交叉引用

本申請(qǐng)要求提交于2014年12月19日的第62/094,917號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)、提交于2014年12月19日的第62/094,919號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以及提交于2014年12月19日的第62/094,924號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，所有這些申請(qǐng)都通過(guò)引用以其全文并入本文以用于所有目的。

發(fā)明背景

雖然人體中的所有細(xì)胞都含有相同的遺傳物質(zhì)，但同組的基因并非在所有這些細(xì)胞中都是活性的?；虮磉_(dá)模式的改變可對(duì)生物學(xué)功能具有深遠(yuǎn)的影響。了解基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的動(dòng)力學(xué)及其相互作用對(duì)于了解例如遺傳和/或環(huán)境誘導(dǎo)的健康障礙的機(jī)制將是至關(guān)重要的，并且可能為發(fā)現(xiàn)新的診斷和治療靶標(biāo)提供基礎(chǔ)。因此，用于在個(gè)體細(xì)胞中監(jiān)測(cè)基因表達(dá)譜和檢測(cè)完整蛋白質(zhì)的特定變體(例如，剪接變體、點(diǎn)突變、翻譯后修飾以及環(huán)境或治療誘導(dǎo)的修飾)的技術(shù)，以及用于隨時(shí)間定量其水平的技術(shù)，可能有助于開發(fā)新的診斷和治療程序。此外，在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)對(duì)多個(gè)而不僅是一個(gè)靶分子進(jìn)行這些分析正變得越來(lái)越重要。

目前可用的方法常需要大量的生物樣品，并且/或者將不提供細(xì)胞特異性信息。另外，由于復(fù)雜樣品分析中固有的挑戰(zhàn)，進(jìn)行多重測(cè)量常常是特別困難的。因此，對(duì)能夠精確和靈敏地對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群體的個(gè)體細(xì)胞中的靶分子進(jìn)行檢測(cè)、鑒別和定量的方法存在需要。此外，常常期望對(duì)樣品中選定細(xì)胞亞群的個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行這些分析，并保留關(guān)于一種或多種靶分子的存在與否的細(xì)胞特異性信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開內(nèi)容描述了用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)靶核酸序列的方法、組合物和試劑盒。所公開的方法總體上適用于檢測(cè)核酸靶分子，并且特別適用于檢測(cè)存在于細(xì)胞混合物中的單個(gè)細(xì)胞中的mrna靶分子，其中個(gè)體細(xì)胞的起源信息得到保留。

本文公開了用于鑒別單個(gè)細(xì)胞中的靶核酸分子的方法，該方法包括：a)提供第一寡核苷酸鄰近探針(proximityprobe)，其包含表位特異性條碼序列和能夠與靶核酸序列的第一區(qū)段雜交的第一靶標(biāo)識(shí)別序列；b)提供第二寡核苷酸鄰近探針，其包含能夠與靶核酸序列的第二區(qū)段雜交的第二靶標(biāo)識(shí)別序列，其中靶核酸序列的第一區(qū)段和第二區(qū)段是不同的并且彼此相隔指定數(shù)目n個(gè)核苷酸；以及c)提供橋寡核苷酸，其包含兩個(gè)探針識(shí)別序列，其中第一探針識(shí)別序列能夠與第一寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，并且第二探針識(shí)別序列能夠與第二寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，從而創(chuàng)建包含所述表位特異性條碼的靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物。

在一些實(shí)施方案中，采用連接酶或聚合酶反應(yīng)將所述第一和第二鄰近探針與橋寡核苷酸共價(jià)接合。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以有序的方式將兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位附接至所述靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物，以創(chuàng)建代表所述單個(gè)細(xì)胞的身份的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼。在一些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位在連續(xù)輪次的裂分-合并合成(split-poolsynthesis)中附接至所述靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述附接包括與寡核苷酸模板分子的雜交，其中該模板分子的一端與所述靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物互補(bǔ)，并且其中在雜交后采用連接酶反應(yīng)將所述可測(cè)定聚合物亞單位與靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物共價(jià)接合。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸模板分子包含位于所述模板分子序列中與所述可測(cè)定聚合物亞單位雜交的部分之間的終止代碼序列，從而抑制所述寡核苷酸模板分子在擴(kuò)增反應(yīng)期間的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述終止代碼序列包括聚-dt序列。在一些實(shí)施方案中，所述終止代碼序列包括聚-t序列。在一些實(shí)施方案中，所述終止代碼序列包括三碳連接體。在一些實(shí)施方案中，所述第一或第二寡核苷酸鄰近探針的至少一種進(jìn)一步包含一種或多種引物序列。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞起源條碼進(jìn)一步包含一種或多種引物序列。在一些實(shí)施方案中，至少一種所述引物序列為擴(kuò)增引物序列。在一些實(shí)施方案中，所公開的方法進(jìn)一步包括對(duì)整套細(xì)胞起源條碼及其相關(guān)的表位特異性條碼的一部分或全部進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，至少一種所述引物序列為測(cè)序引物序列。在一些實(shí)施方案中，所述靶核酸分子為dna分子。在一些實(shí)施方案中，所述靶核酸分子為rna分子。在一些實(shí)施方案中，該rna分子為mrna分子。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸鄰近探針為dna分子。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸鄰近探針的長(zhǎng)度為10至200個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述靶標(biāo)識(shí)別序列的長(zhǎng)度為5至50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述表位特異性條碼的長(zhǎng)度為5至50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，n在1至20之間。在一些實(shí)施方案中，n在20至40之間。在一些實(shí)施方案中，n在40至100之間。在一些實(shí)施方案中，所述橋寡核苷酸為dna分子。在一些實(shí)施方案中，所述橋分子的探針識(shí)別序列的長(zhǎng)度為5至50個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述可測(cè)定聚合物亞單位包含核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述方法是多重的(multiplexed)。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括額外的引物與所述細(xì)胞起源條碼的末端的附接。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸鄰近探針之一進(jìn)一步包含所述橋寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述橋寡核苷酸用作用于附接一個(gè)或多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位的模板分子。在一些實(shí)施方案中，使用兩個(gè)或更多個(gè)模板分子來(lái)組裝所述細(xì)胞起源條碼。

本文還公開了用于檢測(cè)靶mrna序列的方法，該方法包括：(a)裂解細(xì)胞樣品以釋放mrna；(b)使裂解的細(xì)胞樣品與多個(gè)珠子接觸，其中珠子包含能夠與所釋放的mrna分子雜交的多個(gè)栓系的(tethered)寡核苷酸序列；(c)使第一寡核苷酸鄰近探針與所述多個(gè)珠子上所雜交的mrna分子退火，其中第一寡核苷酸鄰近探針包含表位特異性條碼序列和能夠與靶核酸序列的第一區(qū)段雜交的第一靶標(biāo)識(shí)別序列；(d)使第二寡核苷酸鄰近探針與所述多個(gè)珠子上所雜交的mrna分子退火，其中第二寡核苷酸鄰近探針包含能夠與靶核酸序列的第二區(qū)段雜交的第二靶標(biāo)識(shí)別序列，并且其中靶核酸序列的第一和第二區(qū)段是不同的并且彼此相隔指定數(shù)目n個(gè)核苷酸；(e)使橋寡核苷酸與所述多個(gè)珠子上所雜交的寡核苷酸鄰近探針退火，其中該橋寡核苷酸包含兩個(gè)探針識(shí)別序列，其中第一探針識(shí)別序列能夠與第一寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，并且第二探針識(shí)別序列能夠與第二寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，從而創(chuàng)建包含所述表位特異性條碼的靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物；以及(f)將退火的寡核苷酸鄰近探針與橋寡核苷酸連接，以創(chuàng)建共價(jià)接合的靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物。

在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)栓系的寡核苷酸序列進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)引物序列。在一些實(shí)施方案中，所述多個(gè)栓系的寡核苷酸序列包含聚-dt靶標(biāo)識(shí)別序列。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使用一種或多種靶標(biāo)特異性引物擴(kuò)增包含所述表位特異性條碼的所述靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)或定量一種或多種mrna序列的存在與否。

本文公開了一種組合物，其包含：(a)第一寡核苷酸鄰近探針，其包含表位特異性條碼和第一靶標(biāo)識(shí)別序列，其中第一靶標(biāo)識(shí)別序列能夠與靶核酸分子序列的第一區(qū)段雜交；(b)第二寡核苷酸鄰近探針，其包含第二靶標(biāo)識(shí)別序列，其中第二靶標(biāo)識(shí)別序列能夠與靶核酸分子序列的第二區(qū)段雜交；以及(c)橋寡核苷酸，其包含第一和第二探針識(shí)別序列，其中第一探針識(shí)別序列與第一寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，并且第二探針識(shí)別序列與第二寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交。

在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含靶核酸分子。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含含有至少一個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位的細(xì)胞起源條碼，其中所述至少一個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位附接至所述寡核苷酸鄰近探針之一上。在一些實(shí)施方案中，第一和第二靶標(biāo)識(shí)別序列各自與相應(yīng)的第一和第二靶序列區(qū)段在10-30個(gè)堿基對(duì)的范圍上至少80％互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所述橋寡核苷酸的第一和第二探針識(shí)別序列各自與第一和第二寡核苷酸鄰近探針的對(duì)應(yīng)區(qū)段在10-30個(gè)堿基對(duì)的范圍上至少80％互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，第一和第二寡核苷酸鄰近探針與所述橋寡核苷酸共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含一種或多種引物。在一些實(shí)施方案中，至少一種所述引物為擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，至少一種所述引物為測(cè)序引物。

本文還公開了一種試劑盒，其包含：(a)第一寡核苷酸鄰近探針，其包含表位特異性條碼和能夠與靶核酸序列的第一區(qū)段雜交的第一靶標(biāo)識(shí)別序列；(b)第二寡核苷酸鄰近探針，其包含能夠與靶核酸序列的第二區(qū)段雜交的第二靶標(biāo)識(shí)別序列；以及(c)橋寡核苷酸，其包含兩種探針識(shí)別序列，其中第一探針識(shí)別序列能夠與第一寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，并且第二探針識(shí)別序列能夠與第二寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交；其中所述試劑盒提供了用于檢測(cè)和定量個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞混合物中的靶核酸分子的手段。

在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于細(xì)胞起源條碼的裂分-合并合成的多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于可測(cè)定聚合物亞單位的酶偶聯(lián)或化學(xué)偶聯(lián)的試劑。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)所述寡核苷酸鄰近探針進(jìn)一步包含一種或多種引物。在一些實(shí)施方案中，從所述多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位合成的細(xì)胞起源條碼進(jìn)一步包含一種或多種引物。在一些實(shí)施方案中，至少一種所述引物為擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，至少一種所述引物為測(cè)序引物。

本公開內(nèi)容還描述了用于檢測(cè)包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的生物樣品中選定細(xì)胞亞群內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)靶分子的方法、組合物和試劑盒。

本文公開了用于鑒別混合細(xì)胞群體內(nèi)的亞群的方法、組合物和試劑盒，該方法包括：(a)使混合細(xì)胞群體與獨(dú)特結(jié)合劑接觸，其中該獨(dú)特結(jié)合劑被設(shè)計(jì)成與存在于所述亞群中的靶分子結(jié)合，并且其中該獨(dú)特結(jié)合劑附接至代表靶分子的身份的表位特異性條碼；(b)將兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位依次附接至所述表位特異性條碼，以創(chuàng)建與所述獨(dú)特結(jié)合劑結(jié)合的、代表個(gè)體細(xì)胞的身份的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼；以及(c)將所述表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼解碼，從而鑒別所述混合細(xì)胞群體內(nèi)的亞群。

在一些實(shí)施方案中，所述表位特異性條碼和可測(cè)定聚合物亞單位包含寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，采用裂分-合并組合合成法將所述兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位附接至所述表位特異性條碼。在一些實(shí)施方案中，將每次出現(xiàn)的所述表位特異性條碼與相關(guān)細(xì)胞起源條碼的所述兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位連接以形成可被擴(kuò)增和測(cè)序的綴合物。在一些實(shí)施方案中，所公開的方法進(jìn)一步包括表位特異性條碼-細(xì)胞起源條碼綴合物的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述解碼步驟包括對(duì)擴(kuò)增的表位特異性條碼-細(xì)胞起源條碼綴合物的一部分或全部進(jìn)行測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，與所述亞群相關(guān)的細(xì)胞起源條碼的數(shù)目與所述混合群體中的細(xì)胞總數(shù)之比提供了所述混合群體內(nèi)含有所述靶分子的細(xì)胞的比例(fraction)的量度。在一些實(shí)施方案中，使用兩種或更多種獨(dú)特結(jié)合劑來(lái)鑒別所述亞群。在一些實(shí)施方案中，使用兩種或更多種獨(dú)特結(jié)合劑來(lái)鑒別兩個(gè)或更多個(gè)亞群。在一些實(shí)施方案中，至少一種獨(dú)特結(jié)合劑被設(shè)計(jì)成與選自dna、組蛋白、管家蛋白質(zhì)和普通蛋白質(zhì)的靶分子結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，利用與至少一種獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的表位特異性條碼-細(xì)胞起源條碼綴合物的解碼來(lái)鑒別包含死細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞簇或其組合的亞群。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)在條碼化的實(shí)體中檢測(cè)到的dna的量、蛋白質(zhì)的量或dna與蛋白質(zhì)之比來(lái)鑒別所述亞群。在一些實(shí)施方案中，所公開的方法進(jìn)一步包括將與至少第二獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的表位特異性條碼-細(xì)胞起源條碼綴合物解碼，以鑒別存在于所述混合細(xì)胞群體的個(gè)體細(xì)胞中的至少第二靶分子，同時(shí)將包含死細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞簇或其組合的亞群的細(xì)胞起源條碼從進(jìn)一步的分析中排除。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種獨(dú)特結(jié)合劑為針對(duì)選自dna、組蛋白和管家蛋白質(zhì)的靶分子的抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種獨(dú)特結(jié)合劑為選自小檗堿、溴化乙錠、原黃素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、柔紅霉素和沙利度胺的dna嵌入分子。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種獨(dú)特結(jié)合劑包含選自琥珀酰亞胺酯、磺基琥珀酰亞胺酯、四氟苯基酯、磺基二氯苯酚酯、異硫氰酸酯和磺酰氯的胺反應(yīng)性探針。

本文還公開了用于檢測(cè)細(xì)胞亞群中的一種或多種靶分子的方法、組合物和試劑盒，該方法包括：(a)使包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的樣品與兩種或更多種獨(dú)特結(jié)合劑接觸，其中所述兩種或更多種獨(dú)特結(jié)合劑被設(shè)計(jì)成與不同靶分子結(jié)合，并且其中所述兩種或更多種獨(dú)特結(jié)合劑附接至代表靶分子的身份的表位特異性條碼；(b)將兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位依次附接至所述表位特異性條碼，以創(chuàng)建與一種或多種獨(dú)特結(jié)合劑結(jié)合的、代表個(gè)體細(xì)胞的身份的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼；(c)將與至少第一獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼選擇性地?cái)U(kuò)增和測(cè)序，以鑒別細(xì)胞亞群；以及(d)將附接至與步驟(c)中鑒別的那些細(xì)胞亞群相匹配的細(xì)胞起源條碼的、與至少第二獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的表位特異性條碼選擇性地?cái)U(kuò)增和測(cè)序，以檢測(cè)所指定細(xì)胞亞群的個(gè)體細(xì)胞中至少第二靶分子的存在與否。

在所公開的方法、組合物和試劑盒的一些實(shí)施方案中，所述表位特異性條碼和可測(cè)定聚合物亞單位包含寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，采用裂分-合并組合合成法將所述兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位附接至所述表位特異性條碼。在一些實(shí)施方案中，將每次出現(xiàn)的表位特異性條碼與相關(guān)細(xì)胞起源條碼的所述兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位連接以形成可被擴(kuò)增和測(cè)序的綴合物。在一些實(shí)施方案中，至少一種獨(dú)特結(jié)合劑包含能夠與細(xì)胞內(nèi)核酸序列雜交的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種獨(dú)特結(jié)合劑包含能夠與病毒基因組核酸序列雜交的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述至少一種獨(dú)特結(jié)合劑包含能夠與hiv病毒基因組核酸序列雜交的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，至少一種獨(dú)特結(jié)合劑包括針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)的選擇性擴(kuò)增包括進(jìn)行連續(xù)兩輪或更多輪的多重巢式擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)連續(xù)輪次的擴(kuò)增均采用設(shè)計(jì)成與可測(cè)定聚合物亞單位雜交的一組引物，該可測(cè)定聚合物亞單位位于構(gòu)成在步驟(c)中鑒別的細(xì)胞起源條碼的兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位位置的序列中的不同位置。在一些實(shí)施方案中，第一輪擴(kuò)增中采用的引物組與位于細(xì)胞起源條碼中最遠(yuǎn)離表位特異性條碼的位置處的可測(cè)定聚合物亞單位雜交，并且其中每個(gè)連續(xù)輪次的擴(kuò)增均采用與位于更靠近表位特異性條碼的位置處的可測(cè)定聚合物亞單位雜交的一組引物。

本文公開了用于檢測(cè)選定細(xì)胞亞群中的一種或多種靶蛋白分子的方法、組合物和試劑盒，該方法包括：(a)使包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的樣品與包含用于蛋白質(zhì)的非特異性標(biāo)記的胺反應(yīng)性探針的非特異性結(jié)合劑接觸，其中該非特異性結(jié)合劑附接至非特異性蛋白質(zhì)條碼；(b)使所述樣品與設(shè)計(jì)為結(jié)合存在于所述亞群中的靶分子的第一獨(dú)特結(jié)合劑接觸，并且其中第一獨(dú)特結(jié)合劑附接至代表靶分子的身份的表位特異性條碼；(c)將兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位依次附接至所述非特異性條碼和表位特異性條碼，以創(chuàng)建代表個(gè)體細(xì)胞的身份的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼；(d)使用一組珠子對(duì)來(lái)自細(xì)胞已經(jīng)裂解的一部分樣品的一種或多種靶蛋白分子進(jìn)行免疫沉淀，其中每個(gè)珠子包含結(jié)合一種靶蛋白分子的固定化抗體和包含抗體特異性條碼的固定化引物，并且其中該固定化引物能夠與同該抗體的靶蛋白分子相關(guān)聯(lián)的非特異性條碼-細(xì)胞起源條碼復(fù)合物的一端雜交；(e)進(jìn)行引物延伸反應(yīng)以創(chuàng)建抗體特異性條碼-非特異性條碼-細(xì)胞起源條碼復(fù)合物；(f)對(duì)抗體特異性條碼-非特異性條碼-細(xì)胞起源條碼復(fù)合物的集合進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序；以及(g)通過(guò)將所述一種或多種靶蛋白分子的細(xì)胞起源條碼列表與同至少第一獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞起源條碼列表進(jìn)行比較，來(lái)確定一種或多種感興趣的靶蛋白分子是否存在于由至少第一獨(dú)特結(jié)合劑限定的個(gè)體細(xì)胞的亞群中。

在一些實(shí)施方案中，所述非特異性條碼、表位特異性條碼和可測(cè)定聚合物亞單位包含寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，將每次出現(xiàn)的所述非特異性條碼或表位特異性條碼與相關(guān)細(xì)胞起源條碼的所述兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位連接以形成可被擴(kuò)增和測(cè)序的綴合物。在一些實(shí)施方案中，所述胺反應(yīng)性探針選自琥珀酰亞胺酯、磺基琥珀酰亞胺酯、四氟苯基酯、磺基二氯苯酚酯、異硫氰酸酯和磺酰氯。在一些實(shí)施方案中，所述第一獨(dú)特結(jié)合劑包括抗體、抗體片段或核酸序列。在一些實(shí)施方案中，將所述包含胺反應(yīng)性探針的非特異性結(jié)合劑替換為包含用于與mrna分子非特異性雜交的聚-dt寡核苷酸探針序列的非特異性結(jié)合劑，并且其中該非特異性結(jié)合劑附接至非特異性mrna條碼。在一些實(shí)施方案中，本文公開的方法、組合物和試劑盒進(jìn)一步包括將步驟(d)的珠子替換為包含與一種或多種感興趣的mrna分子的一部分或全部互補(bǔ)的固定化探針序列(每個(gè)珠子一種獨(dú)特探針序列)以及包含mrna特異性條碼的固定化引物的珠子，并且其中該固定化引物能夠與同該固定化探針序列的靶mrna分子相關(guān)聯(lián)的非特異性條碼-細(xì)胞起源條碼復(fù)合物的一端雜交。在一些實(shí)施方案中，本文公開的方法、組合物和試劑盒進(jìn)一步包括在步驟(g)中通過(guò)將所述一種或多種靶mrna分子的細(xì)胞起源條碼列表與同至少第一獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞起源條碼列表進(jìn)行比較，來(lái)確定一種或多種感興趣的靶mrna分子是否存在于由至少第一獨(dú)特結(jié)合劑限定的細(xì)胞亞群中。

本文還公開了在對(duì)包含細(xì)胞混合物的樣品中的個(gè)體細(xì)胞中的靶分子進(jìn)行檢測(cè)時(shí)將細(xì)胞亞群從進(jìn)一步的分析中排除的方法、組合物和試劑盒，該方法包括：(a)使細(xì)胞混合物與第一組獨(dú)特結(jié)合劑接觸，其中每種獨(dú)特結(jié)合劑均被設(shè)計(jì)成與靶分子結(jié)合，并且其中每種獨(dú)特結(jié)合劑均附接至表位特異性條碼，該表位特異性條碼對(duì)于該組中的所有獨(dú)特結(jié)合劑而言是相同的；(b)使所述細(xì)胞混合物與第二組獨(dú)特結(jié)合劑接觸，其中第二組的每種獨(dú)特結(jié)合劑均被設(shè)計(jì)成與靶分子結(jié)合，該靶分子不同于第一組獨(dú)特結(jié)合劑的靶分子，并且其中第二組的每種獨(dú)特結(jié)合劑均附接至代表該靶分子的身份的獨(dú)特表位特異性條碼；(c)依次附接兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位，以創(chuàng)建與至少一種獨(dú)特結(jié)合劑結(jié)合的、代表個(gè)體細(xì)胞的身份的一組獨(dú)特細(xì)胞起源條碼；(d)將與第一組獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼選擇性地?cái)U(kuò)增和測(cè)序，以鑒別亞群；(e)將與第二組獨(dú)特結(jié)合劑相關(guān)聯(lián)的表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼選擇性地?cái)U(kuò)增和測(cè)序；以及(f)通過(guò)比較步驟(d)和(e)中生成的細(xì)胞起源條碼列表，來(lái)確定在排除步驟(d)中鑒別的細(xì)胞后第二組獨(dú)特結(jié)合劑的靶分子是否存在于所述樣品的剩余個(gè)體細(xì)胞中。

在一些實(shí)施方案中，步驟(e)的選擇性擴(kuò)增包括進(jìn)行連續(xù)兩輪或更多輪的多重巢式擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)連續(xù)輪次的擴(kuò)增均采用設(shè)計(jì)成與可測(cè)定聚合物亞單位雜交的一組引物，該可測(cè)定聚合物亞單位位于構(gòu)成步驟(d)中鑒別的細(xì)胞起源條碼的兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位的序列中的不同位置。在一些實(shí)施方案中，第一輪擴(kuò)增中采用的引物組與位于細(xì)胞起源條碼中最遠(yuǎn)離表位特異性條碼的位置處的可測(cè)定聚合物亞單位雜交，并且其中每個(gè)連續(xù)輪次的擴(kuò)增均采用與位于更靠近所述表位特異性條碼的位置處的可測(cè)定聚合物亞單位雜交的一組引物。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞起源條碼包含四個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位。在一些實(shí)施方案中，所述表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼進(jìn)一步包含擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，所述表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼進(jìn)一步包含測(cè)序引物。在一些實(shí)施方案中，所述表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼進(jìn)一步包含illumina測(cè)序引物。在一些實(shí)施方案中，所述可測(cè)定聚合物亞單位包含長(zhǎng)度約為15至35個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述可測(cè)定聚合物亞單位包含具有長(zhǎng)度為3至10個(gè)核苷酸的可變編碼區(qū)、其任一端側(cè)翼為6至12個(gè)核苷酸的退火區(qū)的寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述可測(cè)定聚合物亞單位包含具有7個(gè)核苷酸的可變編碼區(qū)、其任一端側(cè)翼為長(zhǎng)度為9個(gè)核苷酸的退火區(qū)的寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，該7個(gè)核苷酸的編碼區(qū)被設(shè)計(jì)用于提供錯(cuò)誤檢測(cè)和校正能力。在一些實(shí)施方案中，所公開的方法、組合物和試劑盒進(jìn)一步包括對(duì)包含細(xì)胞混合物的樣品中的個(gè)體細(xì)胞中存在的一種或多種靶分子的量進(jìn)行定量。

本文還公開了一種組合物，其包含：(a)擴(kuò)增的寡核苷酸條碼產(chǎn)物，其編碼單個(gè)細(xì)胞中存在的靶分子的身份，其中該寡核苷酸條碼包含：(i)表位特異性條碼序列；以及(ii)細(xì)胞起源條碼序列。

在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含一種或多種擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物進(jìn)一步包含一種或多種測(cè)序引物。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種測(cè)序引物為illumina測(cè)序引物。

本文還公開了一種組合物，其包含：(a)獨(dú)特結(jié)合劑，其能夠與感興趣的靶分子結(jié)合或雜交；以及(b)共價(jià)附接的寡核苷酸序列，其中該寡核苷酸序列包含表位特異性條碼以及一個(gè)或多個(gè)連接體序列，并且其中該連接體序列能夠與其他寡核苷酸雜交或共價(jià)附接。

在一些實(shí)施方案中，所述獨(dú)特結(jié)合劑為抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述獨(dú)特結(jié)合劑為設(shè)計(jì)用于與感興趣的靶序列雜交的寡核苷酸探針。

本文還公開了一種組合物，其包含：(a)可測(cè)定聚合物亞單位，其中該可測(cè)定聚合物亞單位為寡核苷酸，該寡核苷酸包含：(i)可變編碼區(qū)；以及(ii)一個(gè)或多個(gè)連接體序列，其中該連接體序列能夠與其他寡核苷酸雜交或共價(jià)附接。

本文還公開了一種試劑盒，其包含：(a)一種或多種獨(dú)特結(jié)合劑，其進(jìn)一步包含表位特異性條碼；(b)一組可測(cè)定聚合物亞單位，其用于細(xì)胞起源條碼的組合合成；(c)酶偶聯(lián)試劑或化學(xué)偶聯(lián)試劑；以及(d)一組pcr擴(kuò)增引物，其包括設(shè)計(jì)成與該組可測(cè)定聚合物亞單位中的每一個(gè)個(gè)體可測(cè)定聚合物亞單位雜交的引物；其中所述試劑盒提供對(duì)包含細(xì)胞混合物的樣品檢測(cè)和定量個(gè)體細(xì)胞中的靶分子的說(shuō)明書和方法。

在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種獨(dú)特結(jié)合劑包括抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種獨(dú)特結(jié)合劑包括能夠與病毒基因組核酸序列雜交的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種獨(dú)特結(jié)合劑包括能夠與hiv病毒基因組核酸序列雜交的核酸序列。

本文還公開了非暫時(shí)性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其存儲(chǔ)有提供對(duì)表位特異性條碼-細(xì)胞起源條碼綴合物組的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行解碼和分組的分析能力的程序。在一些實(shí)施方案中，該程序進(jìn)一步提供數(shù)據(jù)可視化工具。

本公開內(nèi)容還描述了用于檢測(cè)靶rna序列的方法、組合物和試劑盒，其包括：(a)使包含多個(gè)rna序列的樣品與寡核苷酸探針接觸，其中該寡核苷酸探針包含能與靶rna序列雜交的靶標(biāo)識(shí)別區(qū)以及靶標(biāo)特異性條碼；(b)以順序的方式將一個(gè)或多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位附接至所述寡核苷酸探針，以創(chuàng)建細(xì)胞起源條碼；(c)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以創(chuàng)建包含所述細(xì)胞起源條碼、靶標(biāo)特異性條碼、所述靶標(biāo)識(shí)別區(qū)以及所述靶rna序列的一部分或全部的cdna拷貝的分子復(fù)合物；(d)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以擴(kuò)增該分子復(fù)合物；以及(e)對(duì)該擴(kuò)增的分子復(fù)合物進(jìn)行測(cè)序。

在一些實(shí)施方案中，所述靶rna序列為mrna序列。在一些實(shí)施方案中，所述靶標(biāo)識(shí)別區(qū)包含與所述靶rna序列的一部分互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方案中，所述靶標(biāo)識(shí)別區(qū)包含聚-dt序列。在一些實(shí)施方案中，所述分子復(fù)合物進(jìn)一步包含一種或多種引物。在一些實(shí)施方案中，所述引物中的一種或多種為擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，所述引物中的一種或多種為測(cè)序引物。在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增反應(yīng)為pcr反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，所述pcr反應(yīng)采用至少一種擴(kuò)增引物，其包含與靶rna序列的一部分或全部的cdna拷貝互補(bǔ)的識(shí)別區(qū)和測(cè)序引物二者。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后，向cdna拷貝的3’端添加聚-dg尾，并且其中所述pcr反應(yīng)采用包含聚-dc識(shí)別區(qū)和測(cè)序引物二者的至少一種擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，所述pcr反應(yīng)采用包含與靶rna序列的一部分或全部的cdna拷貝互補(bǔ)的半隨機(jī)識(shí)別序列和測(cè)序引物二者的至少一種擴(kuò)增引物。在一些實(shí)施方案中，所述半隨機(jī)識(shí)別序列被設(shè)計(jì)用于使從cdna分子中對(duì)應(yīng)于靶rna序列的3’端的點(diǎn)起32至128個(gè)核苷酸內(nèi)發(fā)生引發(fā)事件的可能性最大化。在一些實(shí)施方案中，所述半隨機(jī)識(shí)別序列的設(shè)計(jì)基于cdna序列，并且采取nnnxxx的一般形式，其中nnn為任意隨機(jī)的一組三個(gè)核苷酸，而xxx為特定的一組三個(gè)核苷酸，其被選擇為與從cdna分子中對(duì)應(yīng)于靶rna序列的3’端的點(diǎn)起約64個(gè)核苷酸的位置處的cdna序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所公開的方法進(jìn)一步包括在進(jìn)行pcr擴(kuò)增之前添加一種或多種阻斷寡核苷酸序列，其中阻斷寡核苷酸與對(duì)應(yīng)于管家基因或其他不想要的靶rna序列的mrna序列互補(bǔ)，由此防止不想要的擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。在一些實(shí)施方案中，所述樣品包含單個(gè)細(xì)胞。

本文還公開了用于擴(kuò)增靶寡核苷酸序列的半隨機(jī)引物，該引物包含(m)i(x)j(n)k形式的寡核苷酸序列，其中(m)i和(n)k為長(zhǎng)度分別為i和k的任意隨機(jī)寡核苷酸核苷酸序列，并且其中(x)j為長(zhǎng)度為j的特定寡核苷酸序列，該特定寡核苷酸序列被選擇為與相對(duì)于靶寡核苷酸序列的3’端的指定位置處的靶寡核苷酸序列互補(bǔ)。

在一些實(shí)施方案中，選擇(x)j，使得所述半隨機(jī)引物在擴(kuò)增反應(yīng)中使用時(shí)與指定位置處的靶寡核苷酸序列雜交，并且該擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生長(zhǎng)度約為z個(gè)核苷酸的產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，z在50至1000之間。在一些實(shí)施方案中，z在100至300之間。在一些實(shí)施方案中，z為250。在一些實(shí)施方案中，i的值為0至6。在一些實(shí)施方案中，j的值為3至6。在一些實(shí)施方案中，k的值為0至6。

援引并入

本說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過(guò)引用并入本文，其程度猶如特別地和單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用而并入。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的新特征在隨附的權(quán)利要求中具體闡述。通過(guò)參考以下對(duì)在其中利用到本發(fā)明原理的說(shuō)明性實(shí)施方案加以闡述的詳細(xì)描述和附圖，將會(huì)獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好的理解，附圖中：

圖1顯示了分子復(fù)合物的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其包含獨(dú)特結(jié)合劑(uba)、表位特異性條碼(esb)以及組裝以創(chuàng)建細(xì)胞起源條碼(cob)的一系列可測(cè)定聚合物亞單位(aps)。

圖2顯示了分子復(fù)合物的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖，其包含獨(dú)特結(jié)合劑(uba)、包含9個(gè)核苷酸代碼的表位特異性條碼(esb)(下圖)以及包含4個(gè)aps代碼(sc1-sc4)的細(xì)胞起源條碼(cob)。在該非限制性實(shí)例中，esb通過(guò)與共價(jià)附接至uba上的寡核苷酸連接體的互補(bǔ)區(qū)退火而附接至uba(上圖)。每個(gè)aps代碼包含7個(gè)核苷酸代碼(下圖)，在任一末端的側(cè)翼為與夾板(splint)寡核苷酸(夾板6)互補(bǔ)的退火序列，該夾板寡核苷酸本身與esb的互補(bǔ)區(qū)退火。在通過(guò)與夾板寡核苷酸退火而組合組裝cob后，(在箭頭指示的位置處)連接aps亞單位以形成包含esb和cob的單個(gè)共價(jià)分子復(fù)合物。

圖3顯示了所公開的方法和組合物的表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼的分子組件以及它們組裝形成分子條碼化復(fù)合物的圖示。

圖4顯示了所公開的方法和組合物的一個(gè)實(shí)施方案中的uba-esb組件的示意圖，及其在檢測(cè)個(gè)體細(xì)胞中的多個(gè)表位中的應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，該uba-esb復(fù)合物進(jìn)一步包含用于組裝細(xì)胞起源條碼的共同連接體(cl)。

圖5示出了用于創(chuàng)建獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的裂分-合并合成途徑的第一輪。在用多個(gè)uba-esb復(fù)合物處理細(xì)胞樣品后，將樣品分成一系列等份，并將第一aps偶聯(lián)至個(gè)體細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的uba-esb復(fù)合物，其中用不同的aps處理每個(gè)樣品等份。

圖6示出了用于創(chuàng)建獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的裂分-合并合成途徑的后續(xù)輪次。在圖5所示的第一輪aps偶聯(lián)后，將樣品等份合并、混合并重新分配成新的一系列等份。然后將第二aps單元偶聯(lián)至在第一偶聯(lián)步驟中生成的結(jié)合的uba-esb-aps復(fù)合物，其中再次用不同的aps處理每個(gè)樣品等份。進(jìn)行反復(fù)輪次的樣品等分、偶聯(lián)反應(yīng)和細(xì)胞樣品合并的裂分-合并導(dǎo)致一組基本上獨(dú)特的細(xì)胞起源條碼的合成。

圖7示出了用于靶mrna分子檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組的一個(gè)實(shí)例，該探針組包含一對(duì)寡核苷酸鄰近探針15和19，每個(gè)探針均包含與靶mrna序列互補(bǔ)的序列區(qū)，并且這一對(duì)探針可采用橋寡核苷酸20相接合，并且可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)引物序列、表位特異性條碼區(qū)和用于采用本公開內(nèi)容的組合物和方法創(chuàng)建獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的共同連接體區(qū)。

圖8示出了用于靶向特定mrna分子的鄰近探針組的另一實(shí)例。

圖9示出了用于以獨(dú)特細(xì)胞起源條碼標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)每次出現(xiàn)的靶mrna分子的過(guò)程的實(shí)例。在該實(shí)例中，uba包含與cd4mrna雜交的序列特異性寡核苷酸探針。

圖10示出了用于靶mrna分子檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組的另一實(shí)例，除了兩個(gè)鄰近探針序列之外，其還采用兩個(gè)夾板分子和橋寡核苷酸。

圖11示出了用于創(chuàng)建圖10所示的鄰近探針組的寡核苷酸序列的非限制性實(shí)例。

圖12示出了用于靶mrna分子檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組的另一非限制性實(shí)例，其采用單個(gè)組合的夾板-橋寡核苷酸來(lái)接合兩個(gè)鄰近探針。

圖13示出了用于創(chuàng)建圖12所示的鄰近探針組的寡核苷酸序列的非限制性實(shí)例。

圖14示出了用于靶mrna分子檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組的另一非限制性實(shí)例，其采用單個(gè)組合的夾板-橋寡核苷酸來(lái)接合兩個(gè)鄰近探針。

圖15示出了用于將包含編碼區(qū)sc1–sc4的aps組裝成獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的夾板寡核苷酸的非限制性實(shí)例。下圖說(shuō)明了用于對(duì)包含抗體或抗體片段的uba進(jìn)行條碼化的寡核苷酸的一個(gè)實(shí)例。

圖16示出了用于將包含編碼區(qū)sc1–sc3的aps組裝成獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的夾板寡核苷酸分子的非限制性實(shí)例。在所公開的方法和組合物的一些實(shí)例中，uba可為抗體。在其他實(shí)例中，uba可包含寡核苷酸探針序列，例如，對(duì)rna或mrna序列為特異性的寡核苷酸探針。所組裝的細(xì)胞起源條碼可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增引物和/或測(cè)序引物序列。

圖17示出了用于將包含編碼區(qū)sc1–sc3的aps組裝成可包含pcr擴(kuò)增引物和測(cè)序引物的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的夾板寡核苷酸分子的非限制性實(shí)例。

圖18示出了采用通用聚-t引物序列對(duì)mrna分子進(jìn)行條碼化的方法的非限制性實(shí)例。

圖19示出了采用靶mrna序列特異性引物將mrna分子進(jìn)行條碼化的方法的非限制性實(shí)例。

圖20示出了用于將包含編碼區(qū)sc1–sc3的aps組裝成特定mrna靶分子(或寡核苷酸標(biāo)記的抗體)的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的鄰近探針組和夾板寡核苷酸分子的非限制性實(shí)例。

圖21示出了通過(guò)將第二夾板分子(夾板sp-v5)與采用第一夾板分子(夾板sp-v4)組裝的生長(zhǎng)中的cob的5’端雜交而延長(zhǎng)cob長(zhǎng)度(即，子代碼區(qū)的數(shù)目)的非限制性實(shí)例。

圖22示出了用于組裝aps以創(chuàng)建靶mrna分子的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的鄰近探針組(包括可進(jìn)一步包含“橋”序列和一個(gè)或多個(gè)“夾板”寡核苷酸分子的靶標(biāo)特異性探針對(duì))的非限制性實(shí)例，其中互補(bǔ)序列識(shí)別事件的數(shù)目及其鄰近性要求組合起來(lái)提供提高的靶標(biāo)檢測(cè)特異性。

圖23示出了用于組裝aps以創(chuàng)建靶mrna分子的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的鄰近探針組(包括可進(jìn)一步包含橋序列和一個(gè)或多個(gè)夾板寡核苷酸分子的靶標(biāo)特異性探針對(duì))的其他非限制性實(shí)例，其中互補(bǔ)序列識(shí)別事件的數(shù)目及其鄰近性要求組合起來(lái)提供提高的靶標(biāo)檢測(cè)特異性。

圖24示出了一個(gè)實(shí)施方案，其使用所公開的組合物和條碼化方法來(lái)鑒別包含混合細(xì)胞群體的樣品內(nèi)的罕見細(xì)胞(例如，含有hiv病毒核酸序列的細(xì)胞)的亞群，并在所鑒別的亞群的個(gè)體細(xì)胞中檢測(cè)特定的一組靶分子，例如蛋白x。

圖25示出了一個(gè)實(shí)施方案，其使用所公開的組合物和方法來(lái)對(duì)罕見細(xì)胞(例如，含有hiv病毒核酸序列的細(xì)胞)的條碼化群體進(jìn)行重新取樣，以在個(gè)體細(xì)胞的基礎(chǔ)上檢測(cè)特定的一組靶分子，例如蛋白x，其中在進(jìn)行條碼化時(shí)，感興趣的靶分子是未知的。

圖26示出了用于將自環(huán)化寡核苷酸條碼附接至抗體或抗體片段的方法，其中該寡核苷酸經(jīng)由連接體(左側(cè))或經(jīng)由與連接寡核苷酸退火(右側(cè))而附接至蛋白質(zhì)分子。寡核苷酸標(biāo)記的抗體使得能夠通過(guò)使用免疫pcr反應(yīng)來(lái)檢測(cè)低豐度的蛋白質(zhì)，其中通過(guò)定量pcr或測(cè)序來(lái)擴(kuò)增并檢測(cè)與結(jié)合的抗體相對(duì)應(yīng)的寡核苷酸條碼。

圖27示出了采用含有可光解的鍵的發(fā)夾寡核苷酸結(jié)構(gòu)，用獨(dú)特細(xì)胞起源條碼對(duì)每次出現(xiàn)的結(jié)合的抗體-est(表位特異性標(biāo)簽)復(fù)合物進(jìn)行條碼化的過(guò)程的非限制性實(shí)例。

圖28示出了在圖27所示的cob組裝過(guò)程中使用的發(fā)夾形成寡核苷酸序列的非限制性實(shí)例。

圖29示出了用于鑒別含有一種或多種感興趣的靶rna分子的個(gè)體細(xì)胞的所公開方法的一個(gè)實(shí)施方案。包含靶標(biāo)特異性寡核苷酸探針序列或聚-dt寡核苷酸探針序列的uba附接至uba代碼序列(即esb)。在與固定的透化細(xì)胞中的靶rna序列雜交后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和條碼化反應(yīng)以創(chuàng)建包含用于鑒別起源細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞特異性條碼的uba-esb-cob綴合物。在所公開的方法的一些實(shí)施方案中，使用還包含測(cè)序引物的靶標(biāo)特異性引物來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增與一種或多種感興趣的靶rna分子相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞起源條碼，從而創(chuàng)建擴(kuò)增產(chǎn)物，可對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以解碼rna靶標(biāo)的身份以及其中檢測(cè)到靶rna分子的個(gè)體細(xì)胞的身份。

圖30示出了用于鑒別含有一種或多種感興趣的靶rna分子的個(gè)體細(xì)胞的所公開方法的備選實(shí)施方案。包含靶標(biāo)特異性寡核苷酸探針序列或聚-dt寡核苷酸探針序列的uba附接至uba代碼序列(即esb)。在與固定的透化細(xì)胞中的靶rna序列雜交后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、聚-dg添加和條碼化反應(yīng)，以創(chuàng)建包含用于鑒別起源細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞特異性條碼的uba-esb-cob綴合物。在該非限制性實(shí)例中，使用任選地還包含測(cè)序引物的聚-dc引物來(lái)擴(kuò)增所有uba-esb-cob綴合物。然后，可使用進(jìn)一步包含測(cè)序引物的靶標(biāo)特異性引物來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增與一種或多種感興趣的靶rna分子相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞起源條碼，從而創(chuàng)建擴(kuò)增產(chǎn)物，可對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以解碼rna靶標(biāo)的身份以及其中檢測(cè)到靶rna分子的個(gè)體細(xì)胞的身份。

圖31示出了用于鑒別含有一種或多種感興趣的靶rna分子的個(gè)體細(xì)胞的所公開方法的又一實(shí)施方案。包含靶標(biāo)特異性寡核苷酸探針序列或聚-dt寡核苷酸探針序列的uba附接至uba代碼序列(即esb)。在與固定的透化細(xì)胞中的靶rna序列雜交后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和條碼化反應(yīng)，以創(chuàng)建包含用于鑒別起源細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞特異性條碼的uba-esb-cob綴合物。在所公開的方法的一些實(shí)施方案中，使用還包含測(cè)序引物的半隨機(jī)引物(例如，具有序列nnngag)來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增與一種或多種感興趣的靶rna分子相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞起源條碼，從而創(chuàng)建擴(kuò)增產(chǎn)物，可對(duì)該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以解碼rna靶標(biāo)的身份以及其中檢測(cè)到靶rna分子的個(gè)體細(xì)胞的身份。選擇該半隨機(jī)引物的非隨機(jī)部分，以使該引物將會(huì)在從聚-dt或靶標(biāo)特異性序列(用來(lái)探測(cè)靶rna)的位置起32至128個(gè)核苷酸的位置處與uba-esb-cob綴合物互補(bǔ)和雜交的可能性最大化，從而確保所擴(kuò)增的產(chǎn)物具有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，以優(yōu)化現(xiàn)代高通量測(cè)序系統(tǒng)的測(cè)序容量的有效利用。

具體實(shí)施方案

本公開內(nèi)容是先前在公開的專利申請(qǐng)pct/us2012/023411和pct/us2013/054190中描述的方法、組合物和試劑盒的擴(kuò)展，所述專利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。特別地，本公開內(nèi)容描述了用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中的多種靶核酸序列，更具體地，檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中的多種靶mrna序列的方法、組合物和試劑盒，其采用設(shè)計(jì)用于使背景信號(hào)的非特異性雜交和擴(kuò)增最小化的鄰近探針，從而改善檢測(cè)靈敏性和特異性。在一些實(shí)施方案中，將所公開的方法應(yīng)用于檢測(cè)包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的生物樣品中的選定細(xì)胞亞群內(nèi)的多種靶mrna序列。特別地，本公開內(nèi)容描述了用于檢測(cè)包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的生物樣品中選定細(xì)胞亞群內(nèi)的單個(gè)細(xì)胞中的多種靶分子的方法、組合物和試劑盒。

本公開內(nèi)容提供了在先前公開的技術(shù)上的改進(jìn)，所公開的方法提供了以下手段：(i)鑒別細(xì)胞群體內(nèi)的死細(xì)胞、細(xì)胞碎片或細(xì)胞簇并將其從進(jìn)一步分析中消除，從而改善針對(duì)復(fù)雜細(xì)胞混合物所收集的細(xì)胞特異性數(shù)據(jù)的質(zhì)量，以及(ii)根據(jù)特異性細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外標(biāo)志物的存在而鑒別復(fù)雜細(xì)胞混合物內(nèi)的罕見細(xì)胞或選定細(xì)胞亞群，并將后續(xù)分析限制于選定的一組細(xì)胞，從而改善所收集的數(shù)據(jù)的特異性。

單細(xì)胞水平下的多重測(cè)試是所公開的方法的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，并且提供了許多潛在的益處，包括提高對(duì)個(gè)體細(xì)胞內(nèi)的生理學(xué)過(guò)程的了解、降低對(duì)樣品量的需求(與多重測(cè)量的數(shù)目成比例)、提高測(cè)試準(zhǔn)確性(通過(guò)消除與重復(fù)測(cè)試相關(guān)的樣品處理和測(cè)量誤差)以及顯著節(jié)省勞力和成本。

i.定義

如本文所用的，短語(yǔ)“獨(dú)特結(jié)合劑”(uba)是指在所公開的方法中使用的多種檢測(cè)試劑中的一種。每種uba均能夠與單個(gè)靶分子種類結(jié)合或雜交。正是結(jié)合或雜交的這種特異性使得能夠檢測(cè)給定個(gè)體細(xì)胞中的靶分子。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“表位”在更普遍的意義上用來(lái)指被獨(dú)特結(jié)合劑識(shí)別的靶分子(包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、dna、rna、mrna、寡核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物和小分子)或靶分子的部分。與上文引用的公開專利申請(qǐng)一樣，術(shù)語(yǔ)“表位”和“靶分子”在本文中可互換使用，以指代通過(guò)本文所述的方法檢測(cè)和/或定量的感興趣分子(或其部分)。

如本文所用的，短語(yǔ)“表位特異性條碼”(esb)是指與特異性表位或靶分子相關(guān)聯(lián)的獨(dú)特代碼。在一些實(shí)施方案中，esb是能夠編碼靶分子的身份的分子或分子組裝體。合適的esb分子或分子組裝體的實(shí)例包括但不限于肽序列、寡核苷酸序列、共價(jià)或非共價(jià)連接的但可區(qū)分的納米顆粒串，等等。

如本文所用的，短語(yǔ)“可測(cè)定聚合物亞單位”(aps)是指包含不同信息包的分子構(gòu)件，其中該分子構(gòu)件能夠以有序的方式連接以創(chuàng)建細(xì)胞起源條碼。合適的可測(cè)定聚合物亞單位的實(shí)例包括但不限于氨基酸、肽、寡核苷酸、納米顆粒等。

如本文所用的，短語(yǔ)“細(xì)胞起源條碼”(cob)是指可測(cè)定聚合物亞單位的有序組裝體，其創(chuàng)建編碼個(gè)體細(xì)胞的身份的分子或分子組裝體。合適的cob分子或分子組裝體的實(shí)例包括但不限于肽序列、寡核苷酸序列、共價(jià)或非共價(jià)連接的但可區(qū)分的納米顆粒串，等等。

如本文所用的，短語(yǔ)“共同連接體”(cl)是指可直接或間接附接至uba、esb或aps亞單位以用于組裝分子條碼的連接體部分。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“夾板”是指用于組裝aps以形成細(xì)胞起源條碼的模板分子。在一些實(shí)施方案中，夾板(或模板，或退火引物)分子為寡核苷酸。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“子代碼”(sc)是指包含在aps內(nèi)的獨(dú)特編碼區(qū)和/或可檢測(cè)分子，其中兩個(gè)或多個(gè)aps的串聯(lián)組合創(chuàng)建具有可檢測(cè)代碼或信號(hào)的單個(gè)cob，該可檢測(cè)代碼或信號(hào)將其與所有其他cob區(qū)分開來(lái)。

如本文所用的，短語(yǔ)“終止代碼”是指設(shè)計(jì)用于防止夾板或模板分子復(fù)制或擴(kuò)增的夾板或模板分子的區(qū)段。

如本文所用的，短語(yǔ)“組合合成”是指使得能夠在包含最少數(shù)目的化學(xué)偶聯(lián)步驟的單個(gè)過(guò)程中合成大量化合物(數(shù)十至數(shù)千至數(shù)十萬(wàn)個(gè)，或更多)的合成方法。

如本文所用的，短語(yǔ)“裂分-合并合成”是指組合合成方法的一個(gè)實(shí)例，其中在進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)之前將反應(yīng)混合物分成幾個(gè)不同的等份，并且其中每個(gè)等份接收待偶聯(lián)的不同單體或組分。偶聯(lián)反應(yīng)后，在進(jìn)行下一輪偶聯(lián)之前，將等份組合(合并)、混合并分配(裂分)成新的一組等份。

如本文所用的，短語(yǔ)“鄰近探針”是指能夠與同一靶分子的不同區(qū)段雜交的一對(duì)探針?lè)肿又械拿恳粋€(gè)。在一些實(shí)施方案中，鄰近探針可以是能夠與同一靶寡核苷酸分子的不同區(qū)段雜交的寡核苷酸探針對(duì)。在一些實(shí)施方案中，被該探針識(shí)別的靶寡核苷酸的不同區(qū)段彼此緊鄰。

如本文所用的，短語(yǔ)“橋分子”(或“橋”)是指連接體分子，只有當(dāng)兩個(gè)對(duì)應(yīng)的鄰近探針與其相應(yīng)的靶分子結(jié)合或雜交時(shí)，其才能與這兩個(gè)對(duì)應(yīng)的鄰近探針結(jié)合或雜交。在一些實(shí)施方案中，橋分子是能夠同時(shí)與一對(duì)寡核苷酸接近探針中的每一個(gè)雜交的寡核苷酸。

ii.測(cè)定方法的概述

本公開內(nèi)容的方法、組合物和試劑盒提供了使用一組新型檢測(cè)試劑和條碼化試劑來(lái)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞(包括選定的細(xì)胞亞群)中的多個(gè)靶分子的手段。在所公開的方法的一些實(shí)施方案中，能夠檢測(cè)來(lái)自選定細(xì)胞亞群的單個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)靶分子。通常，該方法包括使用獨(dú)特結(jié)合劑(uba)來(lái)檢測(cè)感興趣的靶分子，使用表位特異性條碼(esb)來(lái)編碼被uba識(shí)別的靶分子的身份，以及使用可測(cè)定聚合物亞單位(aps)來(lái)創(chuàng)建鑒別個(gè)體細(xì)胞的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼(cob)，從而允許根據(jù)指定的一組生物標(biāo)志物來(lái)確定包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的樣品中的選定細(xì)胞亞群，并隨后將一個(gè)或多個(gè)靶分子的檢測(cè)與選定細(xì)胞亞群中的個(gè)體細(xì)胞相關(guān)聯(lián)。

獨(dú)特結(jié)合劑包括在所公開的方法中使用的檢測(cè)試劑。每種uba對(duì)于單個(gè)靶分子種類均是特異性的，并提供使得能夠檢測(cè)給定個(gè)體細(xì)胞中的靶分子的結(jié)合或雜交特異性。在所公開的方法的許多實(shí)施方案中，將細(xì)胞樣品與一種或多種uba一起溫育(在細(xì)胞固定和/或透化之前或之后)，隨后沖洗掉未結(jié)合的uba。然后，隨后可使用表位特異性條碼(esb)鑒別與樣品細(xì)胞之上或之內(nèi)的靶分子結(jié)合的那些uba。每種esb均包含與特定靶分子的uba相關(guān)聯(lián)的獨(dú)特代碼(圖1)。在所公開的方法的其他實(shí)施方案中，在進(jìn)行測(cè)定之前將esb(直接或間接地)附接至uba。在一些實(shí)施方案中，在將樣品與uba一起溫育(例如，作為測(cè)定程序的一部分)后，將esb附接至uba。

除了用來(lái)鑒別特定靶分子的esb之外，所公開的方法、組合物和試劑盒還提供了用于創(chuàng)建細(xì)胞起源條碼的組件，該細(xì)胞起源條碼提供將檢測(cè)到的靶分子劃歸于特定個(gè)體細(xì)胞的手段。每個(gè)個(gè)體cob均包含與特定起源細(xì)胞相關(guān)的獨(dú)特代碼。因此，通過(guò)其相關(guān)esb鑒別的個(gè)體細(xì)胞的uba集合將共有共同cob，該共同cob與樣品中所有其他細(xì)胞的cob不同。

在一些實(shí)施方案中，cob由附接至結(jié)合的uba-esb復(fù)合物的兩個(gè)或更多個(gè)可測(cè)定聚合物亞單位組成(圖1)，其中這組aps進(jìn)一步包含一組子代碼(sc)(圖2)。每個(gè)sc均包含獨(dú)特編碼區(qū)和/或可檢測(cè)分子，其中兩個(gè)或多個(gè)aps的串聯(lián)組合創(chuàng)建具有可檢測(cè)代碼或信號(hào)的個(gè)體cob，該可檢測(cè)代碼或信號(hào)將該個(gè)體cob與整套cob中的所有其他cob區(qū)分開來(lái)。本公開內(nèi)容的某些方面涉及經(jīng)由裂分-合并合成法(圖3-6)通過(guò)將一系列aps連接在一起而進(jìn)行的cob組合合成，其中可使用指定的一組aps和限定數(shù)目的裂分-合并偶聯(lián)輪次合成的獨(dú)特cob的總數(shù)顯著大于樣品中個(gè)體細(xì)胞的數(shù)目，從而確保任意兩個(gè)個(gè)體細(xì)胞具有相同cob的可能性極低。

如在上文引用的公開專利申請(qǐng)中所述，可采用多種技術(shù)進(jìn)行esb-cob復(fù)合物的解碼，從而鑒別存在于樣品的個(gè)體細(xì)胞中的靶分子。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)擴(kuò)增和測(cè)序來(lái)解碼esb-cob復(fù)合物。因此，本公開內(nèi)容的某些方面提供了使用多個(gè)uba-esb復(fù)合物和一組aps對(duì)細(xì)胞進(jìn)行條碼化的方法，其中每個(gè)aps均包含獨(dú)特的sc，并且其中對(duì)于給定的細(xì)胞，每個(gè)uba-esb-cob復(fù)合物的cob均相同，但與所有其他細(xì)胞的那些不同，并且其中整套esb-cob復(fù)合物的擴(kuò)增和測(cè)序允許對(duì)與樣品或選定細(xì)胞亞群中的每個(gè)個(gè)體細(xì)胞相關(guān)的整套靶分子進(jìn)行分類。在公開的方法、組合物和試劑盒的一些實(shí)施方案中，通過(guò)設(shè)計(jì)和使用靶標(biāo)特異性或半隨機(jī)擴(kuò)增引物來(lái)實(shí)現(xiàn)感興趣的uba-esb-cob復(fù)合物的選擇性擴(kuò)增，所述引物產(chǎn)生僅包含感興趣的和適當(dāng)長(zhǎng)度的那些序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而優(yōu)化現(xiàn)代高通量測(cè)序系統(tǒng)的測(cè)序容量的有效利用。

iii.組合物

a.獨(dú)特結(jié)合劑(uba)

uba是分子或分子組裝體，其被設(shè)計(jì)成與至少一種靶分子或其部分結(jié)合或雜交，并且在適當(dāng)條件下可形成包含uba和靶分子的分子復(fù)合物。靶分子的實(shí)例包括但不限于蛋白質(zhì)、肽、核酸、dna、rna、mrna、脂質(zhì)、碳水化合物、有機(jī)小分子、藥物分子、有機(jī)單體和離子。為方便起見，大多數(shù)本文所述的方法、組合物和試劑盒都在uba與靶蛋白或靶mrna結(jié)合的語(yǔ)境下進(jìn)行解釋。但是，這些方法、組合物和試劑盒還可應(yīng)用于其他靶分子。

在一些實(shí)施方案中，uba包含至少一個(gè)識(shí)別元件，該識(shí)別元件允許其與至少一種靶分子、至少一種靶分子的至少一部分、至少一種靶分子替代物、靶分子替代物的至少一部分或它們的組合發(fā)生結(jié)合或相互作用。uba通常以序列特異性方式、構(gòu)象特異性方式或二者組合的方式與靶分子結(jié)合或相互作用。合適的分子識(shí)別相互作用的實(shí)例包括但不限于抗體-抗原結(jié)合、受體-配體結(jié)合、適體-靶標(biāo)結(jié)合、酶-底物識(shí)別、寡核苷酸探針-靶序列雜交等。相應(yīng)地，適用于構(gòu)建uba的識(shí)別元件包括但不限于抗體、受體、酶、擬肽、適體、肽適體、核酸適體、寡核苷酸探針序列等。

在一些實(shí)施方案中，uba包含至少一個(gè)共同連接體(cl)元件，該元件允許其與編碼靶分子的身份的esb和/或編碼特定個(gè)體分子的身份的cob相附接或雜交。共同連接體可直接或間接附接至uba。在一些實(shí)施方案中，該共同連接體可為寡核苷酸分子。在一些實(shí)施方案中，該共同連接體可為共價(jià)附接至uba的寡核苷酸序列，但在一些實(shí)施方案中，其可非共價(jià)地附接至uba。

在一些實(shí)施方案中，uba進(jìn)一步包含捕獲區(qū)，該捕獲區(qū)可用于uba的分離和/或uba在表面上的固定。在一些實(shí)施方案中，該捕獲區(qū)可為親和標(biāo)簽、珠子、載玻片或陣列。在一些實(shí)施方案中，該捕獲區(qū)為相關(guān)聯(lián)的esb，例如，該esb可為可檢測(cè)的珠子，如具有獨(dú)特光譜特征的珠子(例如，結(jié)合有發(fā)射可見光、近紅外光或紅外光的特定熒光團(tuán)的珠子)。

在一些實(shí)施方案中，uba包括作為識(shí)別元件的抗體(圖2)。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”在廣義上使用，不僅包括完整的抗體分子，包括但不限于免疫球蛋白a、免疫球蛋白g和免疫球蛋白m，而且包括特異性地與至少一個(gè)表位結(jié)合的抗體分子的任何免疫反應(yīng)性組分。這類免疫反應(yīng)性組分包括但不限于fab片段、fab'片段、fab'2片段、單鏈抗體片段(scfv)、迷你抗體(miniantibodies)、雙抗體、交聯(lián)抗體片段、affibody^tm分子、環(huán)肽(cyclotides)分子等。使用抗體工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)得到的免疫反應(yīng)性產(chǎn)物也明顯被包括在如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”的含義內(nèi)。關(guān)于抗體和/或蛋白質(zhì)工程的詳細(xì)描述，包括相關(guān)方案，可見于例如j.maynard和g.georgiou,ann.rev.biomed.eng.2:33976(2000)；antibodyengineering,r.kontermann和s.dubel編,springerlabmanual,springerverlag(2001)；美國(guó)專利5,831,012；和antibodyengineeringprotocols,s.paul,humanapress(1995)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解抗體可從多種來(lái)源獲得，包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、單特異性抗體、重組表達(dá)的抗體、人源化抗體、植物抗體等；并且可從各種動(dòng)物物種獲得，包括兔、小鼠、山羊、大鼠、人、馬、牛、豚鼠、雞、綿羊、驢、人等。許多抗體可從多個(gè)供應(yīng)商購(gòu)買到，并且可從許多合約實(shí)驗(yàn)室獲得定制的抗體。關(guān)于抗體的詳細(xì)描述，包括關(guān)于生產(chǎn)和使用的相關(guān)方案，尤其可見于currentprotocolsinimmunology,coligan等人編,johnwiley&sons(1999年，包括截至2003年8月的更新內(nèi)容)；theelectronicnotebook；basicmethodsinantibodyproductionandcharacterization,g.howard和d.bethel編,crcpress(2000)；monoclonalantibodies:principlesandpractice,第3版,j.goding,academicpress(1996)；usingantibodies,e.harlow和d.lane,coldspringharborlabpress(1999)；以及monoclonalantibodies:apracticalapproach,p.shepherd和c.dean,oxforduniversitypress(2000)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的抗體附接至核酸，例如共同連接體寡核苷酸或包含寡核苷酸序列的esb。同時(shí)包含連接體和esb的寡核苷酸序列的一個(gè)非限制性實(shí)例為：

5’-gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnnnnnnnnncgtcagacagggagc-3’

其中nnnnnnnnn序列是對(duì)所附接的抗體而言為特異性的9個(gè)核苷酸的代碼。用于將核酸與抗體相附接的方法是本領(lǐng)域公知的，并且任何合適的方法均包括在本文公開的方法、組合物和試劑盒中，例如，在一些實(shí)施方案中，可采用gullberg等人,(2004),pnas101(22):228420-8424和boozer等人,(2004),analyticalchemistry76(23):6967-6972中描述的方法將抗體與核酸分子相附接，二者均通過(guò)引用而并入本文。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)隨機(jī)偶聯(lián)至游離胺而將抗體與核酸分子相附接。在一些實(shí)施方案中，可采用10:1的核酸:抗體比例，通過(guò)隨機(jī)偶聯(lián)至游離胺而將抗體與核酸分子相附接。在一些實(shí)施方案中，可采用kozlov等人,(2004),biopolymers5:73(5):621-630中描述的方法將抗體與核酸分子相附接，其在此通過(guò)引用而并入本文。在一些實(shí)施方案中，可采用肼化學(xué)法將抗體與核酸分子相附接。在一些實(shí)施方案中，可采用如nolan(2005),naturemethods2:11-12中所述的“tadpoles”將抗體與核酸分子相附接，其在此通過(guò)引用而并入本文。通常，可采用包括本文所述方法在內(nèi)的本領(lǐng)域已知用于生成工程化抗體的任何合適方法將抗體與核酸分子相附接。

在公開的方法、組合物和試劑盒的一些實(shí)施方案中，uba包含作為識(shí)別元件的核酸序列。核酸識(shí)別元件可包括靶標(biāo)特異性識(shí)別序列，或通用靶標(biāo)識(shí)別序列。合適的靶標(biāo)識(shí)別序列的實(shí)例包括但不限于用于與普通mrna分子雜交的聚-dt探針序列；用于與特定靶mrna雜交的反義dna探針序列，設(shè)計(jì)成與hiv病毒序列雜交的寡核苷酸序列，等等。核酸序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少15個(gè)核苷酸，并且更優(yōu)選為至少20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性識(shí)別序列的長(zhǎng)度為約10至500、20至400、30至300、40至200或50至100個(gè)核苷酸。在其他實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性序列的長(zhǎng)度為約30至70、40至80、50至90，或60至100、30至120、40至140或50至150個(gè)核苷酸。

在公開的方法、組合物和試劑盒的一些實(shí)施方案中，uba包含成組的寡核苷酸探針，例如，一對(duì)鄰近探針以及橋寡核苷酸序列，它們被設(shè)計(jì)為以比采用單個(gè)寡核苷酸識(shí)別序列可實(shí)現(xiàn)的更高的特異性與感興趣的靶核酸分子例如mrna分子雜交。使用橋分子(例如，橋寡核苷酸分子)的本公開內(nèi)容的鄰近寡核苷酸探針組的實(shí)例在圖7、8、10和12中示出。本公開內(nèi)容的寡核苷酸探針組的其他實(shí)例在圖22和23中示出。在公開的方法和組合物的一些實(shí)施方案中，橋分子可并入用于組裝cob的夾板分子中，并且其也可合并有一個(gè)或多個(gè)引物序列。

參考圖7作為示例，本公開內(nèi)容的包含鄰近探針組的uba包含兩個(gè)寡核苷酸序列，15和19，其每一個(gè)均被設(shè)計(jì)成與靶mrna分子的互補(bǔ)區(qū)段雜交。通常，這兩個(gè)鄰近探針將被設(shè)計(jì)成與彼此緊鄰的靶mrna區(qū)段，例如，相隔n個(gè)核苷酸的兩個(gè)靶序列區(qū)雜交，其中n的范圍為1至200個(gè)核苷酸。在許多實(shí)施方案中，該鄰近探針中的一個(gè)或另一個(gè)將進(jìn)一步包含表位特異性條碼序列。在一些實(shí)施方案中，橋連寡核苷酸20被設(shè)計(jì)成與每一個(gè)個(gè)體鄰近探針上的互補(bǔ)序列區(qū)雜交，從而形成特異性識(shí)別靶mrna的分子復(fù)合物，并且其可進(jìn)一步包含擴(kuò)增引物序列和測(cè)序引物序列，以及/或者用于組裝獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的共同連接體。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在與橋連分子退火后進(jìn)行連接而將兩個(gè)鄰近探針接合，從而形成可被擴(kuò)增和測(cè)序的共價(jià)連接的分子復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，用于組裝夾板分子和aps以形成cob的共同連接體位于探針復(fù)合物的5’端(圖7)。在一些實(shí)施方案中，該共同連接體位于探針復(fù)合物的3’端(圖8)。在一些實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性探針組包含兩個(gè)靶標(biāo)特異性鄰近探針，用于將包含sc的aps組裝成獨(dú)特cob的兩個(gè)夾板分子，以及橋連分子(圖10)。在一些實(shí)施方案中，該靶標(biāo)特異性探針組包含兩個(gè)靶標(biāo)特異性鄰近探針和自身用作夾板的橋連分子(圖12)。

在一些實(shí)施方案中，所述uba可進(jìn)一步包含含有一個(gè)或多個(gè)引物的核酸序列，其中該引物用于特定uba探針序列、esb編碼序列、cob序列或它們的組合的擴(kuò)增和/或測(cè)序。任何合適的引物序列均可用于擴(kuò)增和/或測(cè)序，例如，illumina引物可用于對(duì)uba-esb-cob組裝體或綴合物或其部分進(jìn)行測(cè)序。

在一些實(shí)施方案中，所述uba可包含用于識(shí)別和結(jié)合基因組dna或染色體dna結(jié)構(gòu)的非特異性結(jié)合劑，包括但不限于，例如，結(jié)合dna或組蛋白的抗體，或esb可與之附接的dna嵌入分子如小檗堿、溴化乙錠、原黃素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、柔紅霉素或沙利度胺。

在一些實(shí)施方案中，所述uba可包含針對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合劑，包括但不限于，例如，esb可與之附接的選自琥珀酰亞胺酯、磺基琥珀酰亞胺酯、四氟苯基酯、磺基二氯苯酚酯、異硫氰酸酯和磺酰氯的胺反應(yīng)性探針。

b.表位特異性條碼(esb)

本公開內(nèi)容的表位特異性條碼提供了與特定靶分子相關(guān)的獨(dú)特代碼。esb為分子或分子組裝體，其被設(shè)計(jì)用于與uba或其部分相附接或結(jié)合，并且在適當(dāng)條件下可形成包含esb、uba和靶分子的分子復(fù)合物。

在一些實(shí)施方案中，esb包含至少一個(gè)共同連接體區(qū)，該共同連接體區(qū)允許其與至少一個(gè)uba和/或至少一個(gè)aps通常以序列特異性方式、構(gòu)象特異性方法或二者組合的方式結(jié)合或相互作用。esb與其關(guān)聯(lián)的uba和/或aps之間的合適的分子結(jié)合相互作用的實(shí)例包括但不限于抗體-抗原結(jié)合、受體-配體結(jié)合、適體-靶標(biāo)結(jié)合、酶-底物相互作用、寡核苷酸探針-靶序列雜交等。esb與其關(guān)聯(lián)的uba和/或aps之間的相互作用通常由離子鍵合、氫鍵合或范德華力驅(qū)動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，esb與關(guān)聯(lián)的uba和/或aps之間的附接可以是共價(jià)的。在一些實(shí)施方案中，該附接是非共價(jià)的。在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行測(cè)定之前將esb(直接或間接地)附接至uba。在其他實(shí)施方案中，在將樣品與uba一起溫育后將esb與uba結(jié)合或相附接，即，作為測(cè)定程序的一部分。

在公開的方法和組合物的一些實(shí)施方案中，所述esb包含編碼所附接的uba的身份的至少一個(gè)編碼區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該esb為寡核苷酸序列，并且該編碼區(qū)包含長(zhǎng)度為5至15個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，該編碼區(qū)為長(zhǎng)度為9個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列(圖2)。

在許多實(shí)施方案中，所述esb為進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)引物的寡核苷酸序列，并且可采用任何核酸擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增esb核酸序列的部分或全部，以及/或者關(guān)聯(lián)的cob，該核酸擴(kuò)增方法包括但不限于本領(lǐng)域公知的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、支鏈反應(yīng)或滾環(huán)擴(kuò)增方法。

圖26示出了用于將自環(huán)化寡核苷酸條碼附接至抗體或抗體片段的方法的非限制性實(shí)例，其中該寡核苷酸經(jīng)由連接體(左側(cè))或經(jīng)由與連接寡核苷酸退火(右側(cè))而附接至蛋白質(zhì)分子。寡核苷酸標(biāo)記的抗體使得能夠通過(guò)使用免疫pcr反應(yīng)來(lái)檢測(cè)低豐度的蛋白質(zhì)，其中通過(guò)定量pcr或測(cè)序來(lái)擴(kuò)增并檢測(cè)與結(jié)合的抗體對(duì)應(yīng)的寡核苷酸條碼。

在一些實(shí)施方案中，所述esb進(jìn)一步包含捕獲區(qū)，該捕獲區(qū)可用于uba-esb復(fù)合物的分離和/或uba-esb復(fù)合物在固體表面上的固定。在一些實(shí)施方案中，該捕獲區(qū)可為親和標(biāo)簽、珠子、載玻片或陣列。在一些實(shí)施方案中，該捕獲區(qū)為esb，例如，該esb可為可檢測(cè)的珠子，如具有獨(dú)特光譜特征的珠子(例如，結(jié)合有發(fā)射可見光、近紅外光或紅外光的特定熒光團(tuán)的珠子)。在一些實(shí)施方案中，該uba直接或間接附接至esb的捕獲區(qū)。

c.細(xì)胞起源條碼(cob)

本文公開的方法、組合物和試劑盒進(jìn)一步提供了用于創(chuàng)建細(xì)胞起源條碼的手段，其中每個(gè)cob均提供可與特定起源細(xì)胞相關(guān)的獨(dú)特代碼。在一些實(shí)施方案中，cob與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合的uba-esb復(fù)合物的附接(例如，采用共同連接體寡核苷酸)鑒別出uba/esb復(fù)合物所結(jié)合的靶分子的起源細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的cob為分子實(shí)體(或組裝體、復(fù)合物或綴合物)，其可包含(i)能夠與關(guān)聯(lián)于uba-esb復(fù)合物的共同連接體寡核苷酸雜交的共同連接體序列，(ii)與特定起源細(xì)胞相關(guān)的獨(dú)特代碼，以及(iii)一個(gè)或多個(gè)引物序列，或它們的組合。

在一些實(shí)施方案中，cob是由兩個(gè)或更多個(gè)aps組成的模塊化結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，cob是由以線性組合的方式附接的兩個(gè)或更多個(gè)aps組成的模塊化結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，該cob包含以線性組合的方式附接的多個(gè)aps，其中該aps包含確定分子量的小分子。在一些實(shí)施方案中，該cob包含以線性組合的方式附接的2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)獨(dú)特aps。在一些實(shí)施方案中，如在上文引用的公開專利申請(qǐng)中更全面描述的，cob包含若干個(gè)aps的線性組合，例如四個(gè)aps的線性組合，它們采用裂分-合并組合合成法組裝(圖4-6)。相鄰aps的線性附接可采用多種技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)相鄰aps，或通過(guò)將個(gè)體aps與包含設(shè)計(jì)成與個(gè)體aps上的互補(bǔ)序列區(qū)退火的兩組或更多組序列區(qū)的模板(夾板)核酸分子雜交，隨后連接相鄰的aps。模板核酸分子或夾板可包含至少一個(gè)核酸序列，如以下的至少一部分：線性病毒基因組或可被制成線性的病毒基因組，例如，腺病毒、肝炎病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等的基因組；噬菌體，如λ、m13、t系列噬菌體等，包括包含克隆盒、多連接體等的其衍生物；質(zhì)粒，如pbr322和puc系列質(zhì)粒等，包括包含克隆盒、多連接體等的其衍生物；合成模板；包含人工序列的模板；等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，基本上任一段核酸都可充當(dāng)用于制備cob的模板，只要其大小足以包括用于至少兩個(gè)aps的退火區(qū)，或者其可與至少一個(gè)其他核酸序列組合，使得該組合的序列的大小足以包括用于至少兩個(gè)aps的退火區(qū)。

在一些實(shí)施方案中，模板或夾板分子的aps識(shí)別序列組各自被包含1、2、3個(gè)或更多個(gè)碳原子的連接體隔開，該連接體充當(dāng)聚合酶活性的“終止”信號(hào)或終止代碼，從而防止核酸擴(kuò)增步驟期間整個(gè)模板分子的不想要的擴(kuò)增。

在一些實(shí)施方案中，多個(gè)aps可包括一組獨(dú)特設(shè)計(jì)的包含一個(gè)或多個(gè)子代碼(sc)區(qū)的核酸序列，其中對(duì)于所述多個(gè)aps中的每個(gè)個(gè)體aps而言，該子代碼序列均是獨(dú)特的。在一些實(shí)施方案中，該sc區(qū)或序列的長(zhǎng)度為約3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或超過(guò)10個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該子代碼包含獨(dú)特的一組具有限定長(zhǎng)度、例如7個(gè)核苷酸的核酸序列(圖2)，其被設(shè)計(jì)用于提供錯(cuò)誤校正能力。在一些實(shí)施方案中，這組子代碼包含7個(gè)核苷酸的序列，該序列被設(shè)計(jì)為使得該組中序列的任何成對(duì)組合均表現(xiàn)出限定的“遺傳距離”，或錯(cuò)配堿基的數(shù)目，例如，距離為3。在這種情況下，對(duì)在測(cè)定的最終步驟中鑒別的cob組中的子代碼的考察允許在進(jìn)行測(cè)定數(shù)據(jù)的最終分析之前檢測(cè)雜交或擴(kuò)增錯(cuò)誤。

在一些實(shí)施方案中，所述aps進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)共同連接體(cl)區(qū)或序列(例如，共同連接體寡核苷酸)，以便促進(jìn)該aps彼此之間的附接，或與esb或與用于組裝cob的模板分子的附接。因此，在一些實(shí)施方案中，該共同連接體區(qū)包含設(shè)計(jì)成與模板分子上的互補(bǔ)序列雜交的退火區(qū)。該共同連接體可直接或間接地附接至aps分子的剩余部分，并且促進(jìn)該aps共價(jià)或非共價(jià)地組裝成cob。在一些實(shí)施方案中，該共同連接體序列可包含長(zhǎng)度為約10個(gè)至約25個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列或串聯(lián)重復(fù)序列。在一些實(shí)施方案中，該aps包含在sc區(qū)側(cè)翼的兩個(gè)共同連接體序列。在一些實(shí)施方案中，共同連接體序列還可附接在cob的5'端或3'端，并且可用于例如通過(guò)將與該共同連接體序列互補(bǔ)的序列附接至固體支持體或基底而將cob捕獲并固定在表面上，以用于檢測(cè)或成像目的。

在一些實(shí)施方案中，所述aps或cl進(jìn)一步包含允許隨后對(duì)所檢測(cè)到的cob的數(shù)目進(jìn)行定量的隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)。用于制備和使用這類隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，參見casbon等人(2011),nucleicacidsresearch39(12):e81。該隨機(jī)標(biāo)簽區(qū)可充當(dāng)分子計(jì)數(shù)器，用來(lái)估計(jì)與每個(gè)序列變體相關(guān)聯(lián)的模板分子的數(shù)目。在一些實(shí)施方案中，在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)例如pcr擴(kuò)增之前，將分子計(jì)數(shù)器并入esb、aps、cl或組裝的cob中?？蓪?jiǎn)并堿基區(qū)(dbr)的分子計(jì)數(shù)器文庫(kù)并入esb、aps、cl或組裝的cob中。文庫(kù)中獨(dú)特dbr的數(shù)目通常受該dbr的長(zhǎng)度和堿基組成所限制。例如，包含單個(gè)核苷酸的dbr將會(huì)允許四種不同的可能計(jì)數(shù)器，每個(gè)堿基一種?？赏ㄟ^(guò)使用更長(zhǎng)的dbr，例如，對(duì)應(yīng)于4⁸＝65,536個(gè)獨(dú)特序列的八核苷酸dbr，實(shí)現(xiàn)更大的獨(dú)特計(jì)數(shù)器序列文庫(kù)。分子計(jì)數(shù)器可用于確定序列變體是否與單個(gè)模板分子相關(guān)聯(lián)，或者可替代地，是否與多個(gè)模板分子相關(guān)聯(lián)。因此，與一個(gè)序列變體相關(guān)聯(lián)的不同dbr序列的數(shù)目可充當(dāng)初始模板分子數(shù)目的直接量度。該信息可補(bǔ)充或替代由每個(gè)序列變體的讀取數(shù)目所提供的信息，該讀取數(shù)目包括，例如，在進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)后獲得的讀取數(shù)目。dbr還可用于確定序列變體來(lái)源于擴(kuò)增反應(yīng)期間的聚合酶錯(cuò)誤，或者其為在進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)之前存在的真正原始變體的可能性。

在一些實(shí)施方案中，cob的元件可存在于單個(gè)分子實(shí)體(單cob)或兩個(gè)不同的分子實(shí)體(雙cob)中。每個(gè)分子實(shí)體可由一個(gè)分子或通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方式彼此附接的多于一個(gè)分子組成。在一些實(shí)施方案中，雙cob的每個(gè)組件具有與相同靶分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合的靶分子特異性u(píng)ba-esb復(fù)合物。當(dāng)使用雙cob系統(tǒng)時(shí)，其中一個(gè)cob可以是如下所述標(biāo)記的或未標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，未標(biāo)記的cob可包含捕獲區(qū)。

在一些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)成與sc雜交的互補(bǔ)寡核苷酸序列用于將可檢測(cè)分子例如標(biāo)記物或標(biāo)記物單體與cob的每個(gè)sc相附接。例如，可通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記物分子共價(jià)并入該互補(bǔ)寡核苷酸序列中而直接標(biāo)記該互補(bǔ)寡核苷酸序列?；蛘?，例如，可通過(guò)將生物素或其他能夠提供特異性的高親和力配體相互作用的分子并入該互補(bǔ)寡核苷酸序列中而間接標(biāo)記該互補(bǔ)寡核苷酸序列。在這類情況下，該配體(例如，在生物素并入的情況下為抗生物素蛋白或鏈霉親和素)可共價(jià)附接至可檢測(cè)分子。在與sc相附接的可檢測(cè)分子沒(méi)有直接并入互補(bǔ)寡核苷酸序列中的情況下，該互補(bǔ)序列充當(dāng)該可檢測(cè)分子與sc之間的橋，并且可被稱為橋連分子，例如，橋連核酸。

可以用多種標(biāo)記物或標(biāo)記物單體中的任一種，例如，放射性同位素、熒光團(tuán)、染料、酶、納米顆粒、質(zhì)量標(biāo)簽、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物素或本領(lǐng)域已知的其他標(biāo)記物或標(biāo)記物單體(它們可直接(例如，通過(guò)光發(fā)射)或間接(例如，通過(guò)熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合)檢測(cè))，來(lái)標(biāo)記本公開內(nèi)容的cob和組成該cob的aps分子。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種標(biāo)記物單體標(biāo)記cob中的一個(gè)或多個(gè)sc，并且由附接至cob的sc的標(biāo)記物單體所提供的信號(hào)構(gòu)成鑒別出uba(或uba-esb-cob)所結(jié)合的靶標(biāo)(或細(xì)胞)的可檢測(cè)代碼。在一些實(shí)施方案中，來(lái)自sb的給定信號(hào)的缺乏(例如，暗點(diǎn))也可構(gòu)成可檢測(cè)代碼的一部分?？膳c本文所述的cob一起使用的標(biāo)記物單體的其他實(shí)例，以及用于將標(biāo)記物單體并入cob中的方法，在美國(guó)專利7,473,767和第10/542,458、12/324,357、11/645,270和12/541,131號(hào)美國(guó)申請(qǐng)中描述，其通過(guò)引用而全文并入本文。

d.引物

在公開的方法、組合物和試劑盒的一些實(shí)施方案中，使用靶標(biāo)特異性引物、通用引物、半隨機(jī)引物或其組合選擇性地?cái)U(kuò)增感興趣靶標(biāo)的uba-esb-cob復(fù)合物，以便優(yōu)化用于檢測(cè)和定量個(gè)體細(xì)胞中的靶分子的測(cè)序反應(yīng)的成本效益和通量。

所公開的方法、組合物和試劑盒的靶標(biāo)特異性引物的一個(gè)實(shí)例在圖29中示出，并且其包含位于該分子的5’端附近的測(cè)序引物區(qū)(“引物1”)，以及位于該分子的3’端附近的靶標(biāo)特異性序列區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)包括illumina測(cè)序引物序列。通常，該測(cè)序引物區(qū)的長(zhǎng)度將為約18至30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)的長(zhǎng)度將為20至25個(gè)核苷酸。該靶標(biāo)特異性序列區(qū)被設(shè)計(jì)成與感興趣的靶序列互補(bǔ)。通常，該靶標(biāo)特異性序列區(qū)的長(zhǎng)度將為6至30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該靶標(biāo)特異性序列區(qū)的長(zhǎng)度將為18至22個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)和靶標(biāo)特異性序列區(qū)將會(huì)相隔長(zhǎng)度為0至30個(gè)核苷酸的連接體區(qū)。

所公開的方法、組合物和試劑盒的通用引物的一個(gè)實(shí)例在圖30中示出，并且其包含位于該分子的5’端附近的測(cè)序引物區(qū)(“引物1”)，以及位于該分子的3’端附近的聚-c序列區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)包括illumina測(cè)序引物序列。通常，該測(cè)序引物區(qū)的長(zhǎng)度將為約18至30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)的長(zhǎng)度將為20至25個(gè)核苷酸。該聚-c序列區(qū)被設(shè)計(jì)成與在靶rna序列的逆轉(zhuǎn)錄之后添加至靶標(biāo)-uba-esb-cob復(fù)合物的3’端的聚-g序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，該聚-c序列區(qū)的長(zhǎng)度為4至30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該聚-c序列區(qū)的長(zhǎng)度為6至20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該聚-c序列區(qū)的長(zhǎng)度為6至12個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)和聚-c序列區(qū)序列區(qū)將會(huì)相隔長(zhǎng)度為0至30個(gè)核苷酸的連接體區(qū)。

所公開的方法、組合物和試劑盒的半隨機(jī)引物的一個(gè)實(shí)例在圖31中示出，并且其包含位于該分子的5’端附近的測(cè)序引物區(qū)(“引物1”)，以及位于該分子的3’端附近的半隨機(jī)序列區(qū)(例如，“nnngag”)，其中nnn為隨機(jī)的三核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)包括illumina測(cè)序引物序列。通常，該測(cè)序引物區(qū)的長(zhǎng)度將為約18至30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)的長(zhǎng)度將為20至25個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列為(m)i(x)j(n)k的形式，其中(m)i和(n)k為長(zhǎng)度分別為i和k的任意隨機(jī)寡核苷酸核苷酸序列，并且其中(x)j為長(zhǎng)度為j的特定寡核苷酸序列，該特定寡核苷酸序列被選擇為與相對(duì)于靶寡核苷酸序列的3’端在指定位置處的靶寡核苷酸序列互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，i和k的值可為0至6。在一些實(shí)施方案中，j的值可為3至6。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)引物被設(shè)計(jì)成與相對(duì)于靶序列的3’端在指定位置處的靶寡核苷酸序列互補(bǔ)，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度為約z個(gè)核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且其中z的值可為50-1000。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列被設(shè)計(jì)成與cdna序列部分地互補(bǔ)，該cdna序列在從靶rna序列的cdna拷貝與uba探針序列之間的接合處起約64個(gè)核苷酸的位置處。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列被設(shè)計(jì)成與cdna序列部分地互補(bǔ)，該cdna序列在從靶rna序列的cdna拷貝與原始uba探針序列的接合處起128至32個(gè)核苷酸的位置處。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列的非隨機(jī)部分的長(zhǎng)度為2至10個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列的非隨機(jī)部分的長(zhǎng)度為3至6個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列的隨機(jī)部分的長(zhǎng)度為2至10個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列的隨機(jī)部分的長(zhǎng)度為3至6個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物區(qū)和半隨機(jī)序列區(qū)將會(huì)相隔長(zhǎng)度為0至30個(gè)核苷酸的連接體區(qū)。

iv.方法

a.細(xì)胞與uba-esb復(fù)合物的溫育

在所公開的方法的許多實(shí)施方案中，在適合與個(gè)體細(xì)胞的表面上或個(gè)體細(xì)胞內(nèi)的特定分子靶標(biāo)結(jié)合或雜交的條件下，將細(xì)胞懸浮液或樣品與一種或多種uba-esb復(fù)合物一起溫育。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)感興趣的靶標(biāo)可為細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)，并且可采用本領(lǐng)域已知的任意方法將細(xì)胞固定并透化，例如，通過(guò)向細(xì)胞樣品添加冷甲醇并溫育較短的一段時(shí)間，隨后吸出甲醇、沖洗并用牛血清白蛋白或酪蛋白溶液封閉，之后與uba-esb一起溫育。

b.細(xì)胞起源條碼(cob)的組裝

用于對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行條碼化以及組裝相關(guān)的細(xì)胞起源條碼的方法先前已在公開的專利申請(qǐng)pct/us2012/023411和pct/us2013/054190中描述，所述專利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。可通過(guò)包括本文簡(jiǎn)要描述的方法在內(nèi)的本領(lǐng)域已知的任何合適的方法進(jìn)行cob組裝或合成。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)逐步添加包含寡核苷酸的可測(cè)定聚合物亞單位(aps)來(lái)組裝cob。在一些實(shí)施方案中，cob經(jīng)由共同連接體(cl)附接至uba-esb復(fù)合物，該共同連接體自身可為寡核苷酸，并且其可為aps自身的一部分，或單獨(dú)的分子組件。在一些實(shí)施方案中，esb、aps和cl都可包含寡核苷酸序列。因此，在通過(guò)esb、aps和cl上的互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的退火區(qū)之間的雜交而組裝后，可連接組裝的寡核苷酸，以在esb-aps、相鄰aps或相鄰aps-cl單元之間形成共價(jià)鍵?？稍诠押塑账醗sb、aps或cl的任一端或兩端上提供退火區(qū)。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)進(jìn)行一輪或多輪裂分合并合成而將aps添加至結(jié)合的uba-esb，其中每一輪均包括將細(xì)胞樣品裂分成多個(gè)等份，將每個(gè)等份與不同aps(包含不同sc)一起溫育以允許aps與生長(zhǎng)中的uba-esb-aps鏈之間的互補(bǔ)序列的退火，連接(在寡核苷酸esb和aps的情況下)，沖洗，以及等份的合并。如果aps不包含并入的cl區(qū)，則該循環(huán)還可包括溫育步驟，其中使cl與生長(zhǎng)中的uba-esb-aps鏈退火。在一些實(shí)施方案中，可將對(duì)于逐步合成的每個(gè)步驟為特異性的退火區(qū)并入該反應(yīng)的寡核苷酸組分中。在這種情況下，使用步驟特異性退火區(qū)可使其中先前添加步驟失敗的對(duì)于任意細(xì)胞的cob的進(jìn)一步組裝停止。

通過(guò)進(jìn)行逐步裂分-合并組裝和合成可實(shí)現(xiàn)的cob文庫(kù)的多樣性(即，理論上可能的獨(dú)特cob的數(shù)目)取決于可用于每一輪的獨(dú)特aps的數(shù)目，以及用于組裝cob的輪次總數(shù)。例如，對(duì)于采用兩輪組裝/合成和10種獨(dú)特aps創(chuàng)建的cob(即，對(duì)于具有兩個(gè)aps位置的cob)，獨(dú)特cob序列的總數(shù)為2¹⁰＝1,024?；蛘?，對(duì)于采用四輪組裝/合成和10種獨(dú)特aps創(chuàng)建的cob(即，對(duì)于具有四個(gè)aps位置的cob)，獨(dú)特cob序列的總數(shù)為4¹⁰＝1,048,576。通常，期望設(shè)計(jì)cob文庫(kù)，使得可用的獨(dú)特條碼的總數(shù)顯著大于待標(biāo)記的個(gè)體細(xì)胞的數(shù)目，從而確保任意兩個(gè)細(xì)胞用相同細(xì)胞起源條碼標(biāo)記的可能性極低。

在一些實(shí)施方案中，使用退火引物(即，模板分子或“夾板”)將aps縫合在一起和/或與cl相縫合。該退火引物可包含與cl或前一輪逐步合成期間添加的aps互補(bǔ)的第一互補(bǔ)區(qū)。該退火引物還可包含與當(dāng)前輪次正在添加的aps互補(bǔ)的第二互補(bǔ)區(qū)。因此，該退火引物可與連續(xù)輪次的兩個(gè)寡核苷酸亞單位雜交，從而將它們縫合在一起。在一些實(shí)施方案中，每一輪次的退火引物的第一互補(bǔ)區(qū)均與其他輪次的退火引物的第一互補(bǔ)區(qū)不同。在一些實(shí)施方案中，每一輪次的退火引物的第二互補(bǔ)區(qū)均與其他輪次的退火引物的第二互補(bǔ)區(qū)不同。在一些實(shí)施方案中，不同輪次的退火引物的第一或第二互補(bǔ)區(qū)在輪次之間共享。在一些實(shí)施方案中，使用模板或“夾板”(即，延伸的cl分子)組裝aps，其中該夾板包含多組退火區(qū)，該多組退火區(qū)被設(shè)計(jì)成允許個(gè)體aps的逐步雜交和連接以創(chuàng)建完整的cob。

在一些實(shí)施方案中，cl或“夾板”寡核苷酸包含一對(duì)或多對(duì)環(huán)退火區(qū)。相應(yīng)地，可將aps設(shè)計(jì)成與cl或夾板雜交以創(chuàng)建環(huán)幾何結(jié)構(gòu)，即，通過(guò)在cl的每一端與環(huán)退火區(qū)雜交。在一些實(shí)施方案中，可將環(huán)退火區(qū)設(shè)計(jì)成對(duì)裂分-合并合成的輪次而言是特異性的，使得連續(xù)輪次的添加和雜交沿著夾板填充aps位置。隨后可采用任何本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過(guò)連接，將aps連接在一起。在一些實(shí)施方案中，可將aps設(shè)計(jì)用于確保其不在對(duì)其他合成輪次為特異性的環(huán)退火區(qū)處與夾板有效雜交。因此，如果來(lái)自特定輪次的aps由于一些原因而丟失，則在后續(xù)輪次添加的aps不大可能正確地連接，由此降低了下游分析錯(cuò)誤的可能性?；蛘?，即使aps丟失，偶爾也可能合成cob，該cob的位置的側(cè)翼是一對(duì)環(huán)退火區(qū)。然后可相應(yīng)地分析所得的cob，并可將其丟棄或者可以備選地處理所檢索到的信息。

圖15示出了用于將aps組裝成包含編碼區(qū)sc1–sc4的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的夾板寡核苷酸分子的一個(gè)實(shí)例。下圖說(shuō)明了用于對(duì)抗體或抗體片段進(jìn)行條碼化的寡核苷酸的一個(gè)實(shí)例，但其同樣適用于包含寡核苷酸探針的uba。

圖16-19示出了用于將aps組裝成包含編碼區(qū)sc1–sc3并進(jìn)一步包含擴(kuò)增引物和/或測(cè)序引物的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的夾板寡核苷酸分子的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，該測(cè)序引物可包括illumina測(cè)序引物。還示出了進(jìn)一步包含9個(gè)核苷酸的表位特異性條碼區(qū)的、用于將寡核苷酸與抗體附接的寡核苷酸連接體序列的實(shí)例(圖17)。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)與包含熒光團(tuán)的寡核苷酸檢測(cè)探針雜交來(lái)檢測(cè)細(xì)胞起源條碼序列的一部分或全部(圖17，上圖)。

圖21示出了通過(guò)將第二夾板分子(夾板sp-v5)與采用第一夾板分子(夾板sp-v4)組裝的生長(zhǎng)中的cob的5’端雜交而延長(zhǎng)cob長(zhǎng)度(即，子代碼區(qū)的數(shù)目)的實(shí)例。在該實(shí)例中，使用包含sc區(qū)和測(cè)序引物(seqp1)二者的修飾的aps創(chuàng)建第三編碼區(qū)(sc3’)，從而提供與第二夾板(夾板sp-v5)雜交的5’序列。更大數(shù)目的子代碼區(qū)的使用使得能夠創(chuàng)建數(shù)目大得多的用于標(biāo)記來(lái)自個(gè)體細(xì)胞的mrna或蛋白質(zhì)靶分子的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼。在一些實(shí)施方案中，使用更長(zhǎng)長(zhǎng)度的單個(gè)夾板寡核苷酸來(lái)組裝更大數(shù)目的aps以創(chuàng)建cob。

圖27示出了采用包含含有可光解的鍵的發(fā)夾寡核苷酸結(jié)構(gòu)的aps，用獨(dú)特細(xì)胞起源條碼對(duì)每次出現(xiàn)的結(jié)合的抗體-est(表位特異性標(biāo)簽，或表位特異性條碼)復(fù)合物進(jìn)行條碼化的過(guò)程的非限制性實(shí)例。將包含含有第一編碼區(qū)sc1的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的aps與附接至結(jié)合的抗體的est退火并連接。在退火并連接后，將樣品暴露于uv(300nm)光以使可光解的鍵斷裂，從而創(chuàng)建可用于與下一個(gè)aps發(fā)夾雜交的游離5’-磷酸末端序列。采用上述裂分-合并合成方法，利用重復(fù)輪次的退火、連接和uv光暴露來(lái)創(chuàng)建一組獨(dú)特cob。在圖27所示的非限制性實(shí)例中，最終aps發(fā)夾結(jié)構(gòu)包括illumina引物序列。用于創(chuàng)建圖27所示方法的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的這組寡核苷酸序列的非限制性實(shí)例在圖28中示出。

c.用于檢測(cè)條碼的方法

用于擴(kuò)增和檢測(cè)表位特異性條碼和細(xì)胞起源條碼的方法已在公開的專利申請(qǐng)pct/us2012/023411和pct/us2013/054190中更全面地描述，所述申請(qǐng)通過(guò)引用而并入本文。在一些實(shí)施方案中，對(duì)組裝的uba-esb-cob或esb-cob產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，并任選地將結(jié)果與來(lái)自參比樣品的相似靶核酸的擴(kuò)增進(jìn)行比較。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增。在一些情況下，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)來(lái)擴(kuò)增連接的產(chǎn)物?？墒褂玫膒cr技術(shù)的實(shí)例包括但不限于定量pcr、定量熒光pcr(qf-pcr)、多重?zé)晒鈖cr(mf-pcr)、實(shí)時(shí)pcr(rt-pcr)、單細(xì)胞pcr、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性pcr(pcr-rflp)、實(shí)時(shí)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性pcr(rt-pcr-rflp)、熱啟動(dòng)pcr、巢式pcr、原位聚合酶群落(polonony)pcr、原位滾環(huán)擴(kuò)增(rca)、橋式pcr、picotiterpcr和乳液pcr。其他合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(lcr)、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增、自動(dòng)維持序列復(fù)制、靶多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增、共有序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(cp-pcr)、任意引物聚合酶鏈反應(yīng)(ap-pcr)、簡(jiǎn)并寡核苷酸引物pcr(dop-pcr)和基于核酸的序列擴(kuò)增(nabsa)。本文可用的其他擴(kuò)增方法包括美國(guó)專利5,242,794、5,494,810、4,988,617和6,582,938中描述的方法。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。

在公開的方法、組合物和試劑盒的一些實(shí)施方案中，使用靶標(biāo)特異性引物或半隨機(jī)引物來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增感興趣靶標(biāo)的uba-esb-cob復(fù)合物，以便優(yōu)化用于檢測(cè)和定量個(gè)體細(xì)胞中的靶分子的測(cè)序反應(yīng)的通量并使其運(yùn)行成本最低。

在一些實(shí)施方案中，使用如圖29所圖示的靶標(biāo)特異性引物來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增與感興趣的靶標(biāo)或一組靶標(biāo)相關(guān)的那些細(xì)胞起源條碼，從而減少花費(fèi)在對(duì)與例如管家基因轉(zhuǎn)錄物及其他常見轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的條碼化物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序上的測(cè)序容量的量。

在一些實(shí)施方案中，使用如圖30所圖示的通用引物來(lái)預(yù)擴(kuò)增所有條碼化的物質(zhì)，隨后采用一種或多種靶標(biāo)特異性引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，以擴(kuò)增與感興趣的靶標(biāo)或一組靶標(biāo)相關(guān)的那些細(xì)胞起源條碼，從而減少花費(fèi)在對(duì)與例如管家基因轉(zhuǎn)錄物及其他常見轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的條碼化物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序上的測(cè)序容量的量。

在一些實(shí)施方案中，使用如圖31所圖示的半隨機(jī)引物來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增與感興趣的靶標(biāo)或一組靶標(biāo)相關(guān)的那些細(xì)胞起源條碼，從而減少花費(fèi)在對(duì)與例如管家基因轉(zhuǎn)錄物及其他常見轉(zhuǎn)錄物相關(guān)的條碼化物質(zhì)進(jìn)行測(cè)序上的測(cè)序容量的量。該半隨機(jī)序列被設(shè)計(jì)成在從靶rna序列的cdna拷貝與原始uba探針序列之間的接合處起約64個(gè)核苷酸的位置處與cdna序列部分地互補(bǔ)(經(jīng)由該序列的非隨機(jī)部分)，從而確保擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度與商用高通量測(cè)序系統(tǒng)的讀取長(zhǎng)度大致相同，以確保測(cè)序容量和通量的最優(yōu)利用。在一些實(shí)施方案中，該半隨機(jī)序列被設(shè)計(jì)成在從靶rna序列的cdna拷貝與原始uba探針序列的接合處起128至32個(gè)核苷酸的位置處與cdna序列部分地互補(bǔ)。

在任意實(shí)施方案中，可通過(guò)測(cè)序?qū)崿F(xiàn)uba-esb-cob、esb-cob或cob文庫(kù)的檢測(cè)或定量分析?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法或系統(tǒng)，例如通過(guò)采用illuminahiseq2000測(cè)序系統(tǒng)，經(jīng)由所有寡核苷酸標(biāo)簽的完全測(cè)序來(lái)檢測(cè)aps亞單位或整個(gè)cob?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的經(jīng)典sanger測(cè)序方法實(shí)現(xiàn)測(cè)序。還可采用高通量測(cè)序系統(tǒng)和/或新一代測(cè)序系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)測(cè)序，其中一些測(cè)序系統(tǒng)允許在經(jīng)測(cè)序的核苷酸摻入生長(zhǎng)鏈之時(shí)或之后立即檢測(cè)該經(jīng)測(cè)序的核酸，即，實(shí)時(shí)或基本實(shí)時(shí)地檢測(cè)序列。在一些情況下，高通量測(cè)序每小時(shí)生成至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少20,000、至少30,000、至少40,000、至少50,000、至少100,000或至少500,000個(gè)序列讀??；其中每個(gè)讀取為每個(gè)讀取至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120、至少150、至少200或至少250個(gè)堿基。

d.多重測(cè)試

在某些實(shí)施方案中，在多重分析中執(zhí)行檢測(cè)方法，其中在同一分析(即，在單一反應(yīng)混合物中)中檢測(cè)多個(gè)靶分子。在一些實(shí)施方案中，該分析是雜交分析或親和結(jié)合分析，其中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶分子。在一些實(shí)施方案中，該分析是雜交分析或親和結(jié)合分析，其中在單細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶分子。在某些實(shí)施方案中，在同一分析中檢測(cè)的多個(gè)靶分子是至少2個(gè)不同的靶分子、至少5個(gè)不同的靶分子、至少10個(gè)不同的靶分子、至少20個(gè)不同的靶分子、至少50個(gè)不同的靶分子、至少75個(gè)不同的靶分子、至少100個(gè)不同的靶分子、至少200個(gè)不同的靶分子、至少500個(gè)不同的靶分子，至少750個(gè)不同的靶分子或至少1,000個(gè)不同的靶分子。在其他實(shí)施方案中，在同一分析中檢測(cè)的多個(gè)靶分子是最多達(dá)5個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)10個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)20個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)50個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)100個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)150個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)200個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)500個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)750個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)1,000個(gè)不同的靶分子、最多達(dá)2,000個(gè)靶分子或最多達(dá)5,000個(gè)靶分子。在另外其他的實(shí)施方案中，所檢測(cè)的多個(gè)靶分子處于前述不同靶分子的數(shù)目之間的任何范圍內(nèi)，例如但不限于20至50個(gè)不同的靶分子、50至200個(gè)不同的靶分子、100至1000個(gè)不同的靶分子、500至5000個(gè)不同的靶分子等等。

e.定量檢測(cè)

除了由本公開內(nèi)容的uba-esb-cob復(fù)合物提供的定性分析能力及基于其的分析技術(shù)之外，在一些實(shí)施方案中，該uba-esb-cob還可獨(dú)特地適用于進(jìn)行定量分析。通過(guò)提供在uba-esb-cob與其相關(guān)的靶分子之間的1:1結(jié)合化學(xué)計(jì)量，例如在uba-esb復(fù)合物包含用于獨(dú)特地標(biāo)記靶分子的每個(gè)實(shí)例的短隨機(jī)序列(圖10)的實(shí)施方案中，可鑒別出樣品中存在的靶分子的全部或代表性部分，并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。各個(gè)分子種類的這種單獨(dú)計(jì)數(shù)提供了用于確定生物樣品中靶分子的絕對(duì)或相對(duì)濃度的準(zhǔn)確且直接的方法。此外，尋址和計(jì)數(shù)單個(gè)分子的能力允許利用測(cè)定小型化的益處，包括高靈敏性、最低樣品量需求、由小體積中的溶液相動(dòng)力學(xué)提供的快速反應(yīng)速率，以及最終非常低的試劑成本。

f.mrna靶分子的檢測(cè)

用于檢測(cè)特定mrna靶分子以及用獨(dú)特細(xì)胞起源條碼對(duì)其每次出現(xiàn)進(jìn)行標(biāo)記的過(guò)程的非限制性實(shí)例在用于檢測(cè)cd4mrna的圖9中示出。將cd4反向引物添加至已固定并透化的細(xì)胞樣品并使其退火，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(rt)反應(yīng)以創(chuàng)建cd4mrna分子的一部分的cdna拷貝。在去除mrna分子(例如，通過(guò)用rna酶h處理)后，使夾板銜接子與該cdna退火。該夾板銜接子用于使夾板分子退火，隨后使用該夾板分子以組合的方式組裝包含sc區(qū)的兩個(gè)或多個(gè)aps(包含代碼sc1-sc3的三個(gè)aps在圖9中示出)，以創(chuàng)建獨(dú)特cob。在一些實(shí)施方案中，用于與靶分子雜交的反向引物包括對(duì)靶核酸分子為特異性的序列識(shí)別區(qū)(圖18)。在一些實(shí)施方案中，該序列識(shí)別區(qū)的長(zhǎng)度為10至20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該序列識(shí)別區(qū)為六聚體(圖19)。在一些實(shí)施方案中，該寡核苷酸探針被設(shè)計(jì)成通過(guò)例如采用聚-t序列識(shí)別區(qū)與普通mrna分子非特異性地雜交(圖17)。在一些實(shí)施方案中，該夾板分子還用于添加一種或多種擴(kuò)增引物和/或測(cè)序引物。在一些實(shí)施方案中，使退火的分子復(fù)合物經(jīng)歷連接，以創(chuàng)建可被擴(kuò)增和測(cè)序的共價(jià)分子組裝體。

圖18示出了采用通用聚-t(或聚-dt)引物序列對(duì)mrna分子進(jìn)行條碼化的方法的非限制性實(shí)例。在將聚-t引物序列添加至細(xì)胞樣品后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，隨后使“夾板”寡核苷酸退火并用于將包含編碼區(qū)sc1-sc3的aps組裝成可采用illumina引物擴(kuò)增和測(cè)序的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼。

圖19示出了采用靶mrna序列特異性引物將mrna分子進(jìn)行條碼化的方法的非限制性實(shí)例，該引物例如

gctccctgtctgacgxxxxxxxxxxx

在將序列特異性引物添加至細(xì)胞樣品后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，隨后使“夾板”寡核苷酸退火并用于將包含編碼區(qū)sc1-sc3的aps組裝成可采用illumina引物擴(kuò)增和測(cè)序的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼。在一些實(shí)施方案中，可在采用illumina引物擴(kuò)增和測(cè)序之前，使用內(nèi)部引物進(jìn)行一輪或多輪巢式pcr擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，六聚體引物，例如

gctccctgtctgacgnnnnnn

用于與靶mrna分子雜交。

在一些實(shí)施方案中，采用鄰近探針組檢測(cè)靶mrna分子，該鄰近探針組的組合物如上所述。通過(guò)創(chuàng)造兩個(gè)序列識(shí)別事件同時(shí)發(fā)生并且彼此緊鄰的要求，一對(duì)鄰近寡核苷酸探針(每一個(gè)均包含與相同靶mrna的非重疊但緊密間隔的序列區(qū)互補(bǔ)的靶標(biāo)識(shí)別序列)的使用提供了減少的非特異性探針雜交和提高的靶標(biāo)檢測(cè)特異性。

圖7示出了用于靶mrna分子(或普通rna分子)檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組(即，uba)的一個(gè)實(shí)施方案，該探針組包含一對(duì)寡核苷酸鄰近探針15和19，每個(gè)探針均包含與靶mrna序列互補(bǔ)的序列區(qū)，并且隨后可采用橋寡核苷酸(20)將其接合。該鄰近探針可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)引物序列、表位特異性條碼區(qū)和/或用于采用本公開內(nèi)容的組合物和方法創(chuàng)建獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的共同連接體區(qū)。將鄰近探針組添加至已固定并透化的細(xì)胞樣品，使該探針與靶mrna分子退火，隨后將其連接以創(chuàng)建含有表位特異性條碼(即靶標(biāo)特異性條碼)和允許擴(kuò)增整個(gè)復(fù)合物的引物的分子復(fù)合物。可沖洗掉未結(jié)合的探針?lè)肿?，并且可采用上述裂?合并合成法對(duì)樣品的個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行條碼化。在細(xì)胞條碼化程序之后，采用pcr擴(kuò)增或其他任何合適的核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增包含uba-esb-cop的分子復(fù)合物，并進(jìn)行測(cè)序，以基于個(gè)體細(xì)胞來(lái)鑒別和定量哪些mrna分子存在于樣品中。

圖8示出了使用鄰近探針組來(lái)用獨(dú)特cob對(duì)特定靶mrna分子進(jìn)行條碼化的另一實(shí)施方案。在該實(shí)施方案中，如圖7的實(shí)例所示，安排引物和共同連接體的位置，使得cob附接至探針復(fù)合物的3’端而不是5’端。

圖10示出了用于靶mrna分子檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組的另一實(shí)施方案，除了兩個(gè)鄰近探針序列之外，其還采用兩個(gè)夾板分子和橋寡核苷酸。每個(gè)夾板分子均包含與一個(gè)鄰近探針互補(bǔ)的序列區(qū)，以及與橋寡核苷酸的一部分互補(bǔ)的序列區(qū)。在該實(shí)例中，表位特異性條碼被rna特異性代碼(rsc)區(qū)替代，兩個(gè)鄰近探針上各一個(gè)，該rna特異性代碼區(qū)包含用于鑒別被鄰近探針識(shí)別的mrna序列的7核苷酸代碼。該鄰近探針可進(jìn)一步包含用于擴(kuò)增和測(cè)序的引物序列。每個(gè)鄰近探針還可包含用于測(cè)序和擴(kuò)增偏倚校正的短隨機(jī)序列區(qū)。用于創(chuàng)建圖10的鄰近探針組的寡核苷酸序列的實(shí)例在圖11中示出。

圖12示出了用于靶mrna分子檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組的另一實(shí)施方案，其采用單個(gè)組合的夾板-橋寡核苷酸來(lái)接合兩個(gè)鄰近探針。用于創(chuàng)建圖12的鄰近探針組的寡核苷酸序列的非限制性實(shí)例在圖13中示出。

圖14示出了用于靶mrna分子檢測(cè)和條碼化的鄰近探針組的另一實(shí)施方案，其采用單個(gè)組合的夾板-橋寡核苷酸來(lái)接合兩個(gè)鄰近探針。

圖20示出了用于將包含編碼區(qū)sc1–sc3的aps組裝成特定mrna靶分子(或寡核苷酸標(biāo)記的抗體)的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的鄰近探針組和夾板寡核苷酸分子的另一實(shí)例。在該實(shí)例中，一個(gè)鄰近探針?lè)肿?探針2)被延伸以進(jìn)一步包含能夠與探針1的短序列區(qū)雜交的內(nèi)部“橋”寡核苷酸序列，從而縮短了包含在后續(xù)擴(kuò)增和測(cè)序步驟中的靶mrna測(cè)序區(qū)的長(zhǎng)度。

圖22和23示出了用于組裝aps以創(chuàng)建靶mrna分子的獨(dú)特細(xì)胞起源條碼的鄰近探針組(包括可進(jìn)一步包含橋序列和一個(gè)或多個(gè)夾板寡核苷酸分子的靶標(biāo)特異性探針對(duì))的實(shí)例，其中互補(bǔ)序列識(shí)別事件的數(shù)目及其鄰近性要求組合起來(lái)提供提高的靶標(biāo)檢測(cè)特異性。

在一些實(shí)施方案中，本文公開的鄰近探針組可用于在不進(jìn)行額外的細(xì)胞起源條碼化步驟的情況下檢測(cè)特定mrna序列。例如，在一些實(shí)施方案中，可將細(xì)胞樣品裂解以釋放mrna，隨后使樣品與多個(gè)珠子接觸，其中珠子包含能夠例如通過(guò)使用聚-t序列區(qū)而與所釋放的mrna分子雜交的多個(gè)栓系的寡核苷酸序列。在從細(xì)胞樣品中釋放的mrna雜交后，使第一寡核苷酸鄰近探針與所述多個(gè)珠子上所雜交的mrna分子退火，其中第一寡核苷酸鄰近探針包含表位特異性條碼序列和能夠與靶核酸序列的第一區(qū)段雜交的第一靶標(biāo)識(shí)別序列。同時(shí)或隨后，使第二寡核苷酸鄰近探針與珠子上所雜交的mrna分子退火，其中第二寡核苷酸鄰近探針包含能夠與靶核酸序列的第二區(qū)段雜交的第二靶標(biāo)識(shí)別序列，并且其中靶核酸序列的第一和第二區(qū)段是不同的并且彼此相隔指定數(shù)目n個(gè)核苷酸。然后同時(shí)或隨后使橋寡核苷酸與所述多個(gè)珠子上所雜交的寡核苷酸鄰近探針退火，其中該橋寡核苷酸包含兩個(gè)探針識(shí)別序列，其中第一探針識(shí)別序列能夠與第一寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，并且第二探針識(shí)別序列能夠與第二寡核苷酸鄰近探針的區(qū)段雜交，從而創(chuàng)建包含表位特異性條碼的靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，連接退火的組分(即，該寡核苷酸鄰近探針對(duì)和橋寡核苷酸)以創(chuàng)建共價(jià)接合的靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物。在許多實(shí)施方案中，所述多個(gè)栓系的寡核苷酸序列進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)引物序列，例如，擴(kuò)增引物或測(cè)序引物。在一些實(shí)施方案中，采用pcr反應(yīng)以及一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)特異性引物擴(kuò)增該靶標(biāo)特異性探針復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)或定量樣品中一種或多種mrna序列的存在與否。

f.全細(xì)胞與死細(xì)胞、細(xì)胞碎片或細(xì)胞簇之間的區(qū)別

當(dāng)進(jìn)行測(cè)定以鑒別包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的樣品中的個(gè)體細(xì)胞中的多種靶分子時(shí)，可能期望將全細(xì)胞與死細(xì)胞、細(xì)胞碎片或細(xì)胞簇相區(qū)分，使得可將后者的數(shù)據(jù)從后續(xù)分析中排除，從而改善數(shù)據(jù)質(zhì)量。在涉及包含數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞的樣品并且其中每個(gè)細(xì)胞被單獨(dú)條碼化的研究中，細(xì)胞碎片、細(xì)胞雙聯(lián)體或更大的細(xì)胞簇的存在可產(chǎn)生錯(cuò)誤數(shù)據(jù)形式的“噪音”，這指示存在具有其不應(yīng)該具有的標(biāo)志物的細(xì)胞。因此，本公開內(nèi)容的方法、組合物和試劑盒提供了用于將感興趣的單個(gè)細(xì)胞與樣品中存在的死細(xì)胞、細(xì)胞碎片或細(xì)胞簇相區(qū)分的手段。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)每個(gè)“細(xì)胞”的dna與蛋白質(zhì)之比進(jìn)行分析而實(shí)現(xiàn)感興趣的單個(gè)細(xì)胞與樣品中存在的死細(xì)胞、細(xì)胞碎片或細(xì)胞簇之間的區(qū)分。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)每個(gè)“細(xì)胞”所檢測(cè)到的dna的量進(jìn)行分析而實(shí)現(xiàn)感興趣的單個(gè)細(xì)胞與死細(xì)胞、細(xì)胞碎片或細(xì)胞簇之間的區(qū)分。在又一其他實(shí)施方案中，通過(guò)對(duì)每個(gè)“細(xì)胞”所檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的量進(jìn)行分析而實(shí)現(xiàn)區(qū)分。

在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)選擇在為了鑒別特定一組靶分子而選定的uba組中包含針對(duì)基因組dna或染色體dna結(jié)構(gòu)的一種或多種uba，例如結(jié)合劑，包括但不限于結(jié)合dna或組蛋白的抗體，或dna嵌入分子(如小檗堿、溴化乙錠、原黃素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、柔紅霉素或沙利度胺)，來(lái)確定每個(gè)“細(xì)胞”的dna的量。在測(cè)定完成后，從如通過(guò)細(xì)胞起源條碼(cob)鑒別的、針對(duì)每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的dna特異性u(píng)ba-esb復(fù)合物的數(shù)目來(lái)確定每個(gè)“細(xì)胞”的dna的量。在一些實(shí)施方案中，將回收的dna特異性u(píng)ba-esb復(fù)合物的數(shù)目與采用同一組dna導(dǎo)向的uba以及已知濃度的基因組dna或染色體dna在類似溫育條件下生成的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較可能是有用的，從而在dna特異性u(píng)ba與基因組dna或染色體dna結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合化學(xué)計(jì)量不是1:1的情況下校正結(jié)合化學(xué)計(jì)量。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在將細(xì)胞樣品固定并透化之前與針對(duì)基因組dna或染色體dna結(jié)構(gòu)的一種或多種uba進(jìn)行溫育，利用相同的方法來(lái)區(qū)分全細(xì)胞與“死”細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)選擇在為了鑒別特定一組靶分子而選定的uba組中包含非特異性地針對(duì)蛋白質(zhì)的一種或多種uba，例如，包括但不限于胺反應(yīng)性部分，如琥珀酰亞胺酯、磺基琥珀酰亞胺酯、四氟苯基酯、磺基二氯苯酚酯、異硫氰酸酯或磺酰氯，或特異性針對(duì)常見蛋白質(zhì)的一種或多種uba，例如，針對(duì)肌動(dòng)蛋白或其他管家蛋白質(zhì)的抗體，來(lái)確定每個(gè)“細(xì)胞”的蛋白質(zhì)的量。在測(cè)定完成后，從如通過(guò)細(xì)胞起源條碼(cob)鑒別的、針對(duì)每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的非特異性蛋白質(zhì)uba-esb復(fù)合物的數(shù)目來(lái)確定每個(gè)“細(xì)胞”的蛋白質(zhì)的量。在一些實(shí)施方案中，將回收的非特異性蛋白質(zhì)uba-esb復(fù)合物(或在使用針對(duì)肌動(dòng)蛋白或其他管家蛋白質(zhì)的抗體的情況下，為特異性蛋白質(zhì)uba-esb復(fù)合物)的數(shù)目與采用同一組蛋白質(zhì)導(dǎo)向的uba以及已知濃度的蛋白質(zhì)在類似溫育條件下生成的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較可能是有用的，從而在非特異性蛋白質(zhì)uba與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合化學(xué)計(jì)量不是1:1的情況下校正結(jié)合化學(xué)計(jì)量?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，給定蛋白質(zhì)或一組蛋白質(zhì)的表面上可接近的胺基團(tuán)的平均數(shù)目根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算，隨后用于根據(jù)為每個(gè)細(xì)胞回收的非特異性蛋白質(zhì)uba-esb復(fù)合物的數(shù)目來(lái)確定每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)的量。

g.用于鑒別罕見細(xì)胞的方法

當(dāng)進(jìn)行測(cè)定以鑒別包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的樣品中的個(gè)體細(xì)胞中的多種靶分子時(shí)，常常期望鑒別該復(fù)雜混合物內(nèi)的特定細(xì)胞亞群并將后續(xù)分析集中于該亞群，從而提高數(shù)據(jù)的特異性。在涉及包含數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞的樣品并且其中每個(gè)細(xì)胞被單獨(dú)條碼化的研究中，罕見細(xì)胞的存在可構(gòu)成總細(xì)胞群體的低達(dá)0.01％。因此，本公開內(nèi)容的方法、組合物和試劑盒提供了用于將感興趣的細(xì)胞亞組與樣品中存在的大多數(shù)細(xì)胞相區(qū)分的手段。

在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)在為了鑒別特定一組靶分子而選定的uba組中包含針對(duì)特定細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)志物的一種或多種uba，包括但不限于，設(shè)計(jì)成與病毒基因組序列例如hiv病毒序列雜交的寡核苷酸探針序列，或抗cd1、cd3、cd8或cd4的抗體，來(lái)鑒別特定的細(xì)胞亞組。通過(guò)對(duì)附接至用于鑒別細(xì)胞亞群的uba-esb復(fù)合物的那些cob進(jìn)行選擇性擴(kuò)增和測(cè)序，從而生成符合用于限定該亞群的選擇標(biāo)準(zhǔn)的所有細(xì)胞的列表(如通過(guò)其各自的cob鑒別的)，來(lái)將后續(xù)分析限制于選定的細(xì)胞亞群。

可采用選定的細(xì)胞亞群的cob列表來(lái)確定與該亞群相關(guān)的其他uba-esb的完整列表。在一些實(shí)施方案中，使用該cob列表來(lái)設(shè)計(jì)引物組，例如，在使用4個(gè)aps(均包含sc)構(gòu)建cob的情況下的4組引物(參見圖24)，以進(jìn)行一組嵌套的多重pcr輪次。從距uba最遠(yuǎn)的aps位置(或uba將附接的esb-cob綴合物的末端)開始，將第一組引物設(shè)計(jì)成與在第一組(最外側(cè))aps的sc的側(cè)翼，即，在aps1位置的sc1序列組的側(cè)翼的退火區(qū)雜交，第二組引物與序列的aps2–aps1組互補(bǔ)，第三組引物與序列的aps3–aps2–aps1組互補(bǔ)，而第四組引物與序列的aps4–aps3–aps2–aps1組互補(bǔ)。在每一步中，采用與位于esb遠(yuǎn)側(cè)的引物序列互補(bǔ)的第二引物，例如，illumina引物序列，使用若干輪pcr選擇性地?cái)U(kuò)增cob集合的亞組。因此，用每個(gè)引物組連續(xù)進(jìn)行若干輪pcr擴(kuò)增將僅選擇性地?cái)U(kuò)增感興趣的表位特異性條碼-細(xì)胞起源條碼綴合物，即與選定細(xì)胞亞群相關(guān)的表位特異性條碼。在一些實(shí)施方案中，退火步驟包括進(jìn)行從98℃起的緩慢降溫，以允許“最佳”引物找到正確的互補(bǔ)鏈。在一些實(shí)施方案中，選擇所使用的聚合酶和連接酶以使同源雙鏈體形成最大化。在一些實(shí)施方案中，該退火步驟之后是用核酸酶例如ecor1的處理，該核酸酶在進(jìn)行下一擴(kuò)增循環(huán)之前于合適的測(cè)定條件下切割同源雙鏈體dna，從而去除由模板驅(qū)動(dòng)的偶然退火事件。采用任一種本領(lǐng)域已知的測(cè)序方法或系統(tǒng)對(duì)所得pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，或隨后進(jìn)行序列特異性定量pcr，允許鑒別哪些靶分子存在于選定細(xì)胞亞群的個(gè)體細(xì)胞內(nèi)。

h.用于從進(jìn)一步的分析中過(guò)濾出選定細(xì)胞亞群的方法

當(dāng)進(jìn)行測(cè)定以鑒別包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的樣品中的個(gè)體細(xì)胞中的多種靶分子時(shí)，常常期望過(guò)濾出該復(fù)雜混合物內(nèi)的特定細(xì)胞亞群并將后續(xù)分析集中于剩余細(xì)胞，從而提高數(shù)據(jù)的特異性。例如，在一些應(yīng)用中，可能期望鑒別細(xì)胞群體中的成熟b細(xì)胞(采用針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物如cd19、cd38、bcma等的抗體)并將其從進(jìn)一步的考慮中除去，使得后續(xù)分析可集中在存在的任何干細(xì)胞上。因此，本公開內(nèi)容的方法、組合物和試劑盒還可提供用于將特定的細(xì)胞群體從進(jìn)一步的分析中除去的手段。在一些實(shí)施方案中，這通過(guò)用相同esb標(biāo)記多個(gè)uba(例如，一組抗體)而實(shí)現(xiàn)，使得在該測(cè)定的結(jié)合步驟后，指定uba組的esb-cob綴合物的選擇性擴(kuò)增和測(cè)序提供有待從進(jìn)一步的分析中排除的細(xì)胞列表。選擇性擴(kuò)增和測(cè)序可如上所述進(jìn)行。

i.用于檢測(cè)選定細(xì)胞亞群中的其他靶分子的重新取樣

當(dāng)進(jìn)行測(cè)定以鑒別包含復(fù)雜細(xì)胞混合物的樣品中的個(gè)體細(xì)胞中的多種靶分子時(shí)，常常期望對(duì)條碼化的細(xì)胞懸浮液重新取樣，以確定選定亞群中是否還存在其他靶分子。因此，本公開內(nèi)容的方法、組合物和試劑盒還提供用于在進(jìn)行初始細(xì)胞條碼化程序之后的時(shí)間點(diǎn)重新取樣以檢測(cè)一種或多種感興趣的靶分子的手段。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在用于進(jìn)行初始細(xì)胞條碼化的原始uba組中包含非特異性地針對(duì)蛋白質(zhì)的一種或多種uba，例如，包括但不限于胺反應(yīng)性部分如琥珀酰亞胺酯、磺基琥珀酰亞胺酯、四氟苯基酯、磺基二氯苯酚酯、異硫氰酸酯或磺酰氯，來(lái)實(shí)現(xiàn)條碼化細(xì)胞懸浮液的個(gè)體細(xì)胞中一種或多種感興趣的靶分子的檢測(cè)。在如上所述進(jìn)行選擇性擴(kuò)增和測(cè)序以獲得與選定亞群的細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞起源條碼列表后，將條碼化細(xì)胞懸浮液的等份裂解并與包含例如針對(duì)一種感興趣的其他靶分子的固定化抗體和栓系的二級(jí)引物(圖25)的珠子一起溫育，該二級(jí)引物包含用于鑒別固定在給定珠子上的抗體的、引物序列下游的代碼序列?？墒褂枚鄠€(gè)珠子，其中所述多個(gè)珠子包含例如針對(duì)多種靶分子的固定化抗體，以及其相應(yīng)的二級(jí)引物，并且其中任何單個(gè)珠子均包含單一類型的固定化抗體。在靶分子(例如，靶蛋白)的免疫沉淀后，采用合適的聚合酶，例如，taqdna聚合酶、klenowdna聚合酶i等進(jìn)行二級(jí)引物延伸反應(yīng)，隨后擴(kuò)增以生成包含抗體代碼序列和細(xì)胞起源條碼序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，細(xì)胞起源條碼與針對(duì)感興趣的選定亞群鑒別的cob列表的比較允許在個(gè)體細(xì)胞的基礎(chǔ)上鑒別和定量選定亞群中感興趣的其他靶分子的存在。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在細(xì)胞條碼化步驟中使用針對(duì)普通mrna分子的非特異性u(píng)ba，例如包含聚-t(或聚-dt)序列的uba，并使用包含對(duì)感興趣mrna分子為特異性的固定化寡核苷酸探針的一組珠子以及固定化的二級(jí)引物，利用類似的方法檢測(cè)選定細(xì)胞亞群中感興趣的mrna分子。

v.試劑盒

本公開內(nèi)容還描述了用于對(duì)分子和細(xì)胞進(jìn)行條碼化的試劑盒，其中該試劑盒包含如上所述的一種或多種組合物。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可包含一種或多種靶標(biāo)特異性u(píng)ba-esb復(fù)合物，或用于將預(yù)合成的esb附接至用戶提供的uba的試劑。在一些實(shí)施方案中，本文公開的試劑盒的uba包含一種或多種抗體，其可進(jìn)一步包含編碼相關(guān)聯(lián)抗體的身份的附接的esb。在一些實(shí)施方案中，本文公開的試劑盒的uba包含設(shè)計(jì)成與選定的核酸靶標(biāo)雜交的一種或多種寡核苷酸探針，并且其可進(jìn)一步包含編碼相關(guān)聯(lián)靶探針的身份的附接的esb。在一些實(shí)施方案中，所公開的試劑盒可額外包含或作為獨(dú)立產(chǎn)品而包含aps組以及將該aps組組裝成細(xì)胞起源條碼可能需要的任何其他酶或試劑。在一些實(shí)施方案中，該aps組包含設(shè)計(jì)用于在分析的測(cè)序步驟提供錯(cuò)誤檢測(cè)和校正能力的成組子代碼區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所公開的試劑盒可額外包含或作為獨(dú)立產(chǎn)品包含用于選擇性地?cái)U(kuò)增選定細(xì)胞亞群的表位特異性條碼的引物組。

vi.應(yīng)用

本文公開的組合物、方法和試劑盒可用于診斷、預(yù)后、治療、患者分類、藥物開發(fā)、治療選擇和篩選目的。所公開的組合物、方法和試劑盒提供了可在單細(xì)胞水平上從單個(gè)生物樣品中一次分析許多不同靶分子的優(yōu)勢(shì)。例如，這使得若干個(gè)診斷試驗(yàn)?zāi)軌蛟谝粋€(gè)樣品上進(jìn)行。

應(yīng)用的實(shí)例包括但不限于：生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、藥物發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)驗(yàn)證、基因表達(dá)譜分析、蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析、蛋白質(zhì)組分析、代謝組學(xué)研究、翻譯后修飾研究(例如，用于監(jiān)測(cè)糖基化、磷酸化、乙?；捌渌被嵝揎?、藥代動(dòng)力學(xué)研究(例如，藥物代謝、adme譜分析和毒性研究)、特異性血清或粘膜抗體水平的分析；非核酸診斷指示物的評(píng)價(jià)、病原體檢測(cè)、外來(lái)抗原檢測(cè)，等等。

vii.計(jì)算機(jī)軟件

本文還公開了存儲(chǔ)在非暫時(shí)性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的計(jì)算機(jī)軟件包，其提供了對(duì)從表位特異性條碼-細(xì)胞起源條碼綴合物組獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行解碼和分組的分析能力。由這類軟件包提供的能力的實(shí)例包括序列比對(duì)和比較工具、分層聚類工具、擴(kuò)增和/或測(cè)序錯(cuò)誤檢測(cè)和校正工具、數(shù)據(jù)可視化工具等。

雖然本文已經(jīng)顯示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見的是，此類實(shí)施方案僅通過(guò)舉例的方式提供。在不偏離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)將想到眾多更改、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中可采用本文所述的本發(fā)明實(shí)施方案的各種替代方案。以下權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，從而涵蓋這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等效方案。