本發(fā)明涉及的是生物分析技術和醫(yī)學檢驗領域，具體涉及一種測定過氧化物酶活性的電泳滴定方法。
背景技術：
酶分析在臨床醫(yī)藥學(abraham,e.c.；huff,t.a.；cope,n.d.；wilson,j.b.；bramsomeelisa,,e.d.jr.；huisman,t.h.j.diabetes1978,27,931–937.)生物學(tannu,n.s.；hemby,s.e.natureprotocols2006,1,1732-1942.)和藥物篩選(li,juan；wu,ling-jie；guo,shan-shan；fu,hua-e；chen,guo-nan；yang,huang-hao,nanoscale,2013,5,619-623.)領域中有著重要的作用。傳統(tǒng)檢測方法一般基于檢測酶反應體系中底物減少和產(chǎn)物生成來進行催化速率，活性，米氏常數(shù)的測定。目前已有很多方法可以用于酶檢測，例如質(zhì)譜(northen,tr；lee,jc；hoang,l；raymond,j；hwang,dr；yannone,sm；wong,ch；siuzdak,g,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2008,105,3678-3683.),電泳electrophoresis(yfchen,llxu,wwzhao,lpguo,lyang,anal.chem.,2012,84,2961-2967.),液相色譜(lahoz,a；donato,mt；castell,jv；gomez-lechon,mj,currentdrugmetabolism,2008,9,12-19.)和電化學方法(bernhardt,paulv.chem.com.,2011,47,1663-1673.)以及酶聯(lián)免疫檢測elisa(ciaccafava,a；infossi,p；ilbert,m；guiral,m；lecomte,s；giudici-orticoni,mt；lojou,e,angewandtechemie-internationaledition,2012,51,953-956.)。
過氧化物酶是一類氧化還原酶,能催化很多反應。過氧化物酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于細胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。而對于過氧化物酶的測定，常用的方法是用三甲基聯(lián)苯胺作為氫離子供體通過比色法測定辣根過氧化物酶的活性(volkerherzoga；h.dariushfahimia,analyticalbiochemistry,october1973,554–562.)，也有以對氨基苯酚為底物通過測定反應前后電導率變化來測定過氧化物酶的電化學方法(weisuna；kuijiao,analyticachimicaacta,434,2001,43–50.)。以上這些方法有很多優(yōu)點，但是同時面臨一些不足，例如通量低，成本高以及樣品消耗量大等等。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明提供了一種電泳滴定方法(movingreactionboundaryelectrophoresistitration,mrbet)，具體為一種測定過氧化物酶活性的電泳滴定方法。本發(fā)明進行了創(chuàng)新性的理論和技術發(fā)展，成功實現(xiàn)了過氧化物酶活性的測定。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
本發(fā)明涉及一種測定過氧化物酶活性的電泳滴定方法，所述方法包括以下步驟：
a、將芯片的通道部分灌滿凝膠，陽極池中注入鹽酸溶液與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液a，陰極池中注入化學發(fā)光底液與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液b；
b、將過氧化物酶溶液注入陰極池中，使之催化化學發(fā)光底液反應生成激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*；
c、酶催化反應穩(wěn)定后，施加電場，使陰極池中生成的激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*與陽極池中的氫離子h+形成mrb,生成的mrb移向陽極；
d、根據(jù)mrb移動速率與過氧化物酶活性存在的函數(shù)關系，測得過氧化物酶活性指標。
優(yōu)選地，步驟a中，所述凝膠為瓊脂糖凝膠，質(zhì)量分數(shù)為1％～2％。
優(yōu)選地，步驟a中，所述凝膠中含有背景電解質(zhì)溶液。
優(yōu)選地，步驟a中，所述背景電解質(zhì)溶液為離子強度為20mmol/l～250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀溶液。
優(yōu)選地，所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強度與混合溶液a離子強度相同。
優(yōu)選地，所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強度與陰極池中背景電解質(zhì)溶液的離子強度相同。
步驟a中，陽極池中的電解液是鹽酸和離子強度為20mmol/l～250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀混合溶液，所述陽極池中的電解液的離子強度和凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強度相同；所述步驟b中，陰極池中的電解液為離子強度為20mmol/l～250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀溶液，所述陰極池中的電解液的離子強度和所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強度相同。
優(yōu)選地，步驟c中，所述施加的電場為10v/mm～15v/mm。
優(yōu)選地，步驟d中，所述過氧化物酶活性指標包括酶活性，酶促反應速率，最大反應速率，催化常數(shù)。
優(yōu)選地，所述酶活性的計算方程式為：
所述酶的比活性的計算方程式為：
所述酶促反應速率計算方程式為：
所述最大反應速率和米氏常數(shù)的計算方程式為：
調(diào)整底物h2o2的濃度，根據(jù)不同底物濃度情況下測出vmrb，可以得到vmax與km。
所述催化常數(shù)計算方程式為：
其中，上述方程式中，cl*和vl*分別是激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s),ch+和vh+分別是氫離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s)；vmrb,為mrb的移動速率(m/s)；ven和δten分別是酶催化反應體系的溶液體積(ml)和酶促反應時間(s)；cen是陰極池中酶促反應池中的酶濃度(mg/ml)δt是施加電場時間(s)；cl,cu是底物的和瞬時濃度(mg/ml)；[et]是酶的濃度(mg/ml)。
所述mrbet中函數(shù)推導過程如下：
mrb移動速率為：
l1是t1時間mrb移動的距離，l2是t2時間mrb移動的距離。t1為第一次施加電場的時間，t2為第二次施加電場的的時間。
由激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*與氫離子h+形成的mrb移動速率為：
其中cl*andvl*分別是激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s),ch+和vh+分別是氫離子的濃度(mol/l)和遷移速率(m/s)。所以，激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子的濃度可以被簡單地表示成：
假設經(jīng)過酶促反應所有的底物(魯米諾)都轉(zhuǎn)化生成了產(chǎn)物(激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*),那么酶促反應池中底物濃度可以表示成：
cl,in和cl,cu分別是底物(魯米諾)的初始濃度和瞬時濃度。
根據(jù)酶活性的定義(1u＝1μmol/min),可以得到以下酶活性表達式：
將表達式(4)代入(5)，得到：
ven和δten分別是陰極池中酶催化反應體系的溶液體積和酶促反應時間。因此，酶的比活性可以表示為：
其中，cen指的是陰極池中酶促反應池中的酶濃度(mg/ml)。
酶促反應速率vrate被定義為
δt是酶催化反應時間(s)；δc是底物濃度變化。
將表達式(3)代入表達式(8)中,式(3)中的cl*對應式(8)中的δc，可以得到
在表達式(9)中,mrb移動速率可以從表達式(1)獲得。
在酶促動力學中，米氏方程如下：
vrate是酶促反應速率，km是米氏常數(shù),vmax是最大酶促反應速率,[h2o2]是底物h2o2的濃度.將表達式(9)代入表達式(10),可以得到：
由于在反應中，
在酶反應體系中，米氏方程可以表示為：
將表達式(9)以及[h2o2]＝2cl,cu代入表達式(13),可以得到
調(diào)整底物h2o2的濃度，根據(jù)不同底物濃度情況下測出vmrb，可以得到vmax與km。
且根據(jù)：
vmax＝kcat[et](15)
此處,[et]是反應體系中酶的總濃度(mg/ml)，結(jié)合表達式(14)和(15)，可以得到：
表達式(16)是酶催化常數(shù)通過移動反應界面計算的表達式。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
1、該方法能夠有效地檢測過各種過氧化物酶的活性；
2、該方法速度快，滴定過程能在20秒內(nèi)完成；
3、該方法僅需要暗室環(huán)境下可視化，無需復雜光學檢測儀器設備。
附圖說明
通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：
圖1為本發(fā)明的mrbet示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
實施例1
在本實施例中，采用電泳滴定方法測定辣根過氧化物酶活性，所述的電泳滴定方法如圖1所示。首先將芯片的通道部分灌滿凝膠,陽極池中注入鹽酸溶液與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液a，陰極池中注入化學發(fā)光底液與與背景電解質(zhì)溶液的混合溶液b；然后立即將辣根過氧化酶溶液注入陰極池中，使之催化化學發(fā)光底液反應生成發(fā)出藍色熒光的激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*；酶催化反應穩(wěn)定一段時間后后，施加電壓，使得陰極池中生成的激發(fā)態(tài)魯米諾陰離子l*向陽極移動并與陽極池中向陰極方向移動的氫離子h+形成mrb,mrb移向陽極；滴定時，藍色熒光即標示了界面的位置，可進行可視化觀測；之后，利用mrb界面移動速率與魯米諾濃度之間的關系，根據(jù)一系列推導公式，可以計算得出酶促反應速率，辣根過氧化物酶的酶活性，米氏常數(shù)，最大酶促反應速率，催化常數(shù)。
所述mrb界面移動速率與魯米諾濃度之間的關系為
l1是t1時間mrb移動的距離，l2是t2時間mrb移動的距離。t1為第一次施加電場的時間，t2為第二次施加電場的的時間。
所述酶活性的計算公式為：
venandδten分別是酶催化反應體系的溶液體積和酶促反應時間。
所述酶的比活性計算公式為：
cen指的是酶促反應池中的酶濃度(mg/ml)。
所述酶促反應速率計算公式為：
改變底物過氧化氫濃度，得出不同條件下mrb界面移動速率。
按照表達式(3)計算得出不同底物濃度條件下激發(fā)態(tài)魯米諾的濃度。
將計算得出的不同底物濃度條件下激發(fā)態(tài)魯米諾的濃度帶入表達式(13)中，可以得到最大酶促反應速率與米氏常數(shù)的關系式：
調(diào)整底物h2o2的濃度，根據(jù)不同底物濃度情況下測出vmrb，可以得到vmax與km。
又由以下公式,
vmax＝kcat[et](15)
[et]表示酶的濃度。因此，結(jié)合表達式(14)和(15)，得到酶的催化常數(shù)kcat，
所述mrbet滴定中采用的凝膠為瓊脂糖凝膠，重量分數(shù)為1％～2％。
所述凝膠中含有背景電解質(zhì)溶液。
所述背景電解質(zhì)溶液為離子強度從20mmol/l到250mmol/l的氯化鈉或者氯化鉀溶液。
所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強度與混合溶液a離子強度相同。
所述凝膠中的背景電解質(zhì)溶液的離子強度與陰極池中背景電解質(zhì)溶液的離子強度相同。
本實施例測得的辣根過氧化物酶活性指標結(jié)果為：最大反應速率：3.1×10-4mm/s；米氏常數(shù)：3.15×10-4，催化常數(shù)：619。
本實施例的辣根過氧化物酶活性采用傳統(tǒng)的熒光酶標儀方法進行測定，其結(jié)果為：最大反應速率：3.15×10-4mm/s；米氏常數(shù)：3.09×10-4，催化常數(shù)：615。與本實施例測定的結(jié)果一致，說明本發(fā)明方法的可靠性。
綜上所述，本發(fā)明所述的測定過氧化物酶活性的電泳滴定方法，能夠有效地檢測過各種過氧化物酶的活性；該方法速度快，滴定過程能在20秒內(nèi)完成；該方法僅需要暗室環(huán)境下可視化，無需復雜光學檢測儀器設備。
以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。