本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及冠心病診斷分型的代謝標(biāo)志物，具體涉及一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物。

背景技術(shù)：
冠心病亦稱為缺血性心臟病，涉及供應(yīng)心肌血液的動脈發(fā)生粥樣硬化，即冠狀動脈粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或斑塊形成甚至破裂、完全堵塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致心臟缺血性疾病，從而引起臨床上心絞痛、心肌梗死等一系列嚴(yán)重的心血管事件。冠心病是人類健康的主要?dú)⑹郑甙l(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，已經(jīng)成為威脅我國人民健康的主要疾病。目前，基于病理生理機(jī)制，將冠心病分為慢性穩(wěn)定性冠心病(即穩(wěn)定型心絞痛)和急性冠脈綜合征；急性冠脈綜合征又進(jìn)一步分為不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死。冠心病從無至有、從輕至重通常包括如下發(fā)展階段：冠狀動脈正?！跔顒用}粥樣硬化→穩(wěn)定型心絞痛→不穩(wěn)定型心絞痛→急性心肌梗死。冠狀動脈粥樣硬化是冠心病的主要病因，是冠心病的早期病癥。冠狀動脈粥樣硬化是一種常見的進(jìn)行性動脈疾病，病變主要累及中等大小的肌層動脈，動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，平滑肌細(xì)胞增生，形成局限性斑塊，可使動脈壁變硬，嚴(yán)重時(shí)斑塊破裂導(dǎo)致血栓、栓塞、出血，受累管腔部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為動脈粥樣硬化血管并發(fā)癥的發(fā)生。動脈粥樣硬化早期病變可發(fā)生在10歲之前，病變引起動脈狹窄需經(jīng)歷20至30年時(shí)間，早期無臨床癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)和重視，因此對冠狀動脈粥樣硬化的早期預(yù)防和診斷可以有效地防止冠心病的發(fā)生。冠狀動脈造影可以對冠狀動脈的狹窄程度作出準(zhǔn)確的判斷，是診斷冠心病的金標(biāo)準(zhǔn)[冠狀動脈造影金標(biāo)準(zhǔn)與臨床常規(guī)診斷冠心病差異性比較研究，舒榮文等，海軍醫(yī)學(xué)雜志2015年04期]。作為冠心病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，冠脈造影只能發(fā)現(xiàn)血管狹窄程度，而且它還是一種介入測量手段，需要介入手術(shù)，且診斷昂貴。另一方面，醫(yī)生還需要依據(jù)對患者的心電圖、心動圖、平板運(yùn)動試驗(yàn)、CT等檢查結(jié)果作出最終診斷，由于醫(yī)生主觀性判斷、病人敘述不清等情況的出現(xiàn)，對冠心病的診斷仍存在較大的誤診和漏診，這對病人的預(yù)后影響非常大。為了改善患者的生活質(zhì)量，降低患者受到的生命威脅，我們亟需發(fā)展一種具有診斷率高、經(jīng)濟(jì)、無侵入性、操作簡便等特性的診斷方法。代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其隨內(nèi)因和外因變化的科學(xué)，是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要組成部分。它可以對體液如血液和尿液進(jìn)行快速及無侵入性的分析，通過代謝譜的差異獲得可以指示各種生化反應(yīng)的代謝標(biāo)志物。目前常用的分析技術(shù)包括核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(LC-MS/GC-MS)等。LC-MS/GC-MS具有對樣本制備要求低、靈敏度高、動態(tài)范圍寬等特點(diǎn)，可用于檢測樣本中濃度相差大的代謝物，因而成為代謝組學(xué)的研究中應(yīng)用越來越多的技術(shù)平臺。血漿分析是臨床上常用的一種疾病診斷方法，因其簡便、快速、經(jīng)濟(jì)且相對無創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用。目前尚未有人使用血漿代謝物水平對冠心病進(jìn)行診斷分型。應(yīng)用血漿代謝組學(xué)尋找冠狀動脈正常人與冠狀動脈粥樣硬化患者及不同分型冠心病患者血漿代謝物的水平差異對于臨床早期快速確診冠心病并進(jìn)行分型具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明第一目的在于提供一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物，該組代謝標(biāo)志物同時(shí)存在于血漿中，可同時(shí)分析測定；本發(fā)明的第二目的在于提供一種能夠靈敏地分析檢測所述代謝標(biāo)志物的方法；本發(fā)明的第三目的在于提供一種基于所述代謝標(biāo)志物的檢測試劑盒，用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死，提高診斷便利性，促進(jìn)診斷方法標(biāo)準(zhǔn)化。上述目的是通過如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物，包括一個(gè)或多個(gè)如下所述的代謝標(biāo)志物：N-苯丙酰-L-谷氨酰胺、二氫神經(jīng)鞘氨醇、花生四烯酸、花生三烯酸、甘氨膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、色氨酸精氨酸亮氨酸三肽、溶血磷脂酰膽堿(18:2)和溶血磷脂酰膽堿(20:3)。溶血磷脂酰膽堿(14:0)，即1-肉豆蔻酰-甘油-3-磷脂酰膽堿。溶血磷脂酰膽堿(18:2)，即1-亞油酰-甘油-3-磷脂酰膽堿。溶血磷脂酰膽堿(20:3)，即1-二十碳三烯酰-甘油-3-磷脂酰膽堿。進(jìn)一步地，所述的一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物，包括任意三個(gè)所述的代謝標(biāo)志物。進(jìn)一步地，所述的一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物，包括任意四個(gè)所述的代謝標(biāo)志物。進(jìn)一步地，所述的一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物，包括任意五個(gè)所述的代謝標(biāo)志物。進(jìn)一步地，所述的一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物，包括任意六個(gè)所述的代謝標(biāo)志物。進(jìn)一步地，所述的一組用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物，包括全部九個(gè)所述的代謝標(biāo)志物。進(jìn)一步地，所述的代謝標(biāo)志物來源于血漿。一種定性或定量分析所述的用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物的方法為：采用液質(zhì)聯(lián)用和/或氣質(zhì)聯(lián)用對所述的代謝標(biāo)志物進(jìn)行定性或定量分析。液質(zhì)和氣質(zhì)檢測限低、靈敏度高，能靈敏地分析檢測生物樣本中的代謝標(biāo)志物并對其定量。一種用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的檢測試劑盒，包括所述的代謝標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn)品為各代謝標(biāo)志物的化學(xué)單體或混合物。使用標(biāo)準(zhǔn)品可以對生物樣本中的代謝標(biāo)志物進(jìn)行快速準(zhǔn)確地定性、定量分析。試劑盒有助于實(shí)現(xiàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)化，提高檢測便利性和重現(xiàn)性。進(jìn)一步地，所述檢測試劑盒還包括溶解所述標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑和/或提取富集所述代謝標(biāo)志物的溶劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物能準(zhǔn)確地診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死。ROC曲線評價(jià)方法中，ROC曲線下面積AUC在大于0.5的情況下，越接近于1，說明診斷效果越好。AUC在0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性，AUC在0.7～0.9時(shí)有一定準(zhǔn)確性，AUC在0.9以上時(shí)有較高準(zhǔn)確性。經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物單個(gè)用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死時(shí)，AUC均在0.7以上；多個(gè)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，AUC比單個(gè)更接近于1，診斷效果更好；九個(gè)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，AUC最接近于1，診斷區(qū)分效果最好。(2)本發(fā)明提供的分析檢測所述代謝標(biāo)志物的方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。(3)本發(fā)明提供的檢測試劑盒可以用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死，提高診斷便利性，促進(jìn)診斷方法標(biāo)準(zhǔn)化。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。使用的儀器或試劑未做詳細(xì)說明的均為常規(guī)儀器和試劑；未具體描述的試驗(yàn)操作方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的常規(guī)操作方法。實(shí)施例1：不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者之間血漿差異代謝物的篩選表征一、對象和方法1、標(biāo)本來源在取得患者同意后，收集江蘇省人民醫(yī)院2010年9月～2015年6月260例不穩(wěn)定型心絞痛患者、295例急性心肌梗死患者和350例健康人的外周靜脈血血漿，所有患者或健康人均經(jīng)冠脈造影證實(shí)。健康人的年齡、性別與不穩(wěn)定型心絞痛患者、急性心肌梗死患者相匹配。所有不穩(wěn)定型心絞痛患者、急性心肌梗死患者和健康人均有正常心肺肝腎及造血功能。采血時(shí)間均為清晨空腹?fàn)顟B(tài)。2、主要試劑乙腈及甲酸(UPLC純)購于美國ROE公司；色譜級別甲醇和氯仿購于江蘇漢邦科技有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)購于美國Sigma-Aldrich公司；去離子水由美國密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超純水系統(tǒng)制備；標(biāo)準(zhǔn)品包括N-苯丙酰-L-谷氨酰胺、二氫神經(jīng)鞘氨醇、花生四烯酸、花生三烯酸、甘氨膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、色氨酸精氨酸亮氨酸三肽、溶血磷脂酰膽堿(18:2)和溶血磷脂酰膽堿(20:3)，購于美國Sigma-Aldrich。3、血漿差異代謝物的篩選表征3.1UPLC-Q/TOF-MS篩選表征3.1.1樣品制備利用響應(yīng)面法進(jìn)行提取溶劑優(yōu)化：以質(zhì)譜ESI+和ESI-檢測模式下的峰個(gè)數(shù)和總峰面積為因素考察不同溶劑(乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、水)對血漿中代謝物的提取富集效率。將實(shí)驗(yàn)測得數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量分析，利用PLS模型中重要性因子(variableimportancetoprojection，VIP值)反映變量對模型響應(yīng)的重要性。乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、水的VIP值依次為1.503，0.802，0.651，0.688和0.987，乙腈的提取效率最高，故選擇乙腈作為血漿樣本的提取溶劑。樣品處理：取100μL血漿于1.5mL離心管中，加入400μL乙腈，渦旋30秒后混勻，13000rpm×10min離心(4℃)，取200μL上清于1.5mL離心管中，在室溫下用氮吹儀吹干，所得殘?jiān)?00μL的20％乙腈水溶液溶解，即得。3.1.2試驗(yàn)條件及參數(shù)UPLC-Q/TOF-MS條件：色譜分離采用超高效液相色譜(UPLC，Agilent1290，USA)。色譜柱為WatersBEHC18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，柱溫25℃，進(jìn)樣室溫度為室溫，進(jìn)樣量2μL。正、負(fù)離子模式流動相組成均是A為體積濃度0.1％甲酸水溶液，B為體積濃度0.1％甲酸乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～1min為0～30％B相，2min內(nèi)B相線性增加到60％，3～8min線性變化至90％B相，然后在8～9min線性增加至100％B相并保持1min；流速0.3mL/min，柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。質(zhì)譜分析采用四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Agilent6530Q-TOF/MS，USA)。以電噴霧離子源(ESI)正、負(fù)離子模式檢測；干燥氣流速為7L/min，干燥氣溫度為300℃，干燥氣和錐孔氣均為高純氮?dú)?；離子源溫度100℃，正離子和負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓均為3000V，碰撞電壓為100V；采用全掃描模式每秒進(jìn)行三次數(shù)據(jù)采集，掃描質(zhì)量范圍：m/z100-1000道爾頓。3.2GC-Q/MS篩選表征3.2.1樣品制備取200μL血漿于1.5mL離心管中，加入50μL1mg/mL的2-異丙基蘋果酸溶液內(nèi)標(biāo)，渦旋20秒混勻，加入400μL甲醇、氯仿和水的混合溶液(比例為2.5∶1∶1)，然后在70℃的金屬浴上振搖30min(1200rpm)，16000g×5min離心(4℃)，取500μL上清于1.5mL離心管中，加入500μL蒸餾水，渦旋混勻，然后16000g×5min離心(4℃)，取500μL上清于1.5mL離心管中，在室溫下用氮吹儀吹干，所得殘?jiān)?0μL的甲氧胺吡啶溶液溶解，在50℃條件下肟化8h，加入60μLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，在70℃條件下衍生化2h，即得。3.2.2試驗(yàn)條件及參數(shù)GC-Q/MS條件：美國Agilent7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜柱HP-5MS毛細(xì)管柱(30.0m×0.25mm，毛細(xì)管厚度0.25μm)；載氣為高純氦氣，流速1.0mL/min；進(jìn)樣量2μL；程序升溫：80℃恒溫2min，80℃-300℃(5℃/min)恒溫6min；不分流，進(jìn)樣溫度300℃；接口溫度300℃；離子源溫度200℃；電子能量50eV；溶劑延遲3min；采用全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍：m/z30-600道爾頓。4、數(shù)據(jù)處理和分析將UPLC-Q/TOF-MS和GC-Q/MS得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件(version13.0.2，Umetrics)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。通過建立OPLS-DA(正交偏最小二乘法-判別分析)模型，尋找不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者之間代謝輪廓貢獻(xiàn)較大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代謝物。通過HMDB(http：//www.hmdb.ca/)和Metline(http：//metlin.scripps.edu/)等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢索，利用數(shù)據(jù)庫中提供的精確分子量和質(zhì)譜所得的MS/MS圖譜初步鑒定上述差異代謝物的結(jié)構(gòu)。最終通過購買標(biāo)準(zhǔn)品，用標(biāo)準(zhǔn)品的分子量、色譜保留時(shí)間和相應(yīng)的多級MS裂解譜比對，確證差異代謝物的結(jié)構(gòu)。二、結(jié)果篩選表征出9個(gè)差異代謝物，分別為：N-苯丙酰-L-谷氨酰胺、二氫神經(jīng)鞘氨醇、花生四烯酸、花生三烯酸、甘氨膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、色氨酸精氨酸亮氨酸三肽、溶血磷脂酰膽堿(18:2)和溶血磷脂酰膽堿(20:3)。與冠狀動脈硬化患者相比，上述9個(gè)差異代謝物在急性心肌梗死患者血漿中的表達(dá)水平均下調(diào)。通過標(biāo)準(zhǔn)品定量檢測，與冠狀動脈硬化患者相比，上述差異代謝物在急性心肌梗死患者血漿中的表達(dá)水平下調(diào)0.7～0.8倍。由此可見，上述9個(gè)差異代謝物在急性心肌梗死患者和不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中的表達(dá)水平明顯不同，可以用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死。實(shí)施例2：構(gòu)建ROC曲線驗(yàn)證9個(gè)差異代謝物用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的能力采用受試者工作曲線(ROC)法進(jìn)行驗(yàn)證，通過急性心肌梗死患者和不穩(wěn)定型心絞痛患者血漿中差異代謝物的表達(dá)水平判斷其用于診斷區(qū)分急性心肌梗死患者和不穩(wěn)定型心絞痛患者的能力。結(jié)果表明，N-苯丙酰-L-谷氨酰胺、二氫神經(jīng)鞘氨醇、花生四烯酸、花生三烯酸、甘氨膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、色氨酸精氨酸亮氨酸三肽、溶血磷脂酰膽堿(18:2)和溶血磷脂酰膽堿(20:3)這9個(gè)差異代謝物單個(gè)用于診斷區(qū)分急性心肌梗死患者和不穩(wěn)定型心絞痛患者的能力較強(qiáng)，ROC曲線下面積(AUC)均大于0.7，具有臨床診斷意義；聯(lián)合用于診斷時(shí)，隨著聯(lián)合個(gè)數(shù)的增加，AUC進(jìn)一步提高，9個(gè)全部聯(lián)合時(shí)最高，AUC達(dá)0.991，在最佳cutoff值下，靈敏度和特異性分別為99.2％和98.9％。單個(gè)及任意2～8個(gè)用于聯(lián)合用于診斷時(shí)的結(jié)果見表1～3。表1單個(gè)差異代謝物診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者單個(gè)差異代謝物AUC靈敏度特異性N-苯丙酰-L-谷氨酰胺0.87687.9％88.0％二氫神經(jīng)鞘氨醇0.85485.7％85.9％花生四烯酸0.83785.0％84.5％花生三烯酸0.81983.2％81.7％甘氨膽酸0.79580.8％80.1％溶血磷脂酰膽堿(14:0)0.76778.0％78.0％色氨酸精氨酸亮氨酸三肽0.74975.2％75.7％溶血磷脂酰膽堿(18:2)0.73273.5％74.0％溶血磷脂酰膽堿(20:3)0.71671.9％72.4％表2兩個(gè)差異代謝物聯(lián)合診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者表3任意三～八個(gè)差異代謝物聯(lián)合診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者聯(lián)合個(gè)數(shù)AUC靈敏度特異性三個(gè)≥0.910≥91.5％≥91.1％四個(gè)≥0.921≥92.4％≥92.9％五個(gè)≥0.951≥93.1％≥94.0％六個(gè)≥0.958≥95.5≥95.7％七個(gè)≥0.963≥96.9≥97.1％八個(gè)≥0.984≥98.2％≥98.4％從表1可以看出，這9個(gè)差異代謝物單個(gè)用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者的能力較強(qiáng)，AUC均大于0.7，靈敏度較高、特異性較強(qiáng)，具有臨床診斷意義；從表2可以看出，這9個(gè)差異代謝物兩兩聯(lián)合用于診斷時(shí)，AUC比單個(gè)用于診斷時(shí)更高，靈敏度高、特異性較高，具有臨床診斷意義；從表3可以看出，用這9個(gè)差異代謝物中的3～8個(gè)聯(lián)合用于診斷時(shí)，AUC進(jìn)一步提高，靈敏度高、特異性強(qiáng)，具有臨床診斷意義。因此，這9個(gè)差異代謝物可以作為用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死的代謝標(biāo)志物。實(shí)施例3：檢測試劑盒的制備基于本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物制備了檢測試劑盒，該試劑盒包括如下成分：代謝標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品：包括N-苯丙酰-L-谷氨酰胺、二氫神經(jīng)鞘氨醇、花生四烯酸、花生三烯酸、甘氨膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、色氨酸精氨酸亮氨酸三肽、溶血磷脂酰膽堿(18:2)和溶血磷脂酰膽堿(20:3)，各標(biāo)準(zhǔn)品分別封裝；血漿代謝物提取溶劑：100％乙腈和20％乙腈水溶液(用于UPLC-Q/TOF-MS樣品制備)；比例為2.5∶1∶1的甲醇、氯仿和水的混合溶液、甲氧胺吡啶和N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(用于GC-Q/MS樣品制備)；UPLC-Q/TOF-MS篩選表征中，20％乙腈水溶液可以用作溶解標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑；GC-Q/MS篩選表征中，用血漿代謝物提取溶劑按樣品制備的方法制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液；內(nèi)標(biāo)：2-異丙基蘋果酸。當(dāng)然，設(shè)計(jì)檢測試劑盒時(shí)，并不需要完全包含上述9個(gè)代謝標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，可以僅使用其中幾個(gè)進(jìn)行組合。這些標(biāo)準(zhǔn)品可以單獨(dú)封裝，也可以制成混合物封裝。該試劑盒是基于本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物而設(shè)計(jì)的，可以用于診斷區(qū)分不穩(wěn)定型心絞痛患者和急性心肌梗死患者。綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，且具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。