本發(fā)明涉及用于分離生物材料(特別是不同密度的細(xì)胞群體)的裝置、方法和套件。本發(fā)明在將血液分離成其不同構(gòu)成部分或細(xì)胞群體中發(fā)現(xiàn)特別效用。

本發(fā)明的背景

在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中，密度梯度通常將血液分離成不同部分，諸如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血漿。血液覆蓋到具有限定密度的介質(zhì)(例如，F(xiàn)icoll^TM、Ficoll-Paque^TM、GE Healthcare)上且然后離心。在離心過程期間，發(fā)生血液成分的差異轉(zhuǎn)移，從而造成每個血液部分的層的形成。紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移穿過Ficoll層且沉積在管的底部處，而白細(xì)胞移動至在Ficoll上方且在血漿層下方的界面。白細(xì)胞名義上包括不足周圍血液的1%，且此技術(shù)允許它們有效且容易的純化。

對于血液部分的有效分離，密度梯度介質(zhì)和血液樣本之間的界面必須盡可能地分明，帶有最低限度的混合。這可為難以實(shí)現(xiàn)的，且需要熟練、穩(wěn)定的手和耐心。因此，在離心之前將血液裝載到密度梯度介質(zhì)上是非常耗時的。該界面也是脆弱的，且如果管被敲打，則該界面可容易地混合且被破壞。

在離心之后的分離的帶(band)或部分的移除或采集也對操作者提出技術(shù)挑戰(zhàn)，操作者必須小心不干擾或破壞部分且避免密度梯度介質(zhì)的過量帶出。

已開發(fā)了方法和裝置來解決這些問題。

WO2012/149641(Stem Cell Technologies Inc.)描述了一種用于離心管的插入件，其有助于樣本中存在的不同細(xì)胞群體的密度梯度分離。插入件大小確定成適應(yīng)于離心管，且具有通過支撐件(通常是圓柱形支撐件)而定位或穩(wěn)定在管內(nèi)的部件，從而將管分成頂部和底部部分。該部件通常為凹入構(gòu)造且具有至少兩個開口，其中一個當(dāng)插入件就位時較接近管的底部端部且作用為允許液體穿過其行進(jìn)至底部部分，第二個作用為允許空氣逸出以平衡壓力。包括這種插入件的離心管是市售的，即，來自Stem Cell Technologies Inc.的SepMate^TM。

可從Sigma-Aldrich獲得的Accuspin^TM管設(shè)計成與密度梯度介質(zhì)(諸如Histopaque?)一起使用，以用于離析淋巴細(xì)胞和其它單核的細(xì)胞。Accuspin管(也稱為Leucosep^TM管，可從Greiner Bio-One獲得)是特別設(shè)計的聚丙烯離心管，其中兩個腔由多孔高密度聚乙烯屏障或熔塊(frit)分開。密度梯度介質(zhì)(諸如Histopaque-1077)加入熔塊下方的下腔。血液樣本加入頂腔且將管離心。在離心時，紅細(xì)胞沉積至包含密度梯度介質(zhì)的管的底部，而單核的細(xì)胞(諸如淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)在血漿/Histopaque-1077界面處形成稠密帶。然后可通過傾析或利用吸管來移除此帶。由于腔之間的屏障，避免了紅細(xì)胞的污染。

Floaties^TM(www.Biofloaties.com)是小的耐高壓加熱的聚合物混合珠，其設(shè)計成用于通過密度梯度離心從人類全血和臍血樣本將周圍血液單核細(xì)胞(PBMC)在試管內(nèi)離析。珠直接傾倒到離心管中的密度梯度介質(zhì)的頂部上，且緩和地加入血液樣本。大部分的珠上升到樣本的頂部，其可然后在管中離心。在離心之后，PBMC在血漿-密度梯度介質(zhì)界面附近形成層或帶，且通過插入吸管穿過珠層而收集。

雖然多種商業(yè)產(chǎn)品可用于克服上述問題，但仍然需要簡單和靈活的手段以用于以成本效率合算的方式實(shí)現(xiàn)血液部分的有效分離。本發(fā)明通過提供新穎的插入件、方法、離心管和套件來解決此需要。

本發(fā)明的概要

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于離心管的插入件(100)，其包括：盤(20)，其大小確定成適應(yīng)于離心管以用于將所述管分成上部分和下部分；所述盤(20)包括凸起的上表面(21)和在其中具有一個或更多個凹口(24)的外邊緣(22)；和支柱(30)，其從盤(20)的下表面(26)延伸以用于當(dāng)插入件(100)定位在管內(nèi)時接觸所述管的底部。

在一個實(shí)施例中，該一個或更多個凹口(24)允許管的上部分和下部分之間的流體連通。

在另一個實(shí)施例中，該一個或更多個凹口(24)大小確定成跨過該一個或更多個凹口(24)產(chǎn)生表面張力，以在沒有離心力的情況下約束液體穿過其的流動。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，上表面(21)另外包括連接至所述一個或更多個凹口(24)的一個或更多個凹槽(28)。

在一個實(shí)施例中，盤(20)的上表面(21)另外包括握持元件(40)。

在另一個實(shí)施例中，握持元件(40)在盤(20)的上表面(21)的中心。優(yōu)選地，握持元件(40)為桿的形式。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，該一個或更多個凹槽(26)將盤(20)的中心與該一個或更多個凹口(24)連接。

在一個實(shí)施例中，凹槽(26)是扇形的，在盤(20)的中心處比在凹口(24)處窄。

在另一個實(shí)施例中，盤(20)的下表面(28)在形式上是凸起的。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，該一個或更多個凹口(24)在形式上是半圓形或卵形的。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，插入件由聚合物組成。優(yōu)選地，聚合物是惰性聚合物。優(yōu)選地，聚合物是可消毒的，例如通過高壓加熱、化學(xué)處理或通過利用合適的能量(諸如γ射線)照射。通常，聚合物是塑料聚合物，諸如聚乙烯或聚丙烯。然而，可使用其它惰性塑料聚合物，諸如聚碳酸酯、聚乙烯和丙烯酸酯聚合物。

在另一個實(shí)施例中，插入件已經(jīng)處理成使微生物污染最小化。合適的方法的示例包括高壓加熱、利用消毒劑或抗微生物劑的化學(xué)處理，和/或利用合適的能量(諸如γ射線)照射。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種包括如前面描述的插入件的離心管。離心管可另外包含密度梯度介質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于分離細(xì)胞的方法，其包括以下步驟：

i) 將一定體積的密度梯度介質(zhì)加入離心管；

ii) 將如前面描述的插入件定位在所述密度梯度介質(zhì)的表面上，使得支柱與所述管的底部接觸；

iii) 在盤的上表面上分配包含一個或更多個細(xì)胞的液體樣本，以在密度梯度介質(zhì)與樣本之間形成界面；和

iv) 將管離心以從樣本分離所述一個或更多個細(xì)胞。

在一個實(shí)施例中，細(xì)胞選自由哺乳動物細(xì)胞、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和干細(xì)胞組成的組。

在另一實(shí)施例中，樣本包括全血。

在進(jìn)一步的實(shí)施例中，該方法另外包括恢復(fù)該一個或更多個細(xì)胞的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種包括如前面描述的插入件和離心管的套件。優(yōu)選地，套件另外包括一定體積的密度梯度介質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種如前面描述的插入件和一定體積的密度梯度介質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了使用如前面描述的插入件用于從樣本分離一個或更多個細(xì)胞。

定義

如本文所使用，用語“用于離心管的插入件”意在指可逆地或不可逆地放置或固定在離心管內(nèi)的任何裝置或設(shè)備。

離心管是可被離心的管。管可具有在本領(lǐng)域中常見的圓錐形底端部或可為平坦的或圓形底的。市售的離心管的示例包括但不限于Nunc^TM圓錐形無菌聚丙烯離心管(Thermo Scientific^TM)、Nalgene^TM Oak Ridge聚碳酸酯、聚丙烯或Teflon^TM管(Thermo Scientific^TM)以及Sterilin聚丙烯管(Camlab, UK)。

將理解的是，根據(jù)本發(fā)明的插入件可與具有不同容積(諸如例如2ml、5ml、10ml、15ml和50ml)的離心管一起使用。

在一個方面，本發(fā)明中使用的“細(xì)胞”是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選為人類細(xì)胞?？捎迷诒景l(fā)明中的哺乳動物細(xì)胞的示例包括但不限于血細(xì)胞，諸如紅細(xì)胞(紅血球)、白細(xì)胞(包括白血球、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)、血小板(凝血細(xì)胞)和干細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞)。

“細(xì)胞”可為骨髓細(xì)胞。

本文中使用的用語“干細(xì)胞”涉及多能(pluripotent)干細(xì)胞或多能性(multipotent)干細(xì)胞。干細(xì)胞的示例包括但不限于胚胎干細(xì)胞(ESC)、成體干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)。

附圖的簡要描述

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的插入件的實(shí)施例的三維透視圖。

圖2a至圖2c繪出了圖1的插入件的一系列視圖：平面透視(圖2a)、前透視(圖2b)和下側(cè)平面透視(圖2c)。

圖3a是示出了根據(jù)本發(fā)明的插入件的平面透視的示意圖，帶有凹槽的詳細(xì)插圖(圖3b)。

圖4a、圖4b和圖4c是根據(jù)本發(fā)明的插圖的一部分的示意圖。具體而言，圖4a詳細(xì)描繪了插入件的盤的上表面上的液體流，圖4b詳細(xì)描繪了隆起的高度，且圖4c詳細(xì)描繪了凹槽的深度。

圖5a、圖5b和圖5c是定位在空離心管(圖5a)以及離心之前(圖5b)和離心之后(圖5c)的填充的離心管內(nèi)的根據(jù)本發(fā)明的插入件的示意圖。

圖6是在通過離心分離之前的已經(jīng)裝載了Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)(下層，560a、560b和560c)和血液/PBS混合物(上層，562a、562b和562c)的三個離心管(550a、550b和550c)的照片。

圖7是在離心和分離過程之后的圖6中所示的三個離心管的照片。

圖8是來自圖7的管(A對應(yīng)于650a，B對應(yīng)于650b且C對應(yīng)于650c)中的每一個的白細(xì)胞部分的流式細(xì)胞計分析的結(jié)果的圖示，字母G指示白細(xì)胞部分中存在的粒細(xì)胞子群體，M指示單核細(xì)胞子群體，且L指示淋巴細(xì)胞子群體。FSC和SSC分別表示前向散射和側(cè)向散射。

附圖的詳細(xì)描述

在圖1中以三維透視的方式示出了根據(jù)本發(fā)明的插入件的實(shí)施例。插入件(100)包括盤(20)，盤(20)具有尺寸或大小確定成適應(yīng)于離心管(未示出)的直徑，使得一旦其在管內(nèi)就位，則其將把管分成上部分和下部分。插入件可大小確定成適應(yīng)于任何離心管，包括由合適的材料(諸如塑料、金屬或玻璃)制造的標(biāo)準(zhǔn)容積(諸如10ml、15ml或50ml)的離心管。插入件作用為使不同密度的液體的混合最小化，該混合在包含待分離到另一液體中的目標(biāo)(諸如血細(xì)胞)的液體加入不同密度的第一液體時發(fā)生，因?yàn)檫@導(dǎo)致在離心時目標(biāo)到第一液體中的較差分離。插入件還有助于在離心過程期間將目標(biāo)分離到第一液體中。通常，第一液體是密度梯度介質(zhì)，且包含目標(biāo)的液體是含水血液樣本。

盤(20)具有上表面(21)，上表面(21)在形式上是凸起的且具有在其外邊緣(22)或周圍中的多個凹口(24)；凹口可采取任何形式，但大體上是彎曲的，在形狀上為半圓形或卵形。從盤(20)的下表面(未示出)延伸的支柱(30)作用為腿部，以當(dāng)插入件(100)定位在管內(nèi)時在離心管(未示出)的底部上方支撐盤(20)。支柱(30)的長度取決于待加入離心管的液體的體積而確定大小，使得當(dāng)插入件加入此體積的液體時，盤的下側(cè)將與液體的彎液面接觸。握持元件(40)有助于插入件(100)在離心管內(nèi)的定位和移除。插入件可從離心管手動地定位和/或移除，例如通過使用操作者的手指或合適的工具(諸如一副鑷子)，或者通過自動或機(jī)器人手段。

凹槽(28)將盤(20)的中心與凹口(24)連接。凹槽(28)的目的是將液體(該液體可傾倒到盤(20)的凸起的上表面(21)上)引導(dǎo)至凹口(24)，使得液體在第一液體(諸如密度梯度介質(zhì)，其存在于管的下部分中)的頂部上成層，帶有最低限度的干擾或混合(因?yàn)檫@將損害分離過程)。

圖2a、圖2b和圖2c分別是圖1的插入件(200)的頂平面視圖、前透視圖和底平面視圖。圖2a提供了插入件(200)的頂平面視圖，示出了從在盤(120)的中心的握持元件(140)延伸至盤(120)的外邊緣(122)或邊沿上的凹口(124)的凹槽或通道(128)的布置。插入件(200)的握持元件(140)和支柱(130)在圖2b的前透視圖中示出。插入件(200)的下側(cè)平面視圖的圖2c示出了帶有中心支柱(130)的盤(120)的凹入下表面(126)。

在圖3a中示出了根據(jù)本發(fā)明的插入件(300)的實(shí)施例的盤(220)的示意頂平面視圖。在示例中，盤(220)具有從其上表面(221)的其中心(229)沿徑向延伸至外邊緣(222)中的凹口(224)的扇形的凹槽，凹槽(228)在盤的中心處比在外邊緣處窄。盤(220)的直徑(D)將取決于插入件預(yù)期用于的離心管的大小或容積而變化；例如，用于50ml離心管的典型插入件將具有大約26mm直徑的盤。對于這種插入件，彎曲的凹口將在寬度(W)上為大約4mm，且具有大約1mm的深度(D)(圖3b)。

圖4a、圖4b和圖4c示出了本發(fā)明的實(shí)施例的盤的一部分的示意圖。圖4a繪出了在盤的上表面(321)上的液體流(如由箭頭的流動方向所示)。傾倒到盤的凸起的上表面的頂部上的液體流到扇形的凹槽(328)中，沿其長度向下流到凹口(324)中且然后離開盤的表面。凹槽(328)的深度從盤的中心(在那里其與握持元件(330)會合)增大至其外邊緣(322)處的最大值。圖4b是示出了在盤的外邊緣(322)上的未被淹沒的邊沿的隆起高度(H)的示意細(xì)節(jié)，該高度(H)對于用于50ml離心管的插入件而言將為大約1mm。圖4c示出了凹槽(328)的深度(D)，該深度(D)對于示出的插入件而言將為大約1mm。深度D和高度H將取決于插入件的設(shè)計所針對的管的容積而變化。

圖5a、圖5b和圖5c是定位在空離心管(圖5a)以及離心之前(圖5b)和離心之后(圖5c)的填充的離心管內(nèi)的根據(jù)本發(fā)明的插入件的示意圖。

圖5a示出了定位在常規(guī)離心管(450)內(nèi)的根據(jù)本發(fā)明的插入件(500)，該管具有封閉由其內(nèi)壁(453)限定的中空內(nèi)部(452)或腔的蓋(451)。圖5a的離心管(450)不包含任何液體。管的外壁(453)和內(nèi)壁(454)都由惰性材料(諸如塑料、玻璃或金屬)制成。離心管(450)可設(shè)計成適應(yīng)一定范圍的液體體積，諸如5ml、10ml、15ml和50ml，壁被標(biāo)記(455)以指示腔(452)內(nèi)存在的體積。

插入件(500)包括盤(420)，帶有握持元件(440)以允許定位在管(450)內(nèi)且?guī)в兄е?430)以在管的底部上方支撐盤。盤大小確定成使得外邊緣(422)與管(450)的內(nèi)壁(453)接觸以存在液體不可滲透的屏障，使得液體不可從管的上部分行進(jìn)至管的下部分，除非穿過凹口(424)。盤的外邊緣中存在的凹口(424)設(shè)計成在沒有離心力的情況下約束液體跨過盤流動。

圖5b示出了在離心和將細(xì)胞從液體樣本(462)分離到密度梯度介質(zhì)中之前填充有兩種液體(460和462)(密度梯度介質(zhì)(460)和包含細(xì)胞的液體樣本(462))的圖5a的管(450)。為了制備圖5b中所示的管，將預(yù)先限定的體積的密度梯度介質(zhì)(460)傾倒到管的下部分(A)中且隨后將插入件(500)插入，使得當(dāng)其由支柱支撐在管的底部上方時，液體(460)的彎液面與插入件的盤(420)的下表面(426)流體連接。因此，支柱(430)的長度作用為間隔件以限定可在離心管的下部分(A)中存在的液體(460)或密度梯度介質(zhì)的特定體積。將理解的是，支柱(430)的長度將取決于在離心和分離過程中使用的期望體積的液體或密度梯度介質(zhì)(460)以及離心管的內(nèi)部容積而變化。對于典型的50ml離心管，支柱(430)的長度大小確定成使得盤(420)位于管(450)的15ml標(biāo)記處。

包含細(xì)胞(諸如血細(xì)胞)的液體樣本(462)小心地傾倒到盤(420)的上表面上，以在其上方在管的上部分(B)中形成層。然后替換蓋(451)且將管轉(zhuǎn)移至離心機(jī)。

圖5c是離心之后的圖5b的管的示意圖。管(450)中存在的液體已經(jīng)基于密度分離成四個部分D、E、F和G。D部分主要包含血漿，E部分是Ficoll，F(xiàn)部分主要包括紅細(xì)胞，且G部分包含白細(xì)胞?，F(xiàn)在可通過小心地從管吸移各個部分來收集細(xì)胞的目標(biāo)群體：例如，如果需要白細(xì)胞，則首先移除D部分且然后收集G部分。備選地，如果目標(biāo)是紅細(xì)胞，則丟棄D和G部分，小心地移除插入件(500)以避免干擾和剩余部分，且收集F部分。

實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)在將參照以下特定示例來描述本發(fā)明。

對其輔助將血液裝載到Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)上而不在血液-Ficoll界面處混合的能力以及對其允許血液部分分離而不在離心力下混合的能力測試了根據(jù)本發(fā)明的插入件。

利用包含2%人類血清的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將25ml的血液稀釋兩倍。將15ml的Ficoll-Paque加入3個50ml離心管。兩個管是常規(guī)離心管(圖6的550a和550c)，而一個管(圖6的550b)是Accuspin^TM管(Sigma-Aldrich)。Accuspin^TM管是特別設(shè)計的聚丙烯離心管，其中兩個腔由多孔高密度聚乙烯屏障或熔塊分開，以在離心期間輔助淋巴細(xì)胞和其它單核的細(xì)胞從全血和骨髓分離。

將25ml的血液/PBS混合物(562a、562b)小心地吸移到管550a和550b的Ficoll-Paque層的表面上。將根據(jù)本發(fā)明的插入件(600)加入第三管(550c)。通過吸移將25ml的血液/PBS混合物(562c)加入管550c中的插入件的頂部中心，以允許血液混合物沿凹槽向下流動且在Ficoll-Paque層上形成層。

圖6是在通過離心分離之前的已經(jīng)裝載了Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)(下層，560a、560b和560c)和血液/PBS混合物(上層，562a、562b和562c)的三個管(550a、550b和550c)的照片。可見的是，其中兩個管550a和550c是常規(guī)離心管(管550c包含根據(jù)本發(fā)明的插入件600)，而管550b是Accuspin^TM管(Sigma-Aldrich)。

所有三個管在制動器關(guān)閉的情況下在400g下離心30分鐘。

圖7示出了在離心和分離過程之后的圖6的相同的三個管。紅細(xì)胞已經(jīng)在管(650a、650b和650c)的Ficoll-Paque層(665a、665b和665c)的底部(664a、664b和664c)處成團(tuán)，而白細(xì)胞(666a、666b和666c)已經(jīng)在Ficoll-Paque(665a、665b和665c)和血漿(667a、667b和667c)層的界面處分離。

然后利用吸管采集來自每個管的白細(xì)胞部分，且使用核計數(shù)器(NC100，Sartorius)對其計數(shù)。通過流式細(xì)胞計(FACS Calibur, BD Bioscience)分析10⁶細(xì)胞以確定它們的群體組成。

圖8是來自圖7的管(A對應(yīng)于650a，B對應(yīng)于650b且C對應(yīng)于650c)中的每一個的白細(xì)胞部分的流式細(xì)胞計分析的結(jié)果的圖示，字母G指示白細(xì)胞部分中存在的粒細(xì)胞子群體，M指示單核細(xì)胞子群體，且L指示淋巴細(xì)胞子群體。圖還示出了白細(xì)胞群體中存在的每個子群體(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)的百分比。以下的表1給出了用于管中的每一個的白細(xì)胞恢復(fù)和細(xì)胞活力。

N=1

可見的是，在總細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活力或細(xì)胞群體方面，與使用根據(jù)本發(fā)明的插入件相比，使用常規(guī)Ficoll-Paque分層或使用Accuspin^TM管采集的白細(xì)胞中沒有可辨別的差異。

雖然描述了本發(fā)明的優(yōu)選的示范性實(shí)施例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，本發(fā)明可通過不同于所描述的實(shí)施例實(shí)踐，描述的實(shí)施例是為了說明目的而提出且不作為限制。本發(fā)明僅由以下權(quán)利要求限制。