確定循環(huán)RNA的分布譜的方法與流程
相關(guān)申請的交叉引用
本申請依據(jù)35u.s.c.§119要求于2014年9月3日提交的臨時(shí)申請?zhí)?2/045,503的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。
政府許可權(quán)
本發(fā)明是由國家科學(xué)基金會(huì)(nationalsciencefoundation)授予的授權(quán)號(hào)che-1057113和dge-0813967的政府支持下進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中享有一定的權(quán)利。
本公開內(nèi)容提供了基于循環(huán)微rna、病毒rna和長非編碼rna(long-non-codingrna，lncrna)的相關(guān)載體分子來對其進(jìn)行快速分級(jí)的方法。本公開內(nèi)容還提供了，本公開內(nèi)容的方法可用于通過鑒定與病癥和特定載體相關(guān)的特定微rna、lncrna和病毒rna標(biāo)志物來在受試者中診斷病癥。
背景技術(shù)：
已認(rèn)為循環(huán)微rna是用于疾病診斷的良好生物標(biāo)志物，因?yàn)槠淇杀徊∽兊募?xì)胞，例如癌細(xì)胞特異性分泌。考慮到微rna在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的關(guān)鍵作用，微rna的活性分泌可與疾病發(fā)展密切相關(guān)。
通常，從患者的血清提取總微rna，并分析表達(dá)譜以觀察是否能用模式指示疾病階段。但是，盡管已進(jìn)行了大量篩選，但是這樣的模式并尚未揭示非常令人信服的mirna標(biāo)志物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本公開內(nèi)容提供了一種用于確定樣品中循環(huán)rna的分布的分級(jí)方法，其包括：將從受試者獲得的生物流體樣品分級(jí)成至少包含外泌體級(jí)分、蛋白質(zhì)級(jí)分和脂蛋白級(jí)分的級(jí)分，其中每個(gè)級(jí)分包含rna載體；以及確定或定量各所述級(jí)分中的rna以產(chǎn)生所述樣品中所述rna針對所述rna載體的分布譜。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分級(jí)通過進(jìn)行非對稱流場流分級(jí)(asymmetricalflowfield-flowfractionation)(af4)并收集多份洗脫液來進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分級(jí)通過基于芯片的微流體系統(tǒng)來進(jìn)行。在前述任一實(shí)施方案的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物流體樣品是血清樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用厚度為約0.350mm且頂端到頂端長度(tip-to-tiplength)為約275mm的、入口三角形寬度為約20mm且出口寬度為約5mm的梯形分離通來分級(jí)血清樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，積聚壁的表面積為約3160mm2，分子量截止值為10kda。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多份洗脫液在20至25分鐘的時(shí)間內(nèi)作為1分鐘洗脫液進(jìn)行收集。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從所述多份洗脫液產(chǎn)生所述生物流體樣品的至少6個(gè)級(jí)分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述6個(gè)級(jí)分由合并在6個(gè)單獨(dú)且非重疊的時(shí)間段內(nèi)收集的1分鐘洗脫液獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述6個(gè)級(jí)分中的每一個(gè)都富集具有特定流體動(dòng)力學(xué)直徑的rna載體蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述級(jí)分富集蛋白質(zhì)、高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)和外泌體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過深度測序或rt-qpcr來確定或定量所述rna。在前述任意實(shí)施方案的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述rna包括微rna或lncrna，或病毒rna。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微rna或lncrna或病毒rna是與疾病或病癥相關(guān)的生物標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是乳腺癌。在前述任意實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，所述rna為包含seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的序列的微rna。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述rna選自由以下各項(xiàng)組成的組：let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、mir-1、mir-100、mir-101、mir-103、mir-105、mir-106a、mir-106b、mir-107、mir-10a、mir-10b、mir-122a、mir-124a、mir-125a、mir-125b、mir-126、mir-126*、mir-127、mir-128a、mir-128b、mir-129、mir-130a、mir-130b、mir-132、mir-133a、mir-133b、mir-134、mir-135a、mir-135b、mir-136、mir-137、mir-138、mir-139、mir-140、mir-141、mir-142-3p、mir-142-5p、mir-143、mir-144、mir-145、mir-146a、mir-146b、mir-147、mir-148a、mir-148b、mir-149、mir-150、mir-151、mir-152、mir-153、mir-154、mir-154*、mir-155、mir-15a、mir-15b、mir-16、mir-17-3p、mir-17-5p、mir-181a、mir-181b、mir-181c、mir-181d、mir-182、mir-182*、mir-183、mir-184、mir-185、mir-186、mir-187、mir-188、mir-189、mir-18a、mir-18a*、mir-18b、mir-190、mir-191、mir-191*、mir-192、mir-193a、mir-193b、mir-194、mir-195、mir-196a、mir-196b、mir-197、mir-198、mir-199a、mir-199a*、mir-199b、mir-19a、mir-19b、mir-200a、mir-200a*、mir-200b、mir-200c、mir-202、mir-202*、mir-203、mir-204、mir-205、mir-206、mir-208、mir-20a、mir-20b、mir-21、mir-210、mir-211、mir-212、mir-213、mir-214、mir-215、mir-216、mir-217、mir-218、mir-219、mir-22、mir-220、mir-221、mir-222、mir-223、mir-224、mir-23a、mir-23b、mir-24、mir-25、mir-26a、mir-26b、mir-27a、mir-27b、mir-28、mir-296、mir-299-3p、mir-299-5p、mir-29a、mir-29b、mir-29c、mir-301、mir-302a、mir-302a*、mir-302b、mir-302b*、mir-302c、mir-302c*、mir-302d、mir-30a-3p、mir-30a-5p、mir-30b、mir-30c、mir-30d、mir-30e-3p、mir-30e-5p、mir-31、mir-32、mir-320、mir-323、mir-324-3p、mir-324-5p、mir-325、mir-326、mir-328、mir-329、mir-33、mir-330、mir-331、mir-335、mir-337、mir-338、mir-339、mir-33b、mir-340、mir-342、mir-345、mir-346、mir-34a、mir-34b、mir-34c、mir-361、mir-362、mir-363、mir-363*、mir-365、mir-367、mir-368、mir-369-3p、mir-369-5p、mir-370、mir-371、mir-372、mir-373、mir-373*、mir-374、mir-375、mir-376a、mir-376a*、mir-376b、mir-377、mir-378、mir-379、mir-380-3p、mir-380-5p、mir-381、mir-382、mir-383、mir-384、mir-409-3p、mir-409-5p、mir-410、mir-411、mir-412、mir-421、mir-422a、mir-422b、mir-423、mir-424、mir-425、mir-425-5p、mir-429、mir-431、mir-432、mir-432*、mir-433、mir-448、mir-449、mir-450、mir-451、mir-452、mir-452*、mir-453、mir-455、mir-483、mir-484、mir-485-3p、mir-485-5p、mir-486、mir-487a、mir-487b、mir-488、mir-489、mir-490、mir-491、mir-492、mir-493、mir-493-3p、mir-494、mir-495、mir-496、mir-497、mir-498、mir-499、mir-500、mir-501、mir-502、mir-503、mir-504、mir-505、mir-506、mir-507、mir-508、mir-509、mir-510、mir-511、mir-512-3p、mir-512-5p、mir-513、mir-514、mir-515-3p、mir-515-5p、mir-516-3p、mir-516-5p、mir-517*、mir-517a、mir-517b、mir-517c、mir-518a、mir-518a-2*、mir-518b、mir-518c、mir-518c*、mir-518d、mir-518e、mir-518f、mir-518f*、mir-519a、mir-519b、mir-519c、mir-519d、mir-519e、mir-519e*、mir-520a、mir-520a*、mir-520b、mir-520c、mir-520d、mir-520d*、mir-520e、mir-520f、mir-520g、mir-520h、mir-521、mir-522、mir-523、mir-524、mir-524*、mir-525、mir-525*、mir-526a、mir-526b、mir-526b*、mir-526c、mir-527、mir-532、mir-542-3p、mir-542-5p、mir-544、mir-545、mir-548a、mir-548b、mir-548c、mir-548d、mir-549、mir-550、mir-551a、mir-552、mir-553、mir-554、mir-555、mir-556、mir-557、mir-558、mir-559、mir-560、mir-561、mir-562、mir-563、mir-564、mir-565、mir-566、mir-567、mir-568、mir-569、mir-570、mir-571、mir-572、mir-573、mir-574、mir-575、mir-576、mir-577、mir-578、mir-579、mir-580、mir-581、mir-582、mir-583、mir-584、mir-585、mir-586、mir-587、mir-588、mir-589、mir-590、mir-591、mir-592、mir-593、mir-594、mir-595、mir-596、mir-597、mir-598、mir-599、mir-600、mir-601、mir-602、mir-603、mir-604、mir-605、mir-606、mir-607、mir-608、mir-609、mir-610、mir-611、mir-612、mir-613、mir-614、mir-615、mir-616、mir-617、mir-618、mir-619、mir-620、mir-621、mir-622、mir-623、mir-624、mir-625、mir-626、mir-627、mir-628、mir-629、mir-630、mir-631、mir-632、mir-633、mir-634、mir-635、mir-636、mir-637、mir-638、mir-639、mir-640、mir-641、mir-642、mir-643、mir-644、mir-645、mir-646、mir-647、mir-648、mir-649、mir-650、mir-651、mir-652、mir-653、mir-654、mir-655、mir-656、mir-657、mir-658、mir-659、mir-660、mir-661、mir-662、mir-663、mir-7、mir-9、mir-9*、mir-92、mir-93、mir-95、mir-96、mir-98、mir-99a、mir-99b及其任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基于芯片的微流體系統(tǒng)包括：微流體芯片，所述微流體芯片包括至少3個(gè)通道，至少3個(gè)儲(chǔ)存器和樣品儲(chǔ)存器，其中所述通道與所述至少3個(gè)儲(chǔ)存器和樣品儲(chǔ)存器流體連通；第一珠試劑，所述第一珠試劑包含磁珠和與抗原或外泌體相互作用的抗體；以及第二珠試劑，所述第二珠試劑包含帶陽離子電荷的珠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是抗cd63抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括：(i)向樣品儲(chǔ)存器添加血清：(a)向樣品儲(chǔ)存器添加第一珠試劑；向樣品儲(chǔ)存器施加磁場并用磁場將第一珠試劑移動(dòng)通過至少3個(gè)通道中的第一通道至至少3個(gè)儲(chǔ)存器中的第一儲(chǔ)存器；在第一儲(chǔ)存器中破裂外泌體；移除第一珠試劑；向第一儲(chǔ)存器添加第二珠試劑；(b)向樣品儲(chǔ)存器添加guhcl、kcl和洗滌劑以使rna與蛋白質(zhì)解離；向樣品儲(chǔ)存器添加第二珠試劑以結(jié)合rna；將第二珠試劑移動(dòng)通過至少3個(gè)通道中的第二通道至所述至少3個(gè)儲(chǔ)存器中的第二儲(chǔ)存器；以及(c)向樣品儲(chǔ)存器添加硫氰酸胍、洗滌劑和乙醇以使rna與脂蛋白解離；向樣品儲(chǔ)存器添加第二珠試劑以結(jié)合rna；將第二珠試劑移動(dòng)通過至少3個(gè)通道中的第三通道至所述至少3個(gè)儲(chǔ)存器中的第三儲(chǔ)存器；(ii)從第一、第二和第三儲(chǔ)存器的每一個(gè)提取rna。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括能夠破壞蛋白質(zhì)-rna相互作用或脂蛋白復(fù)合物的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑是表面活性劑、有機(jī)溶劑、離液鹽的混合物。
本公開內(nèi)容還提供了一種用于診斷受試者是否患有病癥的方法，其包括在一個(gè)或更多個(gè)健康受試者和一個(gè)或更多個(gè)患有所述病癥的受試者之間比較通過使用前述任意實(shí)施方案的方法獲得的循環(huán)rna的分布，其中差異鑒定疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
本公開內(nèi)容還提供了一種用于進(jìn)行本文中所述的任一種方法的試劑盒，其中所述試劑盒被隔室化(compartmentalized)以包含用于進(jìn)行所述方法的試劑和裝置。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含微流體裝置、第一珠試劑、第二珠試劑和能夠破壞蛋白質(zhì)-rna相互作用或能夠破壞脂蛋白復(fù)合物的試劑。
本公開內(nèi)容提供了基于相關(guān)載體的類型來快速分級(jí)循環(huán)微rna(mirna)的方法。將分級(jí)的mirna收集，鑒定并通過rt-qpcr定量。然后獲得各靶向mirna的分布譜。本文中公開的方法以快速分級(jí)、高回收率并且具有破壞mirna和其載體之間的結(jié)合的低可能性為特征。此外，本公開內(nèi)容的方法能夠?qū)崿F(xiàn)不同載體中mirna的位置的綜合譜分析，這可揭示用于病癥診斷的更靈敏且特異性的微rna標(biāo)志物。分布譜包含用于解釋微rna的分泌和運(yùn)輸途徑以及其在疾病發(fā)展中的作用的更豐富的信息。比較從健康受試者和患有疾病的患者收集的循環(huán)mirna的分布譜不僅可以揭示哪些mirna與病癥相關(guān)，而且還可基于哪種載體與mirna相關(guān)來指示病癥的階段。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了一種用于確定樣品中循環(huán)mirna的分布的快速分級(jí)方法，其包括：通過對從受試者獲得的血清樣品進(jìn)行非對稱流動(dòng)場流分級(jí)(af4)并收集多種洗脫液來分級(jí)該樣品；將多份洗脫液合并成級(jí)分，其中各級(jí)分富集不同的mirna載體；定量各收集級(jí)分中mirna組的水平以生成樣品中mirna針對載體的分布譜；以及確定樣品中循環(huán)mirna的分布。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用厚度為約0.350mm且頂端至頂端長度為約275mm的、入口三角形寬度約20mm且出口寬度約5mm的梯形分離通道來分級(jí)血清樣品。在又一個(gè)實(shí)施方案中，af4積聚壁的表面積為約3160mm2，分子量截止值為10kda。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多份洗脫液在20至25分鐘的時(shí)間內(nèi)作為1分鐘的洗脫液被收集。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從多份洗脫液產(chǎn)生血清樣品的至少6個(gè)級(jí)分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述6個(gè)級(jí)分由合并在6個(gè)單獨(dú)且非重疊的時(shí)間段內(nèi)收集的1分鐘洗脫液獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述6個(gè)級(jí)分中的每一個(gè)富集具有特定流體動(dòng)力學(xué)直徑的mirna載體蛋白質(zhì)。
在一特定實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法包括富集選自高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)和外泌體的mirna載體蛋白的級(jí)分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文中公開的方法包括通過使用rt-qpcr來定量mirna。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法包括為與病癥相關(guān)的生物標(biāo)志物的mirna組，所述病癥例如癌癥、糖尿病、肥胖、癲癇、肝病(例如nash或nafld)、冠狀動(dòng)脈病、阿爾茨海默病、多囊性卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位、腎病(例如，微小病變疾病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法包括與乳腺癌相關(guān)的生物標(biāo)志物的微rna組，例如包含seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的序列的那些微rna。
在一特定實(shí)施方案中，本文中公開的方法可用于診斷受試者是否患有病癥，其包括：將通過使用本公開內(nèi)容的方法獲得的循環(huán)rna分布與通過使用相同方法獲得的來自一個(gè)或更多個(gè)健康受試者和一個(gè)或更多個(gè)患有該病癥的受試者的循環(huán)微rna的分布進(jìn)行比較。
附圖說明
圖1a至e提供了使用外泌體分離物來優(yōu)化af4流動(dòng)譜。(a)3.0ml/分鐘橫流速和0.3ml/分鐘檢測器流速的恒流速。(b)af4后收集(橫流關(guān)閉)。(c-e)在30分鐘(c)、20分鐘(d)和15分鐘(e)內(nèi)將橫流速從3.0ml/分鐘緩降至零橫流速。所有樣品的吸光度檢測均在280nm下測量。所有分離物均由健康人男性庫血清制備。(f)描繪了顯示對應(yīng)于不同級(jí)分的mirna水平的圖，各級(jí)分與不同的rna載體或載體組相關(guān)，對于每種mirna標(biāo)志物，級(jí)分f1至f6對應(yīng)于從左到右的列。
圖2a至b示出了(a)蛋白質(zhì)和納米顆粒標(biāo)準(zhǔn)物的af4；以及(b)外泌體分離物和脂蛋白復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)物的af4。所有樣品通過在280nm下的吸光度來檢測。外泌體分離物由健康人男性庫血清制備。
圖3顯示在af4分離開始時(shí)添加5-分鐘恒流區(qū)提高外泌體分離物中分析物的分辨率。該方法的af4流動(dòng)譜包括5分鐘的3.0ml/分鐘橫流速和0.3ml/分鐘檢測器流速，之后將橫流速從3.0ml/分鐘以15分鐘緩降至零流速。吸光度檢測在280nm下進(jìn)行。
圖4a至b示出了(a)在摻加hdl或ldl之前和之后血清的分級(jí)圖(fractogram)(280nm下的uv吸收)；和(b)在dio染色之后血清和外泌體提取物的分級(jí)圖(用480ex/510em通過熒光檢測)的比較。
圖5示出了來自健康個(gè)體(對照)和bc患者(病例)的血清樣品的分級(jí)圖。表格示出了各收集級(jí)分的時(shí)間范圍，以及各級(jí)分的峰洗脫時(shí)間的rsd值。n/a意指級(jí)分中沒有明顯的峰。
圖6a至d提供了健康血清樣品的(a)吸光度和(b)經(jīng)dio染色的熒光分級(jí)圖。黑色-對照1，紅色-對照2。來自bc患者的血清樣品的(c)吸光度和經(jīng)(d)dio染色的熒光分?jǐn)?shù)圖。黑色–病例#1，紅色–病例#2。所有的吸光度測量均在280nm下進(jìn)行。所有的熒光分級(jí)圖均在485nm的激發(fā)和510nm的發(fā)射下測量。樣品使用優(yōu)化的af4分級(jí)方案進(jìn)行分級(jí)。
圖7a至b提供了(a)af4級(jí)分中的所選脂蛋白的譜計(jì)數(shù)結(jié)果；和(b)所收集級(jí)分中cd-63的elisa檢測。
圖8示出了從純血清或af4級(jí)分的hsa-mir-16的回收。
圖9a至c示出了(a)從一個(gè)乳腺癌患者(病例#1)收集的血清中8種受試mirna的分布譜；(b)對照和病例之間的mirna拷貝的平均log值的變化(計(jì)數(shù)每組中所有四個(gè)測試-2個(gè)樣本，2個(gè)重復(fù))?！?”標(biāo)記出顯示在健康供體(對照組)與bc患者(病例)之間具有p<0.05的顯著差異的那些；和(c)如本文指出的通過對某些分級(jí)中mir-16、-17、-375和-122的mirna量進(jìn)行pca獲得的主成分1相對于主成分2的評分圖。任意圓圈示出了對照組和病例組之間的分離。
圖10a至c提供了對于各級(jí)分的每個(gè)樣品的rt-qpcr分析。(a)對照1、(b)對照2和(c)病例2?；诿總€(gè)樣品中存在的cel-mir-67的拷貝數(shù)來歸一化針對每個(gè)的計(jì)算拷貝數(shù)。y軸是mirna的拷貝數(shù)的對數(shù)值。
圖11示出了芯片上mirna分布譜分析技術(shù)的總體設(shè)計(jì)的示意圖。
圖12示出了用于本公開內(nèi)容的方法和系統(tǒng)的示例性微流體裝置。示出了總共3個(gè)通道，每個(gè)通道專用于一種類型的載體。第一通道用于提取蛋白質(zhì)結(jié)合的rna，第二通道用于脂蛋白締合的rna，第三通道用于外泌體rna。為了防止不期望且非特異性的rna或血清組分吸附，可用八甲基硅氧烷改性裝置表面以具有高疏水性和惰性。
圖13示出了制造本公開內(nèi)容的微流體裝置的方法。
圖14示出了用于從樣品獲得外泌體級(jí)分的珠及其設(shè)計(jì)的實(shí)例。
圖15示出了用于獲得蛋白質(zhì)和脂蛋白級(jí)分的珠及其設(shè)計(jì)的實(shí)例。
圖16a至d示出了不同的分離跡線。(a)用于分析外泌體的由熒光檢測器收集的af4分離跡線(分級(jí)圖)，所述外泌體如在我們的微芯片譜分析技術(shù)中所進(jìn)行的通過免疫珠(虛線)分離和通過invitrogen試劑盒(實(shí)線)分離。
(b)上圖：通過af4在血清分離期間收集的級(jí)分(通過uv吸收進(jìn)行檢測)。將收集的洗脫液干燥并收集蛋白質(zhì)用于通過elisa進(jìn)行cd63定量，結(jié)果顯示在下面的柱形圖中。量為三次重復(fù)測量的平均值，誤差棒是標(biāo)準(zhǔn)偏差。(c)通過免疫珠分離方法和invitrogen試劑盒制備的外泌體中cd63濃度的比較。(d)在用破裂溶液處理之前(實(shí)線)和之后(方形點(diǎn))通過免疫珠分離的外泌體的分級(jí)圖。熒光檢測通過dio染色和480ex/510em的熒光進(jìn)行。
圖17示出了在用蛋白質(zhì)破壞溶液處理之前(實(shí)線)和之后(方形點(diǎn))以及通過脂蛋白破壞溶液(點(diǎn)劃線)的去外泌體血清的分級(jí)圖。實(shí)線塊突出了hdl標(biāo)準(zhǔn)物將被洗脫的位置，方形點(diǎn)塊表示ldl標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫窗口。熒光檢測通過dio染色和480ex/510em的熒光進(jìn)行。
圖18示出了使用本公開內(nèi)容的基于珠的提取方法以及商業(yè)試劑盒的血清中摻加的mirna的百分比回收的比較，所述商業(yè)試劑盒包括具有不同持續(xù)時(shí)間的trizolls試劑、genejetrna純化試劑盒和purelinkrna試劑盒，所述試劑盒全部均由thermofisher發(fā)售。
圖19a至c示出了由芯片上和基于af4的分布譜分析獲得的以及由使用抗體綴合的磁珠免疫捕獲獲得的mirna拷貝的比較。在比較中選擇四種mirna。(a)購自sigma的健康血清的、從微芯片上的通道1和從af4分離的級(jí)分1中回收的蛋白質(zhì)結(jié)合的mirna。(b)通過微芯片上的通道3、通過invitrogen總外泌體分離試劑盒和在來自af4分離的級(jí)分6中回收的外泌體mirna。來自af4和來自invitrogen試劑盒的外泌體用trizolls試劑進(jìn)行處理。(c)在微芯片上的通道2中獲得的脂蛋白締合mirna，加上從af4分離的級(jí)分2-5獲得的脂蛋白締合mirna和用與抗hdl/ldligg綴合的免疫珠獲得的脂蛋白締合mirna。
圖20a至d示出了從一個(gè)患者(a)和一個(gè)健康個(gè)體(b)收集的血清的分布譜。(c)所有7個(gè)病例中的平均mirna含量與來自3個(gè)對照的平均值的比值，其見于全部三個(gè)級(jí)分中(白色、灰色和黑色柱)，相比見于所有級(jí)分的總mirna含量中的比值(圖案化)。(d)所有樣品的pc1相對于pc2的評分圖。病例示為黑色圓圈，對照為紅色三角形。
具體實(shí)施方式
除非上下文清楚地另外指出，否則本文和所附權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“a/an(一)”和“所述”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及“級(jí)分”包括多個(gè)這樣的部分，并且提及“mirna”包括提及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或更多種mirna及其等同物等。
而且，除非另外聲明，否則使用“或/或者”表示“和/或”。類似地，“包含”、“包括”是可互換的并非旨在是限制性的。
應(yīng)進(jìn)一步了解，在多個(gè)實(shí)施方案的描述使用術(shù)語“包括/包含”的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在一些具體情況下，可使用語言“基本上由...組成”或“由...組成”來選擇性地描述實(shí)施方案。
除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文中所述的那些類似或等同的許多方法和試劑均可用于實(shí)施所公開的方法和組合物，但是現(xiàn)在描述了示例性方法和材料。
本文中提及的所有公開均通過引用全部并入本文，并入目的在于說明和公開可與本文中的描述聯(lián)合使用的方法。對于一個(gè)或更多個(gè)公開中所述的與本公開內(nèi)容中明確定義的術(shù)語相似或相同的任何術(shù)語，在所有方面均以本公開內(nèi)容中明確提供的術(shù)語的定義為準(zhǔn)。
細(xì)胞通過很多不同的途徑來與其周圍環(huán)境通訊，包括細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用、激素、生長因子、細(xì)胞因子、激素等。細(xì)胞之間的長程效應(yīng)可通過分泌通過血流傳送以對遠(yuǎn)端細(xì)胞起作用的因子的過程來進(jìn)行。最近，有證據(jù)表明，例如外泌體的囊泡能夠介導(dǎo)這樣的通訊。
癌癥的早期檢測可提高患者的存活率，但成功強(qiáng)烈地依賴于特異性且敏感性的生物標(biāo)志物的可用性。用于癌癥診斷的一類有前景生物標(biāo)志物是微rna(mirna)和長非編碼rna(lncrna)。mirna與靶mrna結(jié)合并抑制靶轉(zhuǎn)錄物的翻譯或誘導(dǎo)靶轉(zhuǎn)錄物的降解。抑制腫瘤抑制基因的mirna的過表達(dá)可干擾抗致癌途徑，而靶向癌基因的mirna的缺失或表觀遺傳沉默可提高致癌效力。還認(rèn)識(shí)到，與mrna譜相比，mirna譜更準(zhǔn)確地反映人癌癥的發(fā)育譜系和組織來源。與蛋白質(zhì)相比，mirna具有更簡單的結(jié)構(gòu)和更不復(fù)雜的合成后加工，并且可通過高靈敏pcr方法來檢測。更有吸引力的是，mirna可釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，并且以可通過例如rt-pcr的靈敏技術(shù)檢測的水平穩(wěn)定存在。越來越多的證據(jù)表明，循環(huán)mirna在癌癥患者和健康對照之間表現(xiàn)出不同的模式，其中一些分泌型mirna的模式在癌癥起始的早期階段改變。由于與其他活檢方法相比，認(rèn)為從循環(huán)體液(例如血液、尿液、唾液等)取樣方便且非侵入性，因此越來越多的研究工作致力于獲得循環(huán)mirna的綜合特征，并驗(yàn)證其作為生物標(biāo)志物的效用。
微rna與某些載體，例如蛋白質(zhì)、脂蛋白顆粒(例如hdl)和外泌體(由細(xì)胞釋放的直徑為約30nm至100nm的膜囊泡)結(jié)合。所述載體與微rna如何分泌以及在循環(huán)系統(tǒng)中如何轉(zhuǎn)運(yùn)高度相關(guān)。因此，rna，特別是載體，而不是總量，與疾病發(fā)展直接相關(guān)。此外，目前用于分級(jí)血清或血漿中與載體結(jié)合的循環(huán)rna的方法僅基于尺寸排阻層析或超速離心。
rna干擾(rnainterference，rnai)是用于控制基因表達(dá)和活性的生物過程。最近，已報(bào)道rnai分子(例如mirna)存在于外泌體、高-密度脂蛋白和低-密度脂蛋白(vickers等,2011)(hdl/ldl)、大細(xì)胞外囊泡(稱為微囊泡)中，并與argonaut2(ago2)(arroyo等,2011；li等,2012；turchinovichet等,2011)相關(guān)。
mirna是長度為18至24個(gè)核苷酸(nt)的小非編碼rna，其在轉(zhuǎn)錄后控制基因表達(dá)。其通過drosha和dicer核酸內(nèi)切酶的順序作用合成，并裝載到risc(rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)中靶向mrna(bartel,2009；maniataki和mourelatos,2005)。
mirna通過mirna相關(guān)risc(由dicer、trbp和ag02蛋白組成)與靶mrna的序列特異性相互作用和配對來工作(bartel,2009)。這種作用抑制翻譯和/或引起mrna去穩(wěn)定(filipowicz,2005)。mirna及其mrna靶標(biāo)的互補(bǔ)程度決定mrna沉默的過程，通過mrna去穩(wěn)定/降解或通過抑制翻譯(ambros,2004；bartel,2009)。如果mirna和靶mrna序列之間完全互補(bǔ)，則risc復(fù)合物起作用來切割結(jié)合的mrna以進(jìn)行降解ambros,2004；bartel,2009)。如果沒有絕對互補(bǔ)，則如在動(dòng)物細(xì)胞中的mirna的大多數(shù)情況下一樣，阻止進(jìn)行翻譯來實(shí)現(xiàn)基因沉默(ambros,2004；bartel,2009)。
為了實(shí)現(xiàn)有效的mirna介導(dǎo)的基因沉默，mirna必須與rlc(risc裝載復(fù)合物)蛋白dicer、trbp和ago2形成復(fù)合物。在rlc中，dicer和trbp需要在前體mirna(pre-mirna)通過輸出蛋白-5從細(xì)胞核出來之后對前體mirna進(jìn)行加工以產(chǎn)生mirna并與ag02結(jié)合。與成熟mirna結(jié)合的ag02構(gòu)成最小的risc，并且隨后可與dicer和trbp解離。單鏈mirna自身并入risc中非常差，并且因此不能有效地被定向其靶mrna進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
外泌體由細(xì)胞在體內(nèi)和體外釋放。術(shù)語“外泌體”意指從受試者獲得的樣品(例如，生物流體)中存在的基于脂質(zhì)的微米顆?；蚣{米顆粒。術(shù)語外泌體在本領(lǐng)域中還稱為微泡、納米囊或細(xì)胞外囊泡。在一些實(shí)施方案中，外泌體的直徑在約20nm至約90nm。外泌體從多種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型分泌或脫落。外泌體是將生物大分子從產(chǎn)生位點(diǎn)運(yùn)載到微環(huán)境或遠(yuǎn)離起源的遠(yuǎn)端位點(diǎn)的靶位點(diǎn)的小膜結(jié)合囊泡。外泌體內(nèi)容物的含量隨產(chǎn)生其的細(xì)胞類型以及改變細(xì)胞的正常狀態(tài)的環(huán)境因素(例如病毒感染)而變化。已經(jīng)顯示，外泌體包含病毒rna、病毒蛋白、病毒mirna、細(xì)胞mirna等(singh等,viruses,7(6):3204-25,2015；hubert等,futurevirol.,10(4):357-370,2015)。
長非編碼rna(lncrna)包括具有低蛋白質(zhì)編碼潛能的長度大于200個(gè)核苷酸的rna分子。盡管傳統(tǒng)上被視為轉(zhuǎn)錄噪聲，但是其現(xiàn)在顯現(xiàn)為例如蛋白質(zhì)合成、rna成熟/轉(zhuǎn)運(yùn)、染色質(zhì)重塑以及轉(zhuǎn)錄激活和/或抑制程序的細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)子。已證明，其可影響例如干細(xì)胞多能性、細(xì)胞周期和dna損傷響應(yīng)的生物過程。作為其重要調(diào)控功能的指示，已經(jīng)在數(shù)種類型的癌癥中觀察到一些lncrna的異常表達(dá)和功能(參見例如美國專利公開no.2013/0178428，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)。
循環(huán)微rna(mirna)是可用于診斷癌癥、糖尿病、肥胖、癲癇、肝病(例如，nash或nafld)、冠狀動(dòng)脈疾病、阿爾茨海默病、多囊性卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位和腎病(例如，微小病變疾病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥)的潛在生物標(biāo)志物。類似地，長非編碼rna(lncrna)分子由于對基因表達(dá)具有影響而已與多種疾病相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些rna分子與例如蛋白質(zhì)、脂蛋白顆粒和外泌體的多種載體結(jié)合?？赡艿兀c特定載體相關(guān)的mirna和lncrna而非整體量與疾病狀況(例如癌癥、心血管、腎臟、子宮內(nèi)膜異位等)相關(guān)。
使用循環(huán)mirna作為診斷劑的一個(gè)障礙是：不是所有的循環(huán)mirna都與癌癥發(fā)生或疾病相關(guān)。癌癥/疾病不相關(guān)的mirna可由血液細(xì)胞分泌，或者在細(xì)胞死亡之后脫落。然后，其可導(dǎo)致個(gè)體間mirna豐度的差異較大并在定量期間補(bǔ)充癌癥相關(guān)mirna的信號(hào)。已經(jīng)知道，無細(xì)胞的mirna在細(xì)胞外環(huán)境和體液中被多種類型的載體保護(hù)避免核酸酶。載體可以是屬于rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)的蛋白質(zhì)，例如argonaute(ago)2和gw182；可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)通訊的脂蛋白(高密度脂蛋白(hdl)和低密度脂蛋白(ldl))顆粒；或者認(rèn)為是來自惡性細(xì)胞的mirna的一個(gè)輸出途徑的囊泡，例如外泌體。雖然惡性細(xì)胞的活性mirna分泌可能是細(xì)胞途徑調(diào)節(jié)異常的結(jié)果，但目的輸出和攝取可能與腫瘤進(jìn)程和轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，為了更好地消除癌癥不相關(guān)的mirna并揭示更多的特異性mirna標(biāo)志物，從癌細(xì)胞特異性分泌的載體分離mirna可提供一種解決方案。因此，循環(huán)mirna的研究近來一直集中于hdl和外泌體。
此外，與多種載體相關(guān)的病毒rna(vrna)可用于確定感染的存在、病毒載量或感染狀態(tài)(例如，活躍或潛伏)。
本文中使用的“rna載體”指存在于受試者的流體或組織中并且在受試者中結(jié)合或攜帶rna的大分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，rna載體不是細(xì)胞(“非細(xì)胞的”)(例如，不是干細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞或其他細(xì)胞)?！敖Y(jié)合”意指與rna載體共價(jià)或非共價(jià)締合(例如，包封在外泌體中、通過h鍵的連接或其他電荷締合等)。rna載體的實(shí)例包括蛋白質(zhì)(例如屬于risc復(fù)合物的argonaute(ago)2和gw182)、脂質(zhì)、脂蛋白(例如高密度脂蛋白(hdl)和/或低密度脂蛋白(ldl))、細(xì)胞外囊泡(例如，外泌體)等。本文中使用的術(shù)語“rna”指mirna、lncrna和病毒rna中的一種或更多種。
術(shù)語“樣品”或“生物樣品”意指從哺乳動(dòng)物受試者獲得的任何生物流體(例如含有血液、血漿、尿、唾液、母乳、眼淚、陰道分泌物或羊膜液的組合物)。
盡管包封在外泌體中的mirna可提供疾病狀態(tài)信息，但是本文中公開的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與其他載體結(jié)合的rna也與疾病發(fā)展高度相關(guān)，因?yàn)椴煌妮d體由不同的途徑分泌并被轉(zhuǎn)運(yùn)到不同的位置。因此，不同載體之間rna的實(shí)際分布模式指示疾病的階段和疾病診斷。通過使用本公開內(nèi)容的方法，可分析單獨(dú)載體中的rna量，從而鑒定特異性微rna、lncrna和vrna疾病狀態(tài)。
純hdl或外泌體通常通過超速離心和免疫親和捕獲來獲得。超速離心可以提供良好的尺寸/密度分辨率，但是其需要大的樣品體積、非常繁瑣且耗時(shí)，并且通常提供低回收。免疫親和捕獲易于進(jìn)行并提供高特異性，但一次只能靶向一種類型的載體。在mirna載體的一項(xiàng)研究中，用尺寸排阻色譜(sizeexclusionchromatography，sec)分級(jí)血清以揭示外泌體和無外泌體的循環(huán)mirna的存在。在另一項(xiàng)研究中，使用sec來進(jìn)一步表征通過超速離心分離的hdl。然而，在sec中，只能在小尺寸范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的分離分辨率，生物分子與柱材料的相互作用是成問題的，并且生物復(fù)合物或囊泡結(jié)構(gòu)在通過填充柱后的完整性是有問題的。
盡管從純hdl或外泌體回收rna有可能除去正常細(xì)胞脫落的癌癥/疾病不相關(guān)rna，但是實(shí)際上關(guān)于那些載體在癌癥和疾病診斷中更為重要尚沒有得出結(jié)論。因此，研究所有類型載體中的rna分布對于回答這一問題具有重要意義。
本公開內(nèi)容提供了一種用于使用(i)非對稱流動(dòng)場流分級(jí)(af4)(或其改進(jìn)形式，參見例如美國專利公開號(hào)no.2009/0301942，其通過引用并入本文)或(b)基于珠的微流體/基于芯片的方法來在來自受試者的流體(例如，血清)中快速分離不同rna載體的方法。與sec和超速離心相比，非對稱流動(dòng)場流分級(jí)(af4)和基于珠的微流體方法更為溫和并且更好地保持rna與其載體之間的結(jié)合。由于其不相互作用的分離能力，af4和珠基微流體方法可用于分離蛋白質(zhì)-rna、脂蛋白-rna和含有rna的外泌體的完整大分子復(fù)合物。
a4f設(shè)備及其變體在多個(gè)公開中進(jìn)行了描述，包括giddings等(science,260：1456-1465,1993)和carl-gustavwahlund等(“propertiesofanasymmetricalflowfield-flowfractionationchannelhavingonepermeablewall,”analyticalchemistry59,1332-39,1987)。
一般來說，a4f單元包括(1)容納液體可滲透的釉料的底部裝配結(jié)構(gòu)，所述釉料通常由經(jīng)燒結(jié)的不銹鋼顆粒制成；(2)位于釉料上方的可滲透膜；(3)包含腔的厚度為約75μm至800μm的間隔件；以及(4)通常容納例如玻璃的材料的透明板的頂部裝配結(jié)構(gòu)。所得夾層結(jié)構(gòu)用螺釘、螺栓、膠或其他工具固定在一起。間隔件中的大致矩形或棺形的腔用作其中將發(fā)生分離的通道。頂部裝配結(jié)構(gòu)通常包含穿過頂板的三個(gè)孔，其被稱為端口并且集中在通道上方且允許配件附接于其的三個(gè)孔。這些端口是：(a)位于通道開始附近并且通過其泵送載體液體(“流動(dòng)相”)的流動(dòng)相入口端口，(b)非常接近入口端口并且在其下游的樣品端口，在樣品端口中，將待分離樣品的等分試樣引至通道，以及(c)經(jīng)分級(jí)的等分試樣經(jīng)其離開通道的出口端口，其在入口端口和樣品端口的下游。
a4f通道用于分離包括血清蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的顆粒，并且橫跨從幾納米到數(shù)十微米的尺寸范圍。由這樣的顆粒組成的樣品等分試樣的分離進(jìn)而取決于矩形或棺形腔的長度、寬度和厚度。另外，其取決于通道流速、橫流與通道流之比、溫度，液體黏度、ph、離子性、顆粒自身的物理組成以及位于釉料上方的可滲透膜的類型。通過適當(dāng)?shù)鼐幊掏ǖ懒髋c橫流之比的時(shí)間變化，可以顯著改善不同顆粒種類的分離，并且通?？稍谕贿\(yùn)行中分離注入的樣品等分試樣中存在的大范圍顆粒尺寸。實(shí)際上，對于待分離的每一類顆粒，可通過憑經(jīng)驗(yàn)改變前述因素來開發(fā)最佳分離。對于特定af4裝置不能改變的唯一變量是通道長度。
以往，a4f的通道長度已為約25cm至30cm，其中最大寬度為約1cm至3cm，所述最大寬度沿其長度逐漸變細(xì)并且以與出口端口的寬度相當(dāng)?shù)膶挾忍幗Y(jié)束。最近的研究表明，更短長度的通道將提供一定的益處，并在此基礎(chǔ)上。
af4已被用于分析血清中的外泌體。因此，af4是用于基于不同mirna載體的流體動(dòng)力學(xué)直徑來快速分離不同mirna載體，使得能夠篩選不同載體之間的rna分布的可用方法。比較從健康個(gè)體和癌癥患者獲得的分布譜可有助于揭示哪些類型的載體與癌癥發(fā)展更相關(guān)，并且因此當(dāng)使包封在這些載體中的mirna作為標(biāo)志物時(shí)增強(qiáng)診斷的靈敏性和特異性。
因此，af4可用于分離人血清中的不同載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，af4用于分離rna載體。然后，可分離在這樣的載體上(或內(nèi))的rna。例如，收集并定量洗脫的rna以獲得其在不同分子載體之間的分布譜。圖1f示出了對由從a4f獲得的與不同rna載體或載體組相關(guān)之不同級(jí)分獲得的不同mirna獲得的信息。
本公開內(nèi)容還提供了基于主要載體來進(jìn)行rna的快速分級(jí)的裝置。與用于mirna分級(jí)的現(xiàn)有分離技術(shù)相比，本公開內(nèi)容的方法和組合物更加快速且更易進(jìn)行，需要較小的樣品體積且可以以較高的自動(dòng)化程度進(jìn)行以避免由人操作者引入的變化，并且更適于處理大量的患者樣品。本公開內(nèi)容提供了用于綜合篩選不同載體之間循環(huán)rna的分布的方法和裝置。這樣的方法和裝置有利于發(fā)現(xiàn)用于疾病診斷的特異性rna生物標(biāo)志物，并且有助于了解循環(huán)rna的生物發(fā)生和功能，從而有助于更好的診斷、治療和預(yù)后。
雖然基于af4的方法通過將載體分離成多個(gè)級(jí)分來提供綜合的分布譜分析，但是從大的洗脫體積回收rna費(fèi)力且耗時(shí)。另外，不同載體之間的分辨率提高將提供更好的定量。為了進(jìn)一步提高樣品回收、工作效率、載體分辨率和分析通量同時(shí)降低樣品消耗，開發(fā)了基于微芯片的分布譜分析技術(shù)。該技術(shù)將外泌體的免疫捕獲與蛋白質(zhì)-rna結(jié)合的基于洗滌劑的破壞組合以在微芯片上的三個(gè)微通道中單獨(dú)分離與蛋白質(zhì)結(jié)合的、與脂蛋白復(fù)合物締合的和包封在外泌體中的rna。初步裝置和方法中的總分離過程在最低人工樣品處理下花費(fèi)約1.5小時(shí)，并且僅需要25μl或更少的血清。處理的體積和時(shí)間兩方面都得到改進(jìn)。洗脫的rna具有良好質(zhì)量并且可通過rt-實(shí)時(shí)pcr或其他rna檢測技術(shù)來定量。
因此，本公開內(nèi)容進(jìn)一步描述了使用微流體/芯片系統(tǒng)來分離rna載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用流體裝置，其包括至少一個(gè)通道(例如，2、3、4、5個(gè)或更多個(gè)通道)、用于接受生物樣品(例如，血清)的樣品儲(chǔ)存器以及包含珠和/或可用于去除和儲(chǔ)存可與樣品中的rna載體或rna結(jié)合的珠的至少一個(gè)珠儲(chǔ)存器。
基于微芯片的rna分布譜分析方法以快速、高通量且半自動(dòng)的方式定量與三種公認(rèn)的載體結(jié)合的循環(huán)rna。芯片上的三個(gè)通道利用免疫親和化學(xué)試劑單獨(dú)地產(chǎn)生蛋白質(zhì)結(jié)合的rna、脂蛋白締合的rna和外泌體的rna。如下文更充分描述的，芯片上方法的確產(chǎn)生預(yù)期的分布譜分析，并且所獲得的譜可用于區(qū)分從癌癥患者和健康個(gè)體收集的血清樣品。
圖12示出了本公開內(nèi)容的一個(gè)示例性微流體裝置10。在基底20上形成通道40和多個(gè)儲(chǔ)存器30、50、60、70、80。儲(chǔ)存器30、50、60、70、80通過通道40流體連接。例如，樣品儲(chǔ)存器30通過通道40與一個(gè)或更多個(gè)洗滌儲(chǔ)存器50流體連接。裝置10包括用于容納磁性或非磁性(例如二氧化硅)珠的一個(gè)或更多個(gè)珠儲(chǔ)存器80。珠可被功能化以包含與樣品中組分的表面上的抗原結(jié)合的抗體或與樣品中的期望靶標(biāo)雜交的核酸。該裝置還可包括外泌體/囊泡破裂儲(chǔ)存器60。該儲(chǔ)存器用作破裂含有rna組分的囊泡的位置。該裝置包括洗脫儲(chǔ)存器70，其用于允許從樣品提取rna以用于通過例如rt-pcr進(jìn)行進(jìn)一步處理。
通道40和儲(chǔ)存器30、50、60、70、80包含不同的流體/緩沖液。例如，通道40可包含油(例如硅油、礦物油等)，而儲(chǔ)存器30、50、60、70、80可包含由在油中的水基緩沖液形成的液滴。以這種方式，可在不同的儲(chǔ)存器30、50、60、70、80中分離不同的反應(yīng)組分，同時(shí)通過通道40保持流體連接。
裝置10可使用常用的微流體制造技術(shù)來制造。圖13示出了制造裝置10的一個(gè)實(shí)施方案。在該過程中，使用光掩模和uv固化粘合劑來定義pdms模具的粘合區(qū)域。uv光僅固化期望區(qū)域中的粘合劑，并且未經(jīng)固化的粘合劑被去除(參見圖13，步驟1)。然后，添加pdms層并固化。去除pdms層，并在pdms中開期望的孔(參見圖13，步驟2)。然后，施加pdms模具并將pdms模具粘合到玻璃基底(參見圖13，步驟3；還參見例如圖12中的20)。
在操作期間，將樣品(例如血清)提供到樣品儲(chǔ)存器30中。為了防止mirna或其他因子(例如，血清組分)在通道或孔的表面上的不期望和非特異性吸附，可用八甲基硅氧烷物質(zhì)改性表面以封閉表面并使通道和孔具有疏水性和惰性。再次參照圖12，將樣品儲(chǔ)存器30中的樣品提取成例如3個(gè)級(jí)分(外泌體、脂蛋白和蛋白質(zhì))。使用經(jīng)針對外泌體表面抗原的抗體標(biāo)記的磁珠將外泌體級(jí)分拉入下部通道40中(參見圖14)。使用磁體將經(jīng)免疫珠標(biāo)記的外泌體通過通道40拉入破裂儲(chǔ)存器60，在此可在乙醇和硫氰酸胍中破裂外泌體。然后，移除磁性免疫珠，并使具有陽離子表面電荷的磁性二氧化硅珠(參見圖15)與經(jīng)破裂的外泌體內(nèi)容物接觸。陽離子帶電珠吸引并結(jié)合破裂儲(chǔ)存器60中存在的陰離子帶電rna分子。然后，珠可將結(jié)合的rna分子拉入提取儲(chǔ)存器70。然后，通過使樣品與磁珠接觸獲得樣品的蛋白質(zhì)級(jí)分，所述磁珠(a)選擇性地與靶蛋白結(jié)合(使用例如抗ago2抗體)，或(b)可在通過表面活性劑/離液鹽混合物破壞蛋白質(zhì)-rna相互作用之后通過靜電吸引、h鍵和/或疏水相互作用吸附rna。然后，將珠通過通道40拖至洗脫儲(chǔ)存器70。然后，通過使樣品與與磁珠接觸獲得樣品的脂蛋白級(jí)分，所述磁珠(a)選擇性地與脂蛋白上的表位結(jié)合(使用例如抗氧化磷脂抗體)，或(b)可在通過表面活性劑/有機(jī)溶劑/離液鹽溶液破壞脂蛋白復(fù)合物之后通過靜電吸引、h鍵和/或疏水相互作用與rna結(jié)合。然后，將珠通過通道40拖至洗滌儲(chǔ)存器70。洗脫儲(chǔ)存器70包含促使rna從珠釋放的緩沖液(例如超純水)。然后，可從每個(gè)洗脫儲(chǔ)存器70分離rna并進(jìn)行rt-pcr和測序，從而提供rna序列-載體信息。
例如，對于血清蛋白結(jié)合rna的提取，使用在約0.6mkcl、約0.01％吐溫20和約4.5m鹽酸胍中的約400μg的1μm裸磁性二氧化硅珠。對于血清脂蛋白結(jié)合rna的提取，使用在約1mkcl、約0.11％吐溫20、約3m鹽酸胍、約2.5m硫氰酸胍和約10％etoh中的約400μg的1μm裸磁性二氧化硅珠。對于血清外泌體，將捕獲的外泌體在包含約50％etoh/3m硫氰酸胍的溶液中孵育，除去捕獲珠并添加約400μg磁性二氧化硅珠、約0.1％吐溫20和約0.6mkcl。
本文中公開了基于微rna所在的位置來快速分級(jí)微rna的方法。本公開內(nèi)容的方法采用非對稱流動(dòng)場流分級(jí)來分離血清中的微rna載體。然后，可收集洗脫的級(jí)分。例如，如果收集總共6個(gè)級(jí)分，則每個(gè)級(jí)分將包含特定載體(例如，級(jí)分#3富集高密度脂蛋白(hdl)顆粒，級(jí)分#6富集外泌體)的富集群。從洗脫的級(jí)分，可提取并定量來自每個(gè)級(jí)分的微rna。在本文中提供的實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，來自級(jí)分的定量的微rna在健康個(gè)體與患有病癥的個(gè)體之間顯示出顯著差異。但是，如果將這些級(jí)分合并，則定量的mirna總和在健康受試者與患有病癥的個(gè)體之間未顯示出顯著差異。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本文中公開的方法利用af4或微流體方法分級(jí)整個(gè)血清。通過利用本公開內(nèi)容的方法，收集離散的洗脫級(jí)分；從每個(gè)部分提取總rna；并通過rt-qpcr定量每個(gè)級(jí)分中8種所選擇的mirna的量。或者，所提取的rna可進(jìn)行深度測序。還提取并鑒定每個(gè)級(jí)分中洗脫的蛋白質(zhì)以揭示每個(gè)級(jí)分中富集的載體的身份。對在每個(gè)級(jí)分中mirna的精確定量產(chǎn)生分布譜。將從健康個(gè)體的血清獲得的分布譜與來自患有乳腺癌的患者的那些進(jìn)行比較。
本文中使用的術(shù)語“深度測序”指允許每個(gè)堿基被讀取數(shù)百次、通常至少約500次、更通常至少約1000次并且甚至更通常至少約1500次的核酸序列測序。深度測序方法實(shí)現(xiàn)靶向測序方法中的更大覆蓋度(深度)?！吧疃葴y序”、“深度覆蓋”或“深度”指對所測序的每個(gè)核苷酸具有高覆蓋量。高覆蓋度不僅允許檢測核苷酸變化，而且還允許檢測遺傳樣品中每個(gè)單堿基的異質(zhì)性程度。此外，深度測序能夠同時(shí)檢測小的插入缺失(indel)和大的缺失、定位確切的斷點(diǎn)、計(jì)算缺失異質(zhì)性并監(jiān)測拷貝數(shù)變化。在一些方面，深度測序策略，如由myllykangas和ji,biotechnolgenetengrev.27：135-58(2010)所提供的，可用于本公開內(nèi)容的方法。
發(fā)現(xiàn)，通過使用本公開內(nèi)容的方法，特定級(jí)分中一些mirna的量在健康個(gè)體和乳腺癌患者之間顯示出比總體量更明顯的差異，表明這樣的mirna當(dāng)存在于某種類型中的載體時(shí)可為用于癌癥診斷的更特異性且敏感的生物標(biāo)志物。了解載體可有助于提高對癌細(xì)胞的mirna標(biāo)志物的差異分泌及其它們在循環(huán)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑背后的基本原理的了解。這樣的信息可有助于解釋它們的功能并且?guī)椭l(fā)現(xiàn)更有效的治療方法。因此，與目前用于收集并定量與載體結(jié)合的mirna的基于sec的分級(jí)方法相比，本公開內(nèi)容的方法允許綜合篩選血清中分布的mirna，并同時(shí)評價(jià)不同載體的量。因此，本公開內(nèi)容的方法提供豐富的信息，其不僅可用于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)(例如指示特定癌癥階段)的生物標(biāo)志物，而且還用于了解循環(huán)微rna的分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)。
為了例示本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，對兩組人樣品(一組來自健康個(gè)體(對照))，另一組來自癌癥患者(病例))的研究已經(jīng)揭示，不同類型的mirna載體(例如脂蛋白顆粒和外泌體)在af4分離之后可富集在單獨(dú)的洗脫級(jí)分。與總和值相比，一些級(jí)分中8種被選擇的mirna的量在“對照”和“病例”之間也顯示出較大變化。此外，與對總mirna量的分析相比，對分布譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析揭示更多潛在的mirna標(biāo)志物。
分級(jí)來自兩個(gè)健康個(gè)體(對照)或來自兩個(gè)癌癥患者(病例)的血清。收集富集不同類型的mirna載體(例如脂蛋白顆粒和外泌體)的6個(gè)級(jí)分。通過rt-qpcr獲得每個(gè)級(jí)分中8種所選擇的mirna的量以產(chǎn)生其在載體之間的分布譜。與總和值相比，在分級(jí)結(jié)果中檢測到對照和病例之間mirna量的更大變化。對分布譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析還證明，特定級(jí)分中4種mirna的量在對照與病例之間顯示出顯著差異。相反，如果對mirna的總量進(jìn)行相同的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，只有2種mirna顯示出顯著差異。此外，主成分分析揭示用分級(jí)的mirna量將對照和病例良好分離。因此，本文中公開的方法允許綜合篩選載體中循環(huán)mirna的分布。獲得的分布譜擴(kuò)大了健康個(gè)體和癌癥患者之間的mirna表達(dá)差異，有利于發(fā)現(xiàn)用于癌癥診斷的特異性mirna生物標(biāo)志物。
以下實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本公開內(nèi)容。雖然該實(shí)施例是可使用的典型實(shí)施例，但是可替代性地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它操作。
實(shí)施例
實(shí)施例1
化學(xué)品和生物材料.hdl和低密度脂蛋白(ldl)購自calbiochem(emdmillipore,billerica,ma)。trizolls試劑，3,3'-雙十八烷基氧雜羰基花青高碘酸鹽(dio)和總外泌體分離試劑盒購自invitrogen(lifetechnologies)。微rna標(biāo)準(zhǔn)品購自integrateddnatechnologies(coralville,ia)。對每個(gè)mirna鏈具有特異性的taqmanmicrornaassays購自appliedbiosystems(lifetechnologies)。用于制備1×pbs(ph7.4的10mm磷酸鹽、137mmnacl、2.7mmkcl和1.0mmmgcl2)的af4運(yùn)行緩沖液的所有化學(xué)物質(zhì)、乙二醇、二甲基亞砜、鹽酸胍、rna級(jí)糖原、2-丙醇和氯仿均購自thermofisher(pittsburgh,pa)。用作af4標(biāo)準(zhǔn)品的所有單一蛋白質(zhì)均購自sigma-aldrich(st.luis，mo)。taq5×主混合物購自newenglandbiolabs。
血清樣品.用于外泌體提取和分離方法優(yōu)化的血清樣品是來自sigma-aldrich的混合的健康男性血清。用于分布譜研究的血清樣品來自經(jīng)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的方案的自愿同意的患者(女性)。乳腺癌患者均患有浸潤性導(dǎo)管癌并且是er/pr/her2陽性的(er雌激素受體；pr-孕酮受體；her2-人表皮生長因子受體)。
通過af4的血清分級(jí).本研究中使用由postnovaanalytics(saltlakecity,ut)制造的af2000系統(tǒng)。梯形分離通道為0.350mm厚(間隔物的厚度)，并且其頂端到頂端長度為275mm，入口三角形寬度為20mm且出口寬度為5mm。進(jìn)樣回路體積為20μl。積聚壁的表面積為3160mm2，其由分子量截止值(mwco)值為10kda的再生纖維素超濾膜(postnovaanalytics)制成。離開af4的洗脫液通過spd-20a吸光度檢測器(shimadzu)，然后通過級(jí)分收集器(bio-rad)。用于所有樣品的運(yùn)行緩沖液均為上述1×pbs。
在血清分級(jí)期間，使用八分鐘的初始聚焦步驟，其中橫流(通過膜壁離開通道的流)為3.00ml/分鐘，頂端流(從入口進(jìn)入通道的流)為0.30ml/分鐘的速度且聚焦流(在入口進(jìn)一步向下的位置進(jìn)入以使分析物聚焦到窄樣品區(qū)的流)為3.00ml/分鐘。在聚焦之后，存在1分鐘的過渡期，在此頂端流增加到3.30ml/分鐘，聚焦流減小到零。在此之后，使頂端流量保持在3.30ml/分鐘持續(xù)5分鐘，然后在15分鐘內(nèi)降至0.30ml/分鐘。在每種情況下，均使橫流減小至使檢測器流(從出口離開通道的流)在0.30ml/分鐘。使用級(jí)分收集器(bio-rad)以每分鐘的時(shí)間間隔進(jìn)行逐步收集。然后，將每個(gè)樣品的這些1分鐘收集物合并為6個(gè)級(jí)分，其中級(jí)分#1(f1)包含從6分鐘至9分鐘收集的洗脫液，f2從9分鐘至13分鐘，f3從13分鐘至16分鐘，f4從16分鐘至19分鐘，f5從19分鐘至23分鐘，f6從23分鐘至28分鐘。
用于方法優(yōu)化的蛋白質(zhì)和顆粒標(biāo)準(zhǔn)品.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品以及來自sigma的純hdl和ldl在細(xì)胞色素c、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、igg或甲狀腺球蛋白的0.1mg/ml溶液中制備。將50-nm聚苯乙烯珠以0.1μm的濃度懸浮。使用外泌體沉淀試劑盒(invitrogen)制備外泌體。簡言之，將全血清與外泌體分離試劑以5∶1的v/v比孵育20分鐘。然后，將樣品在4℃下離心以使外泌體沉淀。除去上清液，并將外泌體重懸于1×pbs中，得到2×濃縮溶液。將外泌體以原樣在系統(tǒng)中運(yùn)行，或者在室溫下用dio(終濃度為5μm)預(yù)孵育20分鐘。使用相同的流動(dòng)程序但沒有5-分鐘恒流窗口來分析所有標(biāo)準(zhǔn)品。
蛋白質(zhì)的lc-ms/ms鑒定.在lc-ms/ms分析之前，對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行胰蛋白酶消化。添加碳酸氫銨以達(dá)到約50mm的終濃度。使用標(biāo)準(zhǔn)的dtt/iaa還原烷基化方案來還原并烷基化樣品。向樣品添加胰蛋白酶，并在37℃下進(jìn)行消化過夜。消化之后，使用c18ziptip(millipore)純化樣品，并在50％乙腈/0.1％三氟乙酸中洗脫。洗脫之后，將樣品干燥并重懸于0.1％tfa中。然后，使用與finneganltq(thermo)接合的waters2695分離模塊對這些樣品進(jìn)行納米lc-ms/ms分析。
將原始數(shù)據(jù)上傳到蛋白質(zhì)勘探搜索引擎(proteinprospectorsearchengine)(由舊金山的加利福尼亞大學(xué)在線提供)用于進(jìn)行肽和蛋白質(zhì)鑒定。使用用于每種蛋白質(zhì)的鑒定肽的數(shù)量進(jìn)行譜計(jì)數(shù)以用于相對蛋白質(zhì)定量(保留重復(fù))。此外，對低豐度的目的蛋白進(jìn)行特定檢索。
從收集的級(jí)分進(jìn)行rna和蛋白質(zhì)提取.向每個(gè)級(jí)分摻加0.31fmol秀麗隱桿線蟲(c.elegans)mirna,cel-mir-67，并使用
微rna分析.為了獲得足夠的mirna量，在每個(gè)重復(fù)中對每份血清進(jìn)行兩次收集。一次收集用于定量hsa-mir-16、mir-191、let-7a、mir-17、mir-155和mir-375，其中將mirna沉淀在31μlte緩沖液中重構(gòu)。另一次收集用于定量hsa-mir-21和mir-122；并且在16μl中進(jìn)行mirna沉淀的重構(gòu)。使用在進(jìn)行rna提取之前摻加到每個(gè)級(jí)分中的cel-mir-67作為內(nèi)標(biāo)以校正提取期間的樣品損失，并使用由標(biāo)準(zhǔn)mirna反應(yīng)制備的外標(biāo)校準(zhǔn)曲線來獲得每個(gè)樣品中的絕對mirna數(shù)量。
從單收集分析全部六條高豐度鏈(hsa-mir-16、mir-191、let-7a、mir-17、mir-155和mir-375)。剩余的兩條鏈(hsa-mir-21和mir-122)從另一次單收集分析。在逆轉(zhuǎn)錄之前，將凍干的mirna沉淀在31μl(用于高豐度鏈)或16ul(用于低豐度鏈)中重構(gòu)。在每個(gè)rt反應(yīng)中，將5μl樣品與3μl逆轉(zhuǎn)錄主混合物和2μl用于到達(dá)mirna鏈的相應(yīng)rt引物(taqman逆轉(zhuǎn)錄探針)混合。主混合物由1.1μl無核酸酶水、1μl的10×緩沖液混合物、0.13μl的rna酶抑制劑、0.1μl的dntp混合物和0.67μl逆轉(zhuǎn)錄酶組成(所有組分均在taqman逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中提供)。在混合之后，在rt混合物的頂部鋪層5μl硅油，并在perkin-elmer2400geneamppcr系統(tǒng)上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。rt反應(yīng)由16℃下的30分鐘退火步驟、42℃下的32分鐘轉(zhuǎn)錄步驟和85℃下的5分鐘變性步驟組成。
在rt之后，對樣品進(jìn)行定量pcr(qpcr)。在qpcr板上，將1μl的rt產(chǎn)物與9μl的qpcr主混合物混合，終體積為10μl。作為覆蓋層，向每份樣品的頂部添加5μl硅油以限制蒸發(fā)損失。主混合物由以下組成：4.9μl無核酸酶水、1μl乙二醇、0.1μl的dmso、0.5μl的25mm氯化鎂、2μl的taq5×主混合物和0.5μl的taqman微rna測定20×qpcr試劑(包含mirnart產(chǎn)物特異性的正向和反向pcr引物，以及rt產(chǎn)物特異性的taqman熒光探針)。將每個(gè)樣品以一式三份鋪板，對應(yīng)于所分析樣品(高相對于低豐度)的任何標(biāo)準(zhǔn)物也如此。在bio-radcfx實(shí)時(shí)儀器上進(jìn)行qpcr分析：在95℃下90秒鐘的初始活化步驟，之后是59℃下50秒的初始退火步驟，然后接著是40個(gè)循環(huán)的pcr，對于每個(gè)循環(huán)，進(jìn)行95℃下的30秒變性和53℃下的70秒退火/延伸。使用cel-mir-67作為內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)品來解釋提取期間的樣品損失，使用標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線來歸一化并定量mirna水平。
外泌體檢測的elisa.添加到微量滴定板(thermo,microfluor2包被的,平底)孔中的6個(gè)收集級(jí)分中每一級(jí)分的蛋白質(zhì)的總量為約22ng，并用1×pbs稀釋至50μl。將elisa板在4℃下孵育過夜以使蛋白質(zhì)吸附到孔的底部。然后，棄掉蛋白質(zhì)溶液，并將板用200μl的1×pbs洗滌兩次(用于測定的所有洗滌緩沖液均為1×pbs)，之后每個(gè)孔添加200μl的在1×pbs中含有5％無脂奶的封閉緩沖液。在室溫下在溫和搖動(dòng)下孵育2小時(shí)之后，傾倒封閉緩沖液，并將孔洗滌兩次。接下來，向孔添加100μl的經(jīng)1×pbs以1∶5000稀釋的一抗(小鼠抗人cd63，目錄號(hào)#ab8219,abcam,cambridge,ma)，之后在室溫下再孵育2小時(shí)。4次洗滌之后，添加100μl第二抗體，經(jīng)1∶25000稀釋的、hrp綴合的兔抗小鼠igg(目錄號(hào)#ab97046,abcam)，并在室溫下在輕輕搖動(dòng)下孵育1小時(shí)。將板洗滌4次，之后添加30μl的periceecl底物(thermofisher)，并孵育5分鐘。檢測所得化學(xué)發(fā)光。在同一板上進(jìn)行兩次重復(fù)。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同板中添加梯度濃度的人cd63(sinobiology)的兩個(gè)重復(fù)。在吸附步驟中，空白僅包含1×pbs。
mirna載體的af4分離.由于蛋白質(zhì)和外泌體之間在流體動(dòng)力學(xué)直徑(dh)方面的差異較大，因此需要優(yōu)化af4分離條件以在合理的時(shí)間內(nèi)洗脫所有載體，同時(shí)維持不同物類之間的適度分辨率。特別地，由于例如外泌體的大顆粒的擴(kuò)散速率慢，因此其洗脫可需要很長時(shí)間。在恒定的通道/橫流條件下，進(jìn)樣通過總外泌體分離試劑盒制備的外泌體，但在30分鐘內(nèi)未洗脫，除非逐漸關(guān)閉橫流(參見圖1a至b)。表明，如果將橫流在15分鐘內(nèi)逐漸降低到零，則實(shí)現(xiàn)外泌體與較小血清成分之間更佳的分辨率以及快速洗脫外泌體且限制峰拖尾(見圖1c)。使用該流動(dòng)程序，具有不同dh的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品在不同的時(shí)間洗脫：白蛋白(mw67kda，dh～4nm)、igg(mw150kda，dh～8nm)和甲狀腺球蛋白(mw660kda，dh～16nm)，以及聚苯乙烯納米顆粒(dh＝50±7nm，代表平均外泌體直徑)(參見圖2a)；hdl(dh～7～10nm)、ldl(dh～21-28nm)和外泌體也如此(圖2b)。結(jié)果支持，主要血清載體可以以單一蛋白質(zhì)<hdl<ldl<外泌體(按洗脫時(shí)間排序)的順序洗脫。為了進(jìn)一步提高較大脂蛋白顆粒和外泌體之間的分離分辨率，使用5-分鐘恒流期，即將橫流在3.0ml/分鐘維持5分鐘，然后開始緩降(參見圖3)。當(dāng)解析單一蛋白質(zhì)和hdl時(shí)，這一條件也提供了輕微的改善。然后，將這種新方法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
通過經(jīng)優(yōu)化的af4方法來分級(jí)從sigma購買的全部人血清。向血清參加純hdl和ldl以確定其精確洗脫窗口(參見圖4a)。hdl在10分鐘至15分鐘內(nèi)洗脫，ldl在17分鐘和23分鐘之間洗脫。此外，在af4分級(jí)之前，將血清或外泌體提取物用dio的親脂性染料染色。dio在水中是弱熒光的，但當(dāng)引入到脂質(zhì)膜中時(shí)，發(fā)出具有高光穩(wěn)定性的強(qiáng)熒光。用熒光檢測(λ入射＝490nm；λ發(fā)射為510nm)獲得的分級(jí)圖進(jìn)一步證實(shí)，具有脂質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)主要在17分鐘后被洗脫(參見圖4b)。
患者血清的分級(jí)和每個(gè)級(jí)分中洗脫的載體的確認(rèn).一旦已知用于洗脫已知mirna載體的大致窗口，則將從2位健康女性(對照，稱為對照#1和#2)和2位乳腺癌(bc)患者(病例，病例#1和#2)收集的血清樣品(參見圖5)分級(jí)。收集6個(gè)級(jí)分以提高每個(gè)級(jí)分中富集的mirna載體的純度。通過從上述研究獲得的hdl、ldl和外泌體的相對洗脫時(shí)間來確定每個(gè)級(jí)分的收集窗口(圖5中的插入表格)。分離是高度可重現(xiàn)的：使用所收集的所有8個(gè)分級(jí)圖(四個(gè)血清樣品，每個(gè)具有兩個(gè)重復(fù))，每個(gè)級(jí)分中峰的洗脫時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)<8％(參見圖6a和6c)。對所有4個(gè)受試血清樣品進(jìn)行dio染色，并確定具有豐富脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的載體例如hdl、ldl和外泌體的可重現(xiàn)洗脫(參見圖6b和6d)。通過uv吸收和dio染色偶聯(lián)熒光檢測獲得的高度可重現(xiàn)的分離譜有助于確定這些樣品之間在常規(guī)蛋白質(zhì)(由血清白蛋白和igg的峰強(qiáng)度表示)和脂質(zhì)(由通過dio染色檢測到的兩個(gè)主要峰表示)含量方面的相似性。這可確保，在mirna分布譜中檢測到的差異來源于bc的存在，而不是來源于載體豐度的差異。此外，高重現(xiàn)性極大地簡化了柱后收集：將級(jí)分收集器編程為自動(dòng)地每一分鐘收集洗脫液，并將在期望時(shí)間窗口內(nèi)的級(jí)分合并用于后續(xù)的mirna和蛋白質(zhì)提取。
為了確定每個(gè)級(jí)分中富集的載體的身份，收集在f1至f6中洗脫的蛋白質(zhì)，通過胰蛋白酶消化，并通過lc-ms/ms分析。通過譜計(jì)數(shù)來評價(jià)洗脫的蛋白質(zhì)的相對豐度，所述譜計(jì)數(shù)計(jì)算針對特定蛋白質(zhì)收集的質(zhì)譜的數(shù)目。在一個(gè)樣品中鑒定到的所有譜中特定蛋白質(zhì)的譜數(shù)的百分比應(yīng)與其在混合物中的相對豐度半定量地成比例。在多個(gè)級(jí)分中發(fā)現(xiàn)屬于不同脂蛋白復(fù)合物的載脂蛋白，例如載脂蛋白a-1(apoa-i)、a-ii(apoa-ii)和b-100(apob)(參見圖7a)。作為hdl的標(biāo)志物的apoa-i發(fā)現(xiàn)于f2-f6中，可能是因?yàn)槠渑c所有的脂蛋白復(fù)合物均相關(guān)，并且甚至在外泌體中。hdl的另一標(biāo)志物蛋白質(zhì)apoa-ii存在于f2-f4級(jí)分中，并且還在f3中富集?？紤]到文獻(xiàn)中報(bào)道的hdl的尺寸范圍(即7～10nm)，得出的結(jié)論，異質(zhì)高密度脂蛋白(hdl)顆粒在f2、f3和f4中洗脫。apob是ldl以及極低密度脂蛋白(vldl)的標(biāo)志物蛋白質(zhì)并且發(fā)現(xiàn)于f4-f6中，其中大多數(shù)在f5中洗脫。因此，ldl應(yīng)該在f5中富集，與圖2b和圖4a中所示的純ldl的遷移窗口匹配。
lc-ms/ms未鑒定到外泌體的標(biāo)志物蛋白質(zhì)，這可能是由于高度豐富的血清蛋白質(zhì)例如igg和白蛋白產(chǎn)生的信號(hào)抑制。相反，通過elisa在每個(gè)級(jí)分中均檢測到外泌體的標(biāo)志物蛋白質(zhì)cd-63(參見圖7b)。約20ng的從每個(gè)級(jí)分提取的蛋白質(zhì)(通過二喹啉甲酸測定確定)吸附到微量滴定板的底部。通過抗cd63抗體和經(jīng)hrp標(biāo)記的二抗檢測cd-63。在f6中檢測到顯著量的cd63(～6ng/20ng)。如從標(biāo)準(zhǔn)分析得出結(jié)論，f6為外泌體主要所在的位置。
總之，上述結(jié)果指出，f1主要含有白蛋白或具有mw<100kda的蛋白質(zhì)。hdl和ldl分別應(yīng)在f3和f5中富集，外泌體主要在f6中但也可在f5中。vldl與f6中與外泌體共洗脫。盡管使用目前的分離方法觀察到多個(gè)載體的共洗脫(例如f4中hdl和ldl的重疊以及f6中外泌體和vldl的共洗脫)，但是在特定級(jí)分中富集特定載體應(yīng)已允許觀察載體之間mirna的一般分布。更高的分辨率確實(shí)將提高分布譜分析的準(zhǔn)確性，并且可通過在每一輪分離中注入較低量的血清來實(shí)現(xiàn)，但需要多次收集，增加分析中的總勞動(dòng)，這不是有利的選擇。通過使用較高的橫流來增加分離力也可有益于分離分辨率，但由于膜吸附而損失更多mirna的風(fēng)險(xiǎn)也增加了。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用當(dāng)前的分級(jí)條件。結(jié)果表明，粗分布譜足以區(qū)分癌癥患者與健康對照，以及揭示對分化重要的鏈和特定載體。
血清中mirna的分布.將總rna沉淀并在水中重構(gòu)以通過rt-pcr進(jìn)行定量。如上所述，測試來自兩組供體(全部女性)的血清。分析來自健康個(gè)體的血清(對照#1和#2)以及來自乳腺癌患者的那些(病例#1和#2)，每個(gè)具有兩次重復(fù)測量。通過rt-qpcr定量8種mirna。其序列以及其包括在研究中的基本原理說明列于表1中。
表1：微rna鏈信息
通過定量來自sigma的血清中的mir-16來評價(jià)該方法中mirna的回收。將通過trizol試劑從全部20μl血清直接提取的mir-16的總含量與從用注射相同血清體積獲得的所有af4級(jí)分回收的總和mirna量進(jìn)行比較。實(shí)現(xiàn)高達(dá)98％的回收(參見圖8)，表明af4通道內(nèi)的膜吸附不會(huì)引起顯著的mirna損失。在20μl血清中測試的每種mirna的所得拷貝數(shù)的范圍通常為104至1010。mir-375和-122相比其他鏈以遠(yuǎn)遠(yuǎn)更低的豐度存在，或者甚至在一些級(jí)分中未檢測到。
分離步驟中的高重現(xiàn)性以及mirna提取和定量中的仔細(xì)處理確保高分析重現(xiàn)性：對于大多數(shù)鏈，兩次重復(fù)測量中總mirna含量的對數(shù)值的rsd為<5％，除mir-375、-21和-122之外，其可變化高達(dá)15％。結(jié)果與以前的報(bào)道一致，在個(gè)體之間，甚至在同一健康組：對照或在bc病例中的兩個(gè)樣品之間觀察到mirna量的較大變化。評價(jià)所有血清樣品中總mirna量的rsd指出，與其他mirna種類相比，mir-16和-17在個(gè)體之間具有相對更穩(wěn)定的表達(dá)。它們的rsd低于15％。然而，如果基準(zhǔn)值為約106，則該rsd已對應(yīng)于mirna拷貝數(shù)的約10倍的改變。對于mir-122，在同一組內(nèi)的兩個(gè)樣品之間觀察到接近120％的rsd值。
由于每個(gè)級(jí)分富集特定類型的mirna載體，因此在每個(gè)級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)對應(yīng)于該特定載體中的mirna水平。不同的mirna在載體之間顯示出不同的分布模式，如病例#1的分布譜所表明(參見圖9a；其他樣品的分布譜示于圖10中)。在該樣品中，在f4-f6中發(fā)現(xiàn)較高量的mir-16、-17和-122。f1-f3中甚至沒有可檢測的mir-122。因此，這三種mirna應(yīng)主要位于該血清樣品中的脂蛋白復(fù)合物和外泌體中。相比之下，let-7a、mir-155和mir-191在所有級(jí)分之間具有相當(dāng)平坦的分布。每種mirna的主要載體類型可與其在離開細(xì)胞時(shí)所采用的主要途徑相關(guān)，并且可能與其生物功能相關(guān)。通過在mirna定量之前分級(jí)載體，本公開內(nèi)容的方法提供了關(guān)于mirna在血清中如何存在的豐富信息，其可進(jìn)一步被探索以解決mirna分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)的基本原理。
然后，在對照和bc樣品之間比較在每個(gè)級(jí)分中發(fā)現(xiàn)的mirna拷貝數(shù)。圖9b示出了bc樣品中平均mirna拷貝數(shù)相對于對照樣品中的平均mirna拷貝數(shù)的對數(shù)比率；即，對于每種mirna，log(bc/對照)。如果在bc病例中的mirna水平低于對照，則可獲得負(fù)log(比)值，反之亦然。log(病例/對照)的絕對值越大表明這兩組之間的差異越明顯。使用來自所有級(jí)分的總mirna量獲得的log(病例/對照)(顯示為紅色柱)也包括在內(nèi)?？偤痛韒irna研究中的可用標(biāo)準(zhǔn)方法得到的結(jié)果，其中定量每種mirna的總體表達(dá)水平。圖9b清楚地表明，與所有受試mirna的總和值相比，在一些級(jí)分中觀察到bc和對照樣品之間的更大差異，除mir-155和-191之外。這些結(jié)果提示，一些載體中的mirna量變化在區(qū)分癌癥患者與健康對照方面比在整個(gè)血清中的總體量更敏感。這一猜測得到以下統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的支持。
mirna分布譜的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.為了了解分布譜是否可顯示健康供體和bc患者之間的差異，以及是否可發(fā)現(xiàn)更可靠的mirna生物標(biāo)志物，對于表1中列出的8種mirna，使用r3.0.2將其在每個(gè)級(jí)分中的量擬合在方程1的線性混合效應(yīng)模型中。
yijk＝μ+bi+bj(i)+εijk(方程1)
其中i＝1,2(患者組的#)，
j＝1,2(每組中的樣品#)
k＝1,2(重復(fù)),
bi:第i組的效應(yīng)(固定的,對照組為1,bc病例組為2)，
bj(i):第i組中第j樣品的效應(yīng)(隨機(jī)的，對照#1為1(1)，對照#2為2(1)，病例#1為1(2)，病例#2為2(2))
對于給定級(jí)分中的mirna，y為觀察到的mirna拷貝數(shù)的對數(shù)值。例如，對于f1中的mir-16，y111是來自對照#1的兩個(gè)重復(fù)之一的mirna拷貝數(shù)的對數(shù)值。當(dāng)比較健康供體與bc患者時(shí)，這種線性混合效應(yīng)模型解釋，樣品間差異
令人感興趣的是觀察到，f4或f6中的mirna量顯示在區(qū)別病例與對照中最為重要。而f6主要包含外泌體，f4富集hdl和ldl。則可能的是，雖然所有四種標(biāo)志物均可能在診斷乳腺癌中具有價(jià)值，但其可能由癌細(xì)胞通過不同的途徑釋放。mir-16可在外泌體中分泌；但是與外泌體級(jí)分相比，在脂蛋白復(fù)合物中的mir-17、-375和-122可能與乳腺癌的發(fā)展更相關(guān)。這突出了測試多種載體而非僅一種載體中mirna量的必要性。
為了可視化f5和f6中mir-16、f4中mir-17、f4中mir-375和f4中mir-122的量在區(qū)別健康供體和bc患者中的有效性，使用xlstat2014(addinsofttm)進(jìn)行主成分分析(pca)。將各級(jí)分中每種mirna的含量作為變量考慮。例如，f6中的mir-16含量是一個(gè)變量，并且命名為mir-16-f6。在研究中進(jìn)行總共8次觀察，每個(gè)樣本的兩次重復(fù)計(jì)數(shù)為兩次獨(dú)立觀察。pca表明，在mir-16-f5、mir-16-f6、17-f4、375-f4和122-f4上分別具有載荷-0.436、-0.598、-0.167、-0.258、0.599的第一主成分可潛在地將健康供體與bc患者分開，如圖9c中的評分圖所示的。事實(shí)上，第一主成分已經(jīng)占總變化的87.1％。然后，利用包含更大量的健康對照和癌癥患者的樣品組的分析得出關(guān)于這些潛在標(biāo)志物在癌癥診斷中能力的肯定結(jié)論。
實(shí)施例2
微芯片制造.簡言之，如圖13中一般性所示制造微芯片。通過將3"×1"載玻片(0.5mm厚)和經(jīng)固化的pdms基底結(jié)合在一起來制造微芯片平臺(tái)。為了制造pdms基底，制備了總共三種主體。首先，僅包含通道特征的第一主體，主體-1，由基于硫醇烯(thiolene)的光學(xué)粘合劑noa81通過開放式方法而制造。在該方法中，通過用準(zhǔn)直的uv光源(365nm,～8.3mw/cm2)照射5秒來在載玻片(經(jīng)等離子體處理)和pdms工作臺(tái)之間預(yù)固化noa81。主體-1的厚度由放置在載玻片和pdms臺(tái)之間的間隔物(～400μm)確定，并且特征由光掩模定義。在短暫的uv暴露之后，從pdms臺(tái)緩慢移出載玻片，其中在表面上具有基于預(yù)固化的noa81的通道特征。使用注射器通過用乙醇、乙醇/丙酮混合物(1∶1)和再次乙醇順序沖洗來除去未暴露的粘合劑。通過uv暴露照射經(jīng)風(fēng)干的載玻片持續(xù)345秒，后固化步驟旨在增加noa81對玻璃的粘附。在50℃下進(jìn)行后續(xù)的12小時(shí)熱固化以延長結(jié)構(gòu)的壽命。在此之后，將主體-1通過1,7-二氯-八甲基四硅氧烷處理以在裝置的主模上產(chǎn)生不粘表面，并用于模制用于制備主體-2的pdms基底。將pdms基底在60℃下固化4小時(shí)，然后剝離主體-1，在井的位置打孔以形成主體-2。在使主體-2附著在經(jīng)等離子體處理的載玻片上之后，在不混入任何氣泡的情況下向通道和井中注入noa81，在uv下固化1300秒，并在50℃下熱老化12小時(shí)。通過小心地移出pdms主體-2，完成在表面上具有低通道特征和高柱結(jié)構(gòu)二者的主體3，然后可將主體3用于復(fù)制用于mirna提取的微芯片的pdms基底。最后通過將形成的pdms基底通過等離子體氧化共價(jià)結(jié)合在薄載玻片來獲得芯片。如下甲基化裝置的通道：洗滌并用1mnaoh孵育10分鐘，用水、乙醇洗滌并隨后干燥，之后進(jìn)行1,7-二氯-八甲基四硅氧烷試劑(在乙醇中10％v/v)孵育。然后，將該芯片用乙醇沖洗并干燥。
微珠的制備.使用碳二亞胺交聯(lián)來使平均直徑為350nm的聚苯乙烯磁性微珠與山羊抗小鼠igg綴合(參見，例如圖14)。向懸浮于50mmmes緩沖液(ph～5.5)中的1mg(20mg/ml)微珠中添加10mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的混合物。孵育30分鐘之后，除去活化緩沖液，并將珠用偶聯(lián)緩沖液(1×pbs，ph～7.2)洗滌2次。然后，向以10mg/ml的終濃度重懸于偶聯(lián)緩沖液中的珠添加適量的抗小鼠igg。將混合物在4℃下混合孵育過夜。然后，將珠用偶聯(lián)緩沖液洗滌兩次，隨后重懸于25mm甘氨酸緩沖液((ph～7.2)中，并在室溫下孵育30分鐘。在用包含1％bsa的1×pbs洗滌兩次之后，將珠分散在儲(chǔ)存緩沖液(具有0.01％bsa的1×pbs)中至25mg/ml的期望濃度。在使用之前，將微珠與1×pbs中終濃度為10mg/ml的小鼠抗人cd63igg混合，之后在4℃下混合孵育過夜。在結(jié)合之后，將珠用1×pbs洗滌3×并儲(chǔ)存在pbs儲(chǔ)存緩沖液中。
mirna的提取.芯片布局示于圖12中。示出了三個(gè)用于提取的通道，每個(gè)通道連接數(shù)個(gè)井/儲(chǔ)存器，并填充有硅油。這些井預(yù)先裝載有液滴形式的合適水溶液。通道1和2具有洗滌、洗脫和珠收集儲(chǔ)存器，并且用于分離蛋白質(zhì)-結(jié)合的mirna和脂蛋白-結(jié)合的mirna。通道3用于分離外泌體mirna。與其他兩個(gè)通道一樣，通道3包括常規(guī)的洗滌、洗脫和珠收集儲(chǔ)存器，但還包括更多的兩個(gè)井；一個(gè)用于外泌體純化和破裂以及ps-珠裝載。
通過將25μl血清和100μg與抗人cd63igg綴合的免疫珠添加到樣品儲(chǔ)存器來開始提取。將樣品上下吸移3至5次以充分混合，并在室溫下孵育30分鐘。然后，使用微流體芯片下面的永久磁體，珠移向通道3，通過洗滌儲(chǔ)存器，然后進(jìn)入破裂儲(chǔ)存器。洗滌儲(chǔ)存器包含1×pbs，并且破裂儲(chǔ)存器容納30μl由75％etoh和2m硫氰酸胍以及1％吐溫-20組成的溶液。在破裂儲(chǔ)存器中孵育15分鐘后，將珠移入連接的珠儲(chǔ)存器中，然后向井中添加20μl的9mguhcl和4μl的6mkcl，隨后添加200μg的1μm磁性二氧化硅珠。在混合和另外一輪15分鐘的孵育之后，二氧化硅珠行進(jìn)至包含無rna酶的超純水的洗脫儲(chǔ)存器中，混合，并孵育15分鐘以卸載mirna，之后將二氧化硅珠移出到相應(yīng)的珠儲(chǔ)存器中。
開始蛋白質(zhì)和脂蛋白結(jié)合的mirna的提取，同時(shí)分離外泌體mirna。從血清中移出外泌體之后，向樣品儲(chǔ)存器中添加30μl的9mguhcl、6μl的6mkcl和0.1％吐溫20。接著，添加200μg的2μl水中的磁性二氧化硅珠，充分混合，并孵育15分鐘。隨后，將二氧化硅珠磁力拖入通道1中。一旦攜帶蛋白質(zhì)結(jié)合的mirna的二氧化硅珠離開樣品儲(chǔ)存器，添加60μl的6m硫氰酸胍、1μl的10％吐溫20、15μl的100％乙醇和200μg二氧化硅珠，充分混合，并孵育15分鐘。此時(shí)，珠將提取脂蛋白結(jié)合的mirna并移動(dòng)到通道2。在通道1和2中，二氧化硅珠移動(dòng)通過洗滌和洗脫儲(chǔ)存器，并最終收集在相應(yīng)的珠儲(chǔ)存器中。
從芯片中移出對應(yīng)于外泌體、蛋白質(zhì)和脂蛋白結(jié)合的mirna級(jí)分的三種洗脫液，并用對每種靶mirna具有特異性的商業(yè)taqmanmirna引物測定試劑盒通過rt-qpcr定量。
外泌體分離和破裂以釋放外泌體mirna的確定.如下確定外泌體的提?。河梅菍ΨQ流動(dòng)場流分級(jí)(af4)分析提取的樣品并比較微流體芯片提取中和通過invitrogen外泌體分離試劑盒制備的外泌體中的cd63量。af4根據(jù)分析物的水合尺寸來對其進(jìn)行分離。所有樣品通過uv-vis吸光檢測，還用dio染料染色并通過熒光檢測以說明富集脂質(zhì)的部分。如圖16a中所示，通過芯片上免疫提取和通過invitrogen試劑盒制備的兩個(gè)樣品均在晚于20分鐘的洗脫時(shí)間時(shí)顯示出顯著峰，其中通過elisa在洗脫液中檢測到顯著量的cd63(圖16b)。通過invitrogen試劑盒制備的樣品還具有在10分鐘至17分鐘之間洗脫的的相對較小的峰，這可能是離心期間共沉淀的脂蛋白結(jié)構(gòu)。通過免疫珠分離的樣品中的外泌體峰在比通過invitrogen試劑盒制備的更晚的時(shí)間出現(xiàn)。在本公開內(nèi)容方法中發(fā)現(xiàn)的cd63濃度為7.04ng/μl(圖16c)，與級(jí)分6-8中發(fā)現(xiàn)的總cd63濃度充分匹配；并且用invitrogen試劑盒濃度為5.28ng/μl，與級(jí)分4-5中的總cd63一致。本發(fā)明的方法產(chǎn)生比invitrogen試劑盒更大的從血清的外泌體回收率，并且產(chǎn)生相對較大的外泌體級(jí)分。從圖16b還可以注意到，級(jí)分7中存在洗脫的大的外泌體，這在af4方法中沒有收集到。
一旦外泌體被分離，用含有75％etoh的溶液對其進(jìn)行處理。高有機(jī)含量破壞外泌體的膜結(jié)構(gòu)，并且釋放包封的mirna。圖16d顯示，在處理之后，當(dāng)通過af4進(jìn)行分析時(shí)，外泌體峰消失。由于dio染料僅在疏水環(huán)境中發(fā)出強(qiáng)熒光，因此熒光信號(hào)的顯著降低表明缺乏完整的疏水結(jié)構(gòu)和外泌體破裂的成功。
mirna-蛋白質(zhì)復(fù)合物的破壞的確定.一旦去除外泌體，樣品中的剩余mirna與脂蛋白復(fù)合物或者與蛋白質(zhì)(例如ago2)結(jié)合。蛋白質(zhì)-rna相互作用依賴于rna上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)上帶正電荷的伯胺之間的h-鍵合和靜電相互作用。rna和蛋白質(zhì)二者的變性劑的存在將確定地影響蛋白質(zhì)-rna復(fù)合物的穩(wěn)定性，釋放蛋白質(zhì)結(jié)合的mirna。為了破壞更緊密的脂蛋白復(fù)合物，應(yīng)采用較高濃度或較強(qiáng)的變性劑。選擇的變性劑為兩種離液鹽鹽酸胍(guhcl)和硫氰酸胍(guscn)、表面活性劑吐溫20和有機(jī)溶劑etoh的組合。為了實(shí)現(xiàn)從同一血清樣品連續(xù)提取蛋白質(zhì)和脂蛋白結(jié)合的mirna，將去外泌體的血清使用包含約0.5mkcl、0.0015％吐溫20和4m鹽酸胍的溫和溶液處理以釋放與蛋白質(zhì)結(jié)合的mirna。一旦通過二氧化硅珠去除這些mirna，就提供更多的吐溫20和更強(qiáng)的硫氰酸胍(guscn)以及etoh變性劑來分解脂蛋白復(fù)合物的緊密結(jié)構(gòu)并釋放締合的mirna。最終混合物包含大約0.25mkcl、1.8mguhcl、2.5mguscn和10％etoh。再次，使用dio染色和af4分析來可視化hdl和ldl復(fù)合物的完整性。在任何處理之前，經(jīng)dio染料染色的血清當(dāng)注射到af4系統(tǒng)中時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)大峰(圖17)。一旦用溫和的變性溶液處理，第一峰的熒光強(qiáng)度顯著降低。如初步研究中表明的，該峰表示免疫球蛋白的洗脫，其也被dio染色。其熒光的失去表明其折疊被打斷，滿足溫和變性溶液的功能的預(yù)期。此外，在將血清與包含guscn和etoh的更強(qiáng)變性溶液孵育之后，痕跡變得平坦，并且在分級(jí)圖中未檢測到明顯的熒光峰(圖17)，指明脂蛋白結(jié)構(gòu)被破壞。
通過二氧化硅珠提取游離的mirna.外泌體、脂蛋白復(fù)合物和簡單蛋白質(zhì)-rna復(fù)合物的破壞從其載體釋放mirna。然后，使釋放的mirna與二氧化硅珠結(jié)合?；诙趸璧膁na或rna提取已得到廣泛應(yīng)用。通常來說，使用例如guhcl的離液鹽來減弱核酸在水溶液中的水合作用并促進(jìn)與二氧化硅表面的疏水相互作用。還可包括kcl以通過在二氧化硅表面上的已電離硅烷醇基團(tuán)和rna的磷酸骨架之間形成鹽橋來增強(qiáng)結(jié)合。兩者都存在于蛋白質(zhì)-rna破壞的溫和變性溶液中，或者在外泌體破壞之后隨二氧化硅珠添加。任何提取操作均可能由于結(jié)合平衡和擴(kuò)散而遭受樣品損失。為了評價(jià)微流體芯片方法的回收率，使用trizol試劑和兩種其他商業(yè)試劑盒g(shù)enejet試劑盒(thermoscientific目錄#k0731)和purelink試劑盒(ambion，目錄12183020)進(jìn)行的總mirna提取。這些代表從生物樣品提取rna的常用方法。按照生產(chǎn)商的方案，使用商業(yè)試劑盒僅回收在血清中摻加的cel-mir-67的很小部分(圖18)。這可能是由于與不提供與顆粒的大相互作用表面的mrna和基因組dna相比，mirna的長度短。芯片上提取方法得到13.5％的最高平均回收率，這可歸因于與商業(yè)試劑盒或試劑相比，其最小的人工操作和液體轉(zhuǎn)移。
分級(jí)效果評價(jià).上述結(jié)果表明，與常規(guī)的rna提取方法，所述分級(jí)方法不導(dǎo)致更多的樣品損失并且花費(fèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)更少的時(shí)間，同時(shí)單獨(dú)獲得與三種不同載體結(jié)合的mirna。為了進(jìn)一步評價(jià)分級(jí)效果，將從芯片上提取回收的mirna量與由af4法獲得的那些進(jìn)行比較。通過af4方法獲得的級(jí)分1和級(jí)分6分別表示蛋白質(zhì)結(jié)合的mirna(圖19a中的灰色柱)和外泌體mirna(圖19b中的灰色柱)，并將其量與用微芯片方法獲得的在通道1和3中的(圖19a和c中的白色柱)進(jìn)行比較。還采用invitrogen總外泌體分離試劑盒來獲得外泌體，并通過trizol提取獲得外泌體mirna(圖19b中的圖案化柱)。認(rèn)為用af4方法從級(jí)分2-5中回收的mirna量為脂蛋白結(jié)合的mirna，并與在通道2中提取的mirna進(jìn)行比較(圖19c)。最后，通過與抗hdl/ldligg綴合的免疫珠分離hdl/ldl復(fù)合物，通過trizol提取mirna，并添加到比較中。測試了四種mirna：mir-17、mir-21、mir-155和mir-191。
如圖19中所示，與af4方法相比，芯片上提取方法從每種類型的載體回收相當(dāng)或更高量的mirna。通過af4的分離產(chǎn)生多至數(shù)ml的大洗脫體積，使后續(xù)用trizol進(jìn)行mirna回收變得更加困難且耗時(shí)(>1天)并且產(chǎn)率較低。相比之下，芯片上提取開始于25μl血清，最終體積不超過150μl，并且該方法可在1.5小時(shí)內(nèi)完成。對于外泌體mirna，圖16a中所示的級(jí)分7在af4方案的本設(shè)計(jì)中未被收集，并且在該級(jí)分中洗脫的較大外泌體中包封的mirna未被提取。所有這些促成微芯片方法的更高的mirna回收率。外泌體mirna的芯片上提取產(chǎn)生比invitrogen總外泌體分離試劑盒更高量的mirna(圖19b中的白色柱相對于圖案化柱)。這可能是由于，本公開內(nèi)容的方法能夠回收更多的大外泌體，而具有更少的來自脂蛋白復(fù)合物的污染，如圖16a中當(dāng)使用af4來分析外泌體尺寸分布和純度時(shí)所述。感興趣的是，對于脂蛋白締合的mirna，使用微芯片方法和通過免疫捕獲獲得相當(dāng)?shù)膍irna量(圖19c中的白色柱相對于圖案化柱)。在不使用昂貴的抗體和復(fù)雜的親和捕獲的情況下，通過多種化學(xué)物質(zhì)分離脂蛋白結(jié)合的mirna，出乎意料地簡單但有效的方法，并且對于所有四種受試mirna鏈產(chǎn)生相當(dāng)(如果不是更高)的回收率。
人血清的分析.獲得來自人受試者的7份血清樣品。這些樣品收集自乳腺癌患者。此外，從innovativeresearchinc.購得健康血清，與每個(gè)癌癥受試者的年齡和種族相匹配，作為對照。一個(gè)病例和一個(gè)對照的mirna分布譜提供在圖20a和b中?？梢钥闯?，每種mirna在三種主要載體之間在其分布方面顯示出不同的模式，這與它們?nèi)绾畏置诤娃D(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。通過將來自所有(n＝7)病例的每個(gè)級(jí)分中的平均mirna含量與來自所有(n＝3)對照的進(jìn)行比較，在各級(jí)分中鑒定到與使用總mirna含量的變化相比更大的變化(圖20c)。圖20c中的圖案化柱表示病例和對照之間在總mirna含量方面的變化。這些變化通常在±0.5的范圍內(nèi)，表明mirna含量的倍數(shù)變化小于10，由于個(gè)體之間的差異較大，這在人樣品中mirna表達(dá)譜的大規(guī)模分析中被認(rèn)為是不可靠的。相比之下，經(jīng)分級(jí)mirna水平的大部分變化超出±1的范圍。例如，患者樣品中蛋白質(zhì)結(jié)合的mir-16和-155的水平比在健康個(gè)體中發(fā)現(xiàn)低超過100倍。脂蛋白締合的mir-105的水平在癌癥患者中甚至超過1000倍低。在病例中鑒定到外泌體let-7a和mir-375含量相對于對照近100倍的增加。感興趣的是，對所有樣品的分布譜進(jìn)行主成分分析(pca)在由前兩個(gè)主成分獲得的散點(diǎn)圖上產(chǎn)生了在所有病例和所有對照之間明確分組(圖20d)。這兩個(gè)主成分總結(jié)了超過78％的數(shù)據(jù)集中的全部差異。相比之下，使用總mirna含量或外泌體mirna分級(jí)，在pca之后在病例和對照之間未觀察到明確的分離。這些結(jié)果充分表明，與常規(guī)方法相比，分布譜分析可揭示癌癥患者和健康個(gè)體之間的更大變化。
本文中已經(jīng)描述了很多實(shí)施方案。盡管如此，應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行多種修改。因此，其他實(shí)施方案也在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表
<110>加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)
<120>確定循環(huán)rna的分布譜的方法
<130>00013-084wo1
<140>尚未分配
<141>2015-09-03
<150>us62/045,503
<151>2014-09-03
<160>9
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>23
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>cel-mir-67內(nèi)標(biāo)
<400>1
cgcucauucugccgguuguuaug23
<210>2
<211>22
<212>rna
<213>智人(homosapiens)
<400>2
ugagguaguagguuguauaguu22
<210>3
<211>22
<212>rna
<213>智人
<400>3
uagcagcacguaaauauuggcg22
<210>4
<211>23
<212>rna
<213>智人
<400>4
caacggaaucccaaaagcagcug23
<210>5
<211>23
<212>rna
<213>智人
<400>5
caaagugcuuacagugcagguag23
<210>6
<211>23
<212>rna
<213>智人
<400>6
uuaaugcuaaucgugauaggggu23
<210>7
<211>22
<212>rna
<213>智人
<400>7
uuuguucguucggcucgcguga22
<210>8
<211>22
<212>rna
<213>智人
<400>8
uagcuuaucagacugauguuga22
<210>9
<211>22
<212>rna
<213>智人
<400>9
uggagugugacaaugguguuug22
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