本發(fā)明涉及用于鑒定能夠誘發(fā)呼吸道致敏的試劑的方法以及用于這些方法中的陣列和分析試劑盒。
背景技術(shù)：
：：呼吸道致敏是由針對環(huán)境蛋白質(zhì)或某些低分子量(lmw)化合物的免疫應(yīng)答引起的上呼吸道和下呼吸道過敏性i型超敏反應(yīng)。呼吸道致敏的臨床癥狀，包括喘息、支氣管收縮和哮喘發(fā)作，在易于和先前致敏的個(gè)體中在反復(fù)暴露于相同化合物時(shí)產(chǎn)生[1]。在機(jī)制上，呼吸道致敏由cd4+th2細(xì)胞的活化引發(fā)并通過過敏原特異性ige抗體的產(chǎn)生增加進(jìn)行b淋巴細(xì)胞的分化來介導(dǎo)[1-3]。雖然呼吸道過敏通常由蛋白質(zhì)過敏原引起，但是lmw化合物主要與涉及cd8+t細(xì)胞和cd4+th1細(xì)胞的iv型超敏反應(yīng)誘發(fā)以及皮膚病狀如過敏性接觸性皮炎(acd)的發(fā)作有關(guān)。然而，某些類別的lmw化合物，例如二異氰酸酯[4]、酸酐[5]、鉑鹽[6]、活性染料[7]和氯胺t[8]，也可能對呼吸道致敏。對這些lmw化合物的暴露通常局限于職業(yè)環(huán)境，并且在長時(shí)間內(nèi)反復(fù)暴露可能最終導(dǎo)致患上職業(yè)性哮喘(oa)[3、9]。雖然已知較少的化學(xué)物質(zhì)引起呼吸道過敏(<100種已知物質(zhì))[10]，但與引起接觸性皮炎的化學(xué)物質(zhì)相比，健康影響仍然可以是災(zāi)難性的。例如，獲得性oa可能導(dǎo)致慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性[11]、廣泛性氣道重塑[12]，因而嚴(yán)重影響受侵襲個(gè)體的生活質(zhì)量。與oa相關(guān)的嚴(yán)重健康影響以及將新化合物引入工作環(huán)境(例如清潔劑和保健產(chǎn)品[9、13-15])強(qiáng)調(diào)需要準(zhǔn)確且可靠的用于潛在呼吸道致敏物的危害分類的測試策略。因此，這些化合物的主動(dòng)鑒定和表征仍然是非常重要的領(lǐng)域。然而，在這方面的挑戰(zhàn)是，引起呼吸道致敏的化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法極大地不發(fā)達(dá)[16]。目前的方法涉及體內(nèi)和體外測試策略。直到最近，該領(lǐng)域仍依賴于基于動(dòng)物的體內(nèi)模型。在這些基于動(dòng)物的方法中，豚鼠試驗(yàn)[17]、小鼠ige試驗(yàn)[18、19]、大鼠ige試驗(yàn)[20、21]和小鼠細(xì)胞因子指紋識(shí)別[22、23]得到了最多的關(guān)注。此外，文獻(xiàn)[24、25]中描述了旨在區(qū)分呼吸道致敏物與皮膚致敏物的幾種化學(xué)誘發(fā)哮喘鼠類模型。盡管這些方法無疑有助于目前對與呼吸道致敏發(fā)展相關(guān)的免疫生物學(xué)機(jī)制和細(xì)胞過程的理解，但是沒有一種方法被證明是足夠可靠的，以便出于調(diào)節(jié)目的用作常規(guī)測定法。另外，存在與使用基于動(dòng)物的方法作為篩選工具相關(guān)的重大的經(jīng)濟(jì)和倫理缺點(diǎn)。因此，已經(jīng)作出了相當(dāng)大的努力來開發(fā)基于細(xì)胞的呼吸道致敏體外測定，其與在directive201/63/eu[26]中所述的關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)和替代(replacement)的3r原則相關(guān)。最近的基于細(xì)胞的方法已經(jīng)涉及使用單細(xì)胞系作為致敏過程中不同階段的模型，例如樹突狀細(xì)胞系thp-1[27]和上皮細(xì)胞系beas-2b[28]和a549[29]。還已使用由epithelix開發(fā)的市售mucilairtm作為人類氣道上皮的3d細(xì)胞模型，進(jìn)行模擬呼吸道致敏物的體內(nèi)暴露途徑的更先進(jìn)的嘗試[30]。此外，在呼吸道致敏中正在探索基于化學(xué)反應(yīng)性的非細(xì)胞基計(jì)算機(jī)預(yù)測模型[31]。與缺乏呼吸道致敏的測定法相比，文獻(xiàn)描述了用于鑒定皮膚致敏化學(xué)物質(zhì)的幾種預(yù)測模型(綜述于[34]中)，其中基于動(dòng)物的局部淋巴結(jié)測定法(llna)[35]歷來是優(yōu)選方法。還已經(jīng)描述了幾種用于皮膚致敏終點(diǎn)的體外模型，包括人類細(xì)胞系活化測試(h-clat)[36、37]、直接肽激活測試(drpa)[38]和測試[39、40]。最近，我們還提出了我們內(nèi)部開發(fā)的基因組過敏原快速檢測(gard)[41、42]體外測定法作為這些方法的準(zhǔn)確替代方法。gard測定法是基于使用全轉(zhuǎn)錄組dna微陣列技術(shù)測量包含骨髓人類細(xì)胞系mutz-3[43-45]中的200個(gè)基因的基因組生物標(biāo)志物簽名(gard預(yù)測簽名或gps)的轉(zhuǎn)錄水平。在最近的研究中，使用包含26種盲式化合物和11種非盲式化合物的群組來評(píng)估gard測定法在預(yù)測性能方面的功能性。測定法的準(zhǔn)確度估計(jì)為89％[46]，相比于llna為72％[47]。皮膚致敏模型是引入關(guān)注的，因?yàn)橐呀?jīng)提出還可以應(yīng)用皮膚致敏測定法如llna來分類呼吸道致敏物[48、49]。llna測定法中的終點(diǎn)是在將小鼠局部暴露于測試化學(xué)物質(zhì)時(shí)在引流淋巴結(jié)中測量的引發(fā)增殖反應(yīng)[50、51]。然而，這種增殖反應(yīng)是由呼吸道致敏物和皮膚致敏物引起的。因此，雖然llna可用于致敏物與非致敏物的分層，但不能準(zhǔn)確區(qū)分皮膚致敏物與呼吸道致敏物[1]。因此，仍然需要建立準(zhǔn)確且可靠的用于特異性鑒定呼吸道致敏物的體外測定法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及基于基因組生物標(biāo)志物簽名來評(píng)估呼吸道致敏物的基于細(xì)胞的測試策略，作為動(dòng)物試驗(yàn)的新型替代方案。我們利用伴隨分析細(xì)胞完整轉(zhuǎn)錄組而產(chǎn)生的極大通用性，并擴(kuò)展了gard測定法的概念以包括通過鑒定單獨(dú)的基因組生物標(biāo)志物簽名(稱為gard呼吸道預(yù)測簽名(grps))來預(yù)測呼吸道致敏物。這可以用來分類呼吸道致敏物。所鑒定的生物標(biāo)志物簽名的預(yù)期用途將與gps組合用于皮膚致敏化學(xué)物質(zhì)的分類。因此，gard概念論證了可以同時(shí)用于未知化學(xué)物質(zhì)的皮膚和呼吸道致敏性質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和危害分類的測試平臺(tái)的獨(dú)特機(jī)會(huì)。因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種用于鑒定能夠在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)呼吸道致敏的試劑的方法，其包括以下步驟或由以下步驟組成：a)使樹突狀細(xì)胞群體或樹突樣細(xì)胞群體暴露于測試劑；和b)測量選自表a中限定的群組的一種或多種生物標(biāo)志物在所述細(xì)胞中的表達(dá)，其中在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在所述細(xì)胞中的表達(dá)指示所述測試劑的呼吸道致敏作用?！爸甘緶y試劑的呼吸道致敏作用”包括確定測試劑是否為呼吸道致敏物和/或確定測試劑作為呼吸道致敏物的效能?！澳軌蛘T發(fā)呼吸道致敏的試劑”是指能夠在哺乳動(dòng)物的呼吸道中誘發(fā)和觸發(fā)i型立即超敏反應(yīng)的任何試劑。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人類。優(yōu)選地，所述i型立即超敏反應(yīng)是dc介導(dǎo)的和/或涉及t細(xì)胞分化成th2細(xì)胞。優(yōu)選地，i型立即超敏反應(yīng)導(dǎo)致體液免疫和/或呼吸道過敏。哺乳動(dòng)物肺的傳導(dǎo)區(qū)包含氣管、支氣管、細(xì)支氣管和末端細(xì)支氣管。呼吸區(qū)包含呼吸道細(xì)支氣管、肺泡管和肺泡。所述傳導(dǎo)區(qū)由氣道組成，與血液無氣體交換，并用軟骨增強(qiáng)以保持打開氣道。所述傳導(dǎo)區(qū)加濕吸入的空氣并將其升溫至37℃(99℉)。它還通過經(jīng)由位于所有通道壁上的纖毛去除顆粒來清潔空氣。呼吸區(qū)是與血液交換氣體的部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，“能夠誘發(fā)哺乳動(dòng)物皮膚致敏的試劑”是能夠在哺乳動(dòng)物的肺上皮部位誘發(fā)和觸發(fā)i型立即超敏反應(yīng)的試劑。優(yōu)選地，所述肺上皮部位在肺的呼吸區(qū)中，但是可選地或另外地在肺的傳導(dǎo)區(qū)中。優(yōu)選地，所述方法是體外或離體方法。所述哺乳動(dòng)物可以是任何家畜或農(nóng)場動(dòng)物。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是大鼠、小鼠、豚鼠、貓、狗、馬或靈長類動(dòng)物。最優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人類。樹突狀細(xì)胞(dc)是構(gòu)成哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)一部分的免疫細(xì)胞。它們的主要功能是加工抗原物質(zhì)并將其呈遞于免疫系統(tǒng)的其它細(xì)胞的表面上(即它們起抗原呈遞細(xì)胞的作用)，從而橋接先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。樹突狀細(xì)胞存在于與外部環(huán)境接觸的組織中，例如皮膚(其中存在被稱為朗格漢斯細(xì)胞的特殊樹突狀細(xì)胞類型)以及鼻、肺、胃和腸的內(nèi)襯。它們也可以不成熟狀態(tài)存在于血液中。一旦被激活，它們就遷移到淋巴結(jié)，在那里它們與t細(xì)胞和b細(xì)胞相互作用以啟動(dòng)并形成適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在某些發(fā)育階段，它們生長出分枝突起，即樹突。雖然外觀相似，但這些是與神經(jīng)元的樹突不同的結(jié)構(gòu)。不成熟的樹突狀細(xì)胞也稱為面紗細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兙哂写蟮募?xì)胞質(zhì)‘面紗’而不是樹突?！皹渫粯蛹?xì)胞”是指表現(xiàn)出樹突狀細(xì)胞特異性的功能和表型特征如形態(tài)學(xué)特征、共刺激分子和mhcii類分子的表達(dá)以及胞飲大分子并激活靜息t細(xì)胞的能力的非樹突狀細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹突樣細(xì)胞是cd34+樹突狀細(xì)胞祖細(xì)胞。任選地，cd34+樹突狀細(xì)胞祖細(xì)胞可以在細(xì)胞因子刺激后獲得通過cd1d、mhci類和ii類呈遞抗原的表型，誘導(dǎo)特異性t細(xì)胞增殖，和/或在用炎癥性介體刺激時(shí)顯示成熟的轉(zhuǎn)錄和表型譜(即與未成熟樹突狀細(xì)胞或朗格漢斯樣樹突狀細(xì)胞相似的表型)。樹突狀細(xì)胞可以通過功能、表型和/或基因表達(dá)模式，特別是通過細(xì)胞表面表型來識(shí)別。這些細(xì)胞的特征在于其獨(dú)特的形態(tài)、高水平的表面mhc-ii類表達(dá)以及向cd4+和/或cd8+t細(xì)胞、特別是向初始t細(xì)胞呈遞抗原的能力(steinman等,(1991)《免疫學(xué)年評(píng)(ann.rev.immunol.)》,9:271)。樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面是不尋常的，具有特征性的面紗樣突起，并且特征在于細(xì)胞表面標(biāo)志物cd11c和mhcli類的表達(dá)。大多數(shù)dc對其它白細(xì)胞譜系的標(biāo)志物呈陰性，包括t細(xì)胞、b細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞的亞群也可以表達(dá)選自下組的其它標(biāo)志物：33d1、ccr1、ccr2、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、cd1a-d、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd11b、cd24、cd40、cd48、cd54、cd58、cd80、cd83、cd86、cd91、cd117、cd123(il3ra)、cd134、cd137、cd150、cd153、cd162、cxcr1、cxcr2、cxcr4、dcir、dc-lamp、dc-sign、dec205、e-鈣粘蛋白、朗格素(langerin)、甘露糖受體、marco、tlr2、tlr3tlr4、tlr5、tlr6、tlr9、cd14、cd34、hla-dr和幾種凝集素。這些細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)模式可隨著樹突狀細(xì)胞的成熟度、其起源組織和/或其起源物種的變化而變化。不成熟的樹突狀細(xì)胞表達(dá)低水平的mhcii類，但能夠內(nèi)吞抗原蛋白并加工它們以便以與mhcii類分子的復(fù)合物形式呈遞。激活的樹突狀細(xì)胞表達(dá)高水平的mhc11類、icam-1和cd86，并且能夠刺激天然同種異體t細(xì)胞的增殖，例如在混合白細(xì)胞反應(yīng)(mlr)中。在功能上，可以通過用于測定抗原呈遞的任何適宜的測定法來鑒定樹突狀細(xì)胞或樹突樣細(xì)胞。這種測定法可包括通過呈遞測試抗原，接著測定t細(xì)胞增殖、il-2釋放等，來測試刺激抗原引發(fā)和/或天然t細(xì)胞的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹突樣細(xì)胞包括上皮細(xì)胞和/或上皮樣細(xì)胞，例如beas-2b[28]、wt9-7和a549[29]。優(yōu)選地，所述上皮細(xì)胞是肺上皮細(xì)胞。優(yōu)選地，所述上皮樣細(xì)胞是肺上皮樣細(xì)胞。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，樹突樣細(xì)胞包括上皮細(xì)胞和/或上皮樣細(xì)胞。“表達(dá)”是指基因產(chǎn)物如mrna或蛋白質(zhì)的水平或數(shù)量。檢測和/或測量蛋白質(zhì)和/或核酸濃度的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，參見例如sambrook和russell,2001,coldspringharborlaboratorypress。用于檢測和/或測量蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法包括western印跡法、north-western印跡法、免疫吸附測定法(elisa)、抗體微陣列、組織微陣列(tma)、免疫沉淀、原位雜交和其它免疫組織化學(xué)技術(shù)、放射免疫測定法(ria)、免疫放射測定法(irma)和免疫酶學(xué)測定法(iema)，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的夾心測定法。示例性夾心測定法由david等在特此通過引用并入的美國專利no.4,376,110和4,486,530中進(jìn)行描述。載玻片上的細(xì)胞的抗體染色可用于如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷測試中眾所周知的方法中。通常，elisa涉及使用通常在固相測定法中產(chǎn)生有色反應(yīng)產(chǎn)物的酶。已經(jīng)廣泛使用諸如辣根過氧化物酶和磷酸酶的酶。擴(kuò)增磷酸酶反應(yīng)的方法是使用nadp作為底物產(chǎn)生nad，其現(xiàn)在作為第二酶體系的輔酶。來自大腸桿菌的焦磷酸酶提供了良好的結(jié)合物，因?yàn)樵撁覆淮嬖谟诮M織中，是穩(wěn)定的并且提供良好的反應(yīng)顏色。還可以使用基于酶如熒光素酶的化學(xué)發(fā)光體系。通常使用與維生素生物素的結(jié)合，因?yàn)檫@可以通過其與在極大的特異性和親和力下所結(jié)合的酶聯(lián)抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素的反應(yīng)容易地檢測。核酸(例如mrna)的檢測和/或測量的優(yōu)選方法包括southern印跡法、northern印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)、定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr)、納米陣列、微陣列、宏陣列、放射自顯影術(shù)和原位雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括以下步驟：c)在哺乳動(dòng)物中使樹突狀細(xì)胞或樹突樣細(xì)胞的單獨(dú)群體暴露于并非呼吸道致敏物的一種或多種陰性對照劑；和d)測量在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在所述細(xì)胞中的表達(dá)，其中如果步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在測試樣本中的存在和/或量不同于在步驟(d)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在對照樣本中的存在和/或量，則所述測試劑被鑒定為呼吸道致敏物。“不同于在步驟(b)中測量的一種或多種蛋白質(zhì)在對照樣本中的存在和/或量”是指測試樣本中的存在和/或量以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著方式不同于一種或多種陰性對照樣本的存在和/或量。優(yōu)選地，暴露于測試劑的細(xì)胞群體中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)是：小于或等于暴露于陰性對照劑的細(xì)胞群體的80％，例如不超過暴露于陰性對照劑的細(xì)胞群體的79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％；或暴露于陰性對照劑的細(xì)胞群體的至少120％，例如，暴露于陰性對照劑的細(xì)胞群體的至少121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％、130％、131％、132％、133％、134％、135％、136％、137％、138％、139％、140％、141％、142％、143％、144％、145％、146％、147％、148％、149％、150％、151％、152％、153％、154％、155％、156％、157％、158％、159％、160％、161％、162％、163％、164％、165％、166％、167％、168％、169％、170％、171％、172％、173％、174％、175％、176％、177％、178％、179％、180％、181％、182％、183％、184％、185％、186％、187％、188％、189％、190％、191％、192％、193％、194％、195％、196％、197％、198％、199％、200％、225％、250％、275％、300％、325％、350％、375％、400％、425％、450％、475％或至少500％?！安煌谠诓襟E(b)中測量的一種或多種蛋白質(zhì)在對照樣本中的存在和/或量”可選地或另外包括將測試樣本歸類為屬于與一種或多種陰性對照樣本不同的群組。例如，如果使用svm，則測試樣本與一種或多種陰性對照樣本在判定值閾值的不同側(cè)(例如，如果測試劑被歸類為呼吸道致敏物，如果一個(gè)或多個(gè)測試(或其平行測定)具有≤0的svm判定值，則一種或多種陽性對照樣本(或其大部分)也應(yīng)具有≤0的svm判定值)。所述一種或多種陰性對照劑可包含一種或多種試劑或由一種或多種試劑組成，所述試劑選自：1-丁醇；2-氨基苯酚；丙烯酸2-羥基乙酯；2-硝基-1,4-苯二胺；4-氨基苯甲酸；氯苯；二甲基甲酰胺；乙基香蘭素；甲醛；香葉醇；己基肉桂醛；異丙醇；kathoncg*；水楊酸甲酯；青霉素g；丙二醇；重鉻酸鉀；高錳酸鉀；tween80；和硫酸鋅(即表1中限定的呼吸道非致敏物群組)。所述一種或多種陰性對照劑可包含選自表1中限定的陰性對照劑群組的一種或多種試劑或由選自表1中限定的陰性對照劑群組的一種或多種試劑組成。所述陰性對照劑可以是與本發(fā)明的測試或?qū)φ談┮黄鹗褂玫娜軇Ｒ虼?，所述陰性對照可以是dmso和/或蒸餾水。所述方法可包括以下或由以下組成：使用至少2種陰性對照劑(即非致敏劑)，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99種或至少100種陰性對照劑?？蛇x地或另外，將樹突狀細(xì)胞或樹突樣細(xì)胞在測試劑暴露之前在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)用作陰性對照。另一種實(shí)施方案包括以下步驟：e)在哺乳動(dòng)物中使樹突狀細(xì)胞或樹突樣細(xì)胞的單獨(dú)群體暴露于作為呼吸道致敏物的一種或多種陽性對照劑；和f)測量在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在所述細(xì)胞中的表達(dá)，其中如果在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在測試樣本中的存在和/或量符合在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在一種或多種陽性對照樣本中的存在和/或量，則所述測試劑被鑒定為呼吸道致敏物?！胺弦环N或多種陽性對照樣本中的表達(dá)”是指暴露于測試劑的細(xì)胞群體中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)與暴露于另一種陽性對照劑的細(xì)胞群體相同或沒有顯著差異。優(yōu)選地，暴露于測試劑的細(xì)胞群體中的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)為暴露于另一種陽性對照劑的細(xì)胞群體的81％至119％，例如，大于或等于暴露于另一種陽性對照劑的細(xì)胞群體的82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且小于或等于暴露于另一種陽性對照劑的細(xì)胞群體的101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％或119％。“符合一種或多種陽性對照樣本中的表達(dá)”可選地或另外包括將測試樣本歸類為屬于與一種或多種陽性對照樣本相同的群組。例如，如果使用svm，則測試樣本與一種或多種陽性對照樣本在判定值閾值的同一側(cè)(例如，如果測試劑被歸類為呼吸道致敏物，如果一個(gè)或多個(gè)測試(或其平行測定)具有>0的svm判定值，則一種或多種陽性對照樣本(或其大部分)也應(yīng)具有>0的svm判定值)。所述一種或多種陽性對照劑可包含一種或多種試劑或由一種或多種試劑組成，所述試劑選自：六氯鉑酸銨；過硫酸銨；乙二胺；戊二醛；六亞甲基二異氰酸酯；馬來酸酐；亞甲基二酚二異氰酸酯；鄰苯二甲酸酐；甲苯二異氰酸酯；和偏苯三酸酐(即表1中限定的呼吸道致敏物群組)。一種或多種陽性對照劑可包含選自表1中限定的陽性對照劑群組的一種或多種試劑或由選自表1中限定的陽性對照劑群組的一種或多種試劑組成。所述方法可包括以下或由以下組成：使用至少2種陽性對照(即致敏劑)，例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99種或至少100種陽性對照劑。根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法可包括或不包括測量tnfrsf19的表達(dá)。所述方法可包括或不包括測量snora74a的表達(dá)。所述方法可包括或不包括測量spam1的表達(dá)。所述方法可包括或不包括測量ensembl轉(zhuǎn)錄本標(biāo)識(shí)號(hào)(etid):enst00000364621的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量homer3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cd1c的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ighd///ighm的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量snrpn///snord116-26的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364678的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量strap的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量diablo的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000411349的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385497的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or51a2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mrpl21的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ppp1r14a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量defb127的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c9orf130的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pro2012的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc399898的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387701的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量wdr68的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量neu2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386677的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量sparc的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000390342的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量crnn的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mmp12的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量acvrl1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量eif4e2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rp11-191l9.1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pdcd6///ahrr的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量arrdc3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量vwde的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量zbtb34的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量itgb1bp2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or10k2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量flj22596的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000306515的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量acvr2a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385690的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386018的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c6orf201的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385583的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385719的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量gpr20的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364357的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量zcchc13的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量gpr64的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cd1d的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量dusp12的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量klhl33的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量psmb6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tmem95的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c1qbp的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量emilin2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cd8a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c20orf152的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量kcnj4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364163的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fam19a1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000384601的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量polr2h的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ak000420的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000363354的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量affymetrix探針組標(biāo)識(shí)號(hào)(apid):8121483的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量egfl6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pou3f4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385841的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or52a5的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量timm8b的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pebp1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or4f6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cdh15的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tmem199的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量abi3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量flj42842的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mc4r的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000410673的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ism1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc440957的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量klb的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量gm2a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量anxa6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tas2r40的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:8142880的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rarres2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量sh2d4a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量plp1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量atp1a2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386800的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mat1a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tsga10ip的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量prdm7的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000390847的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000255183的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mrpl39的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386327的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tiparp的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hes1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000363502的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量prdm9的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000390917的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量kiaa1688的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000391219的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387973的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc100129534的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量slc2a1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量af116714的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量eps8l2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mgc3196的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量7952733的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000384391的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量eme2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量neto1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量nphs1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000384109的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364143的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量isx的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量il17rb的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pcolce2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量lrit3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000330110的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量znf354c的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386444的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or2g3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量glul的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cckbr的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or1s2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量dcun1d5的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000388291的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量emg1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pthlh的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ptges3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cideb的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000383863的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量atp10a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量myo5c的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000380078的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pla2g10的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hspe1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000388324的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量myo6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c7orf30的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000340779的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc441245的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量crim2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量xkr4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fam110b的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pebp4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc644714的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pappas的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量bex4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hmgb4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:bc028413///bc128516的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000363919的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000335621的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量sox1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ctsg的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000362344的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量flj37464的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rax的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量il29的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ceacam20的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:etid:enst00000365557的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量sec14l3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c3orf52的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fetub的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pigy的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cdh12的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量lgsn的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000391031的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hgc6.3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tcag7.873的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量t1560的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量exosc4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tram1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:8159371的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or13c2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pls3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tmem53的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cd1b的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量sorcs3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or52e8的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fam160a2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc649946的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fam158a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:7986637的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量myo1e的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量nupr1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:8005433的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量siglec15的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量2-mar的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc100131554的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ggtlc1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量psma7的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量slc25a18的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c3orf14的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cdx1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386433的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rragd的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量sdk1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc168474的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000384125的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量trhr的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量il11ra的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mgc21881///loc554249的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量znf483的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c9orf169的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mgc21881///loc554249的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364507的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387003的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000388083的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000365084的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量frg2///frg2b///frg2c的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c14orf53的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量odf3l1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fam18a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量prtn3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cfd的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tmed1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387150的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hsd17b14的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量bok的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000365609的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量snrpb的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量epha6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量scarna22的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量flj35424的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387555的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000388664的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000363365的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000362861的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000363181的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量grm6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc646093的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hist1h1e的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tiam2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000363074的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385777的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mtus1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量muc21的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量wdr8的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc100131195的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or4d10的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c12orf63的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ela1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量dnajc14///cip29的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量flj40176的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000410207的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量psme3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000405656的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hn1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000335523的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cyp2a7///cyp2a7p1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量atxn10的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量zmat5的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000362493的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fhit的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量frg2///frg2b///frg2c的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量snx18的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000362433的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量dtx2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量asb4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000365242的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364204的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量col5a1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量lcap的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apoo的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ptpru的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量il28ra的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量neurog3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量vax1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc440131的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c13orf31的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量adamts7的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量smtnl2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc284112的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etv2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fut2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c2orf39的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc200383///dnah6的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385676的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ccdc108的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:8065011的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c22orf27的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364444的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pdlim3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000330110的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000384539的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000390214的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量mgc72080的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c9orf128的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rgag4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pip5k1a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量gpr161的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385353的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or56a3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or5a2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量wnt11的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:7960259的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rab37的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量lair1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000388385的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量chac2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387574的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387884的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量bcl2l1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量kdelr3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tmem108的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量spata16的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量btc的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量supt3h的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量eif4b的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量chmp4c的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量h2bfm的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:8180392的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量nr5a2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量trim49的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ms4a6a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c11orf10的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hspc152的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rasal1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387531的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pldn的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量per1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量als2cr12的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c20orf142的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386848的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量loc100129113的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cerk的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000385783的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pros1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pcdhga的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量muc3b///muc3a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000365355的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:8156969的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000358047的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fam47c的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量nxf4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量piwil4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000384727的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量aldh6a1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量tmem64的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000364816的表達(dá)。所述方法可包括或不包括測量c11orf73的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量or5b21的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量nox5///spesp1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量amica1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387422的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量serpinb1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000387396的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cd1a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量rab9a的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量c10orf90的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量lpxn的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量ggtlc2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000384680的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量pnpla4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量camk1d的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000410754的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cdc123的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量wdfy1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hcg_1749005的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cd48的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量med19的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量drd5的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:7967586的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量vapa的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fam71f1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量apid:8141421的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量hccs的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量cnr2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量oit3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量bmp2k的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量znf366的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量syt17的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量calm2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量xk的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量art4的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000332418的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量zfp36l2的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量gsta3的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量col21a1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000332418的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量fuca1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量etid:enst00000386628的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量azu1的表達(dá)；所述方法可包括或不包括測量il7r的表達(dá)。所述方法可包括以下或由以下組成：在步驟(b)中，測量一種或多種在表a(i)中限定的生物標(biāo)志物，例如至少2或3種在表1a中限定的生物標(biāo)志物的表達(dá)。因此，所述方法可包括測量tnfrsf19的表達(dá)。所述方法可包括測量snora74a的表達(dá)。所述方法可包括測量spam1的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括以下或由以下組成：在步驟(b)中測量tnfrsf19、snora74a和spam1的表達(dá)。所述方法可另外或可選地包括以下或由以下組成：在步驟(b)中測量一種或多種在表a(ii)中限定的生物標(biāo)志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341或342種在表a(ii)中限定的生物標(biāo)志物的表達(dá)。所述方法可另外或可選地包括以下或由以下組成：在步驟(b)中測量一種或多種在表1c中限定的生物標(biāo)志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44種在表a(iii)中限定的生物標(biāo)志物的表達(dá)。因此，可在步驟(b)中測量表a(i)中限定的所有生物標(biāo)志物和/或表a(ii)中限定的所有生物標(biāo)志物和/或表a(iii)中限定的所有生物標(biāo)志物的表達(dá)。因此，所述方法可包括以下或由以下組成：在步驟(b)中測量表a中限定的所有生物標(biāo)志物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(b)包含以下或由以下組成：測量編碼一種或多種生物標(biāo)志物的核酸分子的表達(dá)。所述核酸分子可以是cdna分子或mrna分子。優(yōu)選地，所述核酸分子是mrna分子。然而，所述核酸分子可以是cdna分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)中一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)是使用選自以下的方法進(jìn)行的：southern雜交、northern雜交、聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)、定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr)、納米陣列、微陣列、宏陣列、放射自顯影術(shù)和原位雜交。優(yōu)選地，使用dna微陣列測量一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)。所述方法可包括在步驟(b)中使用一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分測量一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)，每一個(gè)結(jié)合部分能夠選擇性結(jié)合于編碼表a中鑒定的一種生物標(biāo)志物的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分各自包含核酸分子或由核酸分子組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分各自包含dna、rna、pna、lna、gna、tna或pmo或由dna、rna、pna、lna、gna、tna或pmo組成。優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分各自包含dna或由dna組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分的長度為5至100個(gè)核苷酸。然而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們的長度為15至35個(gè)核苷酸。一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分可包含來自humangene1.0starray(affymetrix,santaclara,ca,usa)的一個(gè)或多個(gè)探針或由來自humangene1.0starray(affymetrix,santaclara,ca,usa)的一個(gè)或多個(gè)探針組成。探針標(biāo)識(shí)號(hào)在本文表a中提供。合適的結(jié)合劑(也稱為結(jié)合分子)可根據(jù)如下文所討論的其結(jié)合給定的核酸、蛋白質(zhì)或氨基酸基序的能力從文庫中選擇或篩選。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合部分包含可檢測部分?！翱蓹z測部分”包括允許直接或間接地確定其存在和/或相對量和/或位置(例如，陣列上的位置)的部分。合適的可檢測部分是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，可檢測部分可以是熒光和/或發(fā)光和/或化學(xué)發(fā)光部分，其當(dāng)暴露于特定條件時(shí)可被檢測到。這樣的熒光部分可能需要暴露于特定波長和強(qiáng)度的輻射(即光)以引起熒光部分的激發(fā)，從而使其能夠以可檢測到的特定波長發(fā)射可檢測的熒光?？蛇x地，可檢測部分可以是能夠?qū)?優(yōu)選不可檢測的)底物轉(zhuǎn)化成能夠可視化和/或檢測的可檢測產(chǎn)物的酶。合適的酶的實(shí)例在下面關(guān)于例如elisa測定更詳細(xì)地討論。因此，所述可檢測部分可選自：熒光部分；發(fā)光部分；化學(xué)發(fā)光部分；放射性部分(例如，放射性原子)；或酶部分。優(yōu)選地，可檢測部分包含放射性原子或由放射性原子組成。所述放射性原子可選自锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、錸-186、錸-188和釔-90。顯然，要檢測的試劑(例如，本文所述的測試樣本和/或?qū)φ諛颖局械囊环N或多種生物標(biāo)志物和/或用于檢測所選蛋白質(zhì)的抗體分子)必須具有足夠的適當(dāng)原子同位素，以便可檢測部分易于檢測。在一個(gè)替代的優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合部分的可檢測部分是熒光部分。放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記可以已知方式合并到本發(fā)明方法的樣本中存在的生物標(biāo)志物和/或本發(fā)明的結(jié)合部分中。例如，如果結(jié)合劑是多肽，則其可以是生物合成的，或者可以使用涉及例如氟-19代替氫的合適的氨基酸前體通過化學(xué)氨基酸合成來合成。標(biāo)記如99mtc、123i、186rh、188rh和111in可以例如通過結(jié)合部分中的半胱氨酸殘基連接。釔-90可以通過賴氨酸殘基連接。iodogen方法(fraker等,(1978)《生物化學(xué)與生物物理研究通訊(biochem.biophys.res.comm.)》,80,49-57)可以用于合并123i。參考文獻(xiàn)(“免疫閃爍照相術(shù)中的單克隆抗體(monoclonalantibodiesinimmunoscintigraphy)”,j-fchatal,crcpress,1989)詳細(xì)描述了其它方法。將其它可檢測部分(例如酶、熒光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光或放射性部分)與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，待測試樣本中的生物標(biāo)志物可用間接幫助確定所述蛋白質(zhì)的存在、量和/或位置的部分進(jìn)行標(biāo)記。因此，所述部分可構(gòu)成多組分可檢測部分的一個(gè)組分。例如，待測試樣本中的生物標(biāo)志物可用生物素標(biāo)記，這允許它們隨后使用與可檢測標(biāo)記融合或以其它方式連接的抗生物素蛋白鏈菌素進(jìn)行檢測。在本發(fā)明的第一方面提供的方法可包括以下或由以下組成：在步驟(b)中，確定一種或多種在表a中限定的生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)的表達(dá)。所述方法可包括在步驟(b)中使用一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分測量一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)，每一個(gè)結(jié)合部分能夠選擇性結(jié)合于表a中鑒定的生物標(biāo)志物之一。所述一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分可包含以下或由以下組成：抗體或其抗原結(jié)合片段，例如單克隆抗體或其片段。術(shù)語“抗體”包括任何合成抗體、重組抗體或抗體雜合物，例如(但不限于)由免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈可變區(qū)和/或恒定區(qū)的噬菌體展示產(chǎn)生的單鏈抗體分子，或者能夠以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫測定形式結(jié)合抗原的其它免疫相互作用分子。還包括使用抗體樣結(jié)合劑，例如親和體和適體。參與合成保留其特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段的技術(shù)的一般綜述見于winter和milstein(1991)《自然(nature)》,349,293-299中。另外或可選地，第一結(jié)合分子中的一個(gè)或多個(gè)可以是適體(參見collett等,2005,《方法(methods)》,37:4-15)。分子文庫如抗體文庫(clackson等,1991,《自然(nature)》,352,624-628；marks等,1991,《分子生物學(xué)雜志(jmolbiol)》,222(3):581-97)、肽文庫(smith,1985,《科學(xué)(science)》,228(4705):1315-7)、表達(dá)的cdna文庫(santi等,(2000)《分子生物學(xué)雜志(jmolbiol)》,296(2):497-508)、不同于抗體框架的其它骨架如親和體上的文庫(gunneriusson等,1999,《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(applenvironmicrobiol)》,65(9):4134-40)或基于適體的文庫(kenan等,1999,《分子生物學(xué)方法(methodsmolbiol)》,118,217-31)可用作選擇用于本發(fā)明的方法中的對給定基序具特異性的結(jié)合分子的來源。分子文庫可以在原核細(xì)胞(clackson等,1991,同前；marks等,1991,同前)或真核細(xì)胞(kieke等,1999,《美國國家科學(xué)院院刊(procnatlacadsciusa)》,96(10):5651-6)中體內(nèi)表達(dá)或可以在不涉及細(xì)胞的情況下在體外表達(dá)(hanes和pluckthun,1997,《美國國家科學(xué)院院刊(procnatlacadsciusa)》,94(10):4937-42；he和taussig,1997,《核酸研究(nucleicacidsres)》,25(24):5132-4；nemoto等,1997,《歐洲生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)快報(bào)(febslett)》,414(2):405-8)。在使用基于蛋白質(zhì)的文庫的情況下，編碼潛在結(jié)合分子文庫的基因通常被包裹在病毒中，并且潛在的結(jié)合分子顯示在病毒表面(clackson等,1991,同上；marks等,1991,同上；smith,1985,同上)?；蛟S最常用的顯示系統(tǒng)是在其表面顯示抗體片段的絲狀噬菌體，所述抗體片段表達(dá)為與噬菌體的小外殼蛋白的融合物(clackson等,1991,同上；marks等,1991,同上)。然而，用于顯示的其它合適的系統(tǒng)包括使用其它病毒(ep39578)、細(xì)菌(gunneriusson等,1999,同上；daugherty等,1998,《蛋白質(zhì)工程(proteineng)》,11(9):825-32；daugherty等,1999,《蛋白質(zhì)工程(proteineng)》,12(7):613-21)和酵母(shusta等,1999,《分子生物學(xué)雜志(jmolbiol)》,292(5):949-56)。另外，已利用所謂的核糖體展示系統(tǒng)中的多肽產(chǎn)物與其編碼mrna的連接(hanes和pluckthun,1997,同上；he和taussig,1997,同上；nemoto等,1997,同上)，或者可選地多肽產(chǎn)物與編碼dna的連接(參見美國專利no.5,856,090和wo98/37186)，開發(fā)了顯示系統(tǒng)?？贵w的可變重(vh)和可變輕(vl)結(jié)構(gòu)域參與抗原識(shí)別，這一事實(shí)通過早期蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)而首先認(rèn)識(shí)到。通過嚙齒動(dòng)物抗體的“人源化”進(jìn)一步證實(shí)。嚙齒動(dòng)物源的可變結(jié)構(gòu)域可融合到人源恒定結(jié)構(gòu)域，使得所得抗體保留嚙齒動(dòng)物親本抗體的抗原特異性(morrison等,(1984)《美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》,81,6851-6855)。該抗原特異性由可變結(jié)構(gòu)域賦予并且與恒定結(jié)構(gòu)域無關(guān)，這是從涉及全部含有一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段的細(xì)菌表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中已知的。這些分子包括fab樣分子(better等,(1988)《科學(xué)(science)》,240,1041)；fv分子(skerra等,(1988)《科學(xué)(science)》,240,1038)；單鏈fv(scfv)分子，其中vh和vl配偶結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽連接(bird等,(1988)《科學(xué)(science)》,242,423；huston等,(1988)《美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》,85,5879)和包含分離的v結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體(dab)(ward等,(1989)《自然(nature)》,341,544)。參與合成保留其特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段的技術(shù)的一般綜述見于winter和milstein(1991)《自然(nature)》,349,293-299中。抗體或抗原結(jié)合片段可選自完整抗體、fv片段(例如單鏈fv和二硫鍵鍵合的fv)、fab樣片段(例如fab片段、fab'片段和f(ab)2片段)、單可變結(jié)構(gòu)域(例如vh和vl結(jié)構(gòu)域)和結(jié)構(gòu)域抗體(dab，包括單一和雙重格式[即dab-連接子-dab])。優(yōu)選地，抗體或抗原結(jié)合片段是單鏈fv(scfv)。一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分可以可選地包含以下或由以下組成：抗體樣結(jié)合劑，例如親和體或適體。“scfv分子”是指其中vh和vl配偶結(jié)構(gòu)域通過柔性寡肽連接的分子。使用抗體片段而不是全抗體的優(yōu)點(diǎn)達(dá)數(shù)倍。片段的較小尺寸可能導(dǎo)致改進(jìn)的藥理學(xué)性質(zhì)，例如更好地滲透固體組織。全抗體的效應(yīng)功能如補(bǔ)體結(jié)合被去除。fab、fv、scfv和dab抗體片段都可以在大腸桿菌中表達(dá)和分泌，從而允許容易地產(chǎn)生大量的所述片段。全抗體和f(ab')2片段是“二價(jià)”的。“二價(jià)”是指所述抗體和f(ab')2片段具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。相比之下，fab、fv、scfv和dab片段是單價(jià)的，僅具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w可以是單克隆或多克隆的。合適的單克隆抗體可通過已知技術(shù)制備，例如在“單克隆抗體：技術(shù)手冊(monoclonalantibodies:amanualoftechniques)”,hzola(crcpress,1988)和“單克隆雜交瘤抗體：技術(shù)與應(yīng)用(monoclonalhybridomaantibodies:techniquesandapplications)”,jgrhurrell(crcpress,1982)中公開的那些，所述文獻(xiàn)都通過引用并入本文。當(dāng)潛在的結(jié)合分子選自文庫時(shí)，通常使用一種或多種具有限定的基序的選擇肽。提供降低肽中的撓性的結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基或者允許與結(jié)合分子相互作用的帶電荷的、極性或疏水性側(cè)鏈可用于選擇肽基序的設(shè)計(jì)。例如：(i)脯氨酸可以穩(wěn)定肽結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗膫?cè)鏈與α碳以及氮結(jié)合；(ii)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳族側(cè)鏈并且是高疏水性的，而亮氨酸和異亮氨酸具有脂族側(cè)鏈并且也是疏水性的；(iii)賴氨酸、精氨酸和組氨酸具有堿性側(cè)鏈并且將在中性ph下帶正電荷，而天冬氨酸和谷氨酸具有酸性側(cè)鏈并且將在中性ph下帶負(fù)電荷；(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性ph下是中性的，但含有可能參與氫鍵的酰胺基；(v)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側(cè)鏈含有可能參與氫鍵的羥基。通常，結(jié)合分子的選擇可能涉及使用陣列技術(shù)和系統(tǒng)來分析對應(yīng)于結(jié)合分子類型的點(diǎn)的結(jié)合。一種或多種蛋白質(zhì)結(jié)合部分可包含可檢測部分。所述可檢測部分可選自熒光部分、發(fā)光部分、化學(xué)發(fā)光部分、放射性部分和酶部分。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)可使用包含能夠結(jié)合一種或多種蛋白質(zhì)的第二結(jié)合劑的測定法進(jìn)行，所述第二結(jié)合劑還包含可檢測部分。上文關(guān)于第一結(jié)合劑詳細(xì)描述了合適的第二結(jié)合劑。因此，待測試樣本中的相關(guān)蛋白質(zhì)可首先使用第一結(jié)合劑分離和/或固定，之后可使用第二結(jié)合劑確定所述生物標(biāo)志物的存在和/或相對量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二結(jié)合劑是抗體或其抗原結(jié)合片段；通常是重組抗體或其片段。適宜地，所述抗體或其片段選自：scfv；fab；免疫球蛋白分子的結(jié)合域。合適的抗體和片段及其制備方法在上文中詳細(xì)描述?？蛇x地，第二結(jié)合劑可以是抗體樣結(jié)合劑，例如親和體或適體?？蛇x地，當(dāng)待測試樣本中的蛋白質(zhì)上的可檢測部分包含特異性結(jié)合對的成員(例如生物素)或由包含特異性結(jié)合對的成員(例如生物素)組成時(shí)，所述第二結(jié)合劑可包含所述特異性結(jié)合對的互補(bǔ)成員(例如抗生物素蛋白鏈菌素)或由所述特異性結(jié)合對的互補(bǔ)成員(例如抗生物素蛋白鏈菌素)組成。當(dāng)使用檢測測定法時(shí)，可檢測部分優(yōu)選選自：熒光部分；發(fā)光部分；化學(xué)發(fā)光部分；放射性部分；酶部分。用于本發(fā)明方法中的合適的可檢測部分的實(shí)例如上所述。用于檢測血清或血漿蛋白的優(yōu)選測定法包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)、放射免疫測定法(ria)、免疫放射測定法(irma)和免疫酶測定法(iema)，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的夾心測定法。david等在特此通過引用并入的美國專利no.4,376,110和4,486,530中描述了示例性夾心測定法。載玻片上的細(xì)胞的抗體染色可用于如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷測試中眾所周知的方法。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測定法是elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定法)，其通常涉及使用通常在固相測定中產(chǎn)生有色反應(yīng)產(chǎn)物的酶。已經(jīng)廣泛使用諸如辣根過氧化物酶和磷酸酶的酶。擴(kuò)增磷酸酶反應(yīng)的方法是使用nadp作為底物產(chǎn)生nad，其現(xiàn)在作為第二酶系統(tǒng)的輔酶。來自大腸桿菌的焦磷酸酶提供了良好的結(jié)合物，因?yàn)樵撁覆淮嬖谟诮M織中，是穩(wěn)定的并且提供良好的反應(yīng)顏色。也可以使用基于酶如熒光素酶的化學(xué)發(fā)光體系。通常使用與維生素生物素的結(jié)合，因?yàn)檫@可以通過其與在極大的特異性和親和力下所結(jié)合的酶聯(lián)抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素的反應(yīng)容易地檢測。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，用于蛋白質(zhì)檢測的測定法適宜地是熒光測定法。因此，第二結(jié)合劑的可檢測部分可以是熒光部分，例如alexa熒光團(tuán)(例如alexa-647)。優(yōu)選地，使用陣列執(zhí)行步驟(b)、(d)和/或(f)。所述陣列可能是基于珠粒的陣列或基于表面的陣列。所述陣列可選自：宏陣列；微陣列；納米陣列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用于鑒定能夠誘發(fā)呼吸道超敏反應(yīng)的試劑。優(yōu)選地，所述超敏反應(yīng)是體液超敏反應(yīng)，例如i型超敏反應(yīng)。優(yōu)選地，所述方法用于鑒定能夠誘發(fā)呼吸道過敏的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹突狀細(xì)胞群體或樹突樣細(xì)胞群體是樹突狀細(xì)胞群體。優(yōu)選地，樹突狀細(xì)胞是原代樹突狀細(xì)胞。優(yōu)選地，樹突狀細(xì)胞是骨髓樹突狀細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞或樹突樣細(xì)胞的群體優(yōu)選是哺乳動(dòng)物來源。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是大鼠、小鼠、豚鼠、貓、狗、馬或靈長類動(dòng)物。最優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物是人類。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹突狀細(xì)胞群體或樹突樣細(xì)胞群體是樹突樣細(xì)胞群體，優(yōu)選是骨髓樹突樣細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹突樣細(xì)胞表達(dá)選自cd54、cd86、cd80、hla-dr、cd14、cd34和cd1a的至少一種標(biāo)志物，例如2、3、4、5、6或7種標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樹突樣細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物cd54、cd86、cd80、hla-dr、cd14、cd34和cd1a。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樹突樣細(xì)胞可能源自骨髓樹突狀細(xì)胞。優(yōu)選地，樹突樣細(xì)胞是骨髓性白血病源細(xì)胞。優(yōu)選地，骨髓性白血病源細(xì)胞選自kg-1、thp-1、u-937、hl-60、monomac-6、aml-193、單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞(modc)和mutz-3。最優(yōu)選地，樹突樣細(xì)胞是mutz-3細(xì)胞。mutz-3細(xì)胞是人類急性骨髓單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞，其可從1995年5月15日起從deutschesammlungfürmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsmz),inhoffenstraβe7b,braunschweig,germany(www.dsmz.de)在保藏號(hào)acc295下獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹突樣細(xì)胞在用細(xì)胞因子刺激后，通過cd1d、mhci和ii類呈遞抗原和/或誘導(dǎo)特異性t細(xì)胞增殖。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法指示測試劑是否為呼吸道致敏劑。在替代或額外實(shí)施方案中，所述方法指示待測試樣本的呼吸道致敏效能。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法指示測試劑的致敏物效能(即，測試劑是非致敏物、弱致敏物、中等致敏物、強(qiáng)致敏物或極強(qiáng)致敏物)。pca中的判定值和距離與致敏物效能相關(guān)?？蛇x地或另外，測試劑效能可通過在步驟(e)中提供如下來確定：(i)一種或多種極強(qiáng)呼吸道致敏物陽性對照劑；(ii)一種或多種強(qiáng)呼吸道致敏物陽性對照劑；(iii)一種或多種中等呼吸道致敏物陽性對照劑；和/或(iv)一種或多種弱呼吸道致敏物陽性對照劑，其中如果在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在測試樣本中的存在和/或量符合在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在極強(qiáng)陽性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)；和/或不同于在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在強(qiáng)、中等、弱和/或陰性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)，則所述測試劑被鑒定為極強(qiáng)呼吸道致敏物，其中如果在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在測試樣本中的存在和/或量符合在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在強(qiáng)陽性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)；和/或不同于在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在極強(qiáng)、中等、弱和/或陰性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)，則所述測試劑被鑒定為強(qiáng)呼吸道致敏物，其中如果在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在測試樣本中的存在和/或量符合在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在中等陽性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)；和/或不同于在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在極強(qiáng)、強(qiáng)、弱和/或陰性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)，則所述測試劑被鑒定為中等呼吸道致敏物，和其中如果在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在測試樣本中的存在和/或量符合在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在弱陽性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)；和/或不同于在步驟(f)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物在極強(qiáng)、強(qiáng)、中等和/或陰性對照樣本中的存在和/或量(如果存在的話)，則所述測試劑被鑒定為弱呼吸道致敏物。因此，步驟(e)可包括以下或由以下組成：提供以下類別的呼吸道致敏物陽性對照：(a)極強(qiáng)、強(qiáng)、中等和弱；(b)強(qiáng)、中等和弱；(c)極強(qiáng)、中等和弱；(d)極強(qiáng)、強(qiáng)和中等；(e)極強(qiáng)和強(qiáng)；(f)強(qiáng)和中等；(g)中等和弱；(h)強(qiáng)和弱；(i)極強(qiáng)和中等；(j)極強(qiáng)和弱；(k)極強(qiáng)；(l)強(qiáng)；(m)中等；(n)弱。根據(jù)在人類中的臨床觀察，可將陰性和陽性對照分別歸類為呼吸道非致敏物或呼吸道致敏物。可選地或另外，所述方法可包括將在步驟(b)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)與表示在步驟(c)和/或步驟(e)中測量的一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)預(yù)定參考值進(jìn)行比較。一般來說，呼吸道致敏劑被測定為具有至少0.55的rocauc，例如具有至少0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99的rocauc或具有1.00的rocauc。優(yōu)選地，皮膚致敏劑被測定為具有至少0.85的rocauc，并且最優(yōu)選地具有1的rocauc。通常，使用支持向量機(jī)(svm)，例如可從http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html(例如e10711.5-24)獲得的那些，來鑒定能夠誘發(fā)呼吸道致敏的試劑。然而，也可以使用任何其它合適的手段。還可以使用svm來確定生物標(biāo)志物簽名的rocauc，所述生物標(biāo)志物簽名包括如本文所定義的一種或多種表1生物標(biāo)志物或由如本文所定義的一種或多種表1生物標(biāo)志物組成。支持向量機(jī)(svm)是一組用于分類和回歸的相關(guān)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。給出一組訓(xùn)練實(shí)例，每個(gè)訓(xùn)練實(shí)例被標(biāo)記為屬于兩個(gè)類別之一，svm訓(xùn)練算法構(gòu)建一個(gè)模型，該模型預(yù)測新實(shí)例是否屬于一個(gè)類別或另一個(gè)。直觀地，svm模型是將實(shí)例表示為空間中的映射點(diǎn)，使得單獨(dú)類別的實(shí)例被除以盡可能寬的明確間隔。然后將新的實(shí)例映射到相同的空間中，并且根據(jù)它們落在間隔的哪一側(cè)來預(yù)測屬于哪個(gè)類別。更正式地，支持向量機(jī)在高或無限維空間中構(gòu)建超平面或一組超平面，其可以用于分類、回歸或其它任務(wù)。直觀地，通過與任何類別的最接近的訓(xùn)練數(shù)據(jù)點(diǎn)(所謂的官能余量)具有最大距離的超平面實(shí)現(xiàn)良好的分離，因?yàn)橥ǔＴ６仍酱?，分類器的泛化誤差越低。有關(guān)svm的更多信息，參見例如burges,1998,《數(shù)據(jù)挖掘和知識(shí)發(fā)現(xiàn)(dataminingandknowledgediscovery)》,2:121-167。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在使用已知試劑(即已知的致敏劑或非致敏劑)的生物標(biāo)志物概況進(jìn)行本發(fā)明方法之前，svm被“訓(xùn)練”。通過運(yùn)行這樣的訓(xùn)練樣本，svm能夠?qū)W習(xí)什么樣的生物標(biāo)志物概況與能夠誘發(fā)致敏的試劑相關(guān)聯(lián)。一旦訓(xùn)練過程完成，svm就能夠預(yù)測所測試的生物標(biāo)志物樣本是來自致敏劑還是非致敏劑。單獨(dú)svm的判定值可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體情況確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果一個(gè)或多個(gè)測試(或其平行測定)的svm判定值>0，則測試劑被歸類為呼吸道致敏物。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果一個(gè)或多個(gè)測試(或其平行測定)的svm判定值≤0，則測試劑被歸類為非呼吸道致敏物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用于鑒定作為呼吸道致敏物的試劑，而不管它們是否也是皮膚致敏物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用于鑒定作為呼吸道致敏物但不是皮膚致敏物的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法用于鑒定作為呼吸道致敏物和皮膚致敏物的試劑。這允許測試劑被歸類為致敏或不致敏。此外，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過用已知效能的致敏劑(即非致敏劑、弱、中等、強(qiáng)或極強(qiáng)致敏劑)訓(xùn)練svm，也可以比較性鑒定測試劑的效能。然而，該訓(xùn)練程序可以通過利用必要訓(xùn)練參數(shù)預(yù)先編程svm進(jìn)行旁通。例如，可以基于表a中列出的所有生物標(biāo)志物的測量結(jié)果和/或表b中列出的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用表5中詳述的svm算法根據(jù)已知的svm參數(shù)來鑒定能夠誘發(fā)致敏的試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以通過用適當(dāng)選擇的數(shù)據(jù)(即暴露于已知致敏劑和/或非致敏劑的細(xì)胞的生物標(biāo)志物測量結(jié)果)訓(xùn)練svm機(jī)器來確定表a列出的生物標(biāo)志物的任何組合的合適的svm參數(shù)?？蛇x地，根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何其它合適的統(tǒng)計(jì)方法，表a生物標(biāo)志物可用于鑒定能夠誘發(fā)呼吸道致敏的試劑。可選地，根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何其它合適的統(tǒng)計(jì)方法(例如，anova、ancova、manova、mancova、多變量回歸分析、主成分分析(pca)、因子分析、典型相關(guān)分析、典型相關(guān)分析、冗余分析對應(yīng)分析(ca；倒數(shù)平均)、多維縮放、判別分析、線性判別分析(lda)、聚類系統(tǒng)、遞歸分割和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))，表a數(shù)據(jù)和/或表b數(shù)據(jù)可用于鑒定能夠誘發(fā)呼吸道致敏的試劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法具有至少65％的準(zhǔn)確度，例如66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％準(zhǔn)確度。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法具有至少65％的靈敏度，例如66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％靈敏度。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法具有至少65％的特異性，例如66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％特異性?！皽?zhǔn)確度”是指方法的正確結(jié)果的比例，“靈敏度”是指正確分類為陽性的所有陽性化學(xué)物質(zhì)的比例，并且“特異性”是指正確分類為陰性的所有陰性化學(xué)物質(zhì)的比例。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一方面的方法包括同時(shí)或連續(xù)地執(zhí)行一種鑒定能夠誘發(fā)哺乳動(dòng)物皮膚致敏的試劑的方法，其在通過引用并入本文的pct公開號(hào)wo2012/056236中描述(特別是，本發(fā)明的方面和實(shí)施方案以及權(quán)利要求)。優(yōu)選地，用于鑒定能夠誘發(fā)哺乳動(dòng)物皮膚致敏的試劑的方法與本發(fā)明的第一方面的方法(即，通過在暴露于測試劑的相同細(xì)胞樣本中測量相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)來確定測試化合物是否為皮膚和/或呼吸道致敏物)同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明的第二方面提供了一種用于本發(fā)明第一方面的方法(或其任何實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合)中的陣列，所述陣列包含如上文所定義的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分或由如上文所定義的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合部分(共同地)能夠結(jié)合于表a(i)中限定的所有生物標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合部分(共同地)能夠結(jié)合于表a(ii)中限定的所有生物標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合部分(共同地)能夠結(jié)合于表a(iii)中限定的所有生物標(biāo)志物。優(yōu)選地，結(jié)合部分(共同地)能夠結(jié)合于表a中限定的所有生物標(biāo)志物。所述結(jié)合部分可能是固定的。陣列本身是本領(lǐng)域眾所周知的。通常，它們由具有間隔開(即離散)區(qū)域(“點(diǎn)”)的線性或二維結(jié)構(gòu)形成，每個(gè)區(qū)域具有在固體支撐物表面上形成的有限面積。陣列也可以是珠粒結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)珠?？梢酝ㄟ^分子代碼或顏色代碼鑒定或者在連續(xù)流中鑒定。分析也可以依序執(zhí)行，其中樣本通過一系列的點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)吸附來自溶液的分子類別。固體支撐物通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支撐物可以是如下形式：管、珠粒、圓盤、硅芯片、微板、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜、其它多孔膜、無孔膜(例如塑料、聚合物、有機(jī)玻璃、硅等)、多個(gè)聚合物針，或多個(gè)微量滴定孔，或適合于固定蛋白質(zhì)、多聚核苷酸和其它合適分子和/或進(jìn)行免疫測定法的任何其它表面。結(jié)合方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且通常由將蛋白質(zhì)分子、多聚核苷酸等交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合或物理吸附到固體支撐物組成。可選地，可使用經(jīng)由親和標(biāo)簽或類似構(gòu)建體進(jìn)行的探針的親和偶聯(lián)。通過使用諸如接觸或非接觸印刷、掩?；蚬饪碳夹g(shù)等眾所周知的技術(shù)，可以限定每個(gè)點(diǎn)的位置。關(guān)于綜述，參見jenkins,r.e.,pennington,s.r.(2001,《蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)》,2,13-29)和lal等,(2002,《現(xiàn)代藥物探索(drugdiscovtoday)》,15；7(18增刊):s143-9)。通常所述陣列是微陣列。“微陣列”包括具有至少約100/cm2并且優(yōu)選至少約1000/cm2的離散區(qū)域的密度的區(qū)域陣列的含義。微陣列中的區(qū)域具有典型的尺寸，例如直徑在約10-250μm的范圍內(nèi)，并且與陣列中的其它區(qū)域間隔大致相同的距離。陣列可選地是宏陣列或納米陣列。一旦已經(jīng)鑒定和分離了合適的結(jié)合分子(上文討論)，則本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的方法來制造陣列。優(yōu)選地，所述陣列與本發(fā)明的第一方面中描述的方法以及其中描述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案一致。本發(fā)明的第三方面提供了從表a(i)、表a(ii)和/或表a(iii)中限定的群組中選出的一種或多種(優(yōu)選地兩種或更多種)生物標(biāo)志物組合用于鑒定超敏反應(yīng)致敏劑的用途。優(yōu)選地，表a(i)和表a(ii)中限定的所有生物標(biāo)志物被共同用于鑒定超敏反應(yīng)致敏劑。優(yōu)選地，所述用途與本發(fā)明的第一方面中描述的方法以及其中描述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案一致。本發(fā)明的第四方面提供了如本發(fā)明的第一方面所限定的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選地兩個(gè)或更多個(gè))結(jié)合部分的用途。優(yōu)選地，用于表a(i)和表a(ii)中限定的所有生物標(biāo)志物的結(jié)合部分被共同用于鑒定超敏反應(yīng)致敏劑。優(yōu)選地，所述用途與本發(fā)明的第一方面中描述的方法以及其中描述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案一致。本發(fā)明的第五方面提供了一種用于根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法中的分析試劑盒，其包含以下或由以下組成：a)根據(jù)本發(fā)明的第二方面的陣列和/或如本發(fā)明的第一方面所限定的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合部分；和b)用于執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法的說明書(任選的)。所述分析試劑盒可包含一種或多種對照劑。優(yōu)選地，所述分析試劑盒包含以下或由以下組成：上述特征以及一種或多種陰性對照劑和/或如本發(fā)明的第一方面中所限定的一種或多種陽性對照劑。優(yōu)選地，所述分析試劑盒與本發(fā)明的第一方面中描述的方法以及其中描述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案一致。本發(fā)明的第六方面提供一種治療或預(yù)防患者中的呼吸道i型超敏反應(yīng)(例如呼吸道哮喘)的方法，其包括以下步驟：(a)提供暴露于或已暴露于所述患者的一種或多種測試劑；(b)使用本發(fā)明的第一方面中提供的方法確定步驟(a)中提供的一種或多種測試劑是否為呼吸道致敏物；和(c)如果一種或多種測試劑被鑒定為呼吸道致敏物，則減少或預(yù)防所述患者暴露于被鑒定為呼吸道致敏物的所述一種或多種測試劑和/或?yàn)橹旅舭Y狀提供適當(dāng)?shù)闹委?。?yōu)選地，暴露于或已暴露于患者的一種或多種測試劑是患者目前每個(gè)月至少一次、例如每兩周至少一次、每周至少一次或每天至少一次暴露的試劑。致敏癥狀的治療可包括短效β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑(saba)，例如沙丁胺醇；抗膽堿能藥物，例如異丙托溴銨；其它腎上腺素能激動(dòng)劑，例如吸入型腎上腺素；皮質(zhì)類固醇，例如倍氯米松；長效β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(laba)，例如沙美特羅和福莫特羅；白細(xì)胞三烯拮抗劑，例如孟魯司特和扎非司酮；和/或肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑(例如色甘酸鈉)，它們是皮質(zhì)類固醇的另一種非優(yōu)選替代物。優(yōu)選地，治療方法與本發(fā)明的第一方面中描述的方法以及其中描述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案一致。本發(fā)明的第七方面提供了一種用于操作本發(fā)明的第一方面的方法的計(jì)算機(jī)程序，例如用于解釋步驟(b)、(d)和/或(f)的表達(dá)數(shù)據(jù)，從而確定一種或多種測試劑是否為呼吸道致敏物。所述計(jì)算機(jī)程序可以是編程的svm。所述計(jì)算機(jī)程序可記錄在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的計(jì)算機(jī)可讀載體上。合適的計(jì)算機(jī)可讀載體可包括光盤(包括cd-rom、dvd、藍(lán)光盤等)、軟盤、閃存驅(qū)動(dòng)器、rom或硬盤驅(qū)動(dòng)器。計(jì)算機(jī)程序可安裝在適于執(zhí)行計(jì)算機(jī)程序的計(jì)算機(jī)上。附圖說明現(xiàn)在將參考以下附圖來描述實(shí)施本發(fā)明的某些方面的優(yōu)選的非限制性實(shí)施例：圖1.mutz-3細(xì)胞在化學(xué)刺激后的cd86表達(dá)。所示的數(shù)據(jù)是化學(xué)刺激(n＝3)、4-氨基苯甲酸、dmso和未刺激的細(xì)胞(n＝6)和高錳酸鉀、2-氨基苯酚、己基肉桂醛和丙烯酸2-羥基乙酯(n＝2)的平均值，誤差條顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差。統(tǒng)計(jì)顯著性由studentt檢驗(yàn)確定，其比較了每個(gè)刺激與其相應(yīng)的媒介物，其中p<0.05由*指示。圖2.建立用于預(yù)測呼吸道致敏的預(yù)測性生物標(biāo)志物簽名。(a)使用無監(jiān)督學(xué)習(xí)來構(gòu)建數(shù)據(jù)集的表示?；谕ㄟ^呼吸道致敏物(藍(lán)色，n＝29)與非呼吸道致敏物(綠色，n＝74)之間的單因素anovap值過濾鑒定的999個(gè)轉(zhuǎn)錄本，使用pca將所述方法可視化。(b)將通過p值過濾鑒定的999個(gè)轉(zhuǎn)錄本用作用于反向消除的算法的輸入。在除去610個(gè)轉(zhuǎn)錄本后，觀察到kullback-leibler散度的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。(c)剩余的389個(gè)轉(zhuǎn)錄本被用作pca的輸入變量。如圖中所示，在訓(xùn)練數(shù)據(jù)中實(shí)現(xiàn)了呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的完全分離。圖3.使用gard呼吸道預(yù)測簽名grps進(jìn)行獨(dú)立測試化合物的視覺分類。(a)使用grps的389個(gè)基因作為無監(jiān)督表示的輸入，由來自用于生物標(biāo)志物簽名鑒定的參照化學(xué)物質(zhì)(n＝103)組的三個(gè)第一pca組分構(gòu)建pca空間。將測試數(shù)據(jù)集(n＝92)中的每種化學(xué)物質(zhì)繪制到pca空間中，而不允許所述化合物影響pca組分。(b)根據(jù)作為呼吸道致敏物(深藍(lán)色)或非呼吸道致敏物(深綠色)的致敏性質(zhì)對測試數(shù)據(jù)集中的樣本進(jìn)行著色。沿著訓(xùn)練數(shù)據(jù)和測試數(shù)據(jù)的第一pca分量可見呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的差別。(c)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集已被去除，以獲得訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的清晰視圖。圖4.測試數(shù)據(jù)集的支持向量機(jī)(svm)分類。使用用于監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)的svm驗(yàn)證grps的預(yù)測因子性能。svm算法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)向訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的化合物(n＝103)進(jìn)行感應(yīng)學(xué)習(xí)，隨后應(yīng)用于預(yù)測測試數(shù)據(jù)集中的每個(gè)單獨(dú)樣本(n＝70，不包括媒介物對照)。通過roc曲線分析評(píng)估預(yù)測性能，并估計(jì)曲線下面積(auc)為0.97。圖5.呼吸道致敏物在獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中的分類和基因表達(dá)。對訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的樣本(n＝103)再次訓(xùn)練svm算法，隨后應(yīng)用以將獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中的樣本(n＝70，不包括媒介物對照)分類。獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中的每個(gè)單獨(dú)樣本的svm判定值以降序繪制，并根據(jù)致敏能力著色(呼吸道致敏物＝紫色，非呼吸道致敏物＝深綠色)。散點(diǎn)圖中的虛線表示作為呼吸道致敏物(svm判定值>0)或非呼吸道致敏物(svm判定值<0)分類的閾值水平。grps內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)示于熱圖中。具體實(shí)施方式實(shí)施例引言背景：反復(fù)暴露于某些低分子量(lmw)化合物可能導(dǎo)致皮膚中或呼吸道中過敏反應(yīng)的發(fā)展。在大多數(shù)情況下，某些lmw化合物選擇性地使皮膚致敏，產(chǎn)生過敏性接觸性皮炎(acd)，或者使呼吸道致敏，產(chǎn)生職業(yè)性哮喘(oa)。為了限制過敏性疾病的發(fā)生，目前正在努力開發(fā)可準(zhǔn)確鑒定能夠誘發(fā)這種反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)的預(yù)測性測定法。然而，雖然已經(jīng)描述了用于預(yù)測皮膚致敏的幾種有希望的方法，但迄今為止仍不存在能夠?qū)⒒瘜W(xué)物質(zhì)準(zhǔn)確歸類為呼吸道致敏物的體外或體內(nèi)驗(yàn)證方法。結(jié)果：最近，我們提出了基于體外的基因組過敏原快速檢測(gard)測定法作為用于皮膚致敏化學(xué)物質(zhì)分類的新穎測試策略，其基于基因組生物標(biāo)志物簽名的測量結(jié)果。我們已擴(kuò)展了gard測定法的適用范圍，以通過鑒定與非呼吸道致敏物相比含有呼吸道致敏物的389個(gè)差異調(diào)控基因的另一種生物標(biāo)志物簽名，也用于分類呼吸道致敏物。通過結(jié)合監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)使用獨(dú)立的數(shù)據(jù)集，我們驗(yàn)證了所述測定法，顯示所鑒定的基因組生物標(biāo)志物能夠準(zhǔn)確地分類呼吸道致敏物。結(jié)論：我們已經(jīng)鑒定了用于分類呼吸道致敏物的基因組生物標(biāo)志物簽名。結(jié)合這種新鑒定的生物標(biāo)志物簽名與我們以前鑒定的用于皮膚致敏物分類的生物標(biāo)志物簽名，我們已開發(fā)了一種新穎的體外測試策略，其具有預(yù)測同一樣本中的皮膚和呼吸道致敏的強(qiáng)大能力。材料和方法化學(xué)物質(zhì)將包含選擇的10種充分表征的呼吸道致敏物和22種非呼吸道致敏物的一組32種參考化學(xué)物質(zhì)(統(tǒng)稱為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集)用于細(xì)胞刺激，以建立預(yù)測性基因組生物標(biāo)志物簽名。所述呼吸道致敏物是六氯鉑酸銨、過硫酸銨、乙二胺、戊二醛、六亞甲基二異氰酸酯、馬來酸酐、亞甲基二苯基二異氰酸酯、鄰苯二甲酸酐、甲苯二異氰酸酯和偏苯三酸酐。所述非呼吸道致敏物是1-丁醇、2-氨基苯酚、丙烯酸2-羥基乙酯、2-硝基-1,4-苯二胺、4-氨基苯甲酸、氯苯、二甲基甲酰胺、乙基香蘭素、甲醛、香葉醇、己基肉桂醛、異丙醇、kathoncg、水楊酸甲酯、青霉素g、重鉻酸鉀、高錳酸鉀、丙二醇、tween80、硫酸鋅和媒介物對照二甲亞砜和水。另外，將包括6種呼吸道致敏物和19種非呼吸道致敏物的一組25種化學(xué)物質(zhì)(統(tǒng)稱為獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集)用于細(xì)胞刺激，以形成一個(gè)獨(dú)立的測試集，用于驗(yàn)證所鑒定的預(yù)測性基因組生物標(biāo)志物簽名。所述獨(dú)立的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集包含在模型訓(xùn)練期間包括的對照化學(xué)物質(zhì)，以及以前在模型訓(xùn)練期間未見到的化學(xué)物質(zhì)。所述呼吸道致敏物是氯胺t、乙二胺、異佛爾酮二異氰酸酯、鄰苯二甲酸酐、哌嗪和活性橙。所述非呼吸道致敏物是1-丁醇、2,4-二硝基氯苯、2-巰基苯并噻唑、苯甲醛、氯苯、肉桂醇、鄰苯二甲酸二乙酯、丁子香酚、甘油、乙二醛、異丁子香酚、乳酸、辛酸、苯酚、對羥基苯甲酸、對苯二胺、間苯二酚、水楊酸和十二烷基硫酸鈉。所有化學(xué)物質(zhì)均購自sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)。在細(xì)胞刺激之前，將化學(xué)物質(zhì)在水或dmso中溶解并稀釋成gard輸入濃度。對于溶解在dmso中的化學(xué)物質(zhì)，dmso的孔內(nèi)濃度為0.1％。如前所述[41、42]對于每種化合物監(jiān)測化學(xué)細(xì)胞毒性和建立gard輸入濃度。簡而言之，根據(jù)以下判定時(shí)間表確定gard輸入濃度：無毒且易溶的化合物以對應(yīng)于500μm的濃度使用。無毒且難溶的化合物(在500μm下不溶)以最高可溶濃度使用。有毒化合物在得到90％相對存活率(rv90)的濃度下使用。首次滿足的標(biāo)準(zhǔn)確定了每種化合物的gard輸入濃度。表1中呈現(xiàn)了用于建立預(yù)測性基因組生物標(biāo)志物體簽名的化合物的gard輸入濃度、致敏效能和溶劑，并且表2中呈現(xiàn)了用于驗(yàn)證預(yù)測性基因組生物標(biāo)志物簽名的化合物。細(xì)胞培養(yǎng)、表型分析、化學(xué)暴露、細(xì)胞采集和mrna分離人類急性骨髓單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系mutz-3[68、69]獲自leibniz-institutdsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturen(dsmz,braunschweig,germany)。如先前所述[41、42]進(jìn)行細(xì)胞的維持、mutz-3的化學(xué)刺激和所有隨后的mrna分離和cdna制備。簡而言之，在化學(xué)刺激之前使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行mutz-3的表型控制，以確保細(xì)胞處于未成熟狀態(tài)。使用以下fitc結(jié)合的小鼠單克隆抗體(mab)：cd1a(dakocytomation,glostrup,denmark)、cd34、cd86、hla-dr、igg1(bdbiosciences,franklinlakes,nj)。使用以下pe結(jié)合的小鼠單克隆抗體：cd14(dakocytomation)、cd54、cd80、igg1(bdbiosciences)。使用碘化丙啶(bdbiosciences)染色測定細(xì)胞活力。樣本在facscantoii儀器上運(yùn)行。使用facsdiva軟件(bdbiosciences)獲得數(shù)據(jù)，并使用fcsexpressv4(denovosoftware,losangeles,ca)進(jìn)行分析?；谑褂猛N型對照建立的前向和側(cè)向散射特性和象限，進(jìn)行門控以排除細(xì)胞碎片和非活細(xì)胞。在化學(xué)暴露期間，將細(xì)胞以200,000個(gè)細(xì)胞/ml接種在24孔板中，并以gard輸入濃度暴露于化合物。在37℃、5％co2下溫育24小時(shí)后采集刺激的細(xì)胞，并使用制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)化方案，用試劑(lifetechnologies,carlsbad,ca)分離rna。并行地，通過cd86的流式細(xì)胞術(shù)分析來進(jìn)行細(xì)胞成熟狀態(tài)的控制。根據(jù)制造商(affymetrix)提供的標(biāo)準(zhǔn)化方案，進(jìn)行cdna制備和雜交、洗滌以及humangene1.0starrays(affymetrix,santaclara,ca,usa)的掃描。微陣列數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法使用單通道陣列歸一化(scan)算法[70]對從humangene1.0starrays獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化，并且使用combat[71]經(jīng)驗(yàn)bayes方法調(diào)整了不同組實(shí)驗(yàn)之間的潛在批次效應(yīng)。使用開放式軟件bioconductor2.14版[73]與額外軟件包scan.upc[70]和sva[74]，在r統(tǒng)計(jì)軟件[72]中進(jìn)行歸一化和批次調(diào)整。歸一化數(shù)據(jù)被導(dǎo)入到qlucoreomicsexplorer3.0(qlucoreab,lund,sweden)中，并使用主成分分析(pca)進(jìn)行可視化[75]。從單因素anovap值過濾中選擇預(yù)測因子，使用假發(fā)現(xiàn)率(fdr)[76]來調(diào)整多重假設(shè)檢驗(yàn)，比較呼吸道致敏物和非呼吸道致敏物。將用于反向消除的包裝算法[41、52]應(yīng)用于前999個(gè)預(yù)測因子，以進(jìn)一步減少和優(yōu)化生物標(biāo)志物簽名大小。修改反向消除算法以最小化kullback-leibler誤差[53]，而不是最大化接收器操作特性下的面積(aucroc)[77]，以便在aucroc達(dá)到1.0的情況下實(shí)現(xiàn)簽名優(yōu)化。反向消除后選出的前389個(gè)預(yù)測因子統(tǒng)稱為“gard呼吸道預(yù)測簽名”。利用額外軟件包e1071[78]，在r中編程反向消除的腳本。如前所述[41]，基于線性核函數(shù)，使用基于支持向量機(jī)(svm)的交叉驗(yàn)證[79]來驗(yàn)證建立預(yù)測性基因組生物標(biāo)志物簽名的方法。簡而言之，訓(xùn)練數(shù)據(jù)集被隨機(jī)分為包含70％刺激的新的交叉驗(yàn)證訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，以及包含30％刺激的交叉驗(yàn)證測試數(shù)據(jù)集。另外，如在整個(gè)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，小心謹(jǐn)慎地保持呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的相同比例。使用如上所述的單因素anovap值過濾從交叉驗(yàn)證訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中鑒定出新的預(yù)測性基因組生物標(biāo)志物簽名。根據(jù)交叉驗(yàn)證訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的信息，使用鑒定的預(yù)測性生物標(biāo)志物簽名來訓(xùn)練svm。在具有額外軟件包e1071的r統(tǒng)計(jì)軟件中編譯svm。svm模型隨后用于預(yù)測交叉驗(yàn)證測試數(shù)據(jù)集的樣本。將生物標(biāo)志物鑒定過程重復(fù)20次，并且通過計(jì)算20個(gè)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中包括每個(gè)單獨(dú)轉(zhuǎn)錄本的頻率(稱為驗(yàn)證呼叫頻率，即vcf)來評(píng)估特征選擇過程的穩(wěn)固性。使用如[46]中所述的獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集，估計(jì)grps在未知樣本預(yù)測方面的預(yù)測性能。簡而言之，使用grps作為變量輸入，對訓(xùn)練數(shù)據(jù)集訓(xùn)練svm。隨后，svm隨后以與上文關(guān)于交叉驗(yàn)證所述相同的方式用于預(yù)測訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的樣本，并且使用aucroc評(píng)估模型的預(yù)測性能，使用額外軟件包rocr在r統(tǒng)計(jì)環(huán)境中測定[80]。樣本分類為呼吸道致敏物或非呼吸道致敏物是基于在平行測定水平上的svm判定值。因此，如果來自某種化學(xué)刺激的任何平行測定刺激具有svm判定值>0，則化學(xué)物質(zhì)被歸類為呼吸道致敏物。測定法的準(zhǔn)確度、靈敏度和選擇性使用cooper統(tǒng)計(jì)學(xué)[81]確定。使用metacoretm(thomsonreuters,newyork,ny)通過進(jìn)行功能富集來探索grps的生物相關(guān)性。將來自p值過濾的前999個(gè)預(yù)測因子用作metacoretm算法的輸入，并通過探索與輸入分子相關(guān)聯(lián)的典型途徑來建立生物相關(guān)性。陣列數(shù)據(jù)已上載到arrayexpress(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)，登記號(hào)為e-mexp-3773。結(jié)果未刺激和化學(xué)刺激的mutz-3細(xì)胞的表型分析在化學(xué)攻擊之前，通過使用流式細(xì)胞術(shù)測量常見骨髓和樹突狀細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)來對細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量控制。這些標(biāo)志物包括cd1a、cd14、cd34、cd54、cd80、cd86和hla-dr。結(jié)果與以前公布的表型譜相關(guān)[41]，確保細(xì)胞成功維持在不成熟狀態(tài)。在化學(xué)刺激之后，使用包含10種呼吸道致敏物和20種非呼吸道致敏物以及媒介物對照的一組參考化學(xué)物質(zhì)(表1)，再次通過測量共刺激標(biāo)志物cd86的細(xì)胞表面表達(dá)水平來驗(yàn)證細(xì)胞的一般成熟狀態(tài)，結(jié)果呈現(xiàn)于圖1中。與未刺激的細(xì)胞相比，每種刺激的化學(xué)誘導(dǎo)的cd86上調(diào)在經(jīng)過許多刺激后的細(xì)胞中是明顯的。然而，由于平行測定刺激之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，只有通過呼吸道致敏物六氯鉑酸銨和戊二醛誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用可能被證實(shí)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(studentst檢驗(yàn)，p<0.05)。因此，使用cd86作為呼吸道致敏分類的單一生物標(biāo)志物的測定法將導(dǎo)致僅20％的靈敏度。另外，在非呼吸道致敏刺激2-氨基苯酚和kathoncg中也觀察到cd86的上調(diào)。因此，我們得出結(jié)論，cd86不能用作mutz-3細(xì)胞系中的單一生物標(biāo)志物來分類呼吸道化學(xué)致敏物。然而，由于許多呼吸道致敏物在細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解度差，因此不能以足夠的濃度用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，所以cd86的表達(dá)可作為補(bǔ)充質(zhì)量控制來確?；瘜W(xué)物質(zhì)刺激的生物利用度。通過化學(xué)刺激的mutz-3的轉(zhuǎn)錄譜分析來鑒定預(yù)測性基因組生物標(biāo)志物簽名在全轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上研究了mutz-3細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)變化，以便鑒定呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的最具差異的轉(zhuǎn)錄本。在用一組參照化學(xué)物質(zhì)刺激細(xì)胞24小時(shí)后，收集mrna用于轉(zhuǎn)錄譜分析。刺激包括10種不同的呼吸道致敏物、20種非呼吸道致敏物(陰性對照)和媒介物對照(dmso、蒸餾水)。所有刺激都以生物一式三份進(jìn)行，4-氨基苯甲酸除外，其由于內(nèi)部對照而以6次平行測定進(jìn)行分析，并且高錳酸鉀除外，其由于錯(cuò)誤的陣列而僅以2次平行測定進(jìn)行分析。此外，媒介物對照(dmso和蒸餾水)各自以6次平行測定進(jìn)行分析。樣本的質(zhì)量控制表明，過硫酸銨的平行測定刺激之一是顯著的異常值，必須去除，以免干擾生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)?？偠灾?，準(zhǔn)備分析的數(shù)據(jù)集由103個(gè)陣列組成，每個(gè)數(shù)據(jù)集具有29,141個(gè)轉(zhuǎn)錄本的測量結(jié)果。基因表達(dá)數(shù)據(jù)被導(dǎo)入到qlucoreomicsexplorer中并使用主成分分析(pca)進(jìn)行可視化。我們采用分層方法進(jìn)行特征選擇，結(jié)合過濾方法，以減少數(shù)據(jù)集中的噪音，并根據(jù)固有屬性選擇預(yù)測因子，并且通過考慮每個(gè)單獨(dú)預(yù)測因子如何與整個(gè)簽名一起執(zhí)行，采用基于反向消除的包裝方法，以減少簽名中的基因數(shù)量。過濾方法完全基于p值，如通過單因素anova分析確定，其比較了呼吸道致敏物和非呼吸道致敏物。包裝方法是基于重復(fù)的監(jiān)督學(xué)習(xí)。反向消除算法是內(nèi)部開發(fā)的[52]，并且迭代地提取轉(zhuǎn)錄本子集，隨后通過使用leave-one-out交叉驗(yàn)證程序訓(xùn)練和測試支持向量機(jī)(svm)進(jìn)行評(píng)估。除去最少信息的變量，并重復(fù)該過程直至達(dá)到分類模型的最高性能。由于計(jì)算限制，大約1000個(gè)基因是用作反向消除算法中的輸入的適當(dāng)數(shù)量的潛在預(yù)測因子。在本數(shù)據(jù)集中，預(yù)測因子候選物的這種預(yù)先選擇導(dǎo)致999個(gè)基因，p值為0.024或更低。如圖2a中所示，盡管在兩組之間發(fā)生了一些重疊，但是這些基因共同能夠?qū)崿F(xiàn)呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的區(qū)分。通過根據(jù)p值給出的排列，進(jìn)一步減少預(yù)測因子的數(shù)量，沒有達(dá)到明顯的分離，即使數(shù)據(jù)包含p值低至10-6的預(yù)測因子候選物。然后應(yīng)用內(nèi)部開發(fā)的反向消除算法，去除貢獻(xiàn)最少信息的預(yù)測因子(基因)。當(dāng)610個(gè)預(yù)測因子被消除時(shí)，觀察到kullbach-liebler散度(kld)[53]中的局部最小值(圖2b)。剩余的389個(gè)基因被統(tǒng)稱為“gard呼吸道預(yù)測簽名”(grps)，并且它們在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中區(qū)分呼吸道化學(xué)致敏物與非呼吸道致敏物的能力如圖2c所示?；虻纳矸萘性诒韆中。為了驗(yàn)證建立生物標(biāo)志物簽名的方法，我們進(jìn)行了交叉驗(yàn)證程序，其中我們將在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中使用的樣本隨機(jī)分為如方法中所述的訓(xùn)練集和測試集。將該過程迭代20次，并將20個(gè)新生物標(biāo)志物簽名中的每個(gè)預(yù)測因子轉(zhuǎn)錄本的頻率用作穩(wěn)固性的測量結(jié)果。該訓(xùn)練的結(jié)果列為驗(yàn)證呼叫頻率(vcf)，并在表a中進(jìn)行了總結(jié)。使用gard呼吸道預(yù)測簽名作為預(yù)測性能的估計(jì)值進(jìn)行獨(dú)立測試化合物的目測分類使用包含呼吸道致敏物以及非呼吸道致敏物的獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集驗(yàn)證grps的預(yù)測性能，以說明基因組生物標(biāo)志物體簽名的相關(guān)性作為呼吸道致敏物的預(yù)測測定。表2中描述了獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中包括的化合物。在模型訓(xùn)練中使用的一些化合物，包括1-丁醇、氯苯、乙二胺、鄰苯二甲酸酐和媒介物對照(dmso、蒸餾水)，也包括在獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中以用作對照。在樣本分類之前，其余的化學(xué)物質(zhì)為模型所未見。獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中的所有化學(xué)物質(zhì)都是基于額外的刺激，從包含訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的刺激中及時(shí)分離。因此，在鑒定grps期間未見的化合物以及模型可見的化合物可以被分類，而沒有過度擬合模型的風(fēng)險(xiǎn)。在細(xì)胞刺激24小時(shí)后，采集mrna，轉(zhuǎn)化成cdna并與微陣列雜交。刺激包括6種呼吸道致敏物、19種非呼吸道致敏物和媒介物對照(dmso、蒸餾水)。非呼吸道致敏刺激從先前的一組實(shí)驗(yàn)[41]中重復(fù)使用，并以生物一式三份進(jìn)行。用呼吸道致敏物以及非呼吸道致敏物1-丁醇進(jìn)行的刺激包括新一輪的刺激，并以生物一式兩份的方式進(jìn)行。由于內(nèi)部對照，化學(xué)氯苯包括在兩組中，因此共包含5種刺激。另外，分別以13次和9次平行測定分析了媒介物對照dmso和蒸餾水?？偠灾?，獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集包含92個(gè)陣列。在圖3中依序示出了對未知樣本進(jìn)行可視化分類的過程，使用測試數(shù)據(jù)集強(qiáng)調(diào)了該方法。在初始步驟中，使用grps中的389個(gè)基因作為變量輸入，首先使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，即用于鑒定預(yù)測性grps基因組生物標(biāo)志物簽名的參考化學(xué)物質(zhì)組來生成pca空間。然后將pca冷凍在空間中，并將測試數(shù)據(jù)集中的每個(gè)化合物繪制到該空間中，而不允許它們影響pca組分(圖3a)。如圖3b中所示，在鑒定測試數(shù)據(jù)集中樣本的真實(shí)身份時(shí)，針對訓(xùn)練數(shù)據(jù)和測試數(shù)據(jù)，沿著第一pca組分可見呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的明顯分離，表明在呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的gprs中基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)的相似性和差異也存在于測試數(shù)據(jù)集中。圖3c示出了由訓(xùn)練數(shù)據(jù)集生成的測試數(shù)據(jù)集，繪制到冷凍pca空間中，但其中訓(xùn)練數(shù)據(jù)集已被除去以便于解釋。如圖中所示，呼吸道致敏物和非呼吸道致敏物似乎由第二和第三主要成分產(chǎn)生的超平面分隔，表明grps清楚地包含在獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中在先前未見樣本中達(dá)到呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的差別的相關(guān)信息。svm分類和grps的預(yù)測性能在獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中對樣本進(jìn)行分類的連續(xù)步驟中，使用用于監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)的svm，利用二元分類模型對目測分類進(jìn)行挑戰(zhàn)。對訓(xùn)練數(shù)據(jù)集訓(xùn)練svm，以識(shí)別grps內(nèi)呼吸道致敏物與非呼吸道致敏物之間的基因表達(dá)結(jié)構(gòu)差異。應(yīng)用經(jīng)過訓(xùn)練的svm模型將獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集中的每個(gè)樣本在每個(gè)單獨(dú)平行測定水平上分類為呼吸道致敏物或非呼吸道致敏物。將來自svm的輸出(svm判定值)與測試數(shù)據(jù)集中樣本的真實(shí)身份進(jìn)行比較，并且使用rocauc分析評(píng)估預(yù)測因子的性能，結(jié)果示于圖4中。svm分類是基于線性核函數(shù)，其具有分隔兩組的無偏最大余量超平面，因此呼吸道致敏物分類的閾值對應(yīng)于svm判定值>0。如圖中所示，grps對單獨(dú)刺激水平的預(yù)測因子性能估計(jì)為roc曲線下面積為0.97。從測試數(shù)據(jù)集中的每個(gè)化合物的svm分類獲得的判定值呈現(xiàn)于表3(n＝70，不包括媒介物對照)。該表格中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)一步總結(jié)于圖5中。在該圖中，樣本以從最高到最低svm值降序排序，并且測試數(shù)據(jù)集中每個(gè)化合物的svm判定值與grps中389個(gè)轉(zhuǎn)錄本的單獨(dú)表達(dá)譜相關(guān)。為了方便解釋，根據(jù)致敏能力對圖中的樣本著色(呼吸道致敏物＝紫色，非呼吸道致敏物＝深綠色)，并且分類閾值用虛線示出。如圖中所示，雖然觀察到一些重疊，但是呼吸道致敏物的大部分被分配為高于分配給非呼吸道致敏物的相應(yīng)值的svm判定值，其也與各組內(nèi)大部分化合物之間的表達(dá)譜中的差異相關(guān)。對于每種化學(xué)物質(zhì)的致敏能力的判定和分類，我們選擇使用如下截止值，其陳述如果任何平行測定刺激具有如先前公布的方案[42]中所測定的svm判定值>0，則測試數(shù)據(jù)集中的任何給定樣本應(yīng)分類為呼吸道致敏物?；谶@一標(biāo)準(zhǔn)，grps的準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性使用cooper統(tǒng)計(jì)學(xué)分別估計(jì)為84％、67％和89％。與呼吸道致敏物相關(guān)的典型途徑和gard預(yù)測簽名旨在研究mutz-3細(xì)胞中由呼吸道化學(xué)致敏物引發(fā)的生物反應(yīng)，使用metacoretm中的功能富集分析來分析數(shù)據(jù)。使用利用p值過濾選擇的前999個(gè)基因作為metacoretm的輸入。在999個(gè)基因中，metacoretm能夠?qū)?48個(gè)映射到唯一的id。表4中列出了顯著調(diào)控的途徑(p<0.01)，根據(jù)-log(p值)排列，并按統(tǒng)計(jì)顯著性順序排序。grps中存在的基因以粗體顯示。這些鑒定和顯著調(diào)控途徑中的明顯大多數(shù)主要是由有限的一組分子驅(qū)動(dòng)的。最流行的途徑包括氧化磷酸化(26種分子)和泛醌代謝(19種分子)，表明細(xì)胞事件如氧化-還原過程和呼吸電子傳遞鏈功能受到所研究的化學(xué)物質(zhì)的高度影響。此外，幾個(gè)不太顯著的調(diào)控途徑，包括t細(xì)胞中的抑制性pd-1信號(hào)傳導(dǎo)、mhci類和mhcii類的抗原呈遞、記憶cd4+t細(xì)胞的產(chǎn)生、il-33信號(hào)通路，從免疫學(xué)觀點(diǎn)來看是相關(guān)的。值得注意的是，許多這些途徑的核心是天生和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，以及通過識(shí)別外來物質(zhì)引發(fā)的先天免疫反應(yīng)的參與，導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞成熟和特異性t細(xì)胞應(yīng)答的激活。該過程的關(guān)鍵方面在mutz-3細(xì)胞系中得到良好監(jiān)測和顯著調(diào)控，包括抗原呈遞相關(guān)分子(例如mhci類和mhcii類復(fù)合物)的上調(diào)、共刺激分子(例如cd80和cd86)的上調(diào)，并且通過啟動(dòng)和協(xié)調(diào)負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)免疫應(yīng)答的途徑與關(guān)鍵參與者如t細(xì)胞進(jìn)行交流。值得注意的是，激活的途徑只是在非常有限的程度上在mutz-3[54](顆粒酶b和顆粒酶a信號(hào)傳導(dǎo))中與皮膚致敏物激活的途徑重疊，表明呼吸道致敏物和皮膚致敏物涉及參與不同的信號(hào)通路。討論多種化學(xué)物質(zhì)能夠在皮膚和呼吸道中誘發(fā)過敏性超敏反應(yīng)，最終引起過敏性接觸性皮炎(acd)或職業(yè)性哮喘(oa)的臨床癥狀。雖然能夠誘發(fā)呼吸道致敏的化學(xué)物質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于引起皮膚致敏的化學(xué)物質(zhì)，但由于與獲得性oa相關(guān)的對健康和生活質(zhì)量的嚴(yán)重影響，呼吸道化學(xué)致敏物的鑒定和危害分類仍然是一個(gè)非常重要的領(lǐng)域。開發(fā)準(zhǔn)確鑒定呼吸道致敏物以及將其與皮膚致敏物區(qū)分的可靠測定法已被證明具有挑戰(zhàn)性。在以前的研究中，我們描述了基因組過敏原快速檢測(gard)測定法的開發(fā)和應(yīng)用，作為用于皮膚致敏化學(xué)物質(zhì)的鑒定和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的動(dòng)物測試的體外替代方案。在gard測定法中，基于通過全基因組轉(zhuǎn)錄譜分析測量的預(yù)定基因組生物標(biāo)志物簽名的讀數(shù)對未知的測試化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分類。利用伴隨分析完整轉(zhuǎn)錄組而產(chǎn)生的極大通用性，我們假設(shè)gard的適用范圍可被擴(kuò)寬以還覆蓋通過鑒定替代基因組生物標(biāo)志物簽名進(jìn)行呼吸道致敏物的危害分類。在當(dāng)前研究中，我們呈現(xiàn)了gard的進(jìn)一步發(fā)展，從而允許使用稱為gard呼吸道預(yù)測簽名(grps)的不同生物標(biāo)志物簽名對呼吸道致敏化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分類。因此，限定的grps的預(yù)期用途將是一種新穎的組合體外測定法，其中mutz-3細(xì)胞用待分類的未知化合物刺激。值得注意的是，使用兩個(gè)不同的生物標(biāo)志物簽名，該化合物可以被分類為皮膚致敏物、呼吸道致敏物或非致敏物。能夠誘發(fā)呼吸道和皮膚致敏的化學(xué)物質(zhì)也將被因此具體分類。使用已知為呼吸道致敏物或非呼吸道致敏物的一組參考化學(xué)物質(zhì)鑒定了grps。然后通過anovap值過濾來鑒定這兩組中的差異調(diào)控基因，并且使用內(nèi)部開發(fā)的反向消除包裝算法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。我們建議grps中的389個(gè)基因可以用作基因組生物標(biāo)志物簽名，以區(qū)分呼吸道致敏化學(xué)物質(zhì)與非呼吸道致敏化學(xué)物質(zhì)。評(píng)估grps的預(yù)測性能對于建立用于鑒定呼吸道致敏物的基因組生物標(biāo)志物簽名的可靠性很重要。在本研究中，我們使用支持向量機(jī)(svm)算法進(jìn)行監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)。我們對該模型進(jìn)行了訓(xùn)練，以識(shí)別所鑒定的grps基因組生物標(biāo)志物簽名中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)和相似性，并用包含以前未被該模型所見的化學(xué)物質(zhì)的獨(dú)立測試集挑戰(zhàn)該模型。隨后，我們使用該模型將未見化合物二元分類為呼吸道致敏物或非呼吸道致敏物。通過進(jìn)行該訓(xùn)練，展示了grps實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確預(yù)測的潛力。使用rocauc分析和cooper統(tǒng)計(jì)法，估計(jì)了grps的預(yù)測性能，實(shí)現(xiàn)roc曲線下面積為0.97，并且靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度分別為67％、89％和84％。這是誘發(fā)呼吸道致敏的化學(xué)物質(zhì)的危害分類的所報(bào)道最高準(zhǔn)確度。迄今為止，我們只能推測grps在作為皮膚致敏物的gps的預(yù)測中為什么不能達(dá)到相同的高靈敏度的可能解釋[46]。這可能部分是由于與gps相比，在grps測定開發(fā)期間使用的參考化合物數(shù)量較少，但是在分子水平上也可能發(fā)現(xiàn)另一種可能的解釋，即皮膚致敏物是在mutz-3細(xì)胞中的基因表達(dá)的更有效的調(diào)控劑。不同的是，使用全基因組陣列作為分類讀數(shù)仍然使得grps具有高度的靈活性。隨著更多的樣本被分析，額外信息可以很容易地實(shí)施到測定法中，以提高靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度，并微調(diào)方法來反映可用化合物的多樣性。為了進(jìn)一步探索致敏化學(xué)物質(zhì)對mutz-3的生物學(xué)作用，進(jìn)行了富集分析。為了達(dá)到數(shù)據(jù)的足夠顯著性，將來自p值過濾的前999個(gè)基因用作metacoretm軟件中的輸入，而不是grps的前389個(gè)基因。毫無疑問，最流行的由呼吸道致敏物引發(fā)的途徑涉及細(xì)胞事件，例如氧化-還原過程和呼吸電子傳遞鏈(參見表4)。這些分子屬于p值過濾程序的前面基因，并且不存在于grps簽名中。在這方面，重要的是區(qū)分功能性，在這種情況下旨在描述轉(zhuǎn)錄本的生物相關(guān)性和grps預(yù)測概況，旨在執(zhí)行獨(dú)立樣本的準(zhǔn)確分類。涉及氧化磷酸化和泛素代謝途徑的分子中的幾個(gè)是蛋白質(zhì)復(fù)合物的亞基，并且因此在空間和時(shí)間上相關(guān)聯(lián)。在本研究中特征選擇期間應(yīng)用的反向消除程序是基于變量的正交選擇，因此在該過程中除去了對正交信息無貢獻(xiàn)的特征。因此，一些顯著調(diào)控的途徑不包含或只包含來自grps簽名的一些轉(zhuǎn)錄本并不奇怪而是預(yù)期的，因?yàn)槔绶肿訌?fù)合物中的亞基可能具有相似的表達(dá)模式?；趲讉€(gè)較少激活的途徑，mutz-3對化學(xué)呼吸過敏原的生物反應(yīng)也涉及先天免疫應(yīng)答信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其最終導(dǎo)致細(xì)胞成熟，從而導(dǎo)致增強(qiáng)的抗原呈遞和與其它免疫細(xì)胞的相互作用。此外，使用以前與蛋白質(zhì)過敏原的呼吸道致敏相關(guān)的信號(hào)通路的新發(fā)現(xiàn)將揭示生物過程，從而導(dǎo)致呼吸道響應(yīng)于化學(xué)過敏原的致敏。因此，grps在免疫學(xué)機(jī)制的角度確實(shí)是相關(guān)的，并且提供監(jiān)測導(dǎo)致呼吸道致敏的生物學(xué)事件的轉(zhuǎn)錄本的測量結(jié)果。此外，富集分析結(jié)果以及gard測定法所呈現(xiàn)的結(jié)果表明，mutz-3是預(yù)測皮膚和呼吸道致敏物的合適模型。盡管在免疫生物學(xué)機(jī)制中有一些相似之處，但是皮膚和呼吸道致敏之間存在重要的機(jī)制差異。皮膚致敏主要與th1細(xì)胞的誘導(dǎo)相關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞毒性cd8+t細(xì)胞應(yīng)答和il-2和干擾素(ifn)-γ的分泌，而呼吸道致敏通常涉及cd4+th2細(xì)胞并且其特征在于高水平的il-4、il-10和il-13。雖然蛋白質(zhì)抗原的呼吸道致敏是由特異性ige抗體的產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)的，但仍然不清楚ige抗體在化學(xué)過敏原產(chǎn)生呼吸道過敏期間具有什么作用，以及是否存在能夠獨(dú)立于ige抗體產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)呼吸道致敏的機(jī)制[55、56]。據(jù)建議，無需ige就足以誘導(dǎo)th2應(yīng)答來支持呼吸道致敏的發(fā)展[57]。盡管t細(xì)胞應(yīng)答有明顯的差異，但對于皮膚和呼吸道致敏來說，樹突狀細(xì)胞(dc)的激活是常見的。因此，dc是皮膚和呼吸道致敏方面的測定法發(fā)展的天然靶標(biāo)，因?yàn)樗鼈冊陧憫?yīng)于異種生物化合物的免疫應(yīng)答的起始、調(diào)節(jié)和極化方面具有生理作用。mutz-3細(xì)胞系在表達(dá)譜和激活特異性t細(xì)胞應(yīng)答的能力方面與原代樹突狀細(xì)胞(dc)相似[45]。與原代dc相比，mutz-3容易使用標(biāo)準(zhǔn)化方案生長，并提供可持續(xù)的細(xì)胞來源，從而提供了將測定法擴(kuò)大到高通量格式的機(jī)會(huì)。在開發(fā)用于皮膚和呼吸道致敏的測定法的情況下，重要的是承認(rèn)命名背后的形式語義。類似于其它[24、58-60]，我們使用術(shù)語來表示免疫反應(yīng)的局部位點(diǎn)，而不是本研究中的初始暴露途徑。例如，已經(jīng)顯示呼吸道的致敏也可能在皮膚暴露[61-63]于相關(guān)化學(xué)物質(zhì)后發(fā)生。一般來說，特定化合物選擇性地使皮膚或呼吸道致敏。然而，在某些情況下和免疫敏感個(gè)體中，一些化學(xué)物質(zhì)已被證明會(huì)引起兩種類型的致敏。例如，化學(xué)三縮水甘油基異氰尿酸酯(tgic)已顯示導(dǎo)致oa和acd[64]。最后，與其它替代方法相比，gard測定法的方法具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。使用我們的數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的方法，能夠規(guī)避與當(dāng)前呼吸道致敏物在敏感個(gè)體中引起免疫反應(yīng)的確切機(jī)制方面的知識(shí)缺乏相關(guān)的問題。其次，通過全轉(zhuǎn)錄組方法獲得的大量信息提供了一個(gè)額外的機(jī)會(huì)來闡明分子機(jī)制，例如呼吸道致敏過程中涉及的特定信號(hào)傳導(dǎo)或代謝途徑。本研究的主要目的是根據(jù)關(guān)于用于預(yù)測呼吸道致敏的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的減少、優(yōu)化和替代的3r原則來開發(fā)體外方法。通過訓(xùn)練具有一組參考化學(xué)物質(zhì)的模型，我們提出了用于確定未知化學(xué)物質(zhì)是否可能作為非呼吸道致敏物或呼吸道致敏物的工具。將來，隨著目前關(guān)于化學(xué)物質(zhì)如何在呼吸道中引起致敏的當(dāng)前知識(shí)缺口不斷被填補(bǔ)，與皮膚致敏的不良結(jié)果通路(adverseoutcomepathway，aop)[67]的制定相似的共識(shí)也可能是用于測試呼吸道致敏物的現(xiàn)實(shí)。然后，grps將成為可用于評(píng)估dc成熟的綜合測試策略(its)的有吸引力的部分。總之，本研究提出了在mutz-3細(xì)胞中用于呼吸道化學(xué)致敏物分類的預(yù)測性生物標(biāo)志物簽名，其對以前描述的用于評(píng)估皮膚致敏物的gard測定法進(jìn)行補(bǔ)充。在相同樣本中測試兩種不同端點(diǎn)的能力為符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的減少、優(yōu)化和替代的3r原則的體外測試策略中的化學(xué)物質(zhì)安全性評(píng)估提供了一種有吸引力的和迄今為止唯一的測定法。參考文獻(xiàn)1.boverhofdr,billingtonr,gollapudibb,hotchkissja,kriegersm,etal.(200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test<-dim(datatest)datatest<-as.numeric(datatest)dim(datatest)<-dimdatatestproteinnames<-as.character(rawfile[1,-c(1,2)])rownames(datatest)<-proteinnamescolnames(datatest)<-samplenameslogdatatest<-datatestlogdatatest<-logdatatest[listaboolean,]#第3部分.訓(xùn)練svm并使用它來預(yù)測測試集的樣本類別#第4部分.如果測試數(shù)據(jù)的樣本類別是已知的，則打印rocrocplot(list(sampleinformation＝sampleinformation,rocarea＝rocdata[1],p.value＝rocdata[2],senspe<-senspe,samples＝samples),sensspecnumber＝4)#第5部分.對于未知樣本，打印判定值write.table(res,file＝"predicted_resultsp1206.txt",sep＝"\t",row.names＝true)2.使用反向消除建立預(yù)測簽名的r腳本3.腳本1和2調(diào)用的各種r函數(shù)。4.訓(xùn)練數(shù)據(jù)、測試數(shù)據(jù)和預(yù)測簽名的示例文件。4.1訓(xùn)練數(shù)據(jù)。表格應(yīng)該保存為制表符分隔的.txt文件。樣本樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5樣本6樣本7樣本8樣本9樣本10樣本類別陽性陽性陽性陽性陽性陰性陰性陰性陰性陰性預(yù)測因子1107410446191預(yù)測因子259262935410預(yù)測因子38391925163預(yù)測因子44877568223預(yù)測因子59226347898預(yù)測因子6547104219110預(yù)測因子7645510157101預(yù)測因子854110162684預(yù)測因子9713103121022預(yù)測因子101082826346104.2測試數(shù)據(jù)。表格應(yīng)該保存為制表符分隔的.txt文件。4.3預(yù)測簽名。表格應(yīng)該保存為制表符分隔的.txt文件。預(yù)測因子3預(yù)測因子5預(yù)測因子9當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12