn)行所有的統(tǒng)計學(xué)分析。為了比較兩組，在log2轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)之后，計算未配對的t測試和倍數(shù)變化。在數(shù)據(jù)中存在零值的情況下，用對應(yīng)于所有樣品中的對應(yīng)的分子的最小值的一半的值輸入數(shù)據(jù)。通過Kaplan-Meier圖與中位分隔(mediansplit)和時序測試(logranktest)探究小分子與存活率的關(guān)聯(lián)。另外，在將腫瘤減少信息合并和沒有合并到模型的情況下，針對每個小分子進(jìn)行Cox比例風(fēng)險回歸(Cox比例危險回歸，Coxproportionalhazardregression)測試。用于來自具有小分子的卵巢癌診斷的預(yù)測模型是二進(jìn)制邏輯回歸模型。為了交叉驗(yàn)證，將數(shù)據(jù)集1000次隨機(jī)分到訓(xùn)練組(包含2/3樣品)中，并在驗(yàn)證組(包含1/3樣品)中測試構(gòu)造的模型。對于I-II期腫瘤的分析，沒有進(jìn)行交叉驗(yàn)證。使用RANSAC排列方法匹配來自LC-MS和GCxGC-TOF-MS數(shù)據(jù)的腫瘤組織和血清樣品的小分子生物標(biāo)記物，該RANSAC排列方法已經(jīng)在MZmine2(Pluskaletal.,2010,BMCBioinformatics)以及在自行研發(fā)(in-housedevelop)的Guineu軟件(Castilloetal.,2011,AnalChem)中進(jìn)行。實(shí)施例2結(jié)果關(guān)于選定的生物標(biāo)記物分子的信息GCxGC-TOF-MS數(shù)據(jù)包含497個代謝物峰以及LC-MS數(shù)據(jù)包含635個脂質(zhì)峰。在本專利申請中，對于大部分關(guān)心的選定的代謝物，示出了實(shí)例結(jié)果并將其列于表1中。基于統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果、化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物重要性選擇分子。有時，GCxGC-TOF-MS數(shù)據(jù)可以包含具有相同識別標(biāo)志的若干峰。這可能是因?yàn)榉治鲈蚧蛘?，例如立體異構(gòu)結(jié)構(gòu)。在GCxGC-TOF-MS分析包含參考標(biāo)準(zhǔn)化合物的情況下，始終將對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰選定為最后的結(jié)果。2,3-二羥基丁酸和2,3,4-三羥基丁酸參考化合物沒有包含在分析中。對于這些分子，將示出了惡性對良性比較以及存活率分析兩者中的統(tǒng)計上顯著的結(jié)果的峰選定為實(shí)例。表1.示出了實(shí)例結(jié)果的分子的質(zhì)譜細(xì)節(jié)。對于由LC-MS方法獲得的分子，示出了停留時間(s)和m/z值。對于由GCxGC-TOF-MS方法獲得的分子，示出了保留指數(shù)(RTI)和質(zhì)譜。小分子生物標(biāo)記物的濃度在患卵巢癌的患者中以及尤其在腫瘤減少不完全的患者中變化。表2總結(jié)了對于選定的小分子生物標(biāo)記物和作為比較的在卵巢癌診斷中廣泛使用的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物CA-125的結(jié)果。由表2和圖1顯然的是，當(dāng)與具有良性腫瘤和其他非惡性病癥的對照受試者相比時，所有小分子生物標(biāo)記物在它們在卵巢癌患者血清樣品中的水平上示出統(tǒng)計學(xué)高度顯著的差異。除了鞘磷脂示出相反的趨勢，所有選定的小分子生物標(biāo)記物在患惡性卵巢腫瘤的患者中升高。尤其是3,4-二羥基丁酸和3-羥基丁酸分別示出了1e-27和1e-21數(shù)量級的低的p值，表示高度顯著的結(jié)果。同樣，三酰甘油酯(TAG)示出了它們在卵巢癌患者的血清中的水平的變化。這些脂質(zhì)呈現(xiàn)了這樣的趨勢，其中當(dāng)與對照組相比時，在卵巢癌患者中，在它們的脂肪?；鶄?cè)鏈中具有53或更少碳的那些TAG降低以及具有54或更多碳的那些升高。為了探究小分子生物標(biāo)記物是否與患者中的腫瘤塊的量有關(guān)，將卵巢癌患者分成兩組，即在手術(shù)期間腫瘤減少完全或不完全的那些。該信息沒有直接提供腫瘤的大小，但是在手術(shù)期間腫瘤減少的完全性與存在于身體中的腫瘤塊相關(guān)是合乎邏輯的。如表2所示，典型的卵巢癌標(biāo)記物CA-125沒有示出腫瘤減少完全或不完全的患者之間的統(tǒng)計學(xué)上的顯著的差異。相反，尤其是屬于二羥基丁酸和三羥基丁酸以及鞘磷脂類的小分子示出了統(tǒng)計學(xué)上顯著的結(jié)果。值得注意的，對于二羥基丁酸和三羥基丁酸觀察到漸進(jìn)的變化使得在患良性病癥的患者中觀察到最低的水平，以及在惡性腫瘤和腫瘤減少不完全的患者中觀察到最高的水平(圖2)。對于鞘磷脂類的化合物觀察到正相反的現(xiàn)象?？傊行》肿由飿?biāo)記物以及CA-125蛋白質(zhì)標(biāo)記物在卵巢癌患者的血清中示出改變的水平，但是僅選擇的小分子生物標(biāo)記物與腫瘤減少有關(guān)，并因此與患者的腫瘤塊直接有關(guān)。因此，小分子生物標(biāo)記物比CA-125更好地反映腫瘤的大小。表2.惡性腫瘤、腫瘤減少和患者的總存活率的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。log2fc＝log2倍數(shù)變化，TR＝腫瘤減少。以粗體突出顯示了P值<0.05。用于惡性腫瘤的預(yù)測模型構(gòu)造邏輯回歸模型以探究小分子生物標(biāo)記物的濃度是否可以用于預(yù)測哪位患者正在遭受惡性腫瘤。為此，在每種情況下，將數(shù)據(jù)隨機(jī)分配1000次到訓(xùn)練組(2/3樣品)中并在驗(yàn)證組(剩余的1/3樣品)中測試訓(xùn)練組中構(gòu)成的模型?；谒?000個模型繪出ROC曲線，并在圖3中示出了對于四種不同情況的實(shí)例。表3示出了小分子生物標(biāo)記物和CA-125的不同組合的結(jié)果。如表3所示，選擇了1000次的隨機(jī)的3種脂質(zhì)或代謝物示出相當(dāng)?shù)偷腁UC值(意味著小于0.70)和大的置信區(qū)間，表示僅特定的小分子生物標(biāo)記物能夠預(yù)測患者患有惡性卵巢腫瘤。三種鞘磷脂示出了平均AUC值0.78，以及3,4-二羥基丁酸連同3-羥基丁酸示出了高平均AUC值0.91。CA-125還示出了平均AUC值0.95，但是當(dāng)將鞘磷脂或丁酸中的任一種連同CA-125合并至模型時，預(yù)測更加準(zhǔn)確。尤其是將3,4-二羥基丁酸和3-羥基丁酸合并到模型中使AUC值升高至0.98，即接近于將組完全分開。表3.具有小分子和CA-125蛋白質(zhì)標(biāo)記物的不同組合的實(shí)施例邏輯回歸模型的平均AUC值和95％置信區(qū)間。CA-125蛋白質(zhì)標(biāo)記物在診斷晚期卵巢癌上是良好的，但是早期卵巢癌的檢測更具挑戰(zhàn)。因此，將需要用于早期卵巢癌的新的生物標(biāo)記物。本研究的群體包括僅少數(shù)患者患早期(I或II)卵巢癌(n＝7)。不過，在從對照組分類這些病例中，構(gòu)造了邏輯回歸模型。變量包括在這些實(shí)例模型中以及它們的AUC值呈現(xiàn)在表4中并在圖4中直觀化。在該研究群體中，CA-125出乎意料地示出了高AUC值0.91。出乎意料地，例如僅3-羥基丁酸示出了較好的AUC值0.93。此外，當(dāng)將一種或多種小分子生物標(biāo)記物連同CA-125合并到模型中時，AUC值升高。最終，與CA-125合并的3-羥基丁酸示出AUC值0.994，以及當(dāng)另外地將3,4-二羥基丁酸添加到模型中時，AUC值達(dá)到1.0。表4.小分子和CA-125蛋白質(zhì)標(biāo)記物的不同組合的邏輯回歸模型的AUC值。CA-1253，4-DHBA3-HBASM(d18:1/24:0)SM(d18:1/22:1)SM(d18:1/23:0)AUCXXXX1.00XXX1.00XX0.99XXXX0.95XX0.95XXX0.94XX0.93X0.93X0.91XXX0.64總之，小分子生物標(biāo)記物在，尤其早期卵巢癌的診斷中勝過CA-125，還在整個研究群體中示出了良好的預(yù)測值。尤其組合一種或若干種生物標(biāo)記物連同CA-125，與僅CA-125相比，可以得到具有對于卵巢癌診斷的更高的靈敏度和特異性的模型。小分子水平與患者的總存活率有關(guān)接下來，探究小分子生物標(biāo)記物是否與患惡性腫瘤的患者的總存活率有關(guān)。為了探究這個，針對每種探究的小分子和CA-125蛋白質(zhì)標(biāo)記物，將患者分為兩組，具有高于或低于所有樣品的中值的分子濃度的那些。然后，構(gòu)造Kaplan-Meier圖(圖5)，并將時序測試用于計算組之間的總存活率的差異的p值。在該研究群體中，CA-125標(biāo)記物沒有示出關(guān)于患者的存活率的統(tǒng)計上顯著的結(jié)果(表2)。然而，所有小分子(除SM(d18:1/14:0)以及羥基丁酸和酮體之外)示出了統(tǒng)計上顯著的結(jié)果。由圖5和表2明顯的是，二羥基丁酸和三羥基丁酸、羥基酸和己二酸的濃度升高與更差的總存活率有關(guān)。相反，卵巢癌患者的血清中的鞘磷脂的濃度越低預(yù)示患者的總存活率越差。直觀的是在手術(shù)期間的腫瘤減少的成功與患者的總存活率有關(guān)。隨著發(fā)現(xiàn)多種小分子與腫瘤減少有關(guān)(從而間接與腫瘤負(fù)擔(dān)有關(guān))，探究了小分子生物標(biāo)記物是否可以由腫瘤減少的成功性獨(dú)立預(yù)測存活率。為此，在具有或不具有合并至模型的腫瘤減少信息的情況下，針對每種小分子和CA-125構(gòu)造cox比例風(fēng)險回歸模型。值得注意的，在Kaplan-Meier分析中示出了統(tǒng)計學(xué)上顯著的結(jié)果的幾乎所有的小分子生物標(biāo)記物還在cox回歸模型中示出了統(tǒng)計上顯著的結(jié)果，即使將腫瘤減少合并到模型中。這意味著小分子是患者的總存活率的強(qiáng)預(yù)報因子，并且可以獨(dú)立于腫瘤減少信息預(yù)測存活率。總之，小分子生物標(biāo)記物與患者的總存活率有關(guān)，并與CA-125相反，示出了預(yù)后值。血清中的小分子生物標(biāo)記物的濃度與腫瘤濃度相關(guān)由之前的結(jié)果明顯的是，卵巢癌的存在引起患者的血清中的小生物標(biāo)記物的濃度的變化。為了探究在相同患者的腫瘤中是否也可以觀察到相同現(xiàn)象，將相同的方法論應(yīng)用于腫瘤組織樣品，以及用Pearson和Spearman相互關(guān)系分析來評價血清和腫瘤組織之間的代謝物的相互關(guān)系。表5示出了那些小分子生物標(biāo)記物的結(jié)果，其在Pearson或Spearman相關(guān)分析中示出了統(tǒng)計上顯著的結(jié)果(p<0.05)和R2值>0.2。如表5所示，之前的章節(jié)中提到的多種小分子生物標(biāo)記物示出了顯著的相關(guān)性。對于羥基丁酸3,4-二羥基丁酸和鞘磷脂觀察到最大的相互關(guān)系，以及結(jié)果示于圖6中。表5.當(dāng)測量血清和組織樣品中的濃度之間的相互關(guān)系時，小分子生物標(biāo)記物的Pearson和Spearmanp值和R2值。結(jié)果的生物重要性在之前章節(jié)中呈現(xiàn)的結(jié)果中觀察到的值得注意的現(xiàn)象是用于卵巢癌診斷和預(yù)后的最有希望的小生物標(biāo)記物僅屬于幾個化合物類別。脂肪酸氧化產(chǎn)生酮體、3-羥基丁酸酯、乙酰乙酸和丙酮。這三種中，酮體、3-羥基丁酸酯和乙酰乙酸包含在數(shù)據(jù)組中，以及這些中的兩者在卵巢癌患者的血清中增加。另外，示出了類似的結(jié)構(gòu)的化合物、即2-羥基丁酸、3,4-二羥基丁酸、2,3-二羥基丁酸、2,3,4-三羥基丁酸和3-羥基異戊酸(也稱為β-羥基β-甲基丁酸)都在卵巢癌患者的血清中升高，并且這些中的大部分還示出了強(qiáng)預(yù)后值。此外，3-羥基丁酸和2-羥基丁酸在它們在血清和腫瘤的水平上示出了強(qiáng)相關(guān)性。最后，通過Ω氧化可以在人體生理學(xué)中產(chǎn)生己二酸(其還示出了診斷和預(yù)后值)，Ω氧化是另一種脂肪酸氧化路線。因此，合理的是脂肪酸氧化和酮體的生產(chǎn)增加是卵巢癌代謝的關(guān)鍵特征，這可以解釋目前的結(jié)果?？赡艿难逯|(zhì)的吸收增加可以改變血清及其脂蛋白組成，并因此也可能通過卵巢癌細(xì)胞的改變的脂質(zhì)代謝來解釋鞘磷脂的水平降低以及它們與患者的預(yù)后的關(guān)聯(lián)。在本研究中唯一沒有示出與羥基丁酸或脂質(zhì)代謝的明顯關(guān)聯(lián)的小生物標(biāo)記物是4-羥基苯乳酸，這可能指向腫瘤中的氨基酸分解代謝。重要的是認(rèn)識到β-羥基丁酸和乙酰乙酸兩者在卵巢癌患者中升高，以及如圖7所示，β-羥基丁酸酯可以轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸，乙酰乙酸可以轉(zhuǎn)化為丙酮。丙酮是易揮發(fā)的分子，可以在呼吸中檢測到它。因此，基于目前的發(fā)現(xiàn)，可以將卵巢癌患者的血清或呼吸中的丙酮用作卵巢癌的診斷生物標(biāo)記物是合乎邏輯的。當(dāng)前第1頁1 2 3