本發(fā)明涉及一種分子標記物，抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrinreceptor1,tfr1,又名cd71)抗體在子宮內(nèi)膜癌診斷、臨床分期及預后評估中的應用，屬于分子生物學領域。

背景技術(shù)：

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，約占女性癌癥的7％，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20-30％。近年來，在世界范圍內(nèi)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病有上升趨勢，并呈年輕化(parkindm,brayf,ferlayj,etal.globalcancerstatistics,2002[j].cacancerjclin,2005,55(2):74-108)。

隨著傳統(tǒng)標記物研究的深入及新標記物的不斷發(fā)現(xiàn)，免疫組化在子宮內(nèi)膜癌的病理診斷與鑒別診斷中扮演越來越重要的角色(吳煥文，梁智勇，張卉，劉彤華.子宮內(nèi)膜癌免疫組化標記物的研究進展.診斷病理學，2013，vol.20，no.3180-183)。子宮內(nèi)膜癌診斷目前常用的免疫組化標記物包括激素受體er,pr,cea,p53，p16，pten等。目前這些腫瘤標記物在診斷方面存在靈敏性、廣譜性及特異性方面的不足。如p53主要應用于ii型子宮內(nèi)膜癌的診斷或鑒別診斷，在i型中低分化內(nèi)膜癌也存在部分高表達現(xiàn)象，部分病例呈完全陰性表達；p16主要用于宮頸癌的診斷，在子宮內(nèi)膜癌中表達相對較低，主要用于子宮內(nèi)膜癌與宮頸癌的鑒別診斷。pten缺失表達是i型子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的早期事件，此外，由于是缺失表達，實際應用中pten染色結(jié)果的有效判讀限制了它的普及應用。cea在宮頸癌中高表達，主要是用于子宮內(nèi)膜癌的鑒別診斷。er,pr的表達更多用于子宮內(nèi)膜癌的激素治療評估。迄今，尚未發(fā)現(xiàn)特異高效的分子標記物用于子宮內(nèi)膜癌診斷，本項目中的cd71抗體在子宮內(nèi)膜癌中的整體表達率高達約80％，認為能夠作為輔助診斷子宮內(nèi)膜癌的分子標記物。目前的分子標記物用于臨床預后預測上，有研究認為:除pr外，er,pten,p53 及ki-67的表達情況對患者臨床預后的預測意義較小(子宮內(nèi)膜癌分子標記物與臨床病理特征及預后的關系.北京大學學報(醫(yī)學版)vol.43no.5oct.2011,743-748)。

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfr1，cd71)在增殖分裂活躍的細胞中高表達，尤其是在需要大量鐵的惡性腫瘤細胞及一些快速分裂的細胞表面過度表達，這些受體在正常組織中不表達或極低表達，研究表明，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(cd71)在多種惡性腫瘤中高表達，如肝癌，乳腺癌，腦惡性膠質(zhì)瘤等，目前尚沒有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfr1，cd71)在人子宮內(nèi)膜癌組織中表達的研究報道，更沒有將cd71用于臨床預后預測的資料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人在研究轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfr1，cd71)在人子宮內(nèi)膜癌組織中表達的基礎上，發(fā)現(xiàn)cd71不僅可以用來診斷子宮內(nèi)膜癌，尚能夠?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌的臨床分期及預后進行分析。同時開發(fā)了針對cd71的抗體，所述抗體可以用于診斷子宮內(nèi)膜癌，且能夠?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌的臨床分期及預后進行分析。另外，本發(fā)明還涉及一種用于診斷子宮內(nèi)膜癌，且能夠?qū)ψ訉m內(nèi)膜癌的臨床分期及預后進行分析的檢測試劑盒。

具體而言，本發(fā)明包括以下方面：

一方面，本發(fā)明涉及cd71作為子宮內(nèi)膜癌的分子標記的用途。

另一方面，本發(fā)明涉及cd71在制備用于診斷子宮內(nèi)膜癌、和/或評估子宮內(nèi)膜癌臨床分期及預后的試劑盒中的用途。

所述臨床分期，是指根據(jù)腫瘤大小，位置，有無浸潤及遠處轉(zhuǎn)移等情況，進行臨床分期，期別越高，腫瘤惡性程度越高。其中國際婦產(chǎn)科協(xié)會(figo)分期是本領域中最常見的臨床分期。具體的figo分期標準：0期：原位癌(浸潤前的癌)；1期：腫瘤局限于子宮體；2期；腫瘤浸潤宮頸但沒有超出子宮；3期：腫瘤局灶和/或區(qū)域擴散；4期：腫瘤累及膀胱黏膜和/或腸粘膜，腫瘤伴遠處轉(zhuǎn)移(不包括轉(zhuǎn)移到陰道，盆腔漿膜或附件)。

在優(yōu)選的實施方案中，所述子宮內(nèi)膜癌為人子宮內(nèi)膜癌。

在優(yōu)選的實施方案中，所述制備試劑盒的用途通過制備特異識別cd71的抗體來實現(xiàn)。

在本領域中，抗體的制備方法是已知的，最常見的包括雜交瘤方法、噬菌體展示方法等。本領域已知的抗體制備方法均可以用來制備用于本發(fā)明的抗體。另外，cd71可以通過以下途徑獲得：首先，從人腫瘤細胞系中提取rna，然后，在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中反轉(zhuǎn)錄為cdna文庫。設計cd71cdna的引物，利用pcr的方法，將cd71cdna從cdna文庫中克隆出來。將cd71cdna構(gòu)建到真核表達載體上，選擇性的表達全長的cd71序列或者部分cd71序列，通過親和層析的方法，實現(xiàn)cd71抗原的純化制備。

另一方面，本發(fā)明一種用于診斷子宮內(nèi)膜癌、和/或評估子宮內(nèi)膜癌臨床分期及預后的試劑盒，所述試劑盒包含特異識別cd71的抗體。

在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包含用于免疫檢測的試劑。

在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還可以包含所述試劑盒的使用說明。

在優(yōu)選的實施方案中，所述免疫檢測包括免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀，免疫流式細胞學及免疫雜交。只要能夠表明cd71的抗體與目標組織的結(jié)合及相應強度的免疫檢測方法都可以用來實現(xiàn)本發(fā)明。

在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體。

在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體為單克隆抗體。

在優(yōu)選的實施方案中，所述單克隆抗體或多克隆抗體是針對人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的全部或部分氨基酸序列制備的。并且具有特異結(jié)合cd71的功能的抗體片段也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體主要與子宮內(nèi)膜癌組織中的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合。本發(fā)明中抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體根據(jù)人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的全部或部分氨基酸序列進行制備，能夠與人子宮內(nèi)膜癌組織中的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合。本發(fā)明主要用于免疫組織化學檢測，但是并不局限于免疫組化檢測。

附圖說明

圖1是正常周期子宮內(nèi)膜的免疫組化圖：其中左圖(10×)、右圖(20×)；

圖2是單純性增生子宮內(nèi)膜的免疫組化圖：其中左圖(10×)、右圖(20×)；

圖3是子宮內(nèi)膜癌組織的免疫組化圖：其中左圖(10×)、右圖(20×)；

圖4表示不同臨床分期(figo分期)的子宮內(nèi)膜癌組織與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 (tfr1，cd71)表達強度的關系。根據(jù)figo臨床分期將子宮內(nèi)膜癌分成4組?？ǚ綑z驗顯示：***p<0.001,ns表示沒有顯著性差異。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步說明，本發(fā)明的實施方式并不局限于此，凡是根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容或原理，實施的任何本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

免疫組化檢測并比較正常子宮內(nèi)膜組織、單純性增生子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜癌組織中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達的差異。

1.實驗材料

組織芯片(tma)購買自上海卓立生物科技有限公司，其中包含子宮內(nèi)膜癌樣本57例、正常子宮內(nèi)膜樣本23例，單純性增生子宮內(nèi)膜組織7例。免疫組化試劑：抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體(ec-1)通過常規(guī)鼠雜交瘤方法制備(edwarda.greenfield.generatingmonoclonalantibodies.antibodies:alaboratorymanual,secondedition,2014,coldspringharborlaboratorypress)，具體可以參見，其內(nèi)容通過引用并入本文。

1.實驗方法

常規(guī)免疫組化sp法進行。(dejongas,vankessel-vanvarkm,raapak.histochemj.1985oct；17(10):1119-30.sensitivityofvariousvisualizationmethodsforperoxidaseandalkalinephosphataseactivityinimmunoenzymehistochemistry)對組織芯片(tma)石蠟切片(5um厚)的處理如下：

1)切片脫蠟水化。

2)蒸餾水中5分鐘；

3)用蒸餾水或pbs配置新鮮的3％h2o2室溫封閉10分鐘，用蒸餾水洗1次；

4)常規(guī)抗原修復；

5)pbs洗5分鐘；

6)滴加正常山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，室溫30分鐘；

7)甩去多余液體滴加一抗(cd71的抗體，abcam：ab49517)，37℃1小時或者4℃過夜；

8)pbs洗2次，每次各5分鐘；

9)滴加二抗(辣根酶標記鼠抗山羊igg，北京康為世紀生物科技有限公司)孵育37℃45分鐘；

10)pbs洗2次，每次各5分鐘；

11)dab顯色5分鐘；

12)蒸餾水洗終止染色，蘇木素復染，蒸餾水沖洗。

15)加入中性樹脂(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，加蓋玻片。2.實驗結(jié)果

免疫組化結(jié)果見圖1-3。圖1是正常周期子宮內(nèi)膜的免疫組化圖；圖2是單純性增生子宮內(nèi)膜的免疫組化圖；圖3是子宮內(nèi)膜癌組織的免疫組化圖?？梢钥闯觯恨D(zhuǎn)鐵蛋白受體在子宮內(nèi)膜癌組織中呈中-重度陽性表達，在正常周期子宮內(nèi)膜及單純性增生子宮內(nèi)膜中幾乎不表達。詳細數(shù)據(jù)結(jié)果見下表1。

表1.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfr1,cd71)在子宮內(nèi)膜癌與非癌組織中的表達情況

3.結(jié)論

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在子宮內(nèi)膜癌中高表達，在正常周期子宮內(nèi)膜及單純性增生子宮內(nèi)膜中不表達或極低表達。

實施例2

免疫組化檢測不同臨床分期子宮內(nèi)膜癌組織中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達情況。

1.實驗材料

組織芯片(tma)購自陜西艾麗娜生物科技有限公司，根據(jù)figo分期，其中figo1期標本158例，2期標本32例，3期標本29例，4期標本4例。免疫組化試劑：抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體為ec-1如前所述。

2.實驗方法：同實施例1。

3.實驗結(jié)果：

不同臨床分期(figo分期)的子宮內(nèi)膜癌組織與抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達強弱有相關性?？ǚ綑z驗顯示：p<0.001,提示不同臨床分期間抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達有顯著性差異。結(jié)果見后(說明書中附圖4)

4.結(jié)論

子宮內(nèi)膜癌臨床分期越高，預后越差，則抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達越強。由此，可以根據(jù)抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達的強度判斷子宮內(nèi)膜癌的臨床分期，從而判斷預后。