本發(fā)明涉及對接收生物粒子的樣品進(jìn)行分析的領(lǐng)域，該分析特別包括確定至少一種所述生物粒子沿著樣品的深度軸的位置。

背景技術(shù)：

其中需要知道生物粒子沿著接收該粒子的樣品的深度軸的位置的許多情況在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。

常用的解決方案為在樣品的不同深度處獲取樣品的一系列圖像。然后尋求其中觀察到生物粒子的清晰圖像的圖像。

這種解決方案的缺點(diǎn)在于該解決方案不能得知透明生物粒子的位置，該透明生物粒子的清晰圖像與周圍環(huán)境的圖像混淆。

本發(fā)明的目的是提出一種沒有該缺點(diǎn)的方法和設(shè)備。

特別地，本發(fā)明的目的是提出一種使得可以根據(jù)三維空間的至少一個軸來確定任何生物粒子的位置的方法和設(shè)備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

該目的是通過對接收生物粒子的樣品進(jìn)行分析的方法來實(shí)現(xiàn)的，該生物粒子包括感興趣粒子，該方法是在下述設(shè)備中實(shí)施的，該設(shè)備包括設(shè)置在第一光源和光學(xué)系統(tǒng)之間的所述樣品，并且所述方法包括以下步驟：

-限定位于所述樣品的第一界面上或者沿與所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸平行的軸線距離所述第一界面已知距離處的參考點(diǎn)；

-使用所述第一光源對接收所述感興趣粒子的區(qū)域進(jìn)行照明，該區(qū)域被稱為照明區(qū)域；

-使用位于所述光學(xué)系統(tǒng)的像平面中的傳感器來獲取所述照明區(qū)域的圖像，該圖像被稱為參考圖像，所述感興趣粒子位于所述光學(xué)系統(tǒng)的所述物平面的外部，并且所述物平面與所述參考點(diǎn)之間沿著與所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸平行的軸線的距離是已知距離，該已知距離稱為有用距離；

-使用所述參考圖像來數(shù)字化構(gòu)建一系列重構(gòu)圖像，每個重構(gòu)圖像與所述物平面沿所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸的預(yù)定偏移量相關(guān)聯(lián)；

-使用所述一系列重構(gòu)圖像來確定所述感興趣粒子與所述物平面之間沿與所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸平行的軸線的距離。

因此，有利地，本發(fā)明包括下述步驟：通過下述方式來檢測該參考點(diǎn)：將所述光學(xué)系統(tǒng)放置成使得所述光學(xué)系統(tǒng)的物平面被放置在所述參考點(diǎn)上、所述第一界面上或者距離所述第一界面已知距離處，并且將所述光學(xué)系統(tǒng)設(shè)置成使得所述感興趣粒子位于所述光學(xué)系統(tǒng)的所述物平面的外部。

針對光學(xué)系統(tǒng)的該布置來獲取參考圖像，使得所述感興趣粒子位于所述光學(xué)系統(tǒng)的所述物平面的外部。

光學(xué)系統(tǒng)的該布置可以直接對應(yīng)于為了檢測參考點(diǎn)而實(shí)施的光學(xué)系統(tǒng)的布置。在這種情況下，在檢測到參考點(diǎn)之后直接獲取參考圖像或散焦圖像。

或者，在檢測到參考點(diǎn)之后，所述方法包括下述步驟：通過使接收所述樣品的支持件相對于所述光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行平移來使所述光學(xué)系統(tǒng)的所述物平面相對于所述參考點(diǎn)偏移。在該偏移步驟之后獲取參考圖像或散焦圖像。

本發(fā)明使得可以精確地知道物平面和所述參考點(diǎn)之間的距離。由此可以精確地知道感興趣粒子和物平面之間的距離，然后使得可以最佳地定位分析設(shè)備，以便對感興趣粒子進(jìn)行研究。

有利地，所述方法包括：使用所述感興趣粒子與所述物平面之間的所述距離以及所述有用距離來確定所述感興趣粒子與所述參考點(diǎn)之間的距離。

此外，所述方法可以包括：使用所述感興趣粒子與所述物平面之間的所述距離來確定所述感興趣粒子在介質(zhì)中的存在。

確定所述有用距離包括下述子步驟：

-通過激光束對所述參考點(diǎn)進(jìn)行照射，所述激光束被所述光學(xué)系統(tǒng)聚焦；

-在所述傳感器上獲取表示所述激光束在所述樣品的界面上的反射的圖像；

-根據(jù)在所述傳感器上形成的所述圖像的強(qiáng)度來調(diào)整所述樣品與所述光學(xué)系統(tǒng)之間沿與所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸平行的軸線的所述有用距離。

通常，所述生物粒子粘附到所述樣品的第二界面上，所述第一界面和所述第二界面是不同的或被混為一談。

與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面的位置和參考點(diǎn)沿平行于光學(xué)系統(tǒng)的光軸的軸線在第二界面上的投影之間沿該軸線的距離例如在+5μm至+2000μm之間或-5μm至-2000μm之間。

所述照明區(qū)域可以包括多個生物粒子。

通常，所述第一光源具有小于200nm的譜寬。

有利地，該方法還包括使用所述一系列重構(gòu)圖像來確定感興趣粒子在與光學(xué)系統(tǒng)的光軸正交的平面中的位置。

每個重構(gòu)圖像由實(shí)部和虛部構(gòu)成，并且在所述實(shí)部和所述虛部中，有利地，僅使用所述重構(gòu)圖像的所述虛部來確定所述感興趣粒子與所述參考點(diǎn)之間沿與所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸平行的軸線的距離。

每個重構(gòu)圖像可以與沿著所述光學(xué)系統(tǒng)的所述光軸的偏移量和有用參數(shù)的值相關(guān)聯(lián)，以構(gòu)成根據(jù)所述偏移量來對所述有用參數(shù)的變化進(jìn)行描述的函數(shù)，并且確定所述粒子與所述物平面之間的距離來實(shí)施對所述函數(shù)的顯著值進(jìn)行搜索，該顯著值尤其為極值、拐點(diǎn)或過零值。

有利地，確定所述感興趣粒子與所述物平面之間的距離包括以下子步驟：

-使用與所述物平面的偏移量的第一步長相關(guān)聯(lián)的第一系列重構(gòu)圖像來確定所述感興趣粒子與所述物平面之間的近似距離；

-使用與所述物平面的偏移量的第二步長相關(guān)聯(lián)的第二系列重構(gòu)圖像來確定所述感興趣粒子與所述物平面之間的精確距離，其中所述第二步長比所述第一步長更精細(xì)。

有利地，使用所述感興趣粒子與所述物平面之間的距離使所述光學(xué)系統(tǒng)相對于所述感興趣粒子移位，以便將分析激光束(363)聚焦在所述感興趣粒子上。

有利地，使用所述感興趣粒子與所述物平面之間的所述距離使所述光學(xué)系統(tǒng)相對于所述感興趣粒子移位，以便調(diào)整位于所述像平面中的光電檢測器的聚焦。

此外，所述方法可以包括對所述樣品中存在的生物粒子的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)的步驟。這些生物粒子可以包括：細(xì)菌、孢子、細(xì)胞、酵母或微生物。

本發(fā)明還涉及一種用于對接收生物粒子的樣品進(jìn)行分析的設(shè)備，該生物粒子包括感興趣粒子，所述設(shè)備包括：

-第一光源；

-成像單元，該成像單元包括光學(xué)系統(tǒng)和傳感器，使得所述傳感器位于所述光學(xué)系統(tǒng)的像平面中，所述像平面是物平面通過所述光學(xué)系統(tǒng)的共軛；

-支持件，該支持件適于接收布置在所述第一光源和所述成像單元之間的所述樣品；

-平移裝置，該平移裝置適于使所述支持件沿與所述光學(xué)系統(tǒng)的所述光軸平行的軸線相對于所述成像裝置進(jìn)行移位；以及

-計(jì)算裝置：

-連接至對與參考點(diǎn)相關(guān)的信息進(jìn)行存儲的存儲器，該參考點(diǎn)位于所述樣品的第一界面上或者在沿所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸距離所述第一界面已知距離處，

-當(dāng)所述物平面相對于所述參考點(diǎn)偏移時，接收由所述傳感器獲取的圖像作為輸入，該圖像被稱為參考圖像，

-適于使用所述參考圖像來進(jìn)行一系列重構(gòu)圖像的數(shù)字化構(gòu)建，每個重構(gòu)圖像與所述物平面沿所述光學(xué)系統(tǒng)的光軸的預(yù)定偏移量相關(guān)聯(lián)；以及

-將所述感興趣粒子與所述物平面之間沿著與所述光學(xué)系統(tǒng)的所述光軸平行的軸線的距離提供作為輸出。

該設(shè)備還可以包括激光器，該激光器適于提供與光學(xué)系統(tǒng)的光軸對準(zhǔn)的激光束，并且以激光束的聚焦點(diǎn)對應(yīng)于物平面的方式耦接到光學(xué)系統(tǒng)。

附圖說明

在參照附圖閱讀僅用于信息的目的且絕不是限制性而提供的實(shí)施例的描述時，將更好地理解本發(fā)明，在附圖中：

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的分析設(shè)備的第一實(shí)施例；

圖2概略地示出了根據(jù)本發(fā)明的分析方法的第一實(shí)施例；

圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的分析設(shè)備的第二實(shí)施例；

圖4概略地示出了根據(jù)本發(fā)明的分析方法的第二實(shí)施例的細(xì)節(jié)；

圖5a至圖5c示出了圖4所示方法的細(xì)節(jié)；

圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的參考圖像；

圖7概略地示出了根據(jù)本發(fā)明的分析方法的第三實(shí)施例的細(xì)節(jié)；以及

圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的方法的第四實(shí)施例中使用的輪廓圖。

具體實(shí)施方式

將共同描述根據(jù)本發(fā)明的分析方法和分析設(shè)備，根據(jù)本發(fā)明的分析設(shè)備適于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的分析方法。

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的分析設(shè)備100的第一實(shí)施例。圖2示出了在分析設(shè)備100中實(shí)施的根據(jù)本發(fā)明的分析方法的第一實(shí)施例。

分析設(shè)備100包括支持件110，該支持件110適于接收樣品111。

例如，支持件110是夾具或透明板，或者穿有開口以允許光線通過的板。

樣品111是透明或半透明介質(zhì)，即，在可見光譜中或者更一般地，在300nm和1000nm之間的光譜中具有大于或等于70％的透射系數(shù)。

樣品111由界面或邊界、或樣品與和該樣品直接接觸的介質(zhì)之間的界限來限定。

樣品由諸如水、緩沖溶液、含有試劑的液體、培養(yǎng)基之類的液體和位于該液體中的生物粒子112組成。或者，樣品由諸如瓊脂之類的固體培養(yǎng)基和位于該固體培養(yǎng)基上的生物粒子組成。根據(jù)另一替選方案，樣品由生物粒子位于其中的氣體組成。因此，生物粒子可以位于樣品內(nèi)(例如，在液體中)，或者在樣品的表面上齊平(例如位于瓊脂上)。

例如，生物粒子112表示細(xì)菌、孢子、細(xì)胞、酵母或任何類型的微生物。這些生物粒子之一被命名為感興趣粒子112a。

在圖1所示的示例中，樣品111包括培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基被封閉在由下載玻片113(例如標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片)、上載玻片114和橫向圍繞樣品111并與上載玻片和下載玻片連接在一起的粘合劑115所限定的流體室內(nèi)。上載玻片114和下載玻片113在可見光范圍內(nèi)是透明的，并且這適用于其他有用波長的情況。

樣品和下載玻片113之間的邊界限定了樣品111的下界面116。樣品和上載玻片114之間的邊界限定了樣品111的上界面117。

第一光源120在從第一光源到樣品111的光的傳播方向上位于樣品111的上游。在下文中，術(shù)語上游和下游是指從第一光源120到樣品111的光的傳播方向。

例如，第一光源120是激光器，發(fā)光二極管，白燈，特別是無論是否被濾波的汞蒸汽燈。第一光源可以包括光纖以便在下載玻片113下方傳送光。

有利地，第一光源120是時間相干的。有利地，第一光源120具有小于200nm、甚至小于100nm或甚至25nm的光譜寬度。

優(yōu)選地，第一光源120是空間相干的。

關(guān)于第一光源120的時間相干性和空間相干性，將在下文提供更多細(xì)節(jié)。

第一光源以透射方式照射樣品的區(qū)域119。感興趣粒子112a位于區(qū)域119中。

成像單元130在從第一光源到樣品111的光的傳播方向上位于上載玻片114的下游。在所描述的實(shí)施例中，成像單元130位于樣品111上方。

成像單元130包括光學(xué)系統(tǒng)131和傳感器132。

光學(xué)系統(tǒng)131例如包括物鏡，特別是顯微鏡物鏡。該光學(xué)系統(tǒng)具有物平面133和像平面134。像平面134是物平面通過光學(xué)系統(tǒng)的共軛面(或圖像)。換句話說，位于物平面中的物體對應(yīng)于像平面中的清晰圖像。

傳感器132例如是ccd型或cmos型的矩陣傳感器。該傳感器位于像平面134中。因此，傳感器132獲取物平面133的一部分的透射圖像。

在無限平面配置中，物平面是光學(xué)系統(tǒng)的物體焦平面，并且像平面被發(fā)送到無限遠(yuǎn)。諸如鏡筒透鏡之類的鄰近光學(xué)設(shè)備使得可以將像平面聚焦在傳感器132上。在本文的其余部分中，術(shù)語傳感器132將傳感器132及其鄰近光學(xué)設(shè)備組合在一起。

光學(xué)系統(tǒng)131具有光軸135。光軸垂直于物平面和像平面。光軸135限定樣品111的深度。該軸連接樣品111的下界面116和上界面117。優(yōu)選地，光軸135基本上垂直于下界面116和上界面117。術(shù)語界面表示所研究樣品111的邊界。

根據(jù)本發(fā)明的分析特別包括沿著平行于光軸135的軸線來確定感興趣粒子112a的位置。

設(shè)備100還包括用于平移的裝置140，該裝置適于沿著平行于光軸135的軸線移動成像單元130。在諸如上文所限定的無限平面配置中，平移裝置140只能移動光學(xué)系統(tǒng)131，而傳感器132保持固定?；蛘撸揭蒲b置140適于沿著平行于光軸135的軸線移動支持件110。

根據(jù)實(shí)施例，平移裝置140還根據(jù)對與光軸135正交的平面進(jìn)行限定的另外兩個軸線來進(jìn)行平移。

傳感器132連接到用于計(jì)算的裝置150，特別是處理器或微處理器。

設(shè)備100適于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法，如圖2概略地所示那樣。

該方法包括確定參考點(diǎn)118的第一步驟21。該步驟包括選擇或限定參考點(diǎn)118。該選擇一般是任意的。

參考點(diǎn)位于樣品111的第一界面上，或者在距離該第一界面已知距離處，該距離是沿光軸135限定的。

特別地，參考點(diǎn)位于上界面117或下界面116上。在圖1所示的示例中，參考點(diǎn)位于樣品的上界面117上。

根據(jù)未示出的替選方案，參考點(diǎn)不直接位于樣品的界面上，而是在距離樣品界面已知距離處。例如，參考點(diǎn)位于上載玻片114的與樣品相反的面上，該上載玻片114的厚度是已知的。

在設(shè)備100中，用于計(jì)算的裝置150連接到存儲器151，該存儲器151存儲與參考點(diǎn)有關(guān)的信息，特別是該參考點(diǎn)與所述第一界面之間沿著平行于光軸135的軸線的距離以及可選的該參考點(diǎn)在與光軸135正交的平面中的坐標(biāo)。

然后使用第一光源120來照射樣品111，由此在樣品中形成如上所述的照明區(qū)域119(步驟22)。

然后，使用成像單元130獲取照明區(qū)域119的透射圖像(步驟23)。該圖像被命名為參考圖像。在該獲取期間，物平面133位于距感興趣點(diǎn)118已知距離d1處，該距離是沿著平行于光軸135的軸線來限定的。感興趣粒子112a位于物平面133的外部。優(yōu)選地，在參考圖像的獲取期間，物平面位于樣品111的外部。例如，當(dāng)參考點(diǎn)118位于上界面117上時，物平面位于參考點(diǎn)的上方或下方(上游或下游)的5μm與1500μm之間，優(yōu)選在5μm與1000μm之間，更優(yōu)選在5μm與800μm之間。同樣地，這里的距離是沿著平行于光軸135的軸線來限定的。

通常，在參考圖像的獲取期間，物平面位于距離對樣品111進(jìn)行限定的界面大于2μm的距離處，優(yōu)選地大于5μm，優(yōu)選在[5μm-1500μm]的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在[5μm-1000μm]的范圍內(nèi)，還更優(yōu)選在[5μm-800μm]的范圍內(nèi)?；蛘撸P(guān)于粒子位置的信息可以先驗(yàn)地獲得。然后，物平面相對于該先驗(yàn)信息偏移一個值，諸如如上所限定的值。

在圖1所示的實(shí)施例中，先驗(yàn)信息的示例是附著到表面(例如，對樣品111進(jìn)行界定的上載玻片114)的生物粒子的觀測值。了解載玻片的位置使得可以確立這些粒子的位置的先驗(yàn)值，這些粒子附著到與樣品鄰接的該載玻片的面117。

可以說，參考圖像是照明區(qū)域的一部分的圖像，因?yàn)樵搮⒖紙D像是由來自該照明區(qū)域的光線所形成的。特別地，參考圖像是由來自第一光源并且被樣品的生物粒子散射的光線與來自第一光源120并且已經(jīng)通過樣品而沒有被散射的光線相互干涉而形成的全息圖。參考圖像特別地包括與感興趣粒子相關(guān)聯(lián)的全息圖。

在設(shè)備100中，計(jì)算裝置150連接到傳感器132以便接收參考圖像。

在步驟24中，實(shí)施了一系列重構(gòu)圖像的數(shù)字化構(gòu)建。每個重構(gòu)圖像對應(yīng)于物平面沿著光軸135的、相對于與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面位置的預(yù)定偏移量。這些是虛擬偏移量，即，是通過數(shù)字化構(gòu)建模擬的，而不是實(shí)際實(shí)施的。換句話說，在與相對于物平面的預(yù)定偏移量相關(guān)聯(lián)的重構(gòu)平面中計(jì)算每個重構(gòu)圖像。更準(zhǔn)確地說，每個重構(gòu)平面對應(yīng)于相對于物平面偏移該預(yù)定偏移量的物平面的光學(xué)系統(tǒng)成像。這通常被稱為數(shù)字傳播。這些偏移量被記作di1，di2，...din，di-1，...di-n。優(yōu)選地，偏移量在相對于物平面在兩個端位置之間延伸，其中這兩個端位置圍繞上界面117，更一般地，圍繞感興趣點(diǎn)。這些偏移量可以按照有規(guī)律的步長分布，該步長特別是0.10μm和1μm之間的步長，例如該步長為0.25μm或0.20μm。因此，假設(shè)物平面相繼地位于距離與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面的位置di1，di2，...din，di-1，...di-n處，此時由傳感器132所獲取的圖像被數(shù)字化重構(gòu)。參考圖像是以實(shí)驗(yàn)方式獲得的圖像，而重構(gòu)圖像形成通過數(shù)字傳播構(gòu)建的圖像。

與這些偏移量相關(guān)聯(lián)的兩個端位置之間的差取決于所觀察的樣品111，特別是取決于該樣品的厚度。當(dāng)不存在關(guān)于感興趣粒子的位置的先驗(yàn)時，將兩個端位置確定為使得它們位于樣品111的兩側(cè)上。當(dāng)存在關(guān)于樣品中感興趣粒子的位置的先驗(yàn)時，將兩個端位置設(shè)立成布置在該位置的兩側(cè)上。

數(shù)字化重構(gòu)使用參考圖像(可能已經(jīng)經(jīng)歷了預(yù)先處理)的傅立葉變換，在將該參考圖像轉(zhuǎn)換回真實(shí)空間之前，對該參考圖像應(yīng)用傳播算子。該傳播算子是與所計(jì)算的重構(gòu)圖像相關(guān)聯(lián)的偏移量的函數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明，傳播算子例如是基于瑞利-索末菲(rayleighsommerfeld)公式的積分。

在wilson等人在2012年7月16日第20卷第15期的光學(xué)快報16735-16744頁發(fā)表的題為“3dlocalizationofweakscatterersindigitalholographicmicroscopyusingrayleigh-sommerfeldback-propagation(使用瑞利-索末菲反向傳播的數(shù)字全息顯微術(shù)中弱散射體的3d定位)”的文章中描述了使用微球體的圖像所實(shí)現(xiàn)的數(shù)字傳播的示例。lee等人在2007年2月19日第15卷第4期的光學(xué)快報第1505-1512頁發(fā)表的題為“holographicmicroscopyofholographicallytrappedthree-dimensionalstructures(全息捕獲的三維結(jié)構(gòu)的全息顯微術(shù))”的文章中描述了數(shù)字傳播的另一示例。

重構(gòu)的圖像是復(fù)數(shù)圖像，即具有實(shí)部和虛部。這些重構(gòu)圖像包括一組點(diǎn)，圖像的每個點(diǎn)被分配了復(fù)數(shù)量值。

根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備100的計(jì)算裝置150適于使用參考圖像來執(zhí)行如上所述的一系列重構(gòu)圖像的數(shù)字化構(gòu)建。

然后，使用該一系列重構(gòu)圖像來確定感興趣粒子112a與參考點(diǎn)118之間的距離，該距離是根據(jù)平行于軸線135的軸線來限定的(步驟25)?；蛘?，使用一系列重構(gòu)圖像將該距離限制為感興趣粒子112a與物平面133之間的距離dref。

為此，計(jì)算感興趣粒子112a與和參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面之間沿著光軸135的距離dref。已知該物平面與參考點(diǎn)118之間沿著光軸135的距離d1，從該距離推斷出感興趣粒子112a與參考點(diǎn)118之間沿著光軸135的距離df。

為了確定感興趣粒子112a與和參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面之間沿著光軸135的距離dref，將每個重構(gòu)圖像與有用參數(shù)的值相關(guān)聯(lián)，其中有用參數(shù)為屬于重構(gòu)圖像的點(diǎn)的復(fù)數(shù)強(qiáng)度參數(shù)(或復(fù)數(shù)幅度)的函數(shù)。例如，重構(gòu)圖像的復(fù)數(shù)強(qiáng)度參數(shù)(或復(fù)數(shù)幅度)是重構(gòu)圖像的虛部、實(shí)部、模數(shù)或相位。優(yōu)選地，有用參數(shù)的這些值以輪廓圖的形式聚集在一起，該輪廓圖表示根據(jù)每個重構(gòu)圖像相對于物平面133沿著光軸135的偏移量的有用參數(shù)的值。

然后，尋找該輪廓圖上的顯著值，例如最大值或拐點(diǎn)或過零值。該顯著值與下述偏移量相關(guān)聯(lián)，該偏移量為感興趣粒子和與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面133的位置之間沿著光軸135的偏移量。優(yōu)選地，將要搜尋的顯著值設(shè)置為最大值并且通常是極值，以便限制通過二階導(dǎo)數(shù)(檢測拐點(diǎn))期間的不確定性的影響，并且以便克服測量偏差的校正(檢測過零點(diǎn))。但有用參數(shù)的顯著值也可以是對根據(jù)重構(gòu)圖像與物平面133之間的偏移量的該參數(shù)的變化進(jìn)行描述的函數(shù)的過零值，或該函數(shù)的拐點(diǎn)，或任何其他準(zhǔn)則。

因此，通常，通過以下一連串步驟來確定參考圖像的物平面133與感興趣粒子112a之間的距離dref：

-在參考圖像上識別與所述感興趣粒子相關(guān)聯(lián)的全息圖，

-通過下述方式來進(jìn)行圖像的數(shù)字化重構(gòu)：將投影算子應(yīng)用到所述參考圖像或參考圖像的包括所述全息圖的感興趣區(qū)域，使得針對相對于物平面133的多個預(yù)定偏移量di1，di2，...din，di-1，...di-n獲得重構(gòu)圖像，每個重構(gòu)圖像對應(yīng)于每個偏移量，

-在每個重構(gòu)圖像中提取表示圖像的每個點(diǎn)的復(fù)數(shù)值的參數(shù)，該參數(shù)被稱為有用參數(shù)，

-根據(jù)所述偏移量分析該有用參數(shù)的變化并且識別該有用參數(shù)的顯著值，

-確定與該有用參數(shù)的所述顯著值相對應(yīng)的偏移量，然后認(rèn)為感興趣粒子112a與物平面133之間的距離dref等于該偏移量。

知道物平面133與參考點(diǎn)118之間的距離d1，則可以通過運(yùn)算df＝dref–d1推導(dǎo)出感興趣粒子112a與參考點(diǎn)118之間的距離df。

在每個重構(gòu)圖像上提取有用參數(shù)是指例如通過獲取與構(gòu)成圖像的各個點(diǎn)中的每一點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的復(fù)數(shù)量值的和或平均值來計(jì)算代表這些點(diǎn)的參數(shù)。

有用參數(shù)可以是使用構(gòu)成圖像的各個點(diǎn)的虛部的值所確定的圖像的虛部的平方。然后，有用參數(shù)對應(yīng)于構(gòu)成圖像的所有點(diǎn)的虛部的平方的平均值。發(fā)明人已經(jīng)觀察到，這樣的參數(shù)使得可以獲得良好的定位精度。

除了成像部分之外，該參數(shù)還可以包括構(gòu)成圖像的點(diǎn)的實(shí)部的值，或構(gòu)成圖像的點(diǎn)的模數(shù)，或者這些不同量值的平方。發(fā)明人已經(jīng)表明，可以沿著光軸135來定位感興趣粒子112a的位置，該位置對應(yīng)于有用參數(shù)的顯著值，并且例如對應(yīng)于：

-最大值：這是當(dāng)沿著光軸135觀察圖像的虛部的平方上的變化或模數(shù)上的變化或模數(shù)的平方上的變化時的情況。

-過零值：例如當(dāng)沿著光軸135觀察圖像的實(shí)部或其平方上的變化時。

可替選地或以互補(bǔ)方式，識別所述感興趣參數(shù)的顯著值使得可以得出關(guān)于培養(yǎng)基中的感興趣粒子112a在所考慮的偏移范圍內(nèi)存在的結(jié)論，而感興趣粒子112a與物平面之間的距離dref不一定要被記住。

每個感興趣粒子112a對應(yīng)于參考圖像上的全息圖。然后可以選擇受限于全息圖的感興趣區(qū)域，并且將上述步驟應(yīng)用于與全息圖相關(guān)聯(lián)的每個感興趣區(qū)域。

計(jì)算裝置150將感興趣粒子112a與參考點(diǎn)118之間沿著軸線135的距離df提供作為輸出。

借助于數(shù)字傳播使得可以減少要獲取的樣品圖像的數(shù)量。特別地，獲取單個圖像就足夠了。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法特別快并且可以自動化。

在某些情況下，當(dāng)感興趣粒子位于光學(xué)系統(tǒng)的物平面中時，沒法將該感興趣粒子的圖像與周圍介質(zhì)(該周圍介質(zhì)對應(yīng)于樣品111的圍繞該感興趣粒子的部分)的圖像區(qū)分開。例如，當(dāng)感興趣粒子處于在第一光源的光譜中具有相同的透射系數(shù)或近折射率(例如在20％以內(nèi))的介質(zhì)中時就是這種情況。在這種情況下，根據(jù)例如在背景技術(shù)中所描述的現(xiàn)有技術(shù)的方法不能確定感興趣粒子的位置。但是，根據(jù)本發(fā)明，可以在重構(gòu)圖像中識別感興趣粒子，因?yàn)樵撝貥?gòu)圖像是包含比所獲取的圖像更多的信息的復(fù)數(shù)圖像。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法使得即使在下述情況下也可以沿著平行于光學(xué)系統(tǒng)的光軸的軸線來確定粒子的位置，該情況為當(dāng)粒子位于光學(xué)系統(tǒng)的物平面內(nèi)時在所獲取的圖像中無法將該粒子與該粒子周圍的介質(zhì)區(qū)分開。

最后，根據(jù)本發(fā)明的方法使得可以沿著光軸135將圖像與物平面的位置相關(guān)聯(lián)，該位置是以極高的精度確定的(鏈接至在步驟23中實(shí)施的偏移的步驟)。使用物理和非虛擬偏移將不容易實(shí)現(xiàn)這樣的精度。

參考圖像可以包括單個生物粒子的全息圖，然后該全息圖限定根據(jù)本發(fā)明的感興趣粒子。

或者，參考圖像包括多個生物粒子的全息圖，任意選擇這些全息圖之一來限定根據(jù)本發(fā)明的感興趣粒子，并且重構(gòu)圖像的部分或感興趣區(qū)域位于這些全息圖之一的中央。

可以實(shí)施對參考圖像進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)備步驟。為此，獲取所謂的背景圖像，該背景圖像代表光學(xué)系統(tǒng)的缺陷(內(nèi)部反射，灰塵等)。例如，背景圖像對應(yīng)于在拍攝圖像的同時通過在與物平面平行的平面中移動樣品而獲取的圖像?；蛘?，背景圖像是使用針對樣品在平行于物平面的平面中的多個位置所獲得的多個靜態(tài)圖像而形成的平均圖像。然后，逐個像素地將參考圖像除以背景圖像。由此獲得標(biāo)準(zhǔn)化參考圖像。這樣的標(biāo)準(zhǔn)化改進(jìn)了該方法的結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明的第一替選方案，直接使用參考圖像或使用如上所限定的標(biāo)準(zhǔn)化參考圖像來執(zhí)行數(shù)字傳播。

將與偏移量z相關(guān)聯(lián)的重構(gòu)圖像記為：

up(z)＝tf^-1{tf(u0)xh(z)}

其中：u0表示執(zhí)行數(shù)字傳播所使用的圖像(此處為參考圖像或標(biāo)準(zhǔn)化參考圖像)，tf表示傅里葉變換算子，tf^-1表示傅里葉逆變換，x表示矩陣的逐項(xiàng)相乘，以及h表示基于瑞利-索末菲積分的傳播算子。

在這里所示的例子中，我們特別有：

h(u，v，z)＝exp[-|z|*im(p(u，v))+i*z*re(p(u，v))]

其中：

■re表示實(shí)部算子，im表示虛部算子，i²＝-1，

■u和v表示與實(shí)際空間中和軸135正交的平面中的坐標(biāo)x、y相關(guān)聯(lián)的傅立葉空間中的坐標(biāo)，

■以及

以下述方式來限定坐標(biāo)u和v：

按的步長

按的步長

并且其中：

■δp為在物平面中限定的采樣步長的大小(因此與傳感器132的像素間距相關(guān)并且與光學(xué)系統(tǒng)131的放大系數(shù)相關(guān))，

■nx和ny為在圖像u0中分別根據(jù)x、y的像素?cái)?shù)，

■λ為第一光源的中心波長。

然后使用每個重構(gòu)圖像up(z)的虛部來確定感興趣粒子沿著光學(xué)系統(tǒng)的光軸的位置。特別地，尋找下述重構(gòu)圖像或重構(gòu)圖像的一部分，該重構(gòu)圖像或重構(gòu)圖像的部分的虛部的平方(即，構(gòu)成圖像的各個點(diǎn)的虛部的平方的平均值)最大。重構(gòu)圖像的一部分是重構(gòu)圖像的以感興趣粒子的圖像為中央的一部分。如果參考圖像涉及多個生物粒子，則可以使用相同的參考圖像，每次使用以不同生物粒子為中心的重構(gòu)圖像來確定這些生物粒子中每一個粒子的位置。

現(xiàn)在將參照圖3和圖4來描述根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備300的第二實(shí)施例以及根據(jù)本發(fā)明的方法的第二實(shí)施例。將僅描述圖3相對于圖1的不同之處。

圖1的附圖標(biāo)記111、120、112a、116、117、118、130、131、132、135、120、150、151分別對應(yīng)于圖3的附圖標(biāo)記311、320、312a、316、317、318、330、331、332、335、320、350、351。

把根據(jù)圖3的設(shè)備與根據(jù)圖1的設(shè)備區(qū)分開的特征中的每個特征可以獨(dú)立地與圖1的設(shè)備分離以及組合，以形成本發(fā)明的許多其它替代方案。

根據(jù)如圖3所示的有利實(shí)施例，生物粒子直接粘附到樣品的第二界面。

平行于軸335并通過參考點(diǎn)318的直線通過該第二界面。

有利地，將該第二界面與諸如上文所限定的第一界面混為一談。在相反的情況下，優(yōu)選地，沿著平行于光軸135的軸線，第一界面相對于第二界面的位置是已知的。特別地，該位置沿著平行于光軸135并經(jīng)過參考點(diǎn)318的軸線延伸。

因此，存在關(guān)于參考點(diǎn)318相對于生物粒子的、沿著光軸335的位置的先驗(yàn)知識。

第二界面基本上與軸線335正交。特別地，第二界面是樣品的下界面316或上界面317。

在實(shí)踐中，例如，我們研究：

-瓊脂，生物粒子在該瓊脂的上表面上延伸，或

-生物粒子，該生物粒子自然地粘附在覆蓋樣品的載玻片上，所述載玻片位于樣品上方。

在圖3所示的示例中，生物粒子粘附到上界面317。

通常，上界面相對于垂直于軸線335的平面略微傾斜小于0.1rad(弧度)(甚至小于0.05rad或小于0.02rad)的角度。

根據(jù)本發(fā)明的方法使得可以在對樣品上界面進(jìn)行限定的上載玻片相對于與軸線335正交的平面傾斜的情況下，克服關(guān)于生物粒子沿著軸線335的定位的不確定性。

更一般地，根據(jù)本發(fā)明的方法使得可以在對樣品上界面進(jìn)行限定的上載玻片相對于與軸線335正交的平面形變的情況下，克服關(guān)于生物粒子沿著軸線335的定位的不確定性。該形變可以表示任何形變，例如粘附到所述第二界面的生物粒子位于由垂直于光軸335并且沿該軸間隔至少100μm(甚至小于50μm)的兩個平坦表面所界定的圓柱體內(nèi)。

優(yōu)選地，與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面的位置和參考點(diǎn)318沿平行于光軸335的軸線在第二界面上的投影之間沿該軸線的距離在+5μm至+1500μm之間或-5μm至-1500μm之間。有利地，該距離在+5μm至+1000μm之間或-5μm至-1000μm之間，或者甚至在+5μm至+800μm之間或-5μm至-800μm之間，或更甚至在+5μm至+200μm之間或-5μm至-200μm之間。由此限定了最佳散焦范圍，使得更容易計(jì)算感興趣粒子與參考點(diǎn)之間的距離。

由于生物粒子粘附到所述第二界面并且位于具有有限高度的圓柱體中，因此在參考圖像的獲取期間，容易確保感興趣粒子位于距離最佳散焦范圍中的物平面成一定距離處。

最佳散焦范圍的寬度可以取決于第一光源320的特性，特別是該第一光源的時間相干性和空間相干性。

因此，可以根據(jù)期望研究的多個感興趣粒子之間沿著光軸335的距離來適配第一光源，使得這些感興趣粒子同時處于最佳散焦范圍內(nèi)。

例如，可以使用白光源，以獲得+5μm至+200μm以及-5μm至-200μm的最佳散焦范圍。第一光源的光譜寬度越小，最佳散焦范圍的寬度就越大。

此外，第一光源320的表觀直徑越小，最佳散焦范圍越寬。

在圖3所示的示例中，分析設(shè)備300包括用于確定距離的裝置，該裝置用于確定參考點(diǎn)同與參考圖像相關(guān)聯(lián)的光學(xué)系統(tǒng)物平面的位置之間沿著與光軸335平行的軸線的距離。將該距離命名為有用距離。

這些裝置特別地包括適于對參考點(diǎn)318進(jìn)行照射的激光器360。當(dāng)不期望激光束363照射參考點(diǎn)318時，連接到平移板362的快門361使得可以關(guān)閉激光器的輸出。

有利地，激光束363沿著平行于光軸335的軸線入射在參考點(diǎn)上。

激光束363和圖像傳感器332光學(xué)耦接至同一光學(xué)系統(tǒng)331，使得激光束的聚焦點(diǎn)對應(yīng)于傳感器的物平面。

在圖3所示的示例中，參考點(diǎn)位于上界面317上，這就是為什么激光束363經(jīng)由該上界面317穿透到樣品中的原因。

激光束363穿過第一分離載玻片371，然后在到達(dá)上界面317之前在第二分離載玻片371上反射。每個分離載玻片可以是二向色載玻片。或者，使用立方體或半反射鏡。

通過實(shí)施圖4所示的以下子步驟來確定有用距離。

在子步驟41中，使用激光束照射參考點(diǎn)318。

然后，以下述方式調(diào)整樣品與光學(xué)系統(tǒng)331之間特別是沿著平行于光軸335的軸線的距離，該方式為使得傳感器332接收由激光束363在參考點(diǎn)上的鏡面反射而形成的斑點(diǎn)圖像(子步驟42)?？梢酝ㄟ^參照圖1所描述的平移裝置340來進(jìn)行這種調(diào)整。

在實(shí)踐中，參考點(diǎn)318的定義可以取決于激光束363在與光軸335正交的平面中的任意位置。

該調(diào)整實(shí)現(xiàn)了在接收參考點(diǎn)的表面上檢測激光束363的鏡面反射。圖5a至圖5c中示出了這種調(diào)整的示例，其中參考點(diǎn)位于上界面317上。

圖像5a對應(yīng)于上界面317上方的物平面533的位置。在傳感器上獲得的圖像是不太亮的大斑點(diǎn)。

圖像5b對應(yīng)于上界面317上的物平面的位置。在傳感器上獲得的圖像是窄小且非常亮的斑點(diǎn)。

圖像5c對應(yīng)于上界面317下方的物平面的位置。在傳感器上獲得的圖像是不太亮的大斑點(diǎn)。

通過沿軸線335移動光學(xué)系統(tǒng)，連續(xù)觀察如下：

-不太亮的大斑點(diǎn)；

-第一窄小且非常亮的斑點(diǎn)，該斑點(diǎn)對應(yīng)于由光學(xué)系統(tǒng)331聚焦在上載玻片314的與樣品相反的面315上的激光束363的反射，該斑點(diǎn)呈現(xiàn)最大亮度；

-第二窄小且非常亮的斑點(diǎn)，該斑點(diǎn)對應(yīng)于由光學(xué)系統(tǒng)331聚焦在上載玻片314的面317上的激光束363的反射，其中該面與樣品鄰接，從而構(gòu)成樣品的界面之一，該斑點(diǎn)具有次極大亮度，然后，

-對應(yīng)于激光束在樣品311中的后向散射的不太亮的大斑點(diǎn)。

因此，對激光束的鏡面反射信號的光強(qiáng)度隨光學(xué)系統(tǒng)331與樣品311之間的相對間隔而變化的分析使得可以確定感興趣點(diǎn)318的位置，在本示例中，參考點(diǎn)對應(yīng)于激光束的聚焦點(diǎn)，該聚焦點(diǎn)具有能夠反射光束的表面，在這里是面317或面315。

在上述示例中，鏡面反射的最強(qiáng)圖像和具有次極大強(qiáng)度的鏡面反射的圖像對應(yīng)于下述配置，在該配置中物平面分別穿過激光束與下述兩個面的交叉點(diǎn)，該兩個面分別為上載玻片314的和樣品相反的面以及上載玻片314的和樣品鄰接的面。

可以注意到，檢測激光束在上載玻片的與樣品鄰接的面上的反射是特別有意義的，因?yàn)榧词乖谕ㄟ^浸液物鏡形成光學(xué)系統(tǒng)的情況下該面也是可見的。

然后，該方法可以包括子步驟43，該子步驟43包括相對于成像裝置將接收樣品的支持件沿著光軸335移動已知距離。這里也可以使用如參照圖1所描述的平移裝置。該子步驟可用于將感興趣粒子置于如上所限定的最佳光學(xué)散焦范圍內(nèi)。

圖3示出了在上界面317上反射且通過光學(xué)系統(tǒng)331在傳感器上成像的激光束364。反射的激光束364在第二分離載玻片372上被反射，然后在第一分離載玻片371上被反射。

當(dāng)快門361打開并且第一光源320熄滅時，計(jì)算裝置351接收由傳感器351所獲取的圖像作為輸入。這些計(jì)算裝置對平移裝置340進(jìn)行控制，以便實(shí)施子步驟42，并且在適用情況下，實(shí)施子步驟43。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法還包括使用一系列重構(gòu)圖像來確定感興趣粒子在與光學(xué)系統(tǒng)的光軸正交的平面中的位置。將參照圖7來進(jìn)一步描述這種確定的示例。

平移裝置340可以根據(jù)下述兩個軸線來實(shí)施平移，該兩個軸線合起來對與光軸335正交的平面進(jìn)行限定。由此，可以連續(xù)地定位同一樣品的多個感興趣粒子。在對參考點(diǎn)進(jìn)行確定的單個步驟之后，如上所述地多次實(shí)施以下一系列步驟：

-對樣品的區(qū)域進(jìn)行照明；

-獲取參考圖像；

-數(shù)字化構(gòu)建一系列重構(gòu)圖像；以及

-確定感興趣粒子與參考點(diǎn)之間的距離，和/或使用參考圖像或感興趣粒子的一個或多個重構(gòu)圖像來檢測數(shù)量和位置。

在兩個這些步驟的系列之間，在與光軸335正交的平面中平移樣品。

圖3還示出了在根據(jù)本發(fā)明的方法和設(shè)備中所實(shí)施的分析的附加步驟。

設(shè)備300包括用于將激光束363的腰部(即激光束的直徑最小的位置)定位在感興趣粒子上的裝置。

感興趣粒子在反射中所發(fā)射的輻射由光學(xué)系統(tǒng)331收集并由對該輻射進(jìn)行分析的光譜儀380接收。例如，光譜儀380是對拉曼散射進(jìn)行分析的光譜儀或熒光光譜儀。在這種類型的分析中，優(yōu)選的是，激發(fā)激光束集中在所檢查的粒子上。這防止了粒子附近的拉曼散射光譜的干擾。

借助于諸如平移板(未示出)之類的平移裝置來實(shí)施激光束363的腰部的定位，該平移板適于相對于成像裝置331移動樣品?？梢杂善揭蒲b置340來形成這些平移裝置。平移裝置由計(jì)算裝置350來控制。計(jì)算裝置350使用感興趣粒子相對于參考點(diǎn)的位置來將光學(xué)系統(tǒng)331的物平面定位在感興趣粒子上。

特別地，使成像裝置相對于感興趣粒子移動，以便將分析激光束聚焦在與成像裝置的光軸正交的平面中，該平面接收所述感興趣粒子，并且使該分析激光束的腰部在該平面中移動，使得將該腰部精確地放置在感興趣粒子上。

可以考慮需要將激光束精確定位在感興趣粒子上的任何其他類型的分析?？梢允褂门c激光器360分離的激光源來對感興趣粒子進(jìn)行分析。

類似地，可以使用光學(xué)耦接到光學(xué)系統(tǒng)331的光電檢測器332，例如以響應(yīng)于激發(fā)信號來收集由感興趣粒子112a發(fā)射的熒光信號。知道上述距離之一(df或者dref)使得可以將光學(xué)系統(tǒng)聚焦在粒子上，這優(yōu)化了通過光電檢測器332對熒光信號的收集。

在大多數(shù)情況下，介質(zhì)包含多個感興趣粒子。在第一階段期間，確定并存儲與樣品的每個感興趣粒子112a對應(yīng)的距離dref或df。在第二階段期間，調(diào)整光學(xué)系統(tǒng)331的相對定位，使得該光學(xué)系統(tǒng)的物平面包括感興趣粒子。對于每個感興趣粒子，相繼進(jìn)行這種調(diào)整，以便優(yōu)化分析。

圖6示出了根據(jù)本發(fā)明的參考圖像的示例。橫坐標(biāo)軸和縱坐標(biāo)軸以像素為單位。對多個衍射圖案61進(jìn)行區(qū)分，每個衍射圖案與生物粒子相關(guān)聯(lián)。

現(xiàn)在將參照圖7來描述為了使用第一系列重構(gòu)圖像來確定感興趣粒子與參考點(diǎn)之間沿著與光學(xué)系統(tǒng)的光軸平行的軸線的距離而實(shí)施的步驟的詳細(xì)示例。

在所示的示例中，我們將自己置身于如上所述的實(shí)施例中，其中我們具有：

h(u，v，z)＝exp[-|z|*im(p(u，v))+i*z*re(p(u，v))]

然后實(shí)施下述子步驟：

子步驟71：

對于第一系列重構(gòu)圖像中的每個重構(gòu)圖像，計(jì)算虛部的平方。獲得第一系列所謂的有用重構(gòu)圖像。因此，重構(gòu)圖像的虛部的平方限定了相應(yīng)的有用重構(gòu)圖像的強(qiáng)度。

子步驟72：

每個有用重構(gòu)圖像對應(yīng)于相同的像素矩陣。與每個像素相關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度根據(jù)有用重構(gòu)圖像而變化。

針對每個像素，從各有用重構(gòu)圖像上的強(qiáng)度中選擇最大強(qiáng)度。由此形成最大值的圖像。

類似地，形成最小值的圖像。

然后，計(jì)算與最大值的圖像和最小值的圖像之間的差異對應(yīng)的梯度720的圖像。

可以使用第一矩陣來執(zhí)行該步驟，該第一矩陣的一個維度對應(yīng)于像素，而另一維度對應(yīng)于與有用重構(gòu)圖像相關(guān)聯(lián)的物平面的偏移量。沿著光學(xué)系統(tǒng)的光軸(以下稱為軸線(oz))來測量該偏移量。

例如，如果有用重構(gòu)圖像各自具有x個像素的寬度和y個像素的高度，并且重構(gòu)了n個有用重構(gòu)圖像，則第一矩陣具有xy列和n行。

然后，最小值的圖像對應(yīng)于第二矩陣xy列和1行。最大值的圖像對應(yīng)于第三矩陣xy列和1行。梯度的圖像對應(yīng)于第四矩陣xy列和1行，該第四矩陣等于第三矩陣和第二矩陣之間的差。

子步驟73：

選擇沿著軸線(oz)具有強(qiáng)烈強(qiáng)度梯度的像素。限定與這些像素相關(guān)聯(lián)的平均梯度。該平均梯度的最大值的位置粗略地限定了生物粒子沿著軸線(oz)的位置。

為此，在第四矩陣中，可以選擇具有最高值(例如第一百分位數(shù))的列。由此限定了m個像素的系列。然后，選擇第一矩陣中的這些像素，并且將與沿軸線(oz)相同偏移量相關(guān)聯(lián)的所選像素組合(例如求和或求平均)。由此形成第五矩陣n行和1列。

然后在該第五矩陣的值之中搜索最大值，并且記錄與該最大值相關(guān)聯(lián)的沿軸線(oz)的偏移量。

圖730以輪廓圖的形式示出了第五矩陣，其中橫坐標(biāo)軸是沿軸線(oz)的偏移量，縱坐標(biāo)軸是第五矩陣上的相應(yīng)值。

子步驟73限定了在參考圖像上成像的多個生物粒子沿軸線(oz)的平均位置。該平均位置通過假設(shè)生物粒子基本上位于與軸線(oz)正交的同一平面內(nèi)而限定了根據(jù)本發(fā)明的感興趣粒子的近似位置。

充分利用與沿著軸線(oz)各自具有強(qiáng)梯度的像素的選擇相關(guān)聯(lián)的沿著該軸線的梯度。因此，更容易檢測到與該選擇相關(guān)聯(lián)的梯度的最大值。

子步驟74：

從第一系列有用重構(gòu)圖像的圖像中，選擇與在子步驟73中計(jì)算的沿著軸線(oz)的位置相關(guān)聯(lián)的圖像。

對該圖像進(jìn)行閾值處理，以獲得二值圖像740。然后，檢測由閾值處理所顯示的二進(jìn)制對象的坐標(biāo)。由此，在與軸線(oz)正交的平面中計(jì)算每個生物粒子的近似位置。該步驟可以包括對每個二進(jìn)制對象進(jìn)行橢圓插值的步驟，以便另外計(jì)算每個二進(jìn)制對象以及因此每個生物粒子的近似幾何形狀。

通過任意選擇二進(jìn)制對象之一來任意選擇感興趣粒子。因此已經(jīng)在與軸線(oz)正交的平面中確定了感興趣粒子的近似位置。

二進(jìn)制圖像740被限定為包含該單個二進(jìn)制對象的感興趣區(qū)域。該感興趣區(qū)域是由像素的位置限定的。例如，該感興趣區(qū)域是16×16像素的平方。

子步驟75：

通過在每個有用重構(gòu)圖像中選擇與如上所限定的感興趣區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域，使用第一系列有用重構(gòu)圖像來實(shí)施該步驟。

或者，使用第二系列有用重構(gòu)圖像來實(shí)施該步驟。第二系列有用重構(gòu)圖像中的每個圖像由第二系列重構(gòu)圖像中的圖像的虛部的平方形成。

第二系列重構(gòu)圖像與沿著軸線(oz)的、比第一系列重構(gòu)圖像的采樣步長小的采樣步長相關(guān)聯(lián)。第二系列重構(gòu)圖像中的每個圖像對應(yīng)于如上所限定的感興趣區(qū)域。與第二系列重構(gòu)圖像相關(guān)聯(lián)的沿著軸線(oz)的采樣范圍的幅度小于與第一系列重構(gòu)圖像相關(guān)聯(lián)的采樣范圍的幅度。可以僅為了搜索感興趣粒子的精確位置而計(jì)算第二系列重構(gòu)圖像。

在第二系列有用重構(gòu)圖像上實(shí)施子步驟72和子步驟73，以便計(jì)算感興趣粒子沿軸線(oz)的精確位置。

圖750對應(yīng)于圖730，其中用第二系列有用重構(gòu)圖像代替了第一系列有用重構(gòu)圖像。

子步驟76：

在與軸線(oz)正交的平面中計(jì)算感興趣粒子的精確位置。

為此，從第二系列有用重構(gòu)圖像的圖像中選擇與感興趣粒子沿著軸線(oz)的精確位置相關(guān)聯(lián)的圖像。

對該圖像進(jìn)行閾值處理，以獲得新的二值圖像。然后，檢測由閾值處理所顯示的二進(jìn)制對象的中心的坐標(biāo)。

可以考慮許多替選方案。

特別地，我們可以考慮如上所述的實(shí)施例，其中我們具有：

■h(u，v，z)＝exp(i*2*π*z*w)，其中：對于具有

■否則：h(u，v，z)＝0

因此，有用重構(gòu)圖像被限定為是相應(yīng)重構(gòu)圖像的模數(shù)的平方。

然后，實(shí)施與上述步驟類似的步驟，不同之處在于，搜索沿軸線(oz)的位置所實(shí)施的是搜索具有最大標(biāo)準(zhǔn)偏差值的有用重構(gòu)圖像。

根據(jù)另一替選方案，我們可以考慮如上所述的實(shí)施例，其中我們具有：

■h(u，v，z)＝exp(i*2*π*z*w)，其中：對于具有

■否則：h(u,v,z)＝0

然后，每個有用重構(gòu)圖像被限定為是相應(yīng)重構(gòu)圖像的模數(shù)的平方。

然后如上所述地形成梯度的圖像，并且通過閾值處理在與軸線(oz)正交的平面中推導(dǎo)生物粒子的近似位置。這里通過閾值處理獲得的圖像稱為第一閾值圖像。特別地，由此，在與軸線(oz)正交的平面中限定了感興趣粒子的近似位置。

在第一閾值圖像中，任意選擇與生物粒子相關(guān)聯(lián)的第一二進(jìn)制對象。限定接收該單個二進(jìn)制對象的第一感興趣區(qū)域。

然后，在每個有用重構(gòu)圖像中選擇對應(yīng)于該第一感興趣區(qū)域的區(qū)域。使用如此創(chuàng)建的第一感興趣區(qū)域的一系列圖像來尋求具有最大標(biāo)準(zhǔn)偏差值的圖像的沿軸線(oz)的位置。假設(shè)所有生物粒子基本上位于與軸線(oz)正交的同一平面內(nèi)，則該位置限定了感興趣粒子沿著軸線(oz)的近似位置。

然后，我們返回到梯度的圖像并且使用下述閾值形成第二閾值圖像，該閾值大于用于形成第一閾值圖像的閾值(例如，大1.5倍)。在第二閾值圖像中，通過任意選擇第二二進(jìn)制對象來限定感興趣粒子。通過搜索該第二二進(jìn)制對象的中心，在與軸線(oz)正交的平面中推導(dǎo)出感興趣粒子的精確位置。

使用該第二閾值圖像來限定接收該單個第二二進(jìn)制對象的第二感興趣區(qū)域。然后，在每個有用重構(gòu)圖像中選擇對應(yīng)于該第二感興趣區(qū)域的區(qū)域。使用如此創(chuàng)建的一系列圖像來尋求具有最大標(biāo)準(zhǔn)偏差值的圖像的沿軸線(oz)的位置。該位置限定了感興趣粒子沿軸線(oz)的精確位置。

圖8用于示出本發(fā)明的具體情況。參照圖1的附圖標(biāo)記。

為了確定感興趣粒子和參考點(diǎn)之間沿平行于軸線135的軸線的距離，對感興趣粒子和與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面之間沿該軸線的距離進(jìn)行計(jì)算。

在實(shí)踐中，該計(jì)算使得可以確定感興趣粒子和與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面之間沿平行于軸線135的軸線的距離的絕對值。然后，知道實(shí)驗(yàn)設(shè)置來選擇一個或另一個符號。

例如，

-如果參考點(diǎn)位于上界面117上方，并且

-如果與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面位于上界面117上方，

-那么已知感興趣粒子在與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面下方。

當(dāng)不能可靠地確定該距離的符號時，可以使用與重構(gòu)圖像的實(shí)部相關(guān)的沿著軸線(oz)的輪廓圖。然后可以考慮如上所述的實(shí)施例，其中我們具有：

h(u，v，z)＝exp[-|z|*im(p(u，v))+i*z*re(p(u，v))]

特別地，可以實(shí)施以下步驟：

-使用一系列重構(gòu)圖像來確定一系列二級圖像，其中每個二級圖像是由相應(yīng)重構(gòu)圖像的實(shí)部形成的；

-以與圖7所示的子步驟72相同的方式，將該一系列二級圖像(三維矩陣)變換成二維矩陣，其中二維矩陣中的一維對應(yīng)于像素，另一維對應(yīng)于沿軸線(oz)的偏移量。

-在所述二維矩陣中，選擇沿著軸線(oz)具有強(qiáng)烈強(qiáng)度梯度的像素。由此限定與這些像素相關(guān)聯(lián)的平均梯度。圖8中示出了該梯度。橫坐標(biāo)軸是沿著軸線(oz)的偏移量，特別是和與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面的位置有關(guān)的物平面的偏移量?？v坐標(biāo)軸與二級圖像的實(shí)部相關(guān)。

-根據(jù)輪廓圖的形狀來確定感興趣粒子和與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面之間沿平行于軸線135的軸線的距離的符號：

-如果對于增加的橫坐標(biāo)軸，我們從正的最大值移動到負(fù)的最小值(圖8的情況)，則參考圖像在物平面上方(在光的傳播方向上)，

-如果對于增加的橫坐標(biāo)軸，我們從負(fù)的最小值移動到正的最大值(圖8的相反情況)，則參考圖像在物平面下方(在光的傳播方向上)。

本發(fā)明不限于上述示例，并且在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下可以考慮許多替選方案。例如，數(shù)字化構(gòu)建一系列重構(gòu)圖像的步驟可以實(shí)施除了示例中提到的那些傳播算子之外的傳播算子。也可以以不同的方式來利用重構(gòu)圖像系列，以推導(dǎo)出與參考圖像相關(guān)聯(lián)的物平面和感興趣粒子之間的距離。