母體樣品中存在的許多生物標志物目前被認為與先兆子癇相關(guān)。胎盤生長因子(PlGF)已經(jīng)被證明是預測先兆子癇(EP2368119A1)、特別是早發(fā)型先兆子癇(Pool等2013，Vol.33，No.1，2013期刊發(fā)行日：2013年1月Fetal Diagn Ther 2013；33：16–27)的良好標志物。然而，在導致本公開的研究中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于那些患有慢性高血壓的女性來說，它不是良好標志物。

因此需要對患有慢性高血壓的妊娠個體發(fā)生先兆子癇、特別是早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的風險提供早期評估的方法。

此外，需要基于可以體外進行的生物樣品分析來確定所述風險的方法。

此外，需要基于可以在妊娠的前三月期中進行的生物樣品分析來確定所述風險的方法。

還有，還需要確定先兆子癇、特別是早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的風險的方法，所述方法在單次篩查中具有改善的檢出率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本說明書提供了可用于確定患有慢性高血壓的妊娠個體發(fā)生早期先兆子癇或晚期先兆子癇的風險的方法。本文中描述了生化標志物的有用組合和相關(guān)臨床群體研究。另外，本文中提出了生化標志物的某些組可用于在單次篩查中確定早期先兆子癇或晚期先兆子癇的風險。意外地發(fā)現(xiàn)，PlGF和sP-選擇蛋白(sP-selectin)的組合可用于確定患有慢性高血壓的妊娠個體的早期和晚期先兆子癇的風險。

本文中提供了在妊娠個體中確定早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇風險的方法，所述方法包括測定來自患有慢性高血壓的個體的一個或多個血液樣品中包括PlGF和sP-選擇蛋白在內(nèi)的生化標志物的水平；和利用所測定的生化標志物水平來確定早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的風險。

該方法包括個體的高血壓史；患有慢性高血壓的個體和利用包括PlGF和sP-選擇蛋白在內(nèi)的生化標志物的水平確定先兆子癇的風險。

在下文中，本文中提供的方法將借助于詳細說明和參考實施例1來進一步描述。

附圖說明

圖1a顯示了從后來發(fā)生EO-PE的血壓正常的女性測量的PlGF。

圖1b顯示了在后來發(fā)生EO-PE(并發(fā)EO-PE)的慢性高血壓女性之中的PlGF。

圖2a顯示了并發(fā)EO-PE的PlGF預測。

圖2b顯示了并發(fā)EO-PE的PlGF+sP-選擇蛋白預測。

圖3顯示了在有正常(對照組)和EO-PE情況的血壓正常和慢性高血壓妊娠之中的PlGF MoM。在GA 11-13時取樣。

圖4顯示了在有正常(對照組)和EO-PE情況的血壓正常和慢性高血壓妊娠之中的sP-選擇蛋白MoM。在GA 11-13時取樣。

圖5顯示了在后來發(fā)生“典型”PE的女性之中的PlGF。數(shù)據(jù)顯示，正如與EO-PE一樣，PlGF作為單一標志物在血壓正常的女性中比在慢性高血壓女性中效果更好。

圖6顯示了PlGF和并發(fā)PE。

圖7表1。

發(fā)明的詳細說明

慢性高血壓是指個體血壓長期高于正常的病狀。如果血壓經(jīng)常等于或高于140/90mmHg，通常就說存在高血壓?；加新愿哐獕旱娜焉飩€體在妊娠之前已經(jīng)患有高血壓或妊娠個體一般在20孕周之前被診斷患有高血壓。

并發(fā)先兆子癇是指在20孕周之前患有高血壓的女性中伴或不伴蛋白尿的高血壓(ACOG指南)。它可以通過以下來表征：

-如果在妊娠早期已經(jīng)存在蛋白尿的話，蛋白尿突然加重

-高血壓突然加重

-發(fā)生HELLP綜合征(HELLP綜合征是出現(xiàn)在孕婦中的一組癥狀，所述孕婦具有溶血、肝酶升高和血小板計數(shù)低)。

-患有慢性高血壓的女性發(fā)生頭痛、暗點或上腹痛。

樣品

在妊娠個體中確定早期或晚期先兆子癇風險的方法包括利用來自所述妊娠個體的生物樣品。所述生物樣品可以是含有所選擇的生化標志物的任何體液或組織樣品。優(yōu)選地，所述樣品是血液或血液級分，例如血清。生物樣品的選擇常?？扇Q于在特定的臨床實驗室中可用的用于測試標志物水平的測定形式。例如，一些測定形式缺乏測定全血所需要的靈敏度，致使臨床實驗室選擇測試血液級分例如血清，或使用干血。此外，已經(jīng)保存、例如通過冷凍或干燥(例如以血卡片形式)保存的樣品適合用于本文中描述的方法。實施例1描述了使用血清形式的母體血液?？捎糜诒疚闹忻枋龅姆椒ǖ氖纠陨飿悠钒ㄑ骸⒓兓难褐破?例如血清、血漿等)、尿、羊水、絨毛膜絨毛活檢、胎盤活檢和宮頸陰道液。優(yōu)選的樣品包含血液樣品。這意味著所述方法在體外、在孕婦(在本文中也稱為母體、個體、患者或受試者)的身體外部進行。

用于測定樣品中多肽和其他生物標志物水平的典型的測定形式包括使用對照多肽，尤其在定量這樣的多肽的水平時?？缮藤彽牡鞍踪|(zhì)和其他生物標志物可用作測量生化標志物水平的測定法中的標準品?；蛘?，用于表達蛋白質(zhì)、例如在原核和真核系統(tǒng)中表達蛋白質(zhì)的方法和用于合成多肽的方法是公知的。全長蛋白及其片段可用作定量測定從孕婦獲得的樣品中生物標志物水平的標準品。

“對照樣品”在此是指從處于妊娠的相同三月期或孕齡的受試者獲得的樣品，并且其中所述妊娠被證實具有關(guān)于先兆子癇的特定結(jié)果。通常，“對照樣品”已經(jīng)被證實沒有發(fā)生先兆子癇(參見本文中的實施例)，然而也可以使用被證實已經(jīng)發(fā)生先兆子癇的對照樣品。該術(shù)語在此被定義為包括一個或多個樣品，使得對照樣品可以是從群體獲得的一組樣品。所選的妊娠對照可以通過生物物理參數(shù)例如孕產(chǎn)婦年齡、體質(zhì)指數(shù)、種族和孕齡、抽煙狀況而與先兆子癇病例匹配。

生化標志物的水平

“在來自所述個體的至少一個血液樣品中測定包括PlGF和sP-選擇蛋白在內(nèi)的生化標志物的水平”是指通過具體評估從所述孕婦獲得的樣品和對照樣品中所選擇的生化標志物水平的方法來測定所提到的標志物。樣品中存在的生化標志物的水平可利用適合于測量生物樣品中的蛋白質(zhì)的任何測定形式來測定。出于這種目的的常用測定形式是免疫測定法，包括例如酶免疫測定法(EIA)例如酶放大免疫測定技術(shù)(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、IgM抗體捕捉ELISA(MAC ELISA)、和微粒子酶免疫測定法(MEIA)；毛細管電泳免疫測定法(CEIA)；放射免疫測定法(RIA)；免疫放射測定法(IRMA)；熒光偏振免疫測定法(FPIA)；解離增強的鑭系熒光免疫測定法(DELFIA)和化學發(fā)光測定法(CL)。

相對于對照樣品，所述樣品中生化標志物的水平的差異指示了該女性中先兆子癇的風險。取決于所測試的具體生物標志物，所述差異可以是所述生化標志物水平的增加或降低。

在某些情況下，可以不只一次地從孕婦收集生物樣品，例如，當由于先驗風險、出現(xiàn)癥狀和/或其他因素，她的高血壓和/或胎盤狀況要求監(jiān)測先兆子癇的發(fā)生時。本文中描述的確定先兆子癇風險的方法也可以用于監(jiān)測正經(jīng)歷高血壓和/或胎盤狀況的療法或治療的妊娠個體。如果需要，生化和/或生物物理標志物的測試可以在家庭環(huán)境中進行，例如通過利用家用的試紙條生化測試形式和自動血壓器而在家庭環(huán)境中進行。

“發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的風險增加”是指受試者(孕婦)分別發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的可能性的水平高于沒有發(fā)生所述病癥的對照組孕婦中的水平。

生化標志物

在確定妊娠個體的先兆子癇風險的情況下最令人感興趣的生化標志物是PlGF和sP-選擇蛋白。

以前發(fā)表的研究已經(jīng)顯示，PlGF水平降低指示先兆子癇的發(fā)生。

縮寫“PlGF”是指胎盤生長因子。PlGF最初是在1991年從人足月胎盤cDNA文庫中克隆得到的。PlGF也已在其他組織例如心臟、肺、肌肉和脂肪組織中檢測到。PlGF屬于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族蛋白質(zhì)。它與VEGF-A具有約50％的中等序列相似性。可變剪接產(chǎn)生大小不同的四個同種型，其中PlGF-1和PlGF-2被認為是主要同種型。PlGF-1含有131個氨基酸(MW：單體14.7kDa，二聚體29.4kDa)。PlGF-2含有PlGF-1和21個氨基酸的肝素結(jié)合位點插入片段(MW：單體17.3kDa，二聚體34.6kDa)。全長PlGF-2蛋白的長度因此是152個氨基酸。PlGF-3含有PlGF-1和C-端附近的72個氨基酸插入片段(MW＝單體22.8kDa，二聚體45.6kDa)。因此，全長PlGF-3蛋白的長度是203個氨基酸。PlGF-4含有PlGF-3和21個氨基酸的肝素結(jié)合位點插入片段(MW＝單體26.2kDa，二聚體52.4kDa)。全長PlGF-4的長度因此是224個氨基酸。本文中在沒有同種型的任何限定時對PlGF的指稱，是指PlGF-1。

SP-選擇蛋白(也稱為P-選擇蛋白)是血小板中發(fā)現(xiàn)的粘附分子。在炎性和血栓形成條件中，所述分子在細胞膜上表達并啟動內(nèi)皮細胞、白細胞和血小板之間的相互作用。血小板活化出現(xiàn)在正常妊娠中，但這在PE中放大，以血小板凝聚、血管收縮和內(nèi)皮損傷為特征?？刂蒲“寤罨囊蜃邮俏粗模毎蜃永缒[瘤壞死因子α(TNF-α)被牽涉在內(nèi)。血小板活化標志物——sP-選擇蛋白的血清濃度在已確定的PE期間增加，并且還有證據(jù)表明這種升高可從妊娠的前三月期開始明顯(Akolekar R.等，妊娠高血壓病癥中11至13孕周時的母體血漿P-選擇蛋白(Maternal plasma P-selectin at 11 to 13 weeks of gestation in hypertensive disorders of pregnancy).Hypertens Pregnancy 2011；30(3)：311-21.

如本文中所述，現(xiàn)在已經(jīng)認識到，在患有慢性高血壓的妊娠個體的母體樣品中測量PlGF和sP-選擇蛋白的組合可用于更好地確定孕婦發(fā)生早期或晚期先兆子癇的風險。篩查性能因此得到改善，如與只使用PlGF檢測的實驗室測試相比檢出率增加和假陽性率降低所反映的。

標志物PlGF和sP-選擇蛋白的選擇性檢測可以與用于評估先兆子癇發(fā)生風險的任何其他合適的生化標志物或其他指標相組合。這樣的生化標志物是例如選自激活素A、Ue-3、PAPP-A、PAI-1、PAI-2、PlGF-2、PlGF-3、PlGF-4、PP13、VEGF165b和ADAM-12的那些標志物。

生物物理標志物

本文中描述的方法包括測定個體的血壓?？梢允褂眠x自妊娠個體的收縮壓、舒張壓和平均動脈血壓的一種或多種度量。

生化標志物PlGF和sP-選擇蛋白的選擇性檢測也可以與用于評估先兆子癇發(fā)生風險的任何合適的生物物理標志物相組合。這樣的生化標志物是例如血壓、平均動脈壓(MAP)和子宮動脈搏動指數(shù)(PI)。當應(yīng)用這種實施方式時，確定先兆子癇發(fā)生風險利用生化標志物和至少一種生物物理標志物這二者的水平來進行。

平均動脈壓(MAP)是指在心動周期中的平均血壓，并使用確定的程序，通過心輸出量(CO)、全身血管阻力(SVR)和中心靜脈壓(CVP)來測定。醫(yī)護人員可以使用任何方法來測量妊娠個體的血壓，包括例如觸診法、聽診法和示波法。也可以使用自動血壓測量設(shè)備。

在實施方式中，本文中描述的方法可包括測定子宮動脈搏動指數(shù)(PI)?！白訉m動脈搏動指數(shù)”是指動脈血流速度波形指數(shù)，其被設(shè)計成定量所述波形的搏動或振動。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PI在有舒張期血流逆轉(zhuǎn)、即雙向流的臨床病例中特別有用?？梢岳萌魏我阎姆椒y量妊娠個體的PI。

孕產(chǎn)婦史(maternal history)

在本文中使用時，“孕產(chǎn)婦史因素”是指預計對所測量的生化和生物物理標志物水平有影響的孕產(chǎn)婦特征集。在不良妊娠結(jié)果篩查領(lǐng)域中，孕產(chǎn)婦史公認至少包括孕產(chǎn)婦年齡、孕周、種族來源、妊娠期間吸煙、受孕方法、病史、用藥、胎次(parity)、產(chǎn)科史和BMI。也可以包括妊娠個體的高血壓史。為了改善風險計算的可靠性，可以在算法中包括這些因素。包含孕產(chǎn)婦史改善了妊娠期間篩查的檢出率。為了確定在算法中可用的因素，從其中生化標志物和不良妊娠結(jié)果的關(guān)系被確定的群體收集孕產(chǎn)婦史。收集通常是基于由個體自身完成的問卷，所述問卷優(yōu)選由專業(yè)醫(yī)護人員與患者一起復查。當評估個人風險時，從她收集相同的特征并在進行風險確定時納入考慮。待研究的特征是母親中的高血壓史、孕產(chǎn)婦年齡、種族來源、妊娠期間吸煙、受孕方法、病史、用藥、胎次、產(chǎn)科史和PE家族史。收集或測量的孕產(chǎn)婦體重和身高可以轉(zhuǎn)變?yōu)轶w質(zhì)指數(shù)(BMI)，以Kg/m²計。

統(tǒng)計分析

下文的實施例包括關(guān)于使用生物標志物確定孕產(chǎn)婦健康狀況的風險的臨床研究的統(tǒng)計分析說明。妊娠個體發(fā)生先兆子癇的風險可基于在患者群體研究中收集的臨床數(shù)據(jù)，利用統(tǒng)計分析從生化標志物水平來確定。存在多種統(tǒng)計方法用于組合表征所述妊娠個體的參數(shù)，例如生化標志物的水平，以獲得風險評估。似然法(Palomaki和Haddow，Am.J.Obstet.Gynecol.156，460-3(1987))、線性判別函數(shù)法(Norgarrd-Pedersen等Clin.Genet.37，35-43(1990))和多因素Logistic回歸分析通常用于這種目的。因而，本文中描述的風險確定方法可以基于使用公知的統(tǒng)計方法，其中使用截止值或MoM確定風險。要理解，可以采取等效的公知統(tǒng)計方法來評估醫(yī)學狀況的風險。

似然法的基本原理是參數(shù)(例如生化標志物的水平)的群體分布在“未受影響”和“受影響”組中是已知的。因此，對任何給定的參數(shù)(例如標志物水平和血壓讀數(shù))而言，可以計算“未受影響”和“受影響”組的成員的似然。對基于群體平均值和標準偏差的參數(shù)而言，所述似然按高斯高度(Gaussian height)計算?！八迫槐取笔抢谩拔词苡绊憽焙汀笆苡绊憽钡娜后w參數(shù)計算的高度的比率，并且是相對于先驗風險，患病風險增加的表示。

例如，利用由臨床群體研究導出的公式(Cuckle等1987)，可以計算女性的先驗概率(其是與先驗風險相關(guān)的統(tǒng)計學表示，如本文中下面所描述的)以得到孕產(chǎn)婦的健康狀況。這些先驗概率可利用所述似然比進行修正以導出后驗概率，后驗概率可用于先兆子癇或染色體異常風險評估。利用似然法預測胎兒具有染色體異常的風險的詳細說明在例如以下文獻中闡述：“唐氏綜合征篩查(Screening for Down’s Syndrome)”，J.G.Grudzinskas，T.Chard，M.Chapman和H.Cuckle編著；Cambridge University Press出版，1994)。利用本文中描述的方法，用觀察到的似然比分布來確定風險也是可能的(參見，例如，Spencer等Ann.Clin.Biochem.，29，506-18(1992))。

作為確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風險的方法的實例，可從已知患有先兆子癇的女性群體收集樣品。分析這些樣品以測定各生化標志物的水平。所測定的各生化標志物的水平然后通常被轉(zhuǎn)變?yōu)閷哂邢嗤脑旋g、孕產(chǎn)婦體重、種族、抽煙狀況、受孕方法和胎次的妊娠來說特異性的預期正常中位數(shù)的倍數(shù)(MoM)。然后使用公知的統(tǒng)計回歸方法進行風險計算(參見，例如Draper等《應(yīng)用回歸分析》(Applied Regression Analysis)(第三版)Wiley：New York，NY，1998和Cuckle HS等，利用女性的年齡和血清甲胎蛋白水平評估她具有與唐氏綜合征相關(guān)的妊娠的風險(Estimating a woman′s risk of having a pregnancy associated with Down′s syndrome using her age and serum alphafetoprotein level).Br.J Obstet Gynecol 1987；94：387-402；和上面的其他參考文獻)。

先兆子癇和其他高血壓病癥

按本文中的理解，妊娠期間出現(xiàn)的先兆子癇和其他高血壓病癥是以當病癥發(fā)生時可檢測的癥狀為特征的。如果按照嚴重度遞增的順序排列，最不嚴重的病癥是妊娠高血壓。當除了妊娠高血壓之外還檢出蛋白尿時，它被稱為先兆子癇，其被分成晚發(fā)型和早發(fā)型先兆子癇，如下面所定義的。早發(fā)型先兆子癇是這些病癥中最嚴重的。

根據(jù)國際妊娠高血壓研究學會(International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy)指南(Davey等，Am.J.Obstet Gynecol；158；892098，1988)，妊娠高血壓被描述為相隔至少4h兩次記錄到舒張壓90mmHg以上，和相隔至少4h兩次記錄到壓力至少110mm Hg以上的重度高血壓，或一次記錄到舒張壓至少120mm Hg。

在本文中使用時，術(shù)語“先兆子癇”是指部分特征在于妊娠高血壓和蛋白尿的妊娠病癥。對以前血壓正常的女性來說，PE通常定義為妊娠高血壓伴蛋白尿，重度PE通常定義為重度妊娠高血壓伴蛋白尿。對患有慢性高血壓的女性來說，并發(fā)PE通常定義為新發(fā)生的蛋白尿。可用于做出PE診斷的PE的各方面可根據(jù)各種醫(yī)學組織制定的指南來分類。

蛋白尿經(jīng)常被描述為在24h內(nèi)排泄300mg以上，或者如果24h收集不可用，在中段或?qū)Ч苣驑颖镜脑嚰垪l分析上兩次讀數(shù)2+以上。女性一般在20孕周之前被分類為以前血壓正?；蚧加新愿哐獕骸?/p>

先兆子癇在本文中被理解和應(yīng)該被定義為包括和屬于先兆子癇病癥譜內(nèi)，所述先兆子癇病癥譜包括胎盤功能不全、宮內(nèi)生長遲緩、早期流產(chǎn)、早產(chǎn)、宮內(nèi)死亡和子癇。雖然不希望受理論束縛，已經(jīng)提出宮內(nèi)生長遲緩反映了孕婦身體應(yīng)對先兆子癇狀況的適應(yīng)，它讓胎兒存活。另一方面，早期流產(chǎn)和早產(chǎn)可反映孕婦身體應(yīng)對先兆子癇狀況的適應(yīng)，它讓女性存活。在這種情況下，宮內(nèi)死亡是這種適應(yīng)的失敗。因此，本文中描述的確定先兆子癇風險的方法包括、并且也可以用于確定所述先兆子癇譜上的先兆子癇病癥的風險。

先兆子癇可早在20孕周時發(fā)生，并且如果因為先兆子癇在34周之前進行嬰兒分娩的話，一般被認為是“早期先兆子癇”或“早發(fā)型先兆子癇”。在本文中使用時，“晚期先兆子癇”或“晚發(fā)型先兆子癇”被定義為在34周時或之后發(fā)生嬰兒分娩。早期先兆子癇與發(fā)病率增加有關(guān)，并因此被認為是更嚴重的先兆子癇形式。本文中描述的確定先兆子癇風險的方法特別可用于篩查“早期先兆子癇”。對用于檢測先兆子癇的方法而言，可在前三月期內(nèi)、中三月期內(nèi)和后三月期內(nèi)收集樣品。優(yōu)選地，樣品在前或中三月期內(nèi)、優(yōu)選在前三月期內(nèi)收集。雖然從公眾健康的觀點來看，較早檢驗經(jīng)常是有益的策略，但要了解樣品的收集有時可受到實際考慮的影響，例如女性推遲到她的醫(yī)護人員那里就診直到相對較后的孕周。

在利用如本文所述的方法確定妊娠個體發(fā)生先兆子癇的風險增加的情況下，所述個體可從醫(yī)護人員那里接受治療或生活方式的建議。雖然對先兆子癇沒有廣泛使用的治療，但各種研究已經(jīng)顯示了療法例如抗高血壓藥例如硫酸鎂、阿司匹林、地西泮和苯妥英；和膳食增補劑例如維生素D、鈣和硒的益處。

測定生化標志物水平的時機

所述生化標志物的測定可在妊娠的前三月期或中三月期內(nèi)、或在這兩個三月期內(nèi)進行。然而，在妊娠的前12周內(nèi)檢測發(fā)生高血壓病癥的高風險的能力為醫(yī)護人員給孕婦提供預防策略提供了更多的時間。經(jīng)常希望在妊娠早期完成風險評估，以便為預防或延遲先兆子癇在孕婦中發(fā)生的措施提供時間。

本文中描述的確定患有慢性高血壓的孕婦發(fā)生早期或晚期先兆子癇的風險的方法可利用在妊娠的前三月期內(nèi)從女性獲得的樣品來實踐。在具體實施方式中，所述樣品是在妊娠的前三月期內(nèi)，優(yōu)選在孕齡的8-13周期間，更優(yōu)選在11-13周期間獲得的。在一種實施方式中，可在妊娠的一個或多個三月期從所述女性獲得一個或多個樣品。根據(jù)本發(fā)明方法的另一種實施方式，在妊娠的中三月期內(nèi)獲取樣品。通常這是指妊娠的14至26周。

任選地，可在妊娠的前三月期內(nèi)獲得一個樣品，并在妊娠的后面階段、優(yōu)選在妊娠的中三月期內(nèi)獲得另一個樣品。在妊娠的前三月期內(nèi)檢測發(fā)生先兆子癇的高風險的能力為醫(yī)護人員給孕婦提供預防策略提供了更多的時間。經(jīng)常希望在妊娠早期完成風險評估，以便為預防或延遲PE狀況在女性中發(fā)生的措施提供時間。

風險的計算

通常，由測量生化標志物的水平獲得的結(jié)果利用在計算機上運行的算法來處理。在計算機上執(zhí)行的計算機程序使計算機執(zhí)行確定孕婦先兆子癇風險的過程。該過程可包括輸入至少兩種生物標志物的測量結(jié)果，所述測量結(jié)果通過如下獲得：i)測定從孕婦獲得的樣品，其中至少所述生化標志物至少包括PlGF和sP-選擇蛋白；ii)將所述樣品中各生物標志物的水平與對照樣品中相同生物標志物的水平進行比較，其中相對于對照樣品，所述樣品中生化標志物的水平的差異指示先兆子癇，和iii)基于所述比較的結(jié)果確定所述風險的定量評估。

另外，所述方法可包括利用孕產(chǎn)婦高血壓史以便選擇患有慢性高血壓的個體。

所述計算機程序可進一步包括使用至少一種附加的生化標志物。任選地，所述計算機程序可進一步包括使用至少一種選自激活素A、Ue-3、PAPP-A、PAI-1、PAI-2、PlGF-2、PlGF-3、VEGF165b、PlGF-4和ADAM-12的附加的生化標志物。

所述計算機程序可包括輸入通過測定受試者的一種或多種生物物理標志物而獲得的至少一種生物標志物的測量結(jié)果；將所述受試者的一種或多種生物物理標志物與對照受試者中的相同生物物理標志物進行比較，其中相對于所述對照，所述受試者中所述一種或多種生物物理標志物的度量增加或降低指示發(fā)生先兆子癇的風險增加，和基于所比較的一種或多種生化標志物和所比較的一種或多種生物物理標志物的結(jié)果確定發(fā)生先兆子癇風險的定量評估。

在所述計算機程序中，所述過程也可以包括確定先兆子癇風險的定量評估，所述定量評估包含利用多變量分析確定先兆子癇的似然，并且其中所述多變量分析包含利用所述生化標志物的水平和來自于一組對照參考數(shù)據(jù)的分布參數(shù)。優(yōu)選地，所述多變量分析是多變量高斯分析。

評估孕婦的先兆子癇風險的試劑盒

可利用用于評估患有慢性高血壓的孕婦的先兆子癇風險的試劑盒或商業(yè)包來運用本文中描述的方法。

根據(jù)一種實施方式，利用至少兩種試劑盒來運用所述方法，一種試劑盒用于PlGF，另一種試劑盒用于sP-選擇蛋白。各試劑盒含有至少兩種與所述標志物(例如PlGF)特異性結(jié)合的結(jié)合配偶體，并且至少一種所述結(jié)合配偶體是可檢測的。

根據(jù)另一種實施方式，所述試劑盒提供i)至少四種可檢測的結(jié)合配偶體，其中至少兩種可檢測的結(jié)合配偶體與PlGF特異性結(jié)合，并且至少兩種可檢測的結(jié)合配偶體與sP-選擇蛋白特異性結(jié)合。各標志物的至少一種結(jié)合配偶體是可檢測的。

在實施方式中，所述可檢測的結(jié)合配偶體是抗體或其抗原結(jié)合片段。

在另一種具體實施方式中，試劑盒還可提供關(guān)于在所述確定中使用所述可檢測的結(jié)合配偶體的說明書。所述說明書中可提供試劑體積、溫育時間、反應(yīng)條件等。

檢測方法

在一個方面，本文中提供了確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風險的方法。所述方法包括測定從孕婦獲得的樣品中至少兩種生化標志物的水平，其中所述生化標志物包含PlGF和sP-選擇蛋白；和利用所測定的生化標志物水平確定先兆子癇風險。優(yōu)選被確定風險的所述先兆子癇是早發(fā)型先兆子癇。

在所述方法的實施方式中，確定孕婦發(fā)生先兆子癇的風險還包括利用孕產(chǎn)婦史因素，特別是高血壓史。

根據(jù)所述方法的公開內(nèi)容，從受試者獲得的樣品中PlGF水平降低和sP-選擇蛋白水平增加是所述受試者中早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的風險增加的指示。

樣品觀察結(jié)果

換句話說，鑒定了以下觀察結(jié)果中的至少一種，并因此鑒定了水平差異：相對于對照樣品中的PlGF水平，從受試者獲得的樣品中的PlGF水平降低；相對于對照樣品中的sP-選擇蛋白水平，從受試者獲得的樣品中的sP-選擇蛋白水平增加。

這些觀察結(jié)果被生成為數(shù)值，它們在算法中產(chǎn)生對孕婦發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇風險的評估。

簡而言之，如本文中所述的用于確定患有慢性高血壓的孕婦的早期或晚期先兆子癇風險的方法的示例性版本可通過從孕婦獲取血液樣品來進行。如果需要，所述血液可被處理以制備血漿或血清。使用利用特異性針對生化標志物PlGF和sP-選擇蛋白的至少兩種抗體(一種涂布在微量滴定板上，捕獲抗體，并且另一種用可檢測標記物進行標記，示蹤抗體)的標準免疫測定法來進行生化標志物的測定。實例是使用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，其中試樣中的顯色強度與存在的標志物濃度成正比?；谶@種測試，可計算所述生化標志物的水平。該水平可獨立地，或者如果需要，與其他標志物水平相組合，用于風險算法中。為了設(shè)計所述風險算法，可使用針對假定所述群體中先兆子癇的％發(fā)病率進行調(diào)整的數(shù)據(jù)集的標準Logistic回歸分析。為了確定所述生化標志物的水平是否大于或小于正常，測定來自相關(guān)群體的母體生物樣品中存在的正常生化標志物水平。所述相關(guān)群體可基于能影響所述標志物的正常(未受影響的)水平的任何特征來定義。為了確定早期先兆子癇的風險，所述相關(guān)群體可分別在早期先兆子癇和晚發(fā)型先兆子癇的低風險的基礎(chǔ)上建立。一旦知道所述正常標志物水平，就可利用標準統(tǒng)計方法比較所測定的標志物水平和確定差異顯著性。當所測定的標志物水平和所述正常水平之間有統(tǒng)計顯著性差異時，所測試的個體存在發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的顯著風險。

將所述樣品中所選的生化標志物的水平與對照樣品中相同的生化標志物的水平相比較。相對于對照樣品，所述樣品中生化標志物的水平的差異是發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的風險增加的指示。差異是指數(shù)值的統(tǒng)計顯著性差異。存在任何一種所述生化標志物的“水平增加或降低”是指任何一種所述生化標志物的水平統(tǒng)計顯著性偏離對照樣品中相同生化標志物的水平，高于或低于對照樣品中的水平。

為了在常規(guī)先兆子癇篩查中分析單個樣品的測量結(jié)果，首先需要對照群體的數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)通過測量來自大量樣品、優(yōu)選每個妊娠周超過100個樣品的所選的生化標志物而獲得。然后優(yōu)選將所選的生化標志物的測量濃度進行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換，以產(chǎn)生生物變異的高斯分布。隨后，從對照數(shù)據(jù)確定各選定生化標志物在各妊娠周的中值濃度和標準偏差。之后，可以將任何單個樣品的結(jié)果與適當?shù)闹兄禎舛缺容^，以確定所選的生化標志物的濃度是否不同于它們的正常值。這種比較可用作計算患者先兆子癇風險的基礎(chǔ)，而先兆子癇風險作為做出早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇診斷的基礎(chǔ)。從研究產(chǎn)生這種數(shù)據(jù)的實例在實施例中進行。

也可以進行匹配病例對照研究來證實生化標志物PlGF和sP-選擇蛋白的行為。在這樣的研究中，使用通過生理參數(shù)與早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇病例群體匹配的對照群體。也可以使用稍有不同的方法來計算這樣的研究與常規(guī)篩查相比較的結(jié)果。

PlGF的組合、測量和本發(fā)明的確定患有慢性高血壓的孕婦發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇的風險的方法。

作為一種實施方式，所述確定患有慢性高血壓的孕婦發(fā)生早發(fā)型或晚發(fā)型先兆子癇風險的方法包括測量PlGF水平的差異，較早已經(jīng)報導PlGF是先兆子癇的指示并將測量它與sP-選擇蛋白相組合用于所述分析。PlGF比sP-選擇蛋白更好地預測沒有慢性高血壓的PE，而sP-選擇蛋白比PlGF更好地預測有慢性高血壓的PE。PlGF和sP-選擇蛋白的組合預測所有形式的PE。采用利用PlGF和sP-選擇蛋白的生物標志物組合的本發(fā)明方法，能夠以適合于所述狀況的方式監(jiān)測和治療顯示出發(fā)生早期先兆子癇或晚發(fā)型先兆子癇風險的那些人。

單獨的PlGF是預測并發(fā)EO-PE的差標志物。當與sP-選擇蛋白組合使用時，性能明顯增加。當在妊娠的前三月期內(nèi)測量時，標志物組合在10％FPR下檢出約60％的會發(fā)生并發(fā)EO-PE的那些女性，而單獨的PlGF只檢出約20％的病例。

單獨使用的PlGF檢出約40％的LO-PE(晚發(fā)型PE)病例，而PlGF與sP-選擇蛋白一起在5％FPR下檢出約60％。當PlGF與sP-選擇蛋白組合使用時，對LO-PE的性能也明顯增加(表1，第53、54和55行)。

考慮到篩查群體和作出醫(yī)護決定這兩方面，并且也考慮到個體、她們在妊娠期間的習性、擔憂和甚至焦慮，本文中公開的方法都具有重要的益處。在群體水平上，通過相對于可能的高血壓病癥的預計嚴重度來調(diào)整造訪助產(chǎn)士或產(chǎn)科醫(yī)師的頻率，實現(xiàn)了費用節(jié)省。

數(shù)據(jù)分析原則

-將數(shù)據(jù)分成不同的孕周區(qū)：

10-14，15-26，27-36(整周)

-將各孕區(qū)中的濃度(MoM化)(MoM 1-3)歸一化。協(xié)變量：孕齡，母親體重，種族和吸煙

-計算各孕周區(qū)內(nèi)不同結(jié)果的基于Logistic回歸的風險模型

變量＝分析物MoM

最多三種分析物的組合

-計算不同假陽性率下的檢出率并對所有模型作出ROC曲線。

指征和分組如下：

先兆子癇(PE)

全部

有或沒有慢性高血壓(并發(fā)PE)

早發(fā)型或晚發(fā)型(通過分娩孕齡在34周之前和之后來劃分)

有或沒有慢性高血壓的早發(fā)型

有或沒有慢性高血壓的晚發(fā)型

實施例

實施例1

圖1a顯示了從后來發(fā)生EO-PE的血壓正常的女性測量的PlGF。

圖1a的箱線圖顯示，與未患EO-PE的妊娠(對照組)相比，后來在妊娠中發(fā)生EO-PE的血壓正常的女性中的PlGF濃度降低。樣品的獲取越接近所述疾病的發(fā)作，PlGF濃度降低得越多。

對照是指沒有不良結(jié)果的正常妊娠。

包括“非正?！钡膶φ帐侵笡]有發(fā)生EO-PE但可能遭受其他不良妊娠結(jié)果的妊娠。

GA是指抽血時的孕齡。

圖1b顯示了在后來發(fā)生EO-PE(并發(fā)EO-PE)的慢性高血壓女性之中的PlGF。

圖1b的箱線圖顯示，在患有慢性高血壓并且后來在妊娠中發(fā)生并發(fā)EO-PE的女性中，PlGF濃度沒有降低到與在血壓正常的女性之中相同的程度。

在慢性高血壓上的并發(fā)PE：在20孕周之前患有高血壓的女性中新發(fā)作蛋白尿。它可以通過以下來表征：

-如果在妊娠早期已經(jīng)存在蛋白尿的話，蛋白尿突然加重

-高血壓突然加重

-發(fā)生HELLP綜合征

-患有慢性高血壓的女性發(fā)生頭痛、暗點或上腹痛。

圖2顯示了并發(fā)EO-PE的PlGF預測。

圖2a是PlGF的受者工作特征(ROC)曲線，用于在高血壓女性中預測EO-PE(并發(fā)PE)。圖2a顯示了并發(fā)EO-PE的PlGF預測。

圖2b顯示了并發(fā)EO-PE的PlGF+sP-選擇蛋白預測。

圖2b.PlGF+sP-選擇蛋白組合的ROC曲線，用于預測并發(fā)EO-PE。圖2b顯示了并發(fā)EO-PE的PlGF+sP-選擇蛋白預測。

從所述結(jié)果可得出結(jié)論：

PlGF是預測并發(fā)EO-PE的差標志物。當與sP-選擇蛋白組合使用時，性能明顯增加。當在妊娠的前三月期內(nèi)測量時，標志物組合在10％FPR下檢出約60％的會發(fā)生并發(fā)EO-PE的那些女性，而單獨的PlGF只檢出約20％的病例。

另一個數(shù)據(jù)集證實了上述結(jié)果：

圖3顯示了在有正常(對照組)和EO-PE情況的血壓正常和慢性高血壓妊娠之中的PlGF MoM。在GA 11-13時取樣。

圖4顯示了在有正常(對照組)和EO-PE情況的血壓正常和慢性高血壓妊娠之中的sP-選擇蛋白MoM。在GA 11-13時取樣。

圖5顯示了在后來發(fā)生“典型”PE的女性之中的PlGF。數(shù)據(jù)顯示，正如與EO-PE一樣，PlGF作為單一標志物在血壓正常的女性中比在慢性高血壓女性中效果更好。

圖6顯示了PlGF和并發(fā)PE。

圖7表1。