本發(fā)明涉及使用人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段作為特異性檢測試劑檢測/測定包含哺乳動物血清的樣品中的抗藥物抗體的方法。

發(fā)明背景

使用抗體的標(biāo)準(zhǔn)固相免疫測定涉及在固相上吸附/固定的抗體(捕獲抗體)，抗原和與酶或可檢測標(biāo)記綴合的抗原的另一表位的抗體(示蹤抗體)之間形成復(fù)合物。在測定中，形成夾層：固相/捕獲抗體/抗原/示蹤抗體。在由夾層催化的反應(yīng)中，抗體綴合的酶的活性與溫育介質(zhì)中的抗原濃度成比例?？躬?dú)特型抗體測定在例如us5,219,730；wo87/002778；ep0139389；和ep0170302中提及。wadhwa,m.,etal.(j.immunol.methods278(2003)1-17)報道了由治療性生物制品誘導(dǎo)的不需要的抗體的檢測，測量和表征的策略。用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體的方法在ep1917854中報道。

chen,y.-p.,etal.(clin.vac.immunol.14(2007)720-725)報道了通過針對人紅細(xì)胞和乙型肝炎病毒表面抗原的雙特異性雙抗體介導(dǎo)的凝集測定法快速檢測乙型肝炎病毒表面抗原。porter,r.等人報道了利用自組裝單層修飾電極的免疫測定的電活性系統(tǒng)(easi測定)(biosensorsbioelec.16(2001)9-12)。使用針對htnf-α和辣根過氧化物酶的雙特異性抗體測定人腫瘤壞死因子-α(htnf-α)的酶免疫測定的開發(fā)由berkova,n.,etal.(biotechnol.appl.biochem.23(1996)163-171)報道。在ep0962771中，報告了檢測裝置和用于其的方法。reinhartz,h.w.,etal.(analyst121(1996)767-771)報道了通過實(shí)時相互作用分析研究的雙特異性多價抗體用于開發(fā)抗原抑制酶聯(lián)免疫吸附測定。雙特異性抗體的化學(xué)生成由doppalapudi,v.r.,etal.(proc.natl.acad.sci.usa107(2010)22611-22616)報道。

在ep2492689a1中，報道了使用改進(jìn)的免疫復(fù)合物(ic)elisa檢測抗體。用于檢測抗體的方法在wo2011/135024中報道。在wo2009/077127中報道了區(qū)分測定法。在ep2351792中報道了用于檢測抗藥物抗體的方法。在wo2012/130831中報道了抗體fc變體。

發(fā)明概述

本文中報道了基于人fcγ受體i與針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的fc區(qū)的特異性結(jié)合，用于測定抗藥物抗體的存在以及量的免疫測定法以及方法和用途。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在免疫測定中使用人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段作為一種化合物，對針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的檢測和定量是有利的。通過使用人fcγ受體i，可以提供例如與常規(guī)橋接免疫測定法相比改進(jìn)的免疫測定法。改進(jìn)尤其是改進(jìn)的靈敏度和/或穩(wěn)健性。

如果藥物抗體是效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體，即如果藥物抗體的fc區(qū)(fc區(qū)多肽)含有降低或甚至消除藥物抗體與人fcγ受體iii的結(jié)合的突變，那么本文報道的方面是特別有用的。

人fcγ受體i可以用作捕獲化合物(當(dāng)其固定在固體表面上時)或示蹤化合物(當(dāng)其與可檢測標(biāo)記綴合時)。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成復(fù)合物，由此將全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

-通過可檢測標(biāo)記確定在前面步驟中形成的復(fù)合物。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得樣品中存在的針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成復(fù)合物，由此將全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段綴合至可檢測標(biāo)記，

-分離在針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成的復(fù)合物，以及

-通過可檢測標(biāo)記確定復(fù)合物。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的固相與包含哺乳動物血清的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟b)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的fab的固相與包含哺乳動物血清的樣品一起溫育(從而形成固相結(jié)合的fab-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的fab-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，從而全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，

c)通過測定可檢測標(biāo)記的存在，來確定步驟b)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制人的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有efs-da特異性結(jié)合的抗原的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此將全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將其上固定有全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段的固相與步驟a)中獲得的樣品一起溫育(使得形成固相結(jié)合的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)將固相(其結(jié)合有步驟b)中形成的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)與所述藥物抗體的抗原一起溫育，由此所述抗原與可檢測標(biāo)記綴合，以及

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有針對藥物抗體的抗藥物抗體的固相與步驟a)中獲得的樣品進(jìn)行溫育(使得形成固相結(jié)合的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的方法，其包括以下順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得形成針對樣品中存在的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間的復(fù)合物，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

-通過可檢測標(biāo)記確定在前面步驟中形成的復(fù)合物。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，針對形成樣品中存在的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間的復(fù)合物是1:1復(fù)合物。這意味剛好一個針對樣品中存在的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和剛好一個人fcγ受體i或fc區(qū)結(jié)合片段存在于形成的復(fù)合物中。

在本文報導(dǎo)的所有方面的一個實(shí)施方案中，針對樣品中存在的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間的復(fù)合物是單體復(fù)合物。這意味著復(fù)合物中的化合物都不是多聚體。這進(jìn)一步意味著在本文報道的方面中沒有使用親合力效應(yīng)。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，形成的所有復(fù)合物是單體復(fù)合物。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，形成的所有復(fù)合物為1:1或1:1:1復(fù)合物。這意味著取決于所使用的復(fù)合物形式，僅形成復(fù)合物的每種化合物的單個分子存在于復(fù)合物中。在一個實(shí)施方案中，復(fù)合物包含1)正好一個分子的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體，2)正好一個分子的針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體分子，和3)正好一個分子的人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段。在一個實(shí)施方案中，復(fù)合物包含1)正好一個分子的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體，2)正好一個分子的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗原，和3)正好一個分子的人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段。在一個實(shí)施方案中，所述復(fù)合物包含1)正好一個分子的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體fab，2)正好一個分子的針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體，和3)正好一個分子的人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的固相與包含哺乳動物血清的樣品溫育(使得形成單體1:1固相結(jié)合的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育固相(與步驟a)中形成的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此將全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定步驟b)中單體1:1固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定在樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的固相與包含哺乳動物血清的樣品溫育(使得形成單體1:1固相結(jié)合的fab-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育固相(與步驟a)中形成的fab-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此將全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定步驟b)中單體1:1固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有efs-da特異性結(jié)合的抗原的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(使得形成單體1:1固相結(jié)合的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記物綴合,和

d)通過測定可檢測標(biāo)記的存在來確定步驟c)中單體1:1固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體在樣品中的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將其上固定了全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(使得形成單體1:1固相結(jié)合受體-藥物抗體-抗-藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與藥物抗體的抗原，由此所述抗原與可檢測標(biāo)記綴合,和

d)通過測定可檢測標(biāo)記的存在來確定步驟c)中單體1:1固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體在樣品中的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將其上固定了針對藥物抗體的抗藥物抗體的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(使得形成單體1:1固相結(jié)合的抗藥物抗體-藥物抗體-抗-藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合,和

d)通過測定可檢測標(biāo)記的存在來確定步驟c)中單體1:1固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體在樣品中的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的方法，包括以下順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得樣品中存在的針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成復(fù)合物，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

-通過可檢測標(biāo)記確定前面步驟中形成的復(fù)合物。

本文報道的一個方面是人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定包含哺乳動物血清的樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在或量的用途。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，每個溫育步驟之后是以下步驟：

-洗滌固相以除去未結(jié)合的化合物。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，所述測定法用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在和量，并且包含作為最后步驟的：

-通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在前一步驟中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，并通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線將測定的標(biāo)記物的量與抗藥物抗體的量相關(guān)，確定所述樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的量。

在本文報導(dǎo)的所有方面的一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人igg1或igg4亞類的。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人igg1亞類的并且在兩個fc區(qū)多肽中具有突變l234a，l235a和p329g，或者效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人igg4亞類的，并且在兩個fc區(qū)多肽中具有突變s228p，l235e和p329g(根據(jù)kabat的eu編號系統(tǒng)編號)。

在所有方面的一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是雙特異性抗體，或三特異性抗體，或四特異性抗體，或五特異性抗體或六特異性抗體。在一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是雙特異性抗體。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體不誘導(dǎo)adcc。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，哺乳動物血清是人血清或食蟹猴血清或小鼠血清。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，哺乳動物血清從已經(jīng)施用效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的哺乳動物獲得。在一個實(shí)施方案中，在第一次施用針對哺乳動物的抗體后至少2天獲得樣品。

在本文報導(dǎo)的所有方面的一個實(shí)施方案中，樣品包含0.5％(v/v)至8％(v/v)哺乳動物血清，優(yōu)選約2％(v/v)哺乳動物血清。

在本文報道的所有方面的一個實(shí)施方案中，針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體是igg類的。

在本文報導(dǎo)的所有方面的一個實(shí)施方案中，標(biāo)記的存在和/或量使用酶聯(lián)顯色反應(yīng)，表面等離振子共振，電化學(xué)發(fā)光或放射免疫測定法來測定。

在本文報導(dǎo)的所有方面的一個實(shí)施方案中，免疫測定和/或方法和/或用途是體外免疫測定和/或體外方法和/或體外用途。

在本文報導(dǎo)的所有方面的一個實(shí)施方案中，固相與結(jié)合對的第一成員綴合，并且待固定在固相上的化合物綴合至結(jié)合對的第二成員。

在一個實(shí)施方案中，這樣的結(jié)合對(第一成員/第二成員)選自鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素，抗體/抗原(參見例如hermanson,g.t.,etal.,bioconjugatetechniques,academicpress(1996))，凝集素/多糖，類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，激素/激素受體，酶/底物，igg/蛋白a和/或g等。

在一個實(shí)施方案中，第二結(jié)合配偶體經(jīng)由特異性結(jié)合對結(jié)合(固定化)。在一個實(shí)施方案中，這樣的結(jié)合對(第一組分/第二組分)選自鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素，抗體/抗原(參見例如hermanson,g.t.,etal.,bioconjugatetechniques,academicpress(1996))，凝集素/多糖，類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，激素/激素受體，酶/底物，igg/蛋白a和/或g等。在一個實(shí)施方案中，第二結(jié)合配偶體與生物素綴合并通過固定的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行固定化。

在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合對的第一成員是鏈霉抗生物素蛋白，結(jié)合對的第二成員是生物素。

在一個實(shí)施方案中，將固相與鏈霉抗生物素蛋白綴合，并將固定在固相上的化合物生物素化。

在一個實(shí)施方案中，固相是鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁珠或鏈霉抗生物素蛋白包被的瓊脂糖珠或多孔板的鏈霉抗生物素蛋白包被的孔。

在一個實(shí)施方案中，待與固相綴合的化合物是包含至少兩種化合物的混合物，所述化合物在它們與生物素綴合的位點(diǎn)不同，從而其后固定在固相上。

在一個實(shí)施方案中，待固定在固相上的化合物通過化學(xué)結(jié)合經(jīng)由n-末端和/或ε-氨基(賴氨酸)，不同賴氨酸的ε-氨基，多肽的氨基酸主鏈的羧基-，巰基-，羥基-和/或酚官能團(tuán)和/或多肽的糖類結(jié)構(gòu)的糖醇基團(tuán)，綴合到結(jié)合對的第二成員。

這種通過不同氨基的綴合可以通過在第一步中用化學(xué)保護(hù)劑酰化一部分ε-氨基，例如通過檸康酰化進(jìn)行。在第二步中，通過剩余的氨基進(jìn)行綴合。隨后去除檸康酰化，并通過剩余的游離氨基將結(jié)合配偶體固定在固相上，即所獲得的結(jié)合配偶體通過未被檸康?；Ｗo(hù)的氨基固定在固相上。合適的化學(xué)保護(hù)劑在未保護(hù)的側(cè)鏈胺上形成鍵，并且與n末端處的那些鍵相比穩(wěn)定性較差并且不同于那些鍵。許多這樣的化學(xué)保護(hù)劑是已知的(參見例如ep0651761)。在一個實(shí)施方案中，化學(xué)保護(hù)劑包括環(huán)狀二羧酸酐，如馬來酸或檸康酸酐。

發(fā)明詳述

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在免疫測定中使用人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段作為一種化合物，對針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的檢測和定量是有利的。

通過使用人fcγ受體i，可以提供例如與常規(guī)橋接免疫測定法相比改進(jìn)的免疫測定法。

該改進(jìn)不受靈敏度和/或穩(wěn)健性的限制。

在本文報道的測定中，減少了靶干擾，從而減少了假陽性結(jié)果的數(shù)量。減少了igm的干擾(例如源自早期和/或非特異性免疫應(yīng)答)。

通過本文報道的測定法，可以檢測到低親和力的抗藥物抗體。

用于測定抗藥物抗體的通常使用的橋接測定法形式要求抗藥物抗體可以同時結(jié)合兩分子的藥物抗體。

在本文報道的免疫測定和方法中，抗藥物抗體不需要橋接藥物抗體的兩個拷貝。實(shí)際上，本文報道的免疫測定和方法以順序方式使用不同的結(jié)合位點(diǎn)。

更詳細(xì)地，如本文報道的免疫測定改善了靈敏度，所需樣品體積，化合物的結(jié)合模式等。因此，在抗藥物抗體免疫測定中識別的抗藥物抗體的數(shù)目大于例如，常規(guī)的橋接免疫測定法，因?yàn)橐矙z測到非橋接抗藥物抗體。

此外，如本文報道的免疫測定法相對于igm類的抗藥物抗體(初次免疫應(yīng)答)在檢測igg類的抗藥物抗體(二次免疫應(yīng)答)方面具有改進(jìn)的性質(zhì)。

本文中報道了用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人或人源化藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成復(fù)合物，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，

-通過可檢測標(biāo)記確定前面步驟中形成的復(fù)合物。

本文報道的測定法提供了用于檢測效應(yīng)子功能抑制的治療藥物抗體的改進(jìn)方法。這些效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(這些是唯一可用于治療人類患者的抗體)不結(jié)合人fcγ受體，或反之亦然，人fcγ受體不結(jié)合效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的fc區(qū)，因?yàn)榻Y(jié)合位點(diǎn)已被修飾以抑制由人fcγ受體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能。

人fcγ受體i(cd64)是高親和力(相對于人fc區(qū))受體，而人fcγ受體ii和iii(分別是cd32和cd16)是低親和力受體。

本文中的術(shù)語“抗體”以最廣泛的含義使用，并且涵蓋各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示所需的抗原結(jié)合活性。

在某些實(shí)施方案中，抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同位點(diǎn)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合特異性之一是針對第一抗原，另一個針對不同的第二抗原。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可以結(jié)合相同抗原的兩個不同表位。雙特異性抗體可以制備為全長抗體或抗體片段。在一個實(shí)施方案中，抗體是特異性結(jié)合第一和第二抗原的雙特異性抗體。在一個實(shí)施方案中，雙特異性抗體具有i)特異性結(jié)合抗原上的第一抗原或第一表位的第一結(jié)合特異性，和ii)特異性結(jié)合相同抗原上的第二抗原或第二表位的第二結(jié)合特異性。在一個實(shí)施方案中，相同抗原上的第二表位是非重疊表位。

多特異性抗體描述于wo2009/080251,wo2009/080252,wo2009/080253,wo2009/080254,wo2010/112193,wo2010/115589,wo2010/136172,wo2010/145792,或wo2010/145793。

“抗體片段”是指完整抗體以外的任何分子，其包含完整抗體的一部分，所述一部分結(jié)合完整抗體結(jié)合的抗原?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于fv,fab,fab',fab’-sh,f(ab')2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。

抗體的“類”是指它的重鏈具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。有五種主要類型的抗體：iga，igd，ige，igg和igm，并且這些中的幾種可以進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如，igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α，δ，ε，γ和μ。

“效應(yīng)子功能”是指歸因于抗體的fc區(qū)的那些生物活性，其隨抗體類別而變化?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括：c1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)；fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如b細(xì)胞受體)的下調(diào)；和b細(xì)胞活化。

術(shù)語“效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體”表示不引起adcc的抗體。

在一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的抗體不結(jié)合人fcγ受體iii。

在一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是亞類igg1或亞類igg4的抗體。在一個實(shí)施方案中，亞類igg1的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化抗體包含在重鏈恒定區(qū)中在234位和235位的氨基酸殘基丙氨酸(根據(jù)kabateu指標(biāo)編號)。在一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化抗體在重鏈恒定區(qū)中包含在234位和235位的氨基酸殘基丙氨酸，在329位的氨基酸殘基甘氨酸(根據(jù)kabateu指標(biāo)編號)。在一個實(shí)施方案中，亞類igg4的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化抗體在重鏈恒定區(qū)中包含在235位的氨基酸殘基丙氨酸，在228位的氨基酸殘基脯氨酸(根據(jù)kabateu指標(biāo)編號)。在一個實(shí)施方案中，效應(yīng)子功能抑制的人或人源化抗體在重鏈恒定區(qū)中包含在235位的氨基酸殘基丙氨酸，228位的氨基酸殘基脯氨酸和329位的氨基酸殘基甘氨酸(根據(jù)kabateu指標(biāo)編號)。

本文中的術(shù)語“fc區(qū)”用于定義含有恒定區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈的c末端區(qū)。該術(shù)語包括天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)。在一個實(shí)施方案中，人igg重鏈fc區(qū)從cys226或從pro230延伸至重鏈的羧基末端。然而，fc區(qū)的c端賴氨酸(lys447)可以存在或不存在。除非本文另有規(guī)定，fc區(qū)或恒定區(qū)中的氨基酸殘基的編號根據(jù)eu編號系統(tǒng)，也稱為eu指標(biāo)，如kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242中所述。

“構(gòu)架”或“fr”是指除高變區(qū)(hvr)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的fr通常由四個fr結(jié)構(gòu)域組成：fr1，fr2，fr3和fr4。因此，hvr和fr序列通常以如下序列出現(xiàn)在vh(或vl)中：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。

“人抗體”是具有對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列或利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列衍生自非人來源的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的這種定義特異性排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。

“人源化”抗體指包含來自非人hvr的氨基酸殘基和來自人fr的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含基本上所有至少一個，通常兩個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有hvr(例如cdr)對應(yīng)于非人抗體的那些hvr，并且所有或基本上所有的fr對應(yīng)于人抗體的那些fr。人源化抗體任選地可以包含源自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分。抗體例如，非人抗體的“人源化形式”，是指已經(jīng)經(jīng)歷人源化的抗體。

本文所用的術(shù)語“高變區(qū)”或“hvr”是指抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列中高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)(“高變環(huán)”)的每個區(qū)域。通常，天然四鏈抗體包含六個hvr；三個在vh(h1，h2，h3)，三個在vl(l1，l2，l3)中。hvr通常包含來自高變環(huán)和/或來自“互補(bǔ)決定區(qū)”(cdr)的氨基酸殘基，cdr具有最高的序列變異性和/或參與抗原識別。示例性高變環(huán)出現(xiàn)在氨基酸殘基26-32(l1),50-52(l2),91-96(l3),26-32(h1),53-55(h2),和96-101(h3)(chothia,c.andlesk,a.m.,j.mol.biol.196(1987)901-917)。示例性cdr(cdr-l1，cdr-l2，cdr-l3，cdr-h1，cdr-h2和cdr-h3)存在于l1的氨基酸殘基24-34，l2的50-56，l3的89-97，h1的31-35b，h2的50-65和h3的95-102(kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242)。除了vh中的cdr1之外，cdr通常包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。cdr還包含“特異性決定殘基”或“sdr”，其是接觸抗原的殘基。sdr包含在稱為縮寫-cdr或a-cdr的cdr的區(qū)域內(nèi)。示例性的a-cdr(a-cdr-l1，a-cdr-l2，a-cdr-l3，a-cdr-h1，a-cdr-h2和a-cdr-h3)存在于l1的氨基酸殘基31-34,l2的50-55，l3的89-96，h1的31-35b，h2的50-58和h3的95-102(almagro,j.c.andfransson,j.,front.biosci.13(2008)1619-1633)。除非另有說明，可變結(jié)構(gòu)域中的hvr殘基和其他殘基(例如fr殘基)在本文中根據(jù)kabat等，同上編號。

如本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體，即包含在群體的單個抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，除了可能的變異抗體(例如含有天然突變或在單克隆抗體制劑的生產(chǎn)期間產(chǎn)生)之外，這樣的變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，單克隆抗體制劑的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。因此，修飾語“單克隆”表示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過多種技術(shù)制備，包括但不限于雜交瘤方法，重組dna方法，噬菌體展示方法，以及利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，這樣的方法和用于制備本文所述的單克隆抗體的其它示例性方法。

“多肽”是由通過肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，無論是天然產(chǎn)生的還是合成產(chǎn)生的。小于約20個氨基酸殘基的多肽可以稱為“肽”，而由兩個或更多個多肽組成或包含一個多于100個氨基酸殘基的多肽的分子可以稱為“蛋白質(zhì)”。多肽還可以包含非氨基酸組分，例如碳水化合物基團(tuán)，金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可以通過在其中表達(dá)多肽的細(xì)胞加入，并且可以隨細(xì)胞類型而變化。多肽在本文中根據(jù)其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)或編碼其的核酸來定義。添加例如碳水化合物基團(tuán)通常沒有指定，但仍然可以存在。

術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指參與抗體與抗原結(jié)合的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈(分別為vh和vl)的可變結(jié)構(gòu)域通常具有相似的結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)域包含四個保守的構(gòu)架區(qū)(fr)和三個高變區(qū)(hvr)(參見例如kindt,t.j.etal.kubyimmunology,6thed.,w.h.freemanandco.,n.y.(2007),page91)。單個vh或vl結(jié)構(gòu)域可以足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以使用來自結(jié)合抗原的抗體的vh或vl結(jié)構(gòu)域分離結(jié)合特定抗原的抗體，以分別篩選互補(bǔ)vl或vh結(jié)構(gòu)域的文庫(參見例如portolano,s.etal.,j.immunol.150(1993)880-887；clackson,t.etal.,nature352(1991)624-628)。

術(shù)語“抗獨(dú)特型抗體”表示抗體，其特異性結(jié)合結(jié)合特異性，例如親本抗體的結(jié)合位點(diǎn)，即其針對親本抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，抗獨(dú)特型抗體特異性結(jié)合親本抗體的一個或多個cdr。在一個實(shí)施方案中，親本抗體是治療性抗體。在一個實(shí)施方案中，親本抗體是多特異性抗體。在一個實(shí)施方案中，親本抗體是雙特異性抗體。

不同免疫測定法的原理例如由hage,d.s.(anal.chem.71(1999)294r-304r)描述。lu,b.,etal.(analyst121(1996)29r-32r)報道了用于免疫測定的抗體的定向固定化?？股锼氐鞍?生物素介導(dǎo)的免疫測定法由例如wilchek,m.,andbayer,e.a.,inmethodsenzymol.184(1990)467-469報道。

多肽和單克隆抗體及其恒定結(jié)構(gòu)域含有多個反應(yīng)性氨基酸側(cè)鏈，用于與結(jié)合對的成員(例如多肽/蛋白質(zhì)，聚合物(例如peg，纖維素或聚苯乙烯)或酶綴合。氨基酸的化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)是例如氨基(賴氨酸，α-氨基)，硫醇基(胱氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸)，羧酸基(天冬氨酸，谷氨酸)和糖醇基。這樣的方法例如由aslamm.,anddent,a.,in“bioconjugation”,macmillanref.ltd.1999,pages50-100描述。

多肽和抗體的最常見的反應(yīng)基團(tuán)之一是氨基酸賴氨酸的脂肪族ε-胺。通常，幾乎所有的多肽和抗體都含有豐富的賴氨酸。賴氨酸胺是高于ph8.0(pka＝9.18)的相當(dāng)好的親核試劑，因此容易和干凈地與多種試劑反應(yīng)以形成穩(wěn)定的鍵。胺反應(yīng)性試劑主要與蛋白質(zhì)的賴氨酸和α-氨基反應(yīng)。反應(yīng)性酯，特別是n-羥基-琥珀酰亞胺(nhs)酯是用于修飾胺基的最常用的試劑。在水性環(huán)境中反應(yīng)的最佳ph為8.0至9.0。異硫氰酸酯是胺修飾試劑，并與蛋白質(zhì)形成硫脲鍵。它們在水溶液中與蛋白質(zhì)胺反應(yīng)(最適ph9.0-9.5)。醛在溫和的水性條件下與脂族和芳族胺，肼和酰肼反應(yīng)以形成亞胺中間體(席夫堿)。席夫堿可以用溫和或強(qiáng)還原劑(例如硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉)選擇性還原以得到穩(wěn)定的烷基胺鍵。已經(jīng)用于修飾胺的其它試劑是酸酐。例如，二亞乙基三胺五乙酸酐(dtpa)是含有兩個胺反應(yīng)性酸酐基團(tuán)的雙官能螯合劑。它可以與氨基酸的n-末端和ε-胺基反應(yīng)形成酰胺鍵。酸酐環(huán)打開以產(chǎn)生能夠與配位絡(luò)合物中的金屬緊密結(jié)合的多價金屬螯合臂。

多肽和抗體中的另一常見反應(yīng)性基團(tuán)是來自含硫氨基酸胱氨酸及其還原產(chǎn)物半胱氨酸(或半胱氨酸)的硫醇?xì)埢?。半胱氨酸含有游離硫醇基團(tuán)，其比胺更親核并且通常是蛋白質(zhì)中最具反應(yīng)性的官能團(tuán)。硫醇通常在中性ph下是反應(yīng)性的，因此可以在胺的存在下選擇性地與其它分子偶聯(lián)。由于游離巰基相對具有反應(yīng)性，具有這些基團(tuán)的蛋白質(zhì)通常以它們的氧化形式作為二硫化物基團(tuán)或二硫鍵存在。在這些蛋白質(zhì)中，需要用試劑例如二硫蘇糖醇(dtt)還原二硫鍵以產(chǎn)生反應(yīng)性游離巰基。硫醇反應(yīng)性試劑是將與多肽上的硫醇基偶聯(lián)，形成硫醚偶聯(lián)產(chǎn)物的試劑。這些試劑在弱酸性至中性ph下快速反應(yīng)，因此可以在胺基存在下選擇性地反應(yīng)。文獻(xiàn)報道了使用幾種硫醇化交聯(lián)劑如traut試劑(2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷)，琥珀酰亞胺基(乙酰硫基)乙酸酯(sata)和6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]己酸磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-lc-spdp)以提供通過反應(yīng)性氨基引入多個巰基的有效方式。鹵代乙酰基衍生物，例如碘乙酰胺，形成硫醚鍵，并且也是硫醇修飾的試劑。其它有用的試劑是馬來酰亞胺。馬來酰亞胺與硫醇反應(yīng)性試劑的反應(yīng)基本上與碘乙酰胺相同。馬來酰亞胺在微酸性至中性ph下快速反應(yīng)。

多肽和抗體中的另一常見反應(yīng)性基團(tuán)是羧酸。多肽和抗體在天冬氨酸和谷氨酸的c末端位置和側(cè)鏈中含有羧酸基團(tuán)。羧酸在水中的相對低的反應(yīng)性通常使得難以使用這些基團(tuán)選擇性修飾多肽和抗體。當(dāng)這樣做時，羧酸基團(tuán)通常通過使用水溶性碳二亞胺轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性酯并與親核試劑例如胺，酰肼或肼反應(yīng)。含胺試劑應(yīng)該是弱堿性的，以便在賴氨酸的更高堿性的ε-胺的存在下與活化的羧酸選擇性地反應(yīng)，以形成穩(wěn)定的酰胺鍵。當(dāng)ph升高到8.0以上時可發(fā)生蛋白質(zhì)交聯(lián)。

高碘酸鈉可用于將連接到抗體的碳水化合物部分內(nèi)的糖的醇部分氧化為醛。每個醛基可以如對羧酸所述與胺，酰肼或肼反應(yīng)。由于碳水化合物部分主要存在于抗體的可結(jié)晶片段(fc)區(qū)域上，可以通過將碳水化合物從抗原結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)修飾來實(shí)現(xiàn)綴合。形成席夫堿中間體，其可以通過用氰基硼氫化鈉(溫和和選擇性)或硼氫化鈉(強(qiáng))水溶性還原劑還原中間體而還原為烷基胺。

術(shù)語“樣品”包括但不限于來自生物或先前的生物的任何量的物質(zhì)。這樣的生物包括但不限于人，小鼠，猴，大鼠，兔子和其他動物。在一個實(shí)施方案中，樣品獲自猴，特別是食蟹猴，或兔，或小鼠，或大鼠或人。這樣的物質(zhì)包括但不限于在一個實(shí)施方案中來自個體的全血或血清，其是臨床常規(guī)中最廣泛使用的樣品來源。

術(shù)語“固相”表示非流體物質(zhì)，并且包括由諸如聚合物，金屬(順磁性，鐵磁性顆粒)，玻璃和陶瓷的材料制成的顆粒(包括微粒和珠)；凝膠物質(zhì)如二氧化硅，氧化鋁和聚合物凝膠；毛細(xì)管，其可以由聚合物，金屬，玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物質(zhì)；電極；微量滴定板；固體條；和比色皿，管或其他光譜儀樣品容器。固相組分與惰性固體表面的區(qū)別在于“固相”在其表面上含有至少一個部分，其旨在與樣品中的物質(zhì)相互作用。固相可以是固定組分，例如管，條，比色皿或微量滴定板，或者可以是非固定組分，例如珠粒和微粒?？梢允褂迷试S蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)的非共價或共價連接的多種微粒。這樣的顆粒包括聚合物顆粒，例如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金顆粒如金納米顆粒和金膠體；和陶瓷顆粒如二氧化硅，玻璃和金屬氧化物顆粒。參見例如martin,c.r.,etal.,analyticalchemistry-news&features,70(1998)322a-327a,或butler,j.e.,methods22(2000)4-23。

在一個實(shí)施方案中，從色原體(熒光或發(fā)光基團(tuán)和染料)，酶，nmr-活性基團(tuán)，金屬顆?；虬肟乖?例如地高辛)選擇可檢測標(biāo)記?？蓹z測標(biāo)記也可以是可光活化的交聯(lián)基團(tuán)，例如疊氮基或氮雜環(huán)丙烯基?？梢酝ㄟ^電化學(xué)發(fā)光檢測的金屬螯合物在一個實(shí)施方案中也是信號發(fā)射基團(tuán)，特別優(yōu)選釕螯合物，例如釕(雙吡啶基)3²⁺螯合物。合適的釕標(biāo)記基團(tuán)描述于例如ep0580979，wo90/05301，wo90/11511和wo92/14138中。

本文中報道了使用人fcγ受體i測定在包含哺乳動物血清的樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在和量的方法。

術(shù)語“人fcγ受體i”表示seqidno：01的跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白(也參見uniprot條目p12341，fcgr1a)。人fcγ受體i也稱為分化簇64(cd64)。它以高親和力結(jié)合免疫球蛋白γ的fc區(qū)。介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性和免疫復(fù)合物清除的人fcγ受體i在人和小鼠的免疫性和抗感染中起重要作用。在本文報道的免疫測定和方法中使用的人fcγ受體i可以是全長人fcγ受體i的fc區(qū)結(jié)合片段，例如，在一個實(shí)施方案中只有三個胞外結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，人fcγ受體i具有seqidno：01的氨基酸序列。在一個實(shí)施方案中，人fcγ受體i具有seqidno：02的氨基酸序列。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，人fcγ受體i具有seqidno：03的氨基酸序列。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得形成樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間的復(fù)合物，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

-通過可檢測標(biāo)記確定在前面步驟中形成的復(fù)合物。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的固相與包含哺乳動物血清的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟b)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的fab的固相與包含哺乳動物血清的樣品一起溫育(從而形成固相結(jié)合的fab-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的fab-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，

c)通過測定可檢測標(biāo)記的存在，來確定步驟b)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有efs-da特異性結(jié)合的抗原的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將其上固定有全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段的固相與步驟a)中獲得的樣品一起溫育(使得形成固相結(jié)合的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)將固相(其結(jié)合有步驟b)中形成的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)與所述藥物抗體的抗原一起溫育，由此所述抗原與可檢測標(biāo)記綴合，以及

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有針對藥物抗體的抗藥物抗體的固相與步驟a)中獲得的樣品進(jìn)行溫育(使得形成固相結(jié)合的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

本文報道的一個方面是用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的方法，其包括以下順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得針對形成樣品中存在的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間的復(fù)合物，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，

-通過可檢測標(biāo)記確定在前面步驟中形成的復(fù)合物。

本文報道的一個方面是人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定包含哺乳動物血清的樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在或量的用途。

在本文報道的免疫測定和方法中使用的一些化合物與結(jié)合對的成員綴合。在一個實(shí)施方案中，綴合通過經(jīng)由n-末端和/或ε-氨基(賴氨酸)，不同溶素的ε-氨基，化合物的氨基酸主鏈的羧基-，巰基-，羥基-和/或酚官能團(tuán)和/或化合物的碳水化合物結(jié)構(gòu)的糖醇基團(tuán)的化學(xué)結(jié)合進(jìn)行。在一個實(shí)施方案中，綴合的化合物是與結(jié)合對的成員綴合的至少兩種化合物的混合物，其中混合物中的至少兩種化合物在它們與結(jié)合對的成員綴合的位點(diǎn)不同。例如，混合物可以包含通過氨基酸主鏈的氨基酸的綴合和通過碳水化合物的糖醇基團(tuán)的綴合。此外，例如，混合物可以包含通過氨基酸主鏈的不同氨基酸殘基綴合至結(jié)合對的成員的化合物。表述“不同的氨基酸殘基”表示兩種不同種類的氨基酸，例如賴氨酸和天冬氨酸，或酪氨酸和谷氨酸，或在化合物的氨基酸序列中其位置不同的氨基酸主鏈的兩個氨基酸殘基。在后一種情況下，氨基酸可以是相同種類或不同種類。表達(dá)“位點(diǎn)不同”表示位點(diǎn)種類的差異，例如，氨基酸或糖醇基團(tuán)，或氨基酸主鏈的氨基酸數(shù)目的差異，例如，其中化合物與結(jié)合對的成員綴合。

如本文所用，重鏈和輕鏈的所有恒定區(qū)和結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置根據(jù)kabat,etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)中所述的kabat編號系統(tǒng)編號，并且在本文中被稱為“根據(jù)kabat編號”。具體地，kabat,etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991)的kabat編號系統(tǒng)(參見第647-660頁)用于κ和λ同種型的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域cl并且kabateu指數(shù)編號系統(tǒng)(參見第661-723頁)用于恒定重鏈結(jié)構(gòu)域(ch1，鉸鏈，ch2和ch3)。

本發(fā)明的具體實(shí)施方案

1.一種用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下列順序的步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成復(fù)合物，由此將全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

-通過可檢測標(biāo)記確定在前面步驟中形成的復(fù)合物。

2.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的固相與包含哺乳動物血清的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟b)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

3.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能被抑制的人或人源化藥物抗體的fab的固相與包含哺乳動物血清的樣品一起溫育(從而形成固相結(jié)合的fab-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的fab-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，

c)通過測定可檢測標(biāo)記的存在，來確定步驟b)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

4.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有efs-da特異性結(jié)合的抗原的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

5.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將其上固定有全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段的固相與步驟a)中獲得的樣品一起溫育(使得形成固相結(jié)合的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)將固相(其中結(jié)合有步驟b)中形成的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)與所述藥物抗體的抗原一起溫育，由此所述抗原與可檢測標(biāo)記綴合，以及

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

6.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的抗藥物抗體免疫測定法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有針對藥物抗體的抗藥物抗體的固相與步驟a)中獲得的樣品進(jìn)行溫育(使得形成固相結(jié)合的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b中形成的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

7.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的免疫測定法，其中每個溫育步驟之后是以下步驟：

-洗滌固相以除去未結(jié)合的化合物。

8.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的免疫測定法，其中所述測定法用于確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在和量，并包括作為最后步驟的：

-通過確定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在前一步驟中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，并通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線將測定的標(biāo)記的量與抗藥物抗體的量相關(guān)聯(lián)來確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的量。

9.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的免疫測定法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg1或igg4的。

10.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的免疫測定法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg1的，并且在兩個fc區(qū)多肽中具有突變l234a，l235a和p329g，或其中效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg4，并且在兩個fc區(qū)多肽(根據(jù)kabateu指標(biāo)編號)中均具有突變s228p，l235e和p329g。

11.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的免疫測定法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是雙特異性抗體。

12.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的免疫測定法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體不誘導(dǎo)adcc。

13.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的免疫測定法，其中所述哺乳動物血清是人血清或食蟹猴血清。

14.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的免疫測定法，其中所述哺乳動物血清從哺乳動物獲得，獲得樣品之前至少2天已經(jīng)對所述哺乳動物首次施用效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體。

15.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的免疫測定法，其中所述樣品包含0.5％(v/v)至8％(v/v)哺乳動物血清，優(yōu)選約2％(v/v)哺乳動物血清。

16.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)的免疫測定法，其中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體是igg類的。

17.根據(jù)前述項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的免疫測定法，其中所述標(biāo)記的存在和/或量使用酶聯(lián)顯色反應(yīng)，表面等離振子共振，電化學(xué)發(fā)光或放射免疫測定來測定。

18.一種用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的方法，其包括以下列順序的以下步驟：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成復(fù)合物，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

-通過可檢測標(biāo)記確定在前面步驟中形成的復(fù)合物。

19.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的方法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的固相與包含哺乳動物血清的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟b)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

20.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的方法，其包括以下順序的以下步驟：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能被抑制的人或人源化藥物抗體的fab的固相與包含哺乳動物血清的樣品一起溫育(從而形成固相結(jié)合的fab-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的fab-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，

c)通過測定可檢測標(biāo)記的存在，來確定步驟b)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

21.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的方法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有efs-da特異性結(jié)合的抗原的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

22.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的方法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將其上固定有全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段的固相與步驟a)中獲得的樣品一起溫育(使得形成固相結(jié)合的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)將固相(其中結(jié)合有步驟b)中形成的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)與所述藥物抗體的抗原一起溫育，由此所述抗原與可檢測標(biāo)記綴合，以及

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

23.用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的方法，其包括以下順序的以下步驟：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有針對藥物抗體的抗藥物抗體的固相與步驟a)中獲得的樣品進(jìn)行溫育(使得形成固相結(jié)合的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

24.根據(jù)項(xiàng)18至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中每個溫育步驟之后是以下步驟：

-洗滌固相以除去未結(jié)合的化合物。

25.根據(jù)項(xiàng)18至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述測定法用于確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在和量，并包括作為最后步驟的：

-通過確定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在前一步驟中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，并通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線將測定的標(biāo)記的量與抗藥物抗體的量相關(guān)聯(lián)來確定針對樣品中的效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的量。

26.根據(jù)項(xiàng)目18至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg1或igg4的。

27.根據(jù)項(xiàng)18至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg1，并且在兩個fc區(qū)多肽中具有突變l234a，l235a和p329g，或其中效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg4的，并且在兩個fc區(qū)多肽(根據(jù)kabateu指標(biāo)編號)中均具有突變s228p，l235e和p329g。

28.根據(jù)項(xiàng)18至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是雙特異性抗體。

29.根據(jù)項(xiàng)18至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體不誘導(dǎo)adcc。

30.根據(jù)項(xiàng)18至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物血清是人血清或食蟹猴血清。

31.根據(jù)項(xiàng)18至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動物血清從哺乳動物獲得，獲得樣品之前至少2天已經(jīng)對所述哺乳動物施用效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體。

32.根據(jù)項(xiàng)18至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包含0.5％(v/v)至8％(v/v)哺乳動物血清，優(yōu)選約2％(v/v)哺乳動物血清。

33.根據(jù)項(xiàng)18至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體是igg類的。

34.根據(jù)項(xiàng)18至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述標(biāo)記的存在和/或量使用酶聯(lián)顯色反應(yīng)，表面等離振子共振，電化學(xué)發(fā)光或放射免疫測定來測定。

35.人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定包含哺乳動物血清的樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在或量的用途。

36.人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在的用途，其包括：

-將包含哺乳動物血清的樣品與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段一起溫育，使得樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體和人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段之間形成復(fù)合物，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

-通過可檢測標(biāo)記確定在前面步驟中形成的復(fù)合物。

37.人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的用途，其包括：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的固相與包含哺乳動物血清的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟b)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

38.人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的用途，其包括：

a)將其上固定有效應(yīng)子功能被抑制的人或人源化藥物抗體的fab的固相與包含哺乳動物血清的樣品一起溫育(從而形成固相結(jié)合的fab-抗藥物抗體復(fù)合物)，

b)溫育(與步驟a)中形成的fab-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合的)固相與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

c)通過測定可檢測標(biāo)記的存在，來確定步驟b)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

39.人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的用途，其包括：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有efs-da特異性結(jié)合的抗原的固相與步驟a)中獲得的樣品溫育(從而形成固相結(jié)合的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗原-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

40.人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的用途，其包括：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將其上固定有全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段的固相與步驟a)中獲得的樣品一起溫育(使得形成固相結(jié)合的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)將固相(其中結(jié)合有步驟b)中形成的受體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)與所述藥物抗體的抗原一起溫育，由此所述抗原與可檢測標(biāo)記綴合，以及

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

41.人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段用于測定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在的用途，其包括：

a)向樣品中加入(過量)藥物抗體(以藥物-抗體-抗藥物抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移樣品中存在的(任何)抗藥物抗體)，其中所述樣品包含哺乳動物血清，

b)將固定有針對藥物抗體的抗藥物抗體的固相與步驟a)中獲得的樣品進(jìn)行溫育(使得形成固相結(jié)合的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物)，

c)溫育固相(與步驟b)中形成的抗藥物抗體-藥物抗體-抗藥物抗體復(fù)合物結(jié)合)與全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段，由此全長人fcγ受體i或其fc區(qū)結(jié)合片段與可檢測標(biāo)記綴合，和

d)通過測定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在步驟c)中固相結(jié)合復(fù)合物的形成，從而確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的存在。

42.根據(jù)項(xiàng)目35至41中任一項(xiàng)所述的用途，其中每次溫育之后

-洗滌固相以除去未結(jié)合的化合物。

43.根據(jù)項(xiàng)35至42中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述用途用于確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體(efs-da)的抗藥物抗體(ada)的存在和量，并包括作為最后步驟的：

-通過確定所述可檢測標(biāo)記的存在來確定在前一步驟中固相結(jié)合的復(fù)合物的形成，并通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線將測定的標(biāo)記的量與抗藥物抗體的量相關(guān)聯(lián)來確定樣品中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體的量。

44.根據(jù)項(xiàng)目35至43中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg1或igg4的。

45.根據(jù)項(xiàng)目35至44中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg1的，并且在兩個fc區(qū)多肽中具有突變l234a，l235a和p329g，或其中效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是人亞類igg4的，并且在兩個fc區(qū)多肽(根據(jù)kabateu指標(biāo)編號)中均具有突變s228p，l235e和p329g。

46.根據(jù)項(xiàng)目35至45中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體是雙特異性抗體。

47.根據(jù)項(xiàng)目35至46中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體不誘導(dǎo)adcc。

48.根據(jù)項(xiàng)目35至47中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述哺乳動物血清是人血清或食蟹猴血清。

49.根據(jù)項(xiàng)目35至48中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述哺乳動物血清從哺乳動物獲得，獲得樣品之前至少2天已經(jīng)對所述哺乳動物首次施用效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體。

50.根據(jù)項(xiàng)目35至49中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述樣品包含0.5％(v/v)至8％(v/v)哺乳動物血清，優(yōu)選約2％(v/v)哺乳動物血清。

51.根據(jù)項(xiàng)目35至50中任一項(xiàng)所述的用途，其中針對效應(yīng)子功能抑制的人或人源化藥物抗體的抗藥物抗體是igg類的。

52.根據(jù)項(xiàng)目35至51中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述標(biāo)記的存在和/或量使用酶聯(lián)顯色反應(yīng)，表面等離振子共振，電化學(xué)發(fā)光或放射免疫測定來測定。

53.根據(jù)項(xiàng)1至52中任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述人fcγ受體i具有seqidno：01的氨基酸序列。

54.根據(jù)項(xiàng)1至52中任一項(xiàng)所述的方法或用途，其中所述人fcγ受體i具有seqidno：02的氨基酸序列。

提供以下實(shí)施例和附圖以幫助理解本發(fā)明，其真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求中闡述。應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神的情況下，可以在所闡述的方法中進(jìn)行修改。

附圖說明

圖1使用根據(jù)本發(fā)明的人fcγri的抗藥物抗體測定的方案。

圖2使用常規(guī)橋接測定形式的抗藥物抗體測定方案。

圖3用根據(jù)本發(fā)明的抗藥物抗體測定法測定的十三個樣品的抗藥物抗體測定結(jié)果。

圖4用橋接抗藥物抗體測定法測定的十三個樣品的抗藥物抗體測定結(jié)果。

圖5使用根據(jù)本發(fā)明的人fcγri的抗藥物抗體測定方案。

圖6從根據(jù)本發(fā)明的抗藥物抗體測定法確定的一個實(shí)驗(yàn)動物獲得的十四個樣品的抗藥物抗體測定結(jié)果(x軸：第一次給藥后的時間)。

圖7從用常規(guī)橋接抗藥物抗體測定法確定的一個實(shí)驗(yàn)動物獲得的十四個樣品的抗藥物抗體測定結(jié)果(x軸：第一次給藥后的時間)。

圖8用根據(jù)本發(fā)明的測定法(1)和常規(guī)橋接測定(2)的測定法測定的抗藥物抗體測定結(jié)果的時間進(jìn)程；8a：動物1；8b：動物2；8c：動物3。

圖9使用根據(jù)本發(fā)明的人fcγri的抗藥物抗體測定的方案。

圖10使用根據(jù)本發(fā)明的人fcγri的抗藥物抗體測定方案。

圖11根據(jù)本發(fā)明用抗藥物抗體測定確定的十五個樣品的抗藥物抗體測定結(jié)果；左欄：未添加藥物，右欄：添加藥物(1μg/ml)。

圖12使用根據(jù)本發(fā)明的人fcγri的抗藥物抗體測定。

圖13用根據(jù)實(shí)施例1(1)的測定和根據(jù)實(shí)施例10(2)的測定獲得的結(jié)果的比較。

實(shí)施例1

使用人fcγri-檢測和通過生物素化藥物的藥物抗體捕獲的抗藥物抗體測定

在第一步中將生物素化的雙特異性效應(yīng)子功能沉默的抗ang2/vegf抗體結(jié)合于鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(sa-mtp)。通過洗滌除去過量的未結(jié)合的抗體。將摻加在食蟹猴血清中的樣品/標(biāo)準(zhǔn)品，例如單克隆抗獨(dú)特型抗vegf抗體m-1.17.5加入到用生物素化的抗ang2/vegf抗體包被的sa-mtp的孔中并溫育1小時。洗滌后，將孔與地高辛化的人fcγ受體i(fcγri，來自r&dsystems的非地高辛化fcγri，cat-no：1257-fc)溫育。洗滌后，用辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗地高辛抗體檢測結(jié)合的地高辛化的人fcγri。在進(jìn)一步的洗滌步驟后，加入abts底物。通過elisa讀數(shù)器在405nm波長(參考波長：490nm)測量信號。一式兩份測定每種血清樣品的吸光度值。該測定的方案描述于圖1中。

通過在樣品中摻入不同濃度的雙特異性抗ang2/vegf抗體并測定所得的消光來測定該測定法的藥物耐受性。結(jié)果顯示在下表中(列：抗ang2/vegf抗體濃度；行：m-1.17.5抗體濃度)。為了確定截止值，在同一平板上測量16個不同的單一未處理的空白食蟹猴血清樣品。截止值計算如下：單一血清的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍。對于該平板，截止值計算為0.1au。

實(shí)施例2(比較實(shí)施例)

橋接形式抗藥物抗體測定

在第一步中，將生物素化的抗ang2/vegf抗體，陽性對照抗體(pc；針對vegf和ang2的兩種抗獨(dú)特型抗體mab<id<ang2>m2.6.81-igg和mab<id<vegf>m-2.45.51的混合物(或者可以使用針對抗ang2/vegf抗體的多克隆抗獨(dú)特型抗體pab<id<ang2/vegf>>rb-igg)和樣品，以及第一檢測抗體(地高辛化抗-ang2/vegf抗體)在室溫(rt)下在微量滴定板(mtp)振蕩器上預(yù)溫育過夜。在第二步中，將預(yù)溫育的pc和樣品轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素蛋白包被的mtp(sa-mtp)。通過用300μl緩沖液洗滌三次來除去過量的未結(jié)合的抗體。洗滌后，用辣根過氧化物酶綴合的抗地高辛抗體檢測復(fù)合物結(jié)合的地高辛化的抗ang2/vegf抗體(在室溫下溫育1小時，500rpm振蕩)。在進(jìn)一步洗滌步驟(三次，300μl緩沖液)后，加入abts底物。通過elisa讀數(shù)器在405nm波長(參考波長：490nm)測量信號。一式三份測定每個血清樣品的吸光度值。該測定方案描述于圖2中。

通過在樣品中摻入不同濃度的雙特異性抗ang2/vegf抗體并測定所得的消光來測定該測定法的藥物耐受性。結(jié)果顯示在下表中(列：抗ang2/vegf抗體濃度；行：pc抗體濃度)。為了確定截止值，在同一平板上測量16種不同的單一未處理的空白食蟹猴血清樣品。截止值計算如下：單一血清的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍。對于該板，計算的截止值為0.045au。

實(shí)施例3

獼猴屬研究樣品的測量-根據(jù)本發(fā)明的抗藥物測定與常規(guī)橋接抗藥物抗體測定的比較

將不同動物的十三個樣品在低交聯(lián)緩沖液(candorbiosciencegmbh，wangen，germany)中稀釋至2％的血清量，隨后進(jìn)行如實(shí)施例1所述的測定。為了確定截止值，在同一平板上測量16個不同的單一未處理的空白食蟹猴血清樣品。截止值計算如下：單一血清的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍。

結(jié)果示于圖3中。對于十三個樣品中的八個，根據(jù)本發(fā)明的抗藥物抗體測定導(dǎo)致至少兩倍的截止值的讀數(shù)。其余樣品測定為陰性(讀數(shù)最多為截止值的50％)。

在如實(shí)施例2所述的抗藥物抗體橋接測定中處理相同的十三個樣品。

結(jié)果示于圖4。對于十三個樣品中的一個，橋接抗藥物抗體測定導(dǎo)致大約兩倍的截止值的讀出，并且對于十三個樣品中的四個，橋接抗藥物抗體測定導(dǎo)致在截止值和兩倍截止值之間的讀數(shù)。其余樣品測定為陰性(讀數(shù)大于截止值的50％)。

實(shí)施例4

用人fcγri-檢測和通過生物素化藥物的藥物抗體捕獲的抗藥物抗體測定

在第一步中將生物素化的效應(yīng)字沉默的抗cynocea抗體(<cyno-cea>pglala)il2綴合物固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(sa-mtp)上。通過洗滌除去過量的未結(jié)合的抗體。將樣品/標(biāo)準(zhǔn)品，例如在食蟹猴血清中摻加的多克隆兔抗獨(dú)特型抗cea抗體抗體加入到用生物素化的效應(yīng)子沉默的抗cynocea抗體包被的sa-mtp的孔中并溫育1小時。洗滌后，將孔與地高辛化的人fcγri一起溫育。洗滌后，用辣根過氧化物酶綴合的抗地高辛抗體檢測復(fù)合物結(jié)合的地高辛化人fcγri。在進(jìn)一步洗滌步驟后，加入abts底物。通過elisa讀數(shù)器在405nm波長(參考波長：490nm)測量信號。一式三份測定每個血清樣品的吸光度值。測定方案描述于圖5中。

實(shí)施例5

獼猴研究樣品的測量-根據(jù)本發(fā)明的抗藥物測定與常規(guī)橋接抗藥物抗體測定的比較

將不同動物的42個樣品在低交聯(lián)緩沖液(candorbiosciencegmbh，wangen，germany)中稀釋至2％的血清量，隨后進(jìn)行如實(shí)施例4所述的測定。在兩個平板上測量樣品。為了確定截止值，在每個平板上測量16種不同的單獼猴血清樣品。板特異性截止值計算如下：單個血清的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍。

來自第一平板上的相同動物的十四個樣品的示例性結(jié)果描繪于圖6中。對于第一平板的二十四個樣品中的八個，根據(jù)本發(fā)明的抗藥物抗體測定導(dǎo)致高于截至值的顯著正讀數(shù)。其余樣品被確定為陰性(讀數(shù)顯著低于截止值)。

在如實(shí)施例2所述的抗藥物抗體橋接測定中處理相同的20個樣品。

在圖7中描述了圖6所示的相同十四個樣品的結(jié)果。對于二十個樣品中的十二個，橋接抗藥物抗體測定產(chǎn)生陽性。其余樣品測定為陰性(在截止值以下讀出)。

第二板包括兩只動物的二十三個樣品。這些樣品也在橋接抗藥物抗體測定中進(jìn)行分析。對于二十三個樣品中的十二個，根據(jù)本發(fā)明的抗藥物抗體測定得到陽性讀數(shù)。其余樣品測定為陰性(在截止值以下讀出)。在橋接抗藥物抗體測定中測量這些二十三個樣品得到相同的十二個陽性樣品。

使用本文報道的測定和常規(guī)橋接測定獲得的三種不同動物的比較結(jié)果顯示在圖8a至8c中，降低至相同的規(guī)模。

對于第一動物，使用根據(jù)本發(fā)明的測定法和橋接抗藥物抗體測定法分析起始樣品和在施用藥物后長達(dá)四周在不同時間點(diǎn)取得的十四個樣品。

可以看出，使用橋接抗藥物抗體測定，對于在約100小時取得的樣品確定響應(yīng)最大值。使用根據(jù)本發(fā)明的抗藥物抗體測定，可以看到讀數(shù)的連續(xù)增加。

對于第二動物，使用根據(jù)本發(fā)明的測定法和橋接抗藥物抗體測定法分析起始樣品和在施用藥物后長達(dá)三周的不同時間點(diǎn)的10個樣品。結(jié)果示于圖8b中?？梢钥闯觯瑑煞N測定在給藥后約200小時顯示相同的讀數(shù)增加。在給藥后直到504小時，可以觀察到兩種測定之間的讀數(shù)沒有顯著差異。

對于第三動物，使用根據(jù)本發(fā)明的測定法和橋接抗藥物抗體測定法分析起始樣品和在施用藥物后長達(dá)四周的不同時間點(diǎn)的11個樣品。結(jié)果示于圖8c中。可以看出，兩種測定在給藥后約72小時顯示相同的讀數(shù)增加。然而，使用根據(jù)本發(fā)明的抗藥物抗體測定，這種增加更強(qiáng)。在給藥后約162小時可觀察到兩種測定的第二次增加，導(dǎo)致兩種測定的大致相同的讀數(shù)。

實(shí)施例6

用人fcγri-檢測和通過抗原的藥物抗體捕獲的抗藥物抗體測定

在第一步中將生物素化的vegf結(jié)合到鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(sa-mtp)上。通過洗滌除去過量的未結(jié)合的抗原。同時，通過在單克隆抗獨(dú)特型抗vegf抗體抗體m-1.17.5的稀釋系列中預(yù)溫育在食蟹猴血清中摻入的單克隆抗ang2/vegf抗體制備標(biāo)準(zhǔn)品。所有樣品制備兩次。樣品以1:50稀釋在i)低交聯(lián)緩沖液中，和ii)在含有1μg/ml單克隆抗ang2/vegf抗體的低交聯(lián)緩沖液中。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入vegf包被的sa-mtp的孔中并溫育1小時。洗滌后，將孔與地高辛化的人fcγri一起溫育。洗滌后，用辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗地高辛抗體檢測復(fù)合物結(jié)合的地高辛化人fcγri。在進(jìn)一步的洗滌步驟后，加入hrp底物abts。通過elisa讀數(shù)器在405nm波長(參考波長：490nm)測量信號。每個血清樣品的吸光度值一式三份測定。測定方案描述于圖9中。

實(shí)施例7

用人fcγri檢測和通過抗獨(dú)特型抗體的藥物抗體捕獲的抗藥物抗體測定

在第一步中將生物素化的單克隆抗獨(dú)特型抗vegf抗體抗體結(jié)合到鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(sa-mtp)的孔上。通過洗滌除去過量的未結(jié)合的抗體。通過將稀釋系列中的單克隆抗獨(dú)特型抗-vegf抗體m-1.17.5與摻加在食蟹猴血清中的單克隆抗ang2/vegf抗體預(yù)溫育來制備標(biāo)準(zhǔn)品。所有樣品制備兩次。樣品以1:50稀釋在i)低交聯(lián)緩沖液中，和ii)含有1μg/ml單克隆抗ang2/vegf抗體的低交聯(lián)緩沖液中。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入到vegf包被的sa-mtp的孔中并溫育1小時。洗滌后，將孔與地高辛化的人fcγri一起溫育。洗滌后，用辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗地高辛抗體檢測復(fù)合物結(jié)合的地高辛化人fcγri。在進(jìn)一步的洗滌步驟后，抗體-酶綴合物的hrp催化abts底物的顯色反應(yīng)。通過elisa讀數(shù)器在405nm波長(參考波長：490nm)測量信號。一式三份測定每個血清樣品的吸光度值。測定方案描述于圖10中。

實(shí)施例8

用人fcγri-檢測和通過抗獨(dú)特型抗體的藥物抗體捕獲進(jìn)行抗藥物抗體測定的藥物耐受性

通過在樣品中摻入不同濃度的雙特異性抗ang2/vegf抗體并測定所得的消光來測定該測定的藥物耐受性。結(jié)果顯示在下表中(列：抗ang2/vegf抗體濃度；行：m-1.17.5抗體濃度)。為了確定截止值，在同一平板上測量16個不同的單一未處理的空白食蟹猴血清樣品。截止值計算如下：單一血清的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍。對于該板，計算的截止值為0.13au。

實(shí)施例9

獼猴研究樣品的測量-在存在和不存在藥物的情況下根據(jù)本發(fā)明的測定法測定抗藥物抗體

將不同動物的十五個樣品在低交聯(lián)緩沖液(candorbiosciencegmbh，wangen，germany)中稀釋至2％的血清量。從每種稀釋液制備兩個樣品。將第一樣品進(jìn)行如實(shí)施例7所述的測定，第二樣品摻入1μg/ml單克隆抗ang2/vegf抗體，然后如實(shí)施例7所述進(jìn)行測定。為了確定截止值，在同一板上測量16個不同的單一食蟹猴血清樣品。截止值計算如下：單一血清的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍。結(jié)果示于圖11中。

實(shí)施例10

使用人fcγri-檢測和通過藥物的生物素化f(ab')2片段的藥物抗體捕獲進(jìn)行抗藥物抗體測定

在第一步中將抗ang2/vegf抗體的生物素化的雙特異性f(ab′)2片段與鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板(sa-mtp)結(jié)合。通過洗滌除去過量的未結(jié)合的抗體。將樣品/標(biāo)準(zhǔn)品，例如摻加在10％人池血清中的單克隆抗獨(dú)特型抗vegf抗體抗體m-1.17.5加入到用生物素化的抗ang2/vegf抗體f(ab′)2片段包被的sa-mtp的孔中并溫育一小時。洗滌后，將孔與地高辛化的人fcγri一起溫育。洗滌后，用辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗地高辛抗體檢測結(jié)合的地高辛化的人fcγri。在進(jìn)一步的洗滌步驟后，加入abts底物。通過elisa讀數(shù)器在405nm波長(參考波長：490nm)測量信號。一式兩份測定每種血清樣品的吸光度值。測定方案示于圖12中。圖13顯示與如實(shí)施例1中所述測量的相同樣品相比較的測定結(jié)果。

實(shí)施例11

用fcγri-檢測和通過生物素化藥物的藥物捕獲測定用于ada測定的寡聚靶的干擾

測試如實(shí)施例1,2和7中所述的測定的寡聚靶vegf和ang2的干擾。將靶標(biāo)在100％食蟹猴池血漿中從100ng/ml稀釋至0.048ng/ml，并在測定中測試。結(jié)果示于下表中。

實(shí)施例12

通過表面等離振子共振評價hufcγri的結(jié)合/特異性

所有測量使用t100儀器使用sa-cap-芯片進(jìn)行。除非另有說明，所有溫育在25℃下在hbs緩沖液(hepes，nacl，ph7.4)中進(jìn)行。在第一步中，通過以2μl/min注射sa-cap試劑300秒，用飽和量的鏈霉抗生物素蛋白包被芯片。通過以10μl/min注射包含10μg/mlhufcγri-bi的溶液60秒來實(shí)現(xiàn)用生物素化的人fcγ受體i(hufcγri)包被芯片。隨后，以流速30μl/min注射不同的樣品60秒。注射后測量信號。為了消除非特異性結(jié)合，使用參考流動池來測量沒有固定的hufcyri的相同樣品。從測量流動池的信號中減去參考流動池的信號。所有動物血清在hbs-p緩沖液中1:100稀釋。將純化的蛋白質(zhì)各自稀釋至10μg/ml的濃度。使用來自的biaevaluation軟件計算注射結(jié)束后的參考扣除的應(yīng)答信號。