本發(fā)明涉及一種基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法，具體涉及一種磁珠分離技術(shù)聯(lián)合核酸適體特異性捕集和自催化作用比色檢測(cè)癌胚抗原的試劑盒，屬于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

癌癥是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的頑癥之一，其嚴(yán)重威脅人類的身體健康，隨著人類生存環(huán)境的惡化，這種威脅呈上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，早期癌癥的治愈率可達(dá)80％，但大多數(shù)惡性腫瘤在疾病早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，且臨床上傳統(tǒng)的診斷方法如影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)檢查等方法靈敏度不夠高，再者在醫(yī)療資源匱乏的地區(qū)精密診斷儀器尚難以普及，故大多數(shù)癌癥患者確診時(shí)已為中晚期，只有約10％的病人具有手術(shù)切除的條件，難以挽救更多人的生命。因此，惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和治療仍是迄今為止治療惡性腫瘤最為有效的手段之一，而癌癥的早期診斷最新、最有效的方法是通過(guò)血液檢查，尋找腫瘤標(biāo)志物。

腫瘤標(biāo)志物是指在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的或是由機(jī)體對(duì)腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生或升高的反應(yīng)腫瘤存在或者生長(zhǎng)的一類物質(zhì)，包括胚胎抗原類、糖鏈抗原類、激素、酶、蛋白質(zhì)類及基因類標(biāo)志物等，這一類物質(zhì)通常不存在于正常成人組織而見于胚胎組織，或者腫瘤組織中的含量超過(guò)正常組織的含量。在臨床檢驗(yàn)工作中，腫瘤標(biāo)志物的血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)本易獲得，方法簡(jiǎn)單快捷，無(wú)創(chuàng)，已經(jīng)廣泛用于腫瘤的診斷，判斷癌癥的分期評(píng)價(jià)治療的方案和判斷預(yù)后。

癌胚抗原(cea)是大腸癌組織產(chǎn)生的一種糖蛋白，能反映人體的多種腫瘤的存在，是一類廣譜性腫瘤標(biāo)志物，正常人血清中癌胚抗原的含量極低，癌胚抗原升高主要見于結(jié)腸癌，其對(duì)于胰腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤診斷也具有重要價(jià)值。目前檢測(cè)血清中cea含量主要采用免疫學(xué)方法，如放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶免疫分析法等，均依據(jù)癌胚抗原與其抗體的免疫反應(yīng)。而優(yōu)質(zhì)抗體需由免疫動(dòng)物獲得，費(fèi)時(shí)，成本較高，且易受動(dòng)物機(jī)體狀態(tài)及抗體純化技術(shù)的影響，不同批次的抗體在特異性和性能方面常存在較大的差異而影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。再者，化學(xué)發(fā)光免疫分析法靈敏度高但儀器昂貴，放射免疫分析還存在同位素危害，不利于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的普及使用。目前酶免疫分析法試劑盒應(yīng)用較為廣泛，此類方法結(jié)果判讀依據(jù)酶催化底物顯色，需要先將抗原或抗體與酶結(jié)合制備酶標(biāo)試 劑。酶標(biāo)記過(guò)程繁復(fù)，且酶活性易受溫度等因素的影響，呈溶液狀態(tài)的酶標(biāo)試劑的保質(zhì)期會(huì)嚴(yán)重縮短，故抗體質(zhì)量、酶標(biāo)記技術(shù)及低溫保存條件成為影響酶免疫分析法試劑盒準(zhǔn)確性的重要因素。

核酸適體是一段由堿基組成的單鏈寡核苷酸片段，通過(guò)篩選得到的適體不僅具有類似抗體對(duì)目標(biāo)分子高特異性，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易合成，反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，而且人工合成的核酸適體不依賴于動(dòng)物免疫，相對(duì)抗體而言，適體的穩(wěn)定性和環(huán)境耐受性更好，檢驗(yàn)的成本更低。目前，就適體在血樣腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)分析中的應(yīng)用已取得了重要的進(jìn)展，主要集中在電化學(xué)分析法，熒光分析法，電化學(xué)發(fā)光分析法等，表面增強(qiáng)羅曼散射法，表面增強(qiáng)等離子共振法等，方法在靈敏度、選擇性等方面都有很大改進(jìn)，但仍對(duì)檢測(cè)儀器，實(shí)驗(yàn)技術(shù)有較高的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，包括：

第一適體由核苷酸序列如seqidno.1所示的核苷酸片段的3’端通過(guò)羥基結(jié)合一個(gè)生物素構(gòu)成；

第二適體由核苷酸序列如seqidno.2所示的核苷酸片段構(gòu)成；

鏈霉親和素包被的磁珠；

0.2～1.0mol/l的kcl溶液，體積為5～30μl；

5～10μmol/l的氯化血紅素溶液，體積為1～5μl。

反應(yīng)緩沖液、顯色液、終止反應(yīng)液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述第一適體的反應(yīng)濃度為1～5μmol/l，體積為5～30μl。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述第二適體的反應(yīng)濃度為1～5μmol/l，體積為5～30μl。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述鏈霉親和素包被的磁珠濃度為2～10mg/ml，用量為2～10μg。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述反應(yīng)緩沖液為ph7.2～7.4的磷酸鹽緩沖溶液，體積為30～40μl。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述終止反應(yīng)液為濃度為0.5～2mol/l的h2so4溶液，體積為40～100μl。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述顯色液為濃度為0.1～0.3mg/ml的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液，體積為50～100μl。

上述基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒的制備方法，步驟如下：

(1)化學(xué)合成第一適體；

(2)化學(xué)合成第二適體；

(3)配制濃度為0.2～1.0mol/l的kcl溶液、濃度為5～10μmol/l的氯化血紅素溶液、反應(yīng)緩沖液、顯色液、終止反應(yīng)液，用0.01mol/l、ph7.2～7.4磷酸鹽(pbs)緩沖溶液配制鏈霉親和素包被的磁珠；

(4)對(duì)步驟(1)第一適體、步驟(2)制得的第二適體、步驟(3)配制的kcl溶液、氯化血紅素溶液、反應(yīng)緩沖液、顯色液、終止反應(yīng)液以及鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行裝配，制得基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，kcl溶液為按如下步驟配制：

將kcl固體以超純水配制為濃度1mol/lkcl溶液，再以超純水稀釋至0.2～1.0mol/l；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，氯化血紅素溶液為按如下步驟配制：

采用二甲亞砜溶解并稀釋至5～10μmol/l；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，反應(yīng)緩沖液為按如下步驟配制：

稱取nah2po4·2h2o0.5g，na2hpo4·12h2o5.9g和nacl8.5g，加入超純水1000ml配制含有0.01mol/lpo4^3-的ph7.2～7.4磷酸鹽(pbs)緩沖溶液；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，顯色液為由如下三種溶液在使用前按比例混合制得：

將ph5.2檸檬酸-na2hpo4緩沖溶液、1mg/mltmb溶液、30％h2o2按照700～900:100～300:1.0～3.0體積比混合；

上述1mg/mltmb溶液采用無(wú)水乙醇配制；ph5.2檸檬酸-na2hpo4緩沖溶液由0.1mol/l檸檬酸和0.2mol/lna2hpo4按體積比9.28：10.72配制；0.1mol/l檸檬酸和0.2mol/lna2hpo4采用超純水配制；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，終止反應(yīng)液為按如下步驟配制：

將h2so4加入超純水中配制0.5～2mol/lh2so4溶液。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中，鏈霉親和素包被的磁珠為按如下步驟配制：

將鏈霉親和素包被的磁珠加入0.01mol/l、ph7.2～7.4磷酸鹽(pbs)緩沖溶液中，配制質(zhì)量濃度為2～10mg/ml的鏈霉親和素包被的磁珠。

反應(yīng)原理

本發(fā)明所述試劑盒檢測(cè)反應(yīng)原理如圖1所示；分別對(duì)濃度為0,10,25,50nmol/l的癌胚 抗原第二適體進(jìn)行吸光度檢測(cè)并繪制吸收曲線，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)顯色情況及a到d的對(duì)比結(jié)果可看出，在加入不同濃度癌胚抗原第二適體溶液后，藍(lán)色產(chǎn)物的吸光度值明顯增加，說(shuō)明癌胚抗原特異性第二適體本身的富g序列可形成分子間的g-四鏈體，其在嵌插氯化血紅素后可具有過(guò)氧化物酶活性，可代替過(guò)氧化物酶催化底物tmb顯色。

有益效果

1、本發(fā)明所述試劑盒通過(guò)鏈霉親和素-生物素作用，將生物素化的癌胚抗原第一適體結(jié)合到鏈霉親和素包被的磁珠表面，癌胚抗原與第一適體和第二適體特異性結(jié)合形成類似夾心的結(jié)構(gòu)富集到磁珠的表面實(shí)現(xiàn)與血清中其他成分的高效相分離，再巧妙利用癌胚抗原第二適體富g的dna序列區(qū)域，在kcl作用下可形成分子間g-四鏈體，g-四鏈體嵌插氯化血紅素后具有過(guò)氧化物酶活性可直接催化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，從而實(shí)現(xiàn)癌胚抗原的檢測(cè)；

2、本發(fā)明所述試劑盒對(duì)癌胚抗原進(jìn)行檢測(cè)，較現(xiàn)有檢測(cè)方法，無(wú)需動(dòng)物免疫抗體和酶標(biāo)記過(guò)程，核酸適體為化學(xué)方法合成，穩(wěn)定性和環(huán)境耐受性更好，且試劑保存更為方便，定量檢測(cè)僅需要一臺(tái)可見分光光度計(jì)即可。與其他的免疫學(xué)分析方法相比，方法簡(jiǎn)單、方便、費(fèi)用低，可用于腫瘤的普查，診斷，治療及預(yù)后判斷，尤其是對(duì)于經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)，醫(yī)療資源匱乏地區(qū)居民的癌癥診斷和療效判斷有重要意義，可促進(jìn)癌癥的早期診斷在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所述試劑盒檢測(cè)反應(yīng)原理的示意圖；

圖2為癌胚抗原第二適體在嵌插氯化血紅素后催化底物tmb顯色的吸收曲線圖；

圖中：a到d的吸收曲線對(duì)應(yīng)最終濃度分別為0,10,25,50nmol/l癌胚抗原第二適體；

圖3為在不同濃度癌胚抗原條件下催化顯色后藍(lán)色產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的吸收曲線圖；

圖中：a到d的吸收曲線分別對(duì)應(yīng)最終濃度為0,1,2,4ng/ml癌胚抗原；

圖4為在不同濃度癌胚抗原條件下催化顯色并硫酸終止后的黃色產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的吸收曲線圖；

圖中：a到d的吸收曲線分別對(duì)應(yīng)最終濃度為0,1,2,4ng/ml癌胚抗原；

圖5為cea分析結(jié)果的線性回歸分析曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例中所述的鏈霉親和素包被磁珠購(gòu)自鄭州英諾生物技術(shù)有限公司。

cea標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海領(lǐng)潮生物科技有限公司。

tmb購(gòu)自aladdin公司；

第一適體和第二適體由生工生物工程(上海)股份有限公司化學(xué)合成。

實(shí)施例1

一種基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，包括：

第一適體由核苷酸序列如seqidno.1所示的核苷酸片段的3’端通過(guò)羥基結(jié)合一個(gè)生物素構(gòu)成；

第一適體序列為5'-ttaacttattcgaccatatttttttttt-生物素-3'；

第二適體由核苷酸序列如seqidno.2所示的核苷酸片段構(gòu)成；

第二適體序列為5'-cccatagggaagtggggga-3'；

濃度4mg/ml的鏈霉親和素包被的磁珠，用量為4μg；

0.2mol/l的kcl溶液，20μl；

10μmol/l的氯化血紅素溶液，1μl；

反應(yīng)緩沖液為ph7.4的磷酸鹽緩沖溶液、顯色液為0.1mg/ml的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液、終止反應(yīng)液為濃度2mol/l的h2so4溶液。

上述基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒的制備方法，步驟如下：

(1)化學(xué)合成第一適體；

(2)化學(xué)合成第二適體；

(3)配制kcl溶液、氯化血紅素溶液、反應(yīng)緩沖液、顯色液、終止反應(yīng)液；

將kcl固體以超純水配制為濃度1mol/lkcl溶液，再以超純水稀釋至0.2mol/l，配制kcl溶液；

采用二甲亞砜溶解氯化血紅素并稀釋至10μmol/l，配制氯化血紅素溶液；

稱取nah2po4·2h2o0.5g，na2hpo4·12h2o5.9g和nacl8.5g，加入超純水1000ml配制含有0.01mol/lpo4^3-的ph7.4磷酸鹽(pbs)緩沖溶液；

使用前將ph5.2檸檬酸-na2hpo4緩沖溶液、1mg/mltmb溶液、30％h2o2按照900:100:1.5體積比混合，配制顯色液；上述1mg/mltmb溶液采用無(wú)水乙醇配制；ph5.2檸檬酸-na2hpo4緩沖溶液由0.1mol/l檸檬酸和0.2mol/lna2hpo4按體積比9.28：10.72配制；0.1mol/l檸檬酸和0.2mol/lna2hpo4采用超純水配制；

將h2so4加入超純水中配制2mol/lh2so4溶液，制得終止反應(yīng)液；

將鏈霉親和素包被的磁珠加入0.01mol/l、ph7.4磷酸鹽(pbs)緩沖溶液中，配制質(zhì)量濃度為4mg/ml的鏈霉親和素包被的磁珠。

(4)對(duì)步驟(1)第一適體、步驟(2)制得的第二適體、步驟(3)配制的kcl溶液、氯化血紅素溶液、反應(yīng)緩沖液、顯色液、終止反應(yīng)液以及鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行裝配，制得基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，避光保存。

實(shí)施例2

上述基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)癌胚抗原中的應(yīng)用，具體步驟如下：

1、待測(cè)血清樣品準(zhǔn)備：采用真空促凝管采集全血3ml，靜置1小時(shí)，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)，離心10分鐘，取上層清液10μl待測(cè)。

實(shí)驗(yàn)中用到的緩沖溶液均為po4^3-濃度為0.01mol/lph7.4磷酸鹽(pbs)緩沖溶液。

2、制備癌胚抗原第一適體功能化的磁珠：

將實(shí)施例1制得的試劑盒中30μlph7.4的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液，1μl4mg/ml的直徑為1μm鏈霉親和素包被磁珠，將第一適體用反應(yīng)緩沖液(0.01mol/l、ph7.4磷酸鹽緩沖溶液)稀釋至100μmol/l，充分振蕩10分鐘，再逐級(jí)稀釋至1μmol/l；取20μl1μmol/l的apt1(第一適體)溶液依次加入0.5ml塑料離心管中，振蕩混合均勻。然后將離心管放置于磁力架上，靜置5～10分鐘，待磁珠吸附至離心管管壁，溶液變?yōu)槌吻鍟r(shí)吸去液體，用100μlph7.4的pbs緩沖溶液洗滌磁珠；磁分離及洗滌3次，完全去除未與磁珠結(jié)合還游離在溶液中的第一適體，再用ph7.4的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液將負(fù)載有apt1的磁珠固體重懸至40μl溶液，制得apt1功能化磁珠。

3.癌胚抗原與其特異性第一適體的溫育反應(yīng):

(i)將cea標(biāo)準(zhǔn)品用po4^3-濃度為0.01mol/l、ph7.4的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液稀釋至濃度分別為1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、120ng/ml、160ng/ml的cea溶液，備用。

(ii)向制得的apt1功能化磁珠中加入10μl不同濃度的cea溶液(濃度為1-160ng/ml)，37℃水浴恒溫振蕩30～40分鐘，重復(fù)步驟2的磁分離洗滌過(guò)程，磁分離及洗滌3次，去除未與磁珠表面apt1結(jié)合的游離cea，再用ph7.4的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液將負(fù)載有cea-apt1復(fù)合物的磁珠固體重懸至30μl溶液，制得負(fù)載有cea-apt1復(fù)合物的磁珠。

4.癌胚抗原與其特異性第二適體的溫育反應(yīng):

向制得負(fù)載有cea-apt1復(fù)合物的磁珠中加入20μl1μmol/l的apt2(第二適體)溶液，第二適體先用反應(yīng)緩沖液(0.01mol/l、ph7.4磷酸鹽緩沖溶液)稀釋至100μmol/l，充分振蕩10分鐘，再逐級(jí)稀釋至1μmol/l；取37℃水浴恒溫振蕩30～40分鐘，重復(fù)步驟2的 磁分離洗滌過(guò)程，磁分離及洗滌3次，去除未負(fù)載到磁珠表面的游離apt2得到磁珠負(fù)載的apt1-cea-apt2夾心復(fù)合物，再用ph7.4的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液將負(fù)載有apt1-cea-apt2夾心復(fù)合物的磁珠固體重懸至30μl溶液，制得負(fù)載有apt1-cea-apt2夾心復(fù)合物的磁珠。

5.顯色反應(yīng)：

向負(fù)載有apt1-cea-apt2夾心復(fù)合物的磁珠中加入實(shí)施例1制得的試劑盒中20μl0.2mol/l的kcl，1μl10μmol/l氯化血紅素，振蕩20～30分鐘，加入配制后的100μltmb顯色液，再放置30分鐘，目視觀察顏色定性判讀。

6.cea的檢測(cè)

cea的定性檢測(cè)結(jié)果就顯色情況可以目視辨別，加入10μl10ng/mlcea標(biāo)準(zhǔn)溶液(最終計(jì)算濃度為0.5ng/mlcea)裸視就可辨別出藍(lán)色，即樣品中cea濃度達(dá)到10ng/ml時(shí)可直接根據(jù)tmb顯色情況判讀陽(yáng)性。

藍(lán)色產(chǎn)物在370nm和652nm獲得較強(qiáng)的吸光度如圖3所示，可根據(jù)吸光值進(jìn)行定量檢測(cè)。為保證結(jié)果的穩(wěn)定性可加入酸性終止液，其在450nm處有最大吸光度。

圖3的a到d吸收曲線分別對(duì)應(yīng)最終濃度為0,1,2,4ng/ml癌胚抗原。根據(jù)a到d的對(duì)比結(jié)果可看出，在加入不同濃度癌胚抗原后，通過(guò)適體和癌胚抗原的反應(yīng)，負(fù)載到磁珠上的癌胚抗原第二適體的量不同，得到的模擬酶活性大小不同，故吸光度值不同，可根據(jù)藍(lán)色產(chǎn)物的吸光值的不同判斷體系中癌胚抗原的加入量。

cea的定量測(cè)定采用可見分光光度計(jì)完成。將步驟5得到的藍(lán)色溶液再加入48μl濃度為2mol/l的h2so4溶液定容至200μl，轉(zhuǎn)移至比色皿，待測(cè)。對(duì)一系列不同濃度的cea標(biāo)準(zhǔn)溶液和未加入cea的空白溶液進(jìn)行掃描獲得吸收曲線如圖4所示。

圖4a到d的吸收曲線分別對(duì)應(yīng)最終濃度為0，1，2，4ng/ml癌胚抗原。由于酸終止酶促反應(yīng)吸光度值更為穩(wěn)定，tmb顯色的藍(lán)色產(chǎn)物通常加硫酸終止反應(yīng)后得到黃色產(chǎn)物，其最大吸收峰在450nm處。圖4a到d的對(duì)比結(jié)果與圖3的趨勢(shì)一致，在加入不同濃度癌胚抗原后，負(fù)載到磁珠上的癌胚抗原第二適體的量不同，得到的模擬酶活性大小不同，故最終得到的黃色產(chǎn)物的量不同，可依據(jù)吸光值大小的判斷體系中癌胚抗原的加入量。

測(cè)定450nm處的吸光度值，繪制工作曲線。得到吸光度差值δi450nm＝(i-i0)450nm與cea最終濃度ccea的線性關(guān)系為δi450nm＝0.1411ccea+0.0025，δi與0.1-6ng/mlcea具有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.05ng/ml，r²＝0.9781。

采集待測(cè)人血清樣本，取樣量為10μl，代替cea標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，血清中cea濃度為2～120ng/ml無(wú)需稀釋可直接測(cè)定。

實(shí)施例3

一種基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，包括：

第一適體由核苷酸序列如seqidno.1所示的核苷酸片段的3’端通過(guò)羥基結(jié)合一個(gè)生物素構(gòu)成；

第一適體序列為5'-ttaacttattcgaccatatttttttttt-生物素-3'；

第二適體由核苷酸序列如seqidno.2所示的核苷酸片段構(gòu)成；

第二適體序列為5'-cccatagggaagtggggga-3'；

濃度10mg/ml的鏈霉親和素包被的磁珠，用量為10μg；

1.0mol/l的kcl溶液，10μl；

5μmol/l的氯化血紅素溶液，5μl；

反應(yīng)緩沖液為ph7.2的磷酸鹽緩沖溶液、顯色液為濃度0.1mg/ml的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液、終止反應(yīng)液為濃度1.0mol/l的h2so4溶液。

上述基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒的制備方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

將實(shí)施例3制得的基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒于常溫條件下避光放置1個(gè)月，然后進(jìn)行如下檢測(cè)：

1、采用真空促凝管采集病人全血各3ml，共15例，靜置1小時(shí)，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)，離心10分鐘，取上層清液即為人血清樣本，備用；

2、將實(shí)施例3制得的試劑盒中40μlph7.2的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液，1μl10mg/ml的直徑為1μm鏈霉親和素包被磁珠，將第一適體用反應(yīng)緩沖液(0.01mol/l、ph7.4磷酸鹽緩沖溶液)稀釋至100μmol/l，充分振蕩10分鐘，再逐級(jí)稀釋至5μmol/l；然后將10μl5μmol/l的apt1溶液依次加入0.5ml塑料離心管中，振蕩混合均勻。磁分離及洗滌3次，完全去除未與磁珠結(jié)合還游離在溶液中的癌胚抗原第一適體，再用ph7.2的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液將負(fù)載有apt1的磁珠固體重懸至40μl溶液；

3、加入10μl步驟1制得的人血清樣本，37℃水浴恒溫振蕩30～40分鐘，磁分離及洗滌3次，去除未與磁珠表面apt1結(jié)合的游離cea，再用ph7.2的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液將負(fù)載有cea-apt1復(fù)合物的磁珠固體重懸至40μl溶液；

4、實(shí)施例3制得的第二適體先用反應(yīng)緩沖液(0.01mol/l、ph7.4磷酸鹽緩沖溶液)稀釋至100μmol/l，充分振蕩10分鐘，再逐級(jí)稀釋至5μmol/l；然后向步驟3制得的負(fù)載有cea-apt1復(fù)合物的磁珠固體重懸液中加入10μl5μmol/l的apt2溶液，37℃水浴恒溫振蕩 30～40分鐘，磁分離及洗滌3次，去除未負(fù)載到磁珠表面的游離apt2，再用ph7.2的磷酸鹽(pbs)緩沖溶液將負(fù)載有apt1-cea-apt2夾心復(fù)合物的磁珠固體重懸至40μl溶液；

5、在apt1-cea-apt2夾心復(fù)合物溶液中加入實(shí)施例3制得的試劑盒中10μl1mol/l的kcl溶液，5μl5μmol/l氯化血紅素溶液，振蕩20～30分鐘，加入配制后的100μltmb顯色液，再放置30分鐘，目視觀察顏色定性判讀，其中有9例出現(xiàn)明顯藍(lán)色；

6、再加入98μl濃度為1mol/l的h2so4溶液定容至250μl，在可見分光光度計(jì)上450nm讀取吸光度值，根據(jù)該條件下工作曲線方程計(jì)算不同病人血清中cea含量，分別為5.62ng/ml,6.51ng/ml，17.47ng/ml，10.94ng/ml，2.53ng/ml，24.02ng/ml，17.71ng/ml，35.61ng/ml，14.79ng/ml，26.24ng/ml，3.15ng/ml，8.35ng/ml，19.41ng/ml，7.74ng/ml，24.86ng/ml。

采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測(cè)得病人血清中cea含量分別為3.53ng/ml，5.44ng/ml，15.65ng/ml，8.21ng/ml，0.74ng/ml，27.58ng/ml,17.63ng/ml，30.76ng/ml,18.41ng/ml，21.04ng/ml，1.71ng/ml，5.09ng/ml，15.65ng/ml，6.21ng/ml，20.05ng/ml，作兩種方法分析結(jié)果的回歸分析，y＝0.9891x+1.9661，r²＝0.9257，采用相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)法對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，兩種方法相關(guān)性較好，如圖5所示。并且，實(shí)施例3制備的基于核酸適體自催化作用的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒并未因長(zhǎng)時(shí)間放置而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確，因此可以解決現(xiàn)有酶標(biāo)試劑盒的酶常溫保質(zhì)期短，催化底物顯色后靈敏度低的弊端。