本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種診斷去勢抵抗性前列腺癌試劑盒。

背景技術(shù)：

雄激素受體(ar)屬于調(diào)節(jié)類固醇激素作用的核轉(zhuǎn)錄因子家族。其能與配體形成復(fù)合體，綁定到基因組中的一個(gè)招募基本的轉(zhuǎn)錄裝置和共調(diào)節(jié)劑的平臺---雄激素反應(yīng)元件(ares)。其中的共調(diào)節(jié)蛋白能夠起到ar的激活劑或抑制劑的作用，它們的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致前列腺癌的進(jìn)展。已有一些研究已經(jīng)報(bào)道過ar能夠抑制一些基因，且間接的說明了一些涉及抑制輔助因子蛋白的機(jī)制，而直接機(jī)制是通過綁定到他們的調(diào)節(jié)元件區(qū)包括are基序一致的部分，通過多硫蛋白ezh2調(diào)節(jié)的。但是ar是怎樣抑制基因的表達(dá)還不是十分清楚。

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一，其仍然是男性的第二死亡原因。ar信號通路在前列腺癌的起源和進(jìn)展中起重要作用。因此雄激素剝奪治療，例如阿比特龍和恩雜魯胺，是進(jìn)展性前列腺癌(adpc)的主要治療方式。然而，這些治療雖然開始時(shí)起到使疾病退化的作用，但通常，進(jìn)展性前列腺最終會(huì)發(fā)展成去勢抵抗性前列腺癌(crpc)，這就需要一種新的方法去阻遏ar信號通路，阻止crpc的進(jìn)展。

yap(yes－associatedprotein)一種細(xì)胞內(nèi)連接蛋白，是hippo信號通路中的核心元素，參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并對其下游靶因子的轉(zhuǎn)錄共激活的過程，調(diào)控細(xì)胞增生和凋亡間的平衡，從而保證組織器官的正常大小及機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在正常細(xì)胞中yap因被磷酸化，從而滯留胞質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致增殖抑制、從而促進(jìn)凋亡，產(chǎn)生接觸性抑制。近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道，在人類腫瘤中yap蛋白表達(dá)增高且出現(xiàn)在細(xì)胞核中yap增多，如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、宮頸癌、惡性膠質(zhì)瘤等。說明了yap在腫瘤中起重要作用。此外，已有一些研究提示yap在調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞方面有重要作用，當(dāng)然，yap在腫瘤中的具體作用還有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。此外，yap在控制生長以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞和祖細(xì)胞有關(guān)。在上皮中，yap調(diào)節(jié)對干細(xì)胞和祖細(xì)胞的行為具有不同的影響。在小鼠肝臟中，yap的表達(dá)導(dǎo)致祖細(xì)胞標(biāo)記基因(ck19,sox9和a6)表達(dá)，且yap激活導(dǎo)致去分化單個(gè)成體干細(xì)胞。出人意料的是yap過表達(dá)導(dǎo)致小腸丟失干細(xì)胞而不是獲得干細(xì)胞。然而，yap在干細(xì)胞中的精確功能還并不十分清楚。

關(guān)于yap與去勢抵抗型前列腺癌的關(guān)系及其機(jī)制的研究還鮮有報(bào)道。前列腺癌病人經(jīng)過藥物去勢治療后，平均18個(gè)月進(jìn)展為去勢抵抗型前列腺癌，對任何內(nèi)分泌治療不敏感，使患者失去治療的機(jī)會(huì)。去勢抵抗性前列腺癌發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，一般可分為神經(jīng)內(nèi)分泌、干細(xì)胞，雄激素受體陽性等亞型。目前，尚沒有明確的診斷指標(biāo)預(yù)測和診斷去勢抵抗性前列腺癌干細(xì)胞亞型。本發(fā)明通過臨床數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來研究yap與去勢抵抗型前列腺癌之間的關(guān)系，本發(fā)明的成果可以為臨床診斷去勢抵抗型前列腺癌提供新的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種診斷去勢抵抗性前列腺癌試劑盒。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種診斷去勢抵抗性前列腺癌試劑盒，包括：yap抗體、二甲苯、乙醇、3％h2o2溶液、1％bsa封閉液、dab顯色試劑、蘇木素、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠igg、0.01m的ph＝6.0檸檬酸鹽緩沖液和0.01mpbs。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的試劑盒能特異性的對去勢抵抗性前列腺癌進(jìn)行診斷，靈敏度高，特異性強(qiáng)，成本低。基于yap蛋白的表達(dá)量與去勢抵抗性前列腺癌的相關(guān)性，以該蛋白作為分子標(biāo)記對其表達(dá)量進(jìn)行檢測可以診斷前列腺癌中較難區(qū)分的ar低表達(dá)的去勢抵抗性前列腺癌。

附圖說明

圖1敲減yap蛋白能夠有效抑制前列腺癌c4-2細(xì)胞的侵襲生長。

圖2敲減yap蛋白能夠抑制前列腺癌干細(xì)胞球的生長.

圖3前列腺癌病例評分+，無轉(zhuǎn)移生長。

圖4前列腺癌病例，結(jié)合臨床psa及病理診斷為去勢抵抗性前列腺癌，評分+++.有骨轉(zhuǎn)移，前列腺包膜外浸潤生長，去勢治療8個(gè)月后死亡。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施作詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

所述yap抗體為商品化抗體，制備方法參見文獻(xiàn)：

yokoyamawm,etal.2001.productionofmonoclonalantibodies.currentprotocolsinimmunology.74:2.5.1-2.5.25.)相應(yīng)的，利用特異性抗yap蛋白的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體。

實(shí)施例1

一種診斷去勢抵抗性前列腺癌試劑盒，包括：yap抗體、二甲苯、乙醇、3％h2o2溶液、1％bsa封閉液、dab顯色試劑、蘇木素、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠igg、0.01m的ph＝6.0檸檬酸鹽緩沖液和0.01mpbs。

實(shí)施例2

2×10⁴敲減yap蛋白的c4-2去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞和對照細(xì)胞(正常c4-2細(xì)胞)分別接種于聚碳酸酯膜小室(corning公司產(chǎn)品)的上層，培養(yǎng)24小時(shí)后用結(jié)晶紫將穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞染色后，在顯微鏡下觀察并照相，分別記數(shù)每個(gè)視野穿過聚碳酸酯膜的癌細(xì)胞，求平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比較，敲減yap蛋白的去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞體外遷移能力顯著減少(圖1)，提示yap可能增加去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例3

2×10⁴過表達(dá)yap的c4-2去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞和對照細(xì)胞(正常c4-2細(xì)胞)分別接種混有1640血清培養(yǎng)液的matrigel中，培養(yǎng)一周后用結(jié)晶紫將膠的細(xì)胞染色后，在顯微鏡下觀察并照相，分別記數(shù)每個(gè)視野形成球的癌細(xì)胞，求平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比較，yap高表達(dá)的去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移生長能力顯著增高(圖2)，提示yap可能增加去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例4

隨機(jī)選取15例前列腺癌患者術(shù)后去勢抵抗性前列腺癌組織的石蠟切片使用實(shí)施例1的診斷去勢抵抗性前列腺癌試劑盒驗(yàn)證對去勢抵抗性前列腺癌的診斷：包括如下步驟：

(1)將去勢抵抗性前列腺癌組織石蠟切片，60℃烤箱過夜；

(2)切片脫臘脫水；步驟為：將烤箱過夜石蠟切片于：

二甲苯ⅰ10min→二甲苯ⅱ10min→二甲苯ⅲ10min→100％乙醇5min→95％乙醇5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min→雙蒸水5min(ⅰ代表第一個(gè)容器，ii代表第二個(gè)容器)

(3)3％h2o2溶液，室溫浸泡20min；

(4)雙蒸水洗5min×3；

(5)抗原修復(fù)：切片放入0.01m檸檬酸鹽緩沖液(ph6.0)中煮沸30min；

(6)自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5min×3；

(7)37℃，1％bsa封閉液封閉30min；

(8)甩去所述封閉液，加一抗(yap1抗體，稀釋比例1：200)置入濕盒中4℃冰箱放置16小時(shí)；

(9)室溫復(fù)溫15min，然后0.01mpbs洗5min×4；

(10)滴加二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠igg，購自中國中山金橋公司，即用型，無需稀釋)45min，37℃；

(11)0.01mpbs洗5min×4，dab顯色試劑顯色2-10min，鏡下觀察；

(12)雙蒸水終止顯色，蘇木素復(fù)染10秒；

(13)分化后自來水返藍(lán)，蒸餾水浸泡；

(14)取出，蓋玻片覆蓋；

(15)顯微鏡下觀察陽性染色，分別于癌組織和癌旁組織各隨機(jī)選取3個(gè)視野，拍照；

(16)yap1陽性表達(dá)為細(xì)胞胞膜和(或)胞漿上呈現(xiàn)棕黃色顆粒；采用半定量結(jié)果判斷，分別對鏡下陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評分。①陽性著色細(xì)胞數(shù)：每張切片上觀察5個(gè)高倍視野(×200)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞數(shù)<5％為0分，5％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，76％～100％為4分。②陽性著色強(qiáng)度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。③兩者計(jì)分相乘即為陽性等級：0分為陰性(-)，1-4分為弱陽性(+)，5-8分為陽性(++)，9-12分為強(qiáng)陽性(+++)。

yap高低表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)以評分高于++為yap蛋白高表達(dá)，低于+為yap蛋白低表達(dá)。

結(jié)果：隨機(jī)選取15例前列腺癌標(biāo)本yap免疫組化試劑盒染色，病例1免疫組化評分為+++； 病例2為+；病例3為+；病例3為++；病例4為+++；病例5為+；病例6為+；病例7為+；病例8為++；病例9為+++；病例10為+；病例11為+++；病例12為+；病例13為+；病例14為+；病例15為+，病例中位數(shù)為+。病例1，3,4,8,9,11與病理醫(yī)師診斷一致，均為去勢抵抗型前列腺癌。

實(shí)施例5

樣本：某前列腺癌患者腫瘤的組織切片，采用本發(fā)明的實(shí)施例1的試劑盒，采用實(shí)施例4的檢測方法，檢測yap蛋白在癌組織中的表達(dá)量。癌組織的顯微圖片如圖3所示。經(jīng)計(jì)算，該組織的評分+，低表達(dá)。結(jié)合臨床psa和病理分級診斷為前列腺癌i期，未發(fā)生精囊及包膜外浸潤和遠(yuǎn)處骨轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例6

樣本：某前列腺癌患者腫瘤的組織切片，采用本發(fā)明的實(shí)施例1的試劑盒，采用實(shí)施例4的檢測方法，檢測yap蛋白在癌組織中的表達(dá)量，癌組織的顯微圖片如圖4所示。經(jīng)計(jì)算，該組織的評分++，診斷為去勢抵抗性前列腺癌(結(jié)合臨床psa，并為病理醫(yī)師確認(rèn))。

由以上試驗(yàn)結(jié)果可知，采用本發(fā)明的試劑盒能幫助診斷去勢抵抗性前列腺癌。當(dāng)免疫組化評分高于+時(shí)，去勢抵抗性前列腺癌可能性高。顯然，yap蛋白與去勢抵抗性前列腺癌的轉(zhuǎn)移潛能具有相關(guān)性，因此，以yap蛋白作為蛋白質(zhì)分子標(biāo)記對其表達(dá)量進(jìn)行檢測能幫助診斷去勢抵抗性前列腺癌。相應(yīng)的，特異性抗yap蛋白的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，能用于制備診斷去勢抵抗性前列腺癌試劑盒。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。