本發(fā)明涉及用于光學(xué)檢測(cè)流體樣品(例如液體樣品或空氣)中的納米粒子的方法和設(shè)備，通常用于30nm至200nm的納米粒子。該方法更具體地用于檢測(cè)存在于水生環(huán)境中的游離病毒，特別是用于對(duì)海水或河水中的病毒的計(jì)數(shù)和表征。

背景技術(shù)：

病毒是尺寸通常在30nm和200nm之間的納米物體。它們通常特定針對(duì)一定的宿主細(xì)胞，因此它們?yōu)橐粋€(gè)物種(甚至是該物種的變種或菌株)所特有。僅自1989年以來(lái)，得益于挪威團(tuán)隊(duì)的工作(見k.j.等，“enumerationandbiomassestimationofplanktonicbacteriaandvirusesbytransmissionelectronmicroscopy”，appl.environ.microbiol.(1990)56：352-356)，我們已經(jīng)意識(shí)到各種水生環(huán)境中病毒的豐富程度。已在湖泊、河流、冰層或海洋的沉積層深度中，有時(shí)甚至在云層中測(cè)出高濃度的病毒，這表明它們?cè)谏锶Φ墓δ苤衅鹬匾饔?。得益于各種機(jī)制，例如破壞優(yōu)勢(shì)物種以有益于更多稀有物種或?qū)⒉《净蜣D(zhuǎn)移到宿主，病毒保持了水生生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性并促進(jìn)了遺傳混合。因此，為了更好地理解病毒與宿主之間的關(guān)系，對(duì)不同水生生態(tài)系統(tǒng)中的病毒進(jìn)行表征并估計(jì)它們的分布至關(guān)重要。

根據(jù)水生生態(tài)系統(tǒng)、季節(jié)甚至采樣深度，游離病毒的濃度通常在每毫升10⁶至10⁹個(gè)粒子之間。有許多已知的方法用于對(duì)水生培養(yǎng)基中的病毒進(jìn)行表征和計(jì)數(shù)。

例如，我們知道透射電子顯微鏡(或tem)，其允許我們以非常好的精度對(duì)病毒進(jìn)行計(jì)數(shù)并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行表征。然而，這種破壞性技術(shù)需要龐大而昂貴的設(shè)備。

在對(duì)水生環(huán)境中的病毒表征的光學(xué)技術(shù)中，我們知道熒光顯微鏡，其在用熒光標(biāo)記物將核酸染色后，使得可以對(duì)游離病毒進(jìn)行計(jì)數(shù)(參見例如，bettarel等,“acomparisonofmethodsforcountingvirusesinaquaticsystems”,applenvironmicrobiol,66:2283–2289(2000)。然而，這種技術(shù)需要對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行固定的階段，這被證明對(duì)于分子生化分析的后期階段是麻煩的。

由于病毒表現(xiàn)得像電介質(zhì)納米粒子，其折射率在可見光譜中接近1.5，與水的折射率(1.33)明顯不同，同樣也已知如何檢測(cè)它們的存在并通過確定這些納米粒子在入射電磁場(chǎng)中引起的擾動(dòng)來(lái)潛在對(duì)它們進(jìn)行表征。

因此，已經(jīng)描述了基于由于病毒粒子懸浮引起的光散射的方法(參見例如wmbalch等,“l(fā)ightscatteringbyviralsuspensions”,limnoloceanogr,45:492–498(2000))。然而，這些方法由于檢測(cè)靈敏度差而僅限于對(duì)病毒的均質(zhì)溶液的分析，并且它們僅能夠確定給定尺寸和形狀的病毒濃度；因此，它們不適合于識(shí)別多樣性病毒，而在自然環(huán)境中通常是多樣性病毒。

為了提高靈敏度，已將干涉測(cè)量方法用于檢測(cè)液體環(huán)境中的病毒。因此，mitra等人的文章(“real-timeopticaldetectionofsinglehumanandbacterialvirusesbasedondark-fieldinterferometry”,biosensbioelectron.2012january15；31(1):499–504)描述了一種用于觀察納米流體導(dǎo)管中的一個(gè)接一個(gè)地運(yùn)動(dòng)的納米粒子干涉檢測(cè)方法。被入射激光束照射的納米粒子所散射的低光強(qiáng)度被高強(qiáng)度的基準(zhǔn)光束放大。此外，結(jié)構(gòu)化照明消除了由導(dǎo)管接口上的寄生反射(在黑色背景上的檢測(cè))引起的噪聲。然而，除了使用相干光源(激光)之外，這種技術(shù)還需要復(fù)雜的納米流體布局。

本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)在諸如水的流體中運(yùn)動(dòng)的納米粒子的干涉技術(shù)，其以空間上不相干的照射來(lái)操作，避免了對(duì)激光的需求。此外，所描述的技術(shù)不需要針對(duì)被檢查的流體的特定布局。然而，本說(shuō)明書中描述的技術(shù)具有非常好的靈敏度，并且可以檢測(cè)直徑小至幾十納米的納米粒子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及一種用于通過透射以光學(xué)檢測(cè)在流體樣品中運(yùn)動(dòng)的納米粒子的設(shè)備，包括：

-光源，用于發(fā)射用于照射樣品的空間非相干光束；

-包括顯微鏡物鏡的成像光學(xué)系統(tǒng)；

-二維光學(xué)檢測(cè)器，所述二維光學(xué)檢測(cè)器包括通過所述成像光學(xué)系統(tǒng)與所述顯微鏡物鏡的物焦平面共軛的檢測(cè)平面，并且允許獲取所述樣品的分析體積的一系列圖像，每個(gè)圖像通過入射到所述樣品上的所述照射光束和在不到1毫秒的預(yù)設(shè)時(shí)間段內(nèi)由所述分析體積中的每個(gè)納米粒子散射的光束之間的光學(xué)干涉產(chǎn)生；

-圖像處理裝置，所述圖像處理裝置允許取得所述一系列圖像的平均值，并且從每個(gè)圖像中減去所述平均值，從而針對(duì)所述分析體積中的每個(gè)納米粒子確定所述散射光束的振幅。

檢測(cè)設(shè)備用于檢測(cè)納米粒子，即直徑小于幾百納米的粒子，更具體地，直徑在30nm和200nm之間的納米粒子。

如此描述的設(shè)備，非常容易實(shí)現(xiàn)并且無(wú)需將樣品以特定形式放置，使得，由于當(dāng)納米粒子被“凍結(jié)”時(shí)在很短的時(shí)間內(nèi)，通過由光源發(fā)射的信號(hào)和由每個(gè)納米粒子散射的信號(hào)之間的干涉所得到的散射信號(hào)的放大，可以檢測(cè)直徑小至幾十納米的納米粒子。

在入射照明光束和由每個(gè)納米粒子散射的光束之間直接產(chǎn)生的干涉不需要基準(zhǔn)波和照射樣品以用于形成干涉的波之間的初始物理分離，例如使用分隔器的干涉儀。

通過空間不相干光束的照射使得可以將空間相干性限制于“體素”(voxel)的水平，“體素”的截面與顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑成反比。因此，干涉只能在納米粒子所在的體素內(nèi)部進(jìn)行；因此干涉在幾乎同心的球面波之間發(fā)生。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)樣品實(shí)施方式，所述光源是脈沖源，使得能夠順序地發(fā)射所述預(yù)設(shè)時(shí)間段的光脈沖，并且所述設(shè)備還包括將所述二維光學(xué)檢測(cè)器和所述脈沖光源同步以獲取所述一系列圖像的裝置。所使用的二維檢測(cè)器可以是以100hz操作的標(biāo)準(zhǔn)相機(jī)。

或者，可以使用連續(xù)的光源和高速攝像機(jī)，通常具有每秒多于幾千個(gè)圖像的頻率。

光源是空間不相干的光源，例如led，并且能夠避免在檢測(cè)區(qū)域中可能產(chǎn)生寄生背景的任何斑點(diǎn)效應(yīng)。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)樣品實(shí)施方式，所使用的顯微鏡物鏡具有大于或等于1的數(shù)值孔徑，從而增加由每個(gè)納米粒子散射的光信號(hào)的強(qiáng)度，并且使得能夠檢測(cè)較小直徑的納米粒子。

根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及一種用于通過透射以光學(xué)檢測(cè)在流體樣品中運(yùn)動(dòng)的納米粒子的方法，包括：

-發(fā)射空間不相干的光束以照射樣品；

-通過包括顯微鏡物鏡的成像光學(xué)系統(tǒng)，在二維光學(xué)檢測(cè)器的檢測(cè)平面上，形成位于所述顯微鏡物鏡的物焦平面附近的所述樣品的分析體積的圖像；

-通過所述二維檢測(cè)器獲取所述樣品的分析體積的一系列圖像，在不到1毫秒的預(yù)設(shè)時(shí)間段內(nèi)，每個(gè)圖像通過入射到所述樣品上的所述照射光束和由所述分析體積中的每個(gè)納米粒子散射的光束之間的光學(xué)干涉產(chǎn)生；

-處理圖像以取得所述一系列圖像的平均值，并從每個(gè)圖像中減去所述平均值，從而針對(duì)所述分析體積中的每個(gè)納米粒子確定所述散射光束的振幅。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)樣品實(shí)施方式，光束的發(fā)射是所述預(yù)設(shè)時(shí)間段的光脈沖的順序發(fā)射，圖像的獲取與光脈沖的發(fā)射同步。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)樣品實(shí)施方式，該方法還包括從以這種方式處理的所述一系列圖像的開始確定所述納米粒子的軌跡。

附圖說(shuō)明

在熟讀以下附圖所示的說(shuō)明書時(shí)，將明白本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和特征：

-圖1是示出根據(jù)本說(shuō)明書的針對(duì)流體樣品中的納米粒子的檢測(cè)設(shè)備的示例的圖；

-圖2更詳細(xì)地圖示出了圖1所示類型的設(shè)備中的液體樣品支座的示例；

-圖3圖示出在例如圖1所示設(shè)備的示例中來(lái)自位于顯微鏡物鏡的物焦平面之前和之后的納米粒子的球形波的圖；

-圖4a和4b分別圖示出了在位于顯微鏡物鏡的物焦平面之后和在位于顯微鏡的物焦平面之前的粒子的情況下，透射波和由納米粒子散射的波之間的干涉原理；

-圖5a圖示出了透射波和由位于顯微鏡物鏡的物焦平面之前或之后的多個(gè)納米粒子中的每個(gè)散射的波的之間的干涉原理，且圖5b示出了在檢測(cè)器的檢測(cè)平面中得到的干涉圖案。

-圖6a至圖6c分別圖示出通過去除平均值處理后獲得的液體樣品的圖像、與對(duì)應(yīng)于“噬菌體λ”型病毒的粒子相關(guān)聯(lián)的所述圖像的干涉圖案的變焦和作為在檢測(cè)器的檢測(cè)平面中的像素?cái)?shù)量的函數(shù)的、在所述粒子的區(qū)域中測(cè)量的光強(qiáng)度分布。

-圖7示出了不同納米粒子(t4型噬菌體病毒)的軌跡的曲線，所述軌跡由兩個(gè)連續(xù)圖像之間的一系列躍遷表示。

為了一致性，在不同附圖中，相同的元件由相同的數(shù)字指示。

具體實(shí)施方式

圖1以示意性方式示出了根據(jù)本說(shuō)明書的用于檢測(cè)在流體樣品中運(yùn)動(dòng)的納米粒子的設(shè)備的示例，圖2示出了圖1所示類型的設(shè)備中的樣品布置的具體示例。

圖1所示的檢測(cè)設(shè)備100包括適于發(fā)射通過液體或氣體樣品20的入射光束的光源10。該光源是空間不相干光源，例如熱源或led(發(fā)光二極管)。光源10照射通常大于1的大數(shù)值孔徑的顯微鏡物鏡31的場(chǎng)。圖1中所示的設(shè)備100還包括通常稱為管透鏡的光學(xué)器件32，其與顯微鏡物鏡31一起形成光學(xué)成像系統(tǒng)30，適于在二維光學(xué)檢測(cè)器40的檢測(cè)平面上形成顯微鏡物鏡的物焦平面的圖像。物鏡是例如標(biāo)準(zhǔn)油浸式顯微鏡物鏡，并且二維檢測(cè)器是例如相機(jī)，例如ccd或cmos，通常以最小約100hz量級(jí)的頻率和大的阱容量(例如至少十萬(wàn)個(gè)電子量級(jí))操作。阱容量設(shè)定信噪比，從而設(shè)定最小的可測(cè)病毒尺寸。在圖1的示例中，檢測(cè)設(shè)備100還包括連接到檢測(cè)器40和屏幕60以及在本示例中連接到光源10的控制單元11的處理裝置50，從而提供在脈沖模式下工作和檢測(cè)之間的光源的同步。

如圖2更詳細(xì)所示，樣品20例如是體積為微升量級(jí)的液體樣品；體積由厚度大約等于一百微米的塑料膜23中的圓形孔(例如，半徑為毫米數(shù)量級(jí))形成，放置在2個(gè)顯微鏡蓋玻片22之間，整體形成樣本保持器21。除了不定期進(jìn)行初步過濾以分離非常大的粒子并且僅保留直徑小于幾百納米(例如，有利地小于一百納米)的粒子之外，對(duì)于液體樣品的分析不需要特別的準(zhǔn)備。然而，在特別“干凈的”樣品(低濃度病毒)的情況下，可能須通過已知方法“濃縮”病毒樣品。

盡管對(duì)于液體樣品的情況進(jìn)行了描述，但是根據(jù)本說(shuō)明書的納米粒子的檢測(cè)方法也可以應(yīng)用于在氣體例如空氣中運(yùn)動(dòng)的納米粒子；在這種情況下，設(shè)備100可以直接安裝在正在分析空氣的環(huán)境中。還可以進(jìn)行初步過濾以將檢測(cè)限制在直徑小于幾百納米的粒子中。

本發(fā)明的原理通過針對(duì)與物場(chǎng)的一個(gè)“像素”或“體素”對(duì)應(yīng)的體積的圖3示出；圖3以示意方式示出了來(lái)自分別位于顯微鏡物鏡的物焦平面之前和之后的物場(chǎng)中的兩種納米粒子的球形波。

物場(chǎng)的像素或“體素”是指在顯微鏡物鏡31的物空間中對(duì)像場(chǎng)的像素的定義的基本體積vi，該像場(chǎng)由檢測(cè)器40的有效檢測(cè)表面限定。

物場(chǎng)中的體素vi可以通過由顯微鏡物鏡31的景深所限定的長(zhǎng)度l和由顯微鏡物鏡的衍射斑所限定的截面s的圓柱體積表示。景深l和截面s的直徑φ由下式給出：

其中na是顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑，n是物空間的介質(zhì)指數(shù)(indexofthemedium)(例如，在油浸式顯微鏡物鏡的情況下介質(zhì)指數(shù)為≈1.5的介質(zhì))，λ為由光源10發(fā)射的光波的工作波長(zhǎng)。

因此，可以通過體素vi的總和來(lái)定義樣本的分析體積va；分析體積va表示：能夠在其中能被檢測(cè)到在流體中運(yùn)動(dòng)的粒子的體積。分析體積具有由物場(chǎng)的尺寸限定的橫向尺寸(即，檢測(cè)表面的尺寸與成像系統(tǒng)30的放大倍數(shù)的倒數(shù)的乘積)，以及由景深l限定的軸向尺寸。

如圖3所示，來(lái)自顯微鏡物鏡31的焦平面f的點(diǎn)fi的波是具有中心fi的球面波w0，顯微鏡物鏡將其轉(zhuǎn)換成平面波w'0。平面波w'0(下文中稱為“基準(zhǔn)波”)遇到顯微鏡管透鏡(圖3中未示出)。在檢測(cè)器40的檢測(cè)平面中，該平面波形成直徑作為顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑和成像系統(tǒng)30的放大倍數(shù)的函數(shù)的衍射斑點(diǎn)。

在體素vi內(nèi)，當(dāng)被來(lái)自光源10的光波照射時(shí)，亞波長(zhǎng)納米粒子p1和p2(即，具有小于工作波長(zhǎng)的尺寸，并位于點(diǎn)fi附近，但在景深的界限處)各自發(fā)射散射的球面波，其被顯微鏡物鏡31轉(zhuǎn)換成準(zhǔn)平面波，分別表示為圖3中的w'1，w'2。納米粒子太小而不能產(chǎn)生相移。另一方面，在納米粒子的存在下，體素內(nèi)的空間相干性在分別來(lái)自照明光束和由納米粒子散射的光束的近似同心球形波之間產(chǎn)生干涉。

根據(jù)本說(shuō)明書的檢測(cè)方法基于通過二維檢測(cè)器40獲取樣品分析體積的一系列圖像，每個(gè)圖像通過在相對(duì)于納米粒子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間足夠短的預(yù)設(shè)時(shí)間段(通常不到1毫秒)期間發(fā)射的入射光和由從入射光束形成的分析體積中存在的每個(gè)納米粒子散射的光束之間的光學(xué)干涉產(chǎn)生。因此，在圖3的示例中，光波w'1，w'2中的每個(gè)與基準(zhǔn)波w'0相干?？梢允境?參見下文)，取決于納米粒子是位于顯微鏡的物焦平面的下游(例如，粒子p1)還是上游(例如，粒子p2)，干涉將是相長(zhǎng)的或相消的。這種差異是由于“gouy相”，這是來(lái)自位于焦點(diǎn)之前或之后的點(diǎn)的球面波之間的180°相移的原因。

因此，圖4a和圖4b分別示出了分別位于顯微鏡物鏡的物焦平面的下游和上游的但總是在景深中的納米粒子的相長(zhǎng)和相消干涉的機(jī)制。在這些圖中，僅示出了光源10和顯微鏡物鏡31。

圖4a的示例示出了位于顯微鏡物鏡31的物焦平面下游的納米粒子p1的情況。納米粒子p1位于由檢測(cè)器的場(chǎng)(圖4a中未示出)和顯微鏡物鏡31的景深l限定的分析體積中。納米粒子由光源10照射，光源10有利地是空間和時(shí)間上不相干的光源，例如led，從而避免形成可能阻礙干涉信號(hào)判讀的斑點(diǎn)。

我們這里將來(lái)自焦點(diǎn)fi并由顯微鏡物鏡的孔徑截取的基準(zhǔn)波表示為w0，將由納米粒子p1散射的同樣被顯微鏡物鏡的孔徑截取的波表示為w。在圖4a的情況下，基準(zhǔn)波和散射波是同相的球面波。在波之間產(chǎn)生了相長(zhǎng)干涉，其在顯微鏡物鏡的孔徑的區(qū)域中轉(zhuǎn)化為亮的干涉圖案i。納米粒子的位置與焦點(diǎn)之間的相移小于景深，波w和w0對(duì)于在顯微鏡物鏡的孔徑中散射的所有角度(即在顯微鏡物鏡的光軸和物鏡的最大孔徑之間形成的所有角度，或者對(duì)于油浸物鏡通常為54°)的光線是同相的。因此，在圖4a的干涉場(chǎng)中看不到環(huán)。

另一方面，圖4b的示例示出了位于顯微鏡物鏡31的物焦平面下游但仍處于寬度由顯微鏡物鏡31的景深限定的分析體積中的納米粒子p2的情況。在該示例中，由于引入gouy相，基準(zhǔn)波w0和散射波w異相。在波之間產(chǎn)生相消干涉，在顯微鏡物鏡的孔徑區(qū)域中轉(zhuǎn)化成暗的干涉圖案i。如前所述，納米粒子的位置與焦點(diǎn)之間的相移小于景深，波w和w0針對(duì)所有角度都是異相的，且看不到任何環(huán)。

如根據(jù)圖4a和圖4b所述，非常弱的信號(hào)(例如由每個(gè)納米粒子散射的信號(hào))和來(lái)自光源的強(qiáng)信號(hào)之間的干涉現(xiàn)象中，觀察到通過干涉的放大，其使得能夠檢測(cè)非常小的散射信號(hào)，因此能夠識(shí)別直徑小于幾十納米的納米粒子。

因此，將由光源的光子直接誘導(dǎo)的光電子數(shù)量指定為ns，并將由散射納米粒子產(chǎn)生的光電子數(shù)量指定為nd，可以通過這些兩種波之間的干涉獲得許多光電子n，使得：

其中φ是光源光束和散射光束之間的相移。

這里，散射納米粒子產(chǎn)生的光電子數(shù)量nd與光源發(fā)射的光電子數(shù)ns相比非常少(通常為1/10⁶)。此外，在這種情況下，由于粒子在顯微鏡物鏡的景深中的位置，根據(jù)散射粒子和焦點(diǎn)的相對(duì)位置，相移φ接近零或180°；因此，cos(φ)等于+1或-1。

因此，如果取大量圖像的平均值，考慮到粒子的運(yùn)動(dòng)，通常由于尺寸非常小的粒子的布朗運(yùn)動(dòng)，在所有圖像的范圍內(nèi)所取的平均值將表示背景(ns)，因?yàn)榕c粒子相關(guān)聯(lián)的信號(hào)被降低到噪聲水平。為了獲得僅包含與納米粒子相關(guān)聯(lián)的信號(hào)的圖像，可以從所獲取的每個(gè)圖像中減去平均值。然后，獲得干涉項(xiàng)構(gòu)成去除背景之后的信號(hào)，并且遠(yuǎn)大于nd?；趯?duì)干涉項(xiàng)的測(cè)量，可以獲得由納米粒子散射的光束的振幅，ns是已知的，并且從該信息中推導(dǎo)出諸如粒子的尺寸、散射信號(hào)的振幅隨粒子尺寸的立方的變化。

用每像素能夠存儲(chǔ)160000個(gè)電子的檢測(cè)器對(duì)信噪比進(jìn)行計(jì)算表明，在通過減去平均值的處理之后，殘留的測(cè)量噪聲對(duì)應(yīng)于由直徑為20納米的粒子生成的信號(hào)。

此外，使用大數(shù)值孔徑na(通常na等于或大于1)的顯微鏡物鏡將不僅能夠增加光采集的立體角，而且還將能夠使由每個(gè)納米粒子散射的信號(hào)的強(qiáng)度增加，因此減小了可觀察到的納米粒子的最小直徑。事實(shí)上，由納米粒子散射的強(qiáng)度隨σ/s變化，其中σ是納米粒子的有效散射橫截面，s是衍射斑點(diǎn)的表面；因此，根據(jù)上述等式(2)，由納米粒子散射的強(qiáng)度隨著數(shù)值孔徑na的平方而變化。

圖5b示意性地示出了在給定時(shí)刻獲得的用于觀察在諸如圖5a中所示的流體介質(zhì)中移動(dòng)的多個(gè)納米粒子的圖像。

圖5a示出了表示為p1至p4的4個(gè)納米粒子，納米粒子p1、p3、p4位于顯微鏡物鏡的焦平面的下游，而粒子p2位于顯微鏡物鏡的焦平面的上游。所有的粒子位于由檢測(cè)器的場(chǎng)和顯微鏡物鏡的景深l限定的分析體積va中。

納米粒子在流體介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)。例如，它們可以是數(shù)十納米到幾百納米的納米粒子，例如水生環(huán)境中的病毒。在根據(jù)本說(shuō)明書的檢測(cè)方法的實(shí)施期間，獲得了一系列圖像，每個(gè)圖像通過在分析體積中發(fā)射的入射光束和由每個(gè)納米粒子在給定的足夠短的時(shí)間(以“凍結(jié)”粒子的運(yùn)動(dòng))期間散射的光束之間的光學(xué)干涉產(chǎn)生。

已知，經(jīng)歷布朗運(yùn)動(dòng)的半徑為r的球形納米粒子的散射能力由下式給出：

d＝kbt/6πηr(4)

其中kb是玻爾茲曼常數(shù)，η是在溫度t下浸入有納米粒子的流體的粘度。

對(duì)于時(shí)間間隔t，在相機(jī)上以2維成像的粒子的跳躍l由下式給出：l＝√4dt其中d是由等式(4)給出的散射能力。

因此，實(shí)際上，嘗試在足夠短的時(shí)間t內(nèi)形成圖像，使得納米粒子尚未覆蓋大于衍射斑點(diǎn)的一部分的距離。通常，顯示圖像將在不超過1毫秒的時(shí)間段內(nèi)形成。

根據(jù)第一變型，可以通過檢測(cè)來(lái)凍結(jié)運(yùn)動(dòng)，利用具有非常高的采集速率的相機(jī)，通常每秒鐘超過幾千幅圖像。

或者，可以使用持續(xù)時(shí)間小于1毫秒的脈沖源，與在檢測(cè)器上獲取每個(gè)圖像同步。在這種情況下，例如，檢測(cè)器可以是采集速率為一百赫茲的標(biāo)準(zhǔn)相機(jī)。半徑為幾十納米(例如約40nm)納米粒子經(jīng)歷的且在2個(gè)連續(xù)圖像之間測(cè)量的“躍遷”大于1微米，這在所使用的顯微鏡物鏡的分辨率下容易測(cè)得。

如上文通過圖4a和圖4b所解釋的，位于顯微鏡物鏡焦平面下游的納米粒子將引起相長(zhǎng)干涉，得到在圖5b所示的檢測(cè)平面41上的亮衍射斑點(diǎn)(p'1，p'3，p'4)。另一方面，位于顯微鏡物鏡的焦平面上游的納米粒子將引起相消干涉，導(dǎo)致檢測(cè)平面上的暗衍射斑點(diǎn)(p'2)。

實(shí)際上，如上所述，根據(jù)干涉是相長(zhǎng)的還是相消的，在檢測(cè)平面41上觀察到實(shí)質(zhì)背景，其上疊加有比背景更亮或更暗的衍射斑點(diǎn)。有利地，根據(jù)本說(shuō)明書的檢測(cè)方法，記錄一系列圖像(例如數(shù)百個(gè))，并且取其平均值。為了獲得僅包含與納米粒子相關(guān)聯(lián)的信號(hào)的圖像，可以從獲取的每個(gè)圖像中減去平均值。

圖6和圖7示出了使用根據(jù)本說(shuō)明書的檢測(cè)方法分析的液體樣品獲得的第一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以檢測(cè)和識(shí)別潛在存在的病毒。這分別涉及含有噬菌體λ型病毒的樣品和含有噬菌體t4型病毒的樣品，該樣品正是代表在布列塔尼海岸發(fā)現(xiàn)的樣品。

圖6a是通過去除平均值處理之后從液體樣品獲得的圖像。用于獲得該圖像的設(shè)備是圖1所示的那種設(shè)備，其具有imperial藍(lán)光led、油浸物鏡100x、用于過采樣衍射點(diǎn)的焦距為300mm的管透鏡、和cmosphotonphf-mv-d1024e-160-cl-12相機(jī)。在圖6a中觀察到一組亮斑點(diǎn)或暗斑點(diǎn)，每一個(gè)對(duì)應(yīng)于位于顯微鏡物鏡的物焦平面的上游或下游的納米粒子。

圖6b示出了與隔離的納米粒子相關(guān)聯(lián)的圖6a的圖像的干涉圖案的變焦，圖6c示出了在所述粒子的區(qū)域中測(cè)量的光強(qiáng)度分布(以借助于已知尺寸的納米粒子校準(zhǔn)的單位)，其作為在檢測(cè)器的檢測(cè)平面中的像素?cái)?shù)的函數(shù)并對(duì)應(yīng)于由納米粒子散射的光束的振幅。

用所獲得的圖像不僅可以確認(rèn)病毒的存在，還可以鑒別它們，特別是根據(jù)其尺寸；在目前的情況下，對(duì)散射光強(qiáng)度的測(cè)量可以推測(cè)出與“噬菌體λ”病毒對(duì)應(yīng)的直徑為60nm的納米粒子。

圖7示出了在十分之一秒量級(jí)的時(shí)間段期間測(cè)量的一定數(shù)量的粒子的軌跡，用類似于用于形成圖6a所示的圖像的設(shè)備那樣的設(shè)備。在該示例中，通過由大約十五個(gè)納米粒子在兩個(gè)連續(xù)圖像之間進(jìn)行的一系列躍遷形成每個(gè)軌跡，它們中的每一個(gè)在圖7中通過圖例中所示的符號(hào)識(shí)別。

從這些實(shí)驗(yàn)測(cè)量開始，可以(如前所述)確定散射光振幅(在圖例中與每個(gè)符號(hào)相對(duì)的任意單位表示的值)。這里，所有納米粒子的散射振幅基本相同，并且可以推斷直徑為90納米的“噬菌體t4”型病毒的均質(zhì)群體的存在。

對(duì)軌跡的分析使得可以將補(bǔ)充信息提供給散射強(qiáng)度的測(cè)量值。事實(shí)上，對(duì)布朗運(yùn)動(dòng)的分析也使得可以推導(dǎo)出關(guān)于納米粒子的具體信息，例如，它們的尺寸、存在的擾亂布朗運(yùn)動(dòng)的尾部等。

盡管通過一定數(shù)量的樣品實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但根據(jù)本發(fā)明的用于檢測(cè)流體環(huán)境中的納米粒子的光學(xué)方法和用于實(shí)施所述方法的設(shè)備具有不同的變型、修改和改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，應(yīng)當(dāng)理解為這些不同的變型、修改和改進(jìn)是由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍的一部分。