本發(fā)明屬于利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)研究蛋白質(zhì)微觀構(gòu)象的研究領(lǐng)域，具體涉及一種活性共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜檢測技術(shù)相結(jié)合的方法，考察蛋白質(zhì)構(gòu)象以及賴氨酸在活性蛋白質(zhì)中的局部結(jié)構(gòu)微環(huán)境變化。
背景技術(shù)：
：：質(zhì)譜技術(shù)在提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息方面有著巨大優(yōu)勢，和其他技術(shù)如x射線晶體衍射和核磁共振相比，它不受蛋白質(zhì)大小、溶解度、純度等限制(文獻(xiàn)1.aebersoldr,mannm.massspectrometry-basedproteomics.nature,2003,422(6928):198-207)。在應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)考察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，通常需要對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)標(biāo)記處理，而氫氘交換和共價(jià)化學(xué)標(biāo)記是最常用的標(biāo)記策略(文獻(xiàn)2.konermannl,vahidis,sowolema.massspectrometrymethodsforstudyingstructureanddynamicsofbiologicalmacromolecules.analyticalchemistry,2013,86(1):213-232)。氫氘交換是一種活性標(biāo)記的方法，不會(huì)改變蛋白質(zhì)的生物活性。但是，氘氫的“回交(backexchange)”效應(yīng)在很大程度上影響了這種方法的準(zhǔn)確性(文獻(xiàn)3.scholtena,vissernfc,vandenheuvelrhh,etal.analysisofprotein-proteininteractionsurfacesusingacombinationofefficientlysineacetylationandnanolc-maldi-ms/msappliedtothee9:im9bacteriotoxin-immunityproteincomplex.journaloftheamericansocietyformassspectrometry,2006,17(7):983-994)。相比之下，穩(wěn)定共價(jià)標(biāo)記策略通常是修飾具有高反應(yīng)活性的氨基酸殘基側(cè)鏈，例如賴氨酸殘基的側(cè)鏈伯胺基團(tuán)。然而，大多數(shù)共價(jià)標(biāo)記方法為了確保較高標(biāo)記效率需要使用高反應(yīng)活性的酰胺化反應(yīng)試劑，如n-acetyl-succinimide,sulfosuccinimidylacetate和s-methylthioacetimidate，這些試劑會(huì)中和賴氨酸側(cè)鏈的正電荷，影響蛋白質(zhì)中的靜電相互作用，從而導(dǎo)致標(biāo)記后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變以及活性的喪失(文獻(xiàn)4.kvaratskheliam,millerjt,budihassr,etal.identificationofspecifichiv-1reversetranscriptasecontactstotheviralrna:trnacomplexbymassspectrometryandaprimaryamineselectivereagent.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2002,99(25):15988-15993)。結(jié)合活性共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜檢測技術(shù)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象至今尚未有報(bào)道。通過甲醛ch2o和氰基硼氫化鈉nabh3cn對賴氨酸側(cè)鏈上的伯胺進(jìn)行還原二甲基化標(biāo)記反應(yīng)(文獻(xiàn)6.boersemapj,raijmakersr,lemeers,etal.multiplexpeptidestableisotopedimethyllabelingfor quantitativeproteomics.natureprotocols,2009,4(4):484-494)是一種高效穩(wěn)定的共價(jià)化學(xué)標(biāo)記方法，在核磁共振和x射線晶體衍射的研究中，已經(jīng)證實(shí)這種方法不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與活性(文獻(xiàn)7.(a)gerkenta,jentoftje,jentoftn,etal.intramolecularinteractionsofaminogroupsin13creductivelymethylatedhenegg-whitelysozyme.journalofbiologicalchemistry,1982,257(6):2894-2900(b)walterts,meierc,assenbergr,etal.lysinemethylationasaroutinerescuestrategyforproteincrystallization.structure,2006,14(11):1617-1622)。此外，二甲基化標(biāo)記后賴氨酸殘基的帶電狀態(tài)不改變，因此這種方法也幾乎不會(huì)引入人為的蛋白-蛋白相互作用(文獻(xiàn)8.huqueme,vogelhj.carbon-13nmrstudiesofthelysinesidechainsofcalmodulinanditsproteolyticfragments.journalofproteinchemistry,1993,12(6):695-707)。迄今為止，活性二甲基化標(biāo)記反應(yīng)尚未與質(zhì)譜檢測技術(shù)結(jié)合用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在開發(fā)一種結(jié)合活性共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法,將整體蛋白質(zhì)活性二甲基化標(biāo)記方法與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，基于位于蛋白質(zhì)表面的賴氨酸殘基比掩埋在內(nèi)部或有相互作用的賴氨酸殘基更容易接近和標(biāo)記，揭示蛋白質(zhì)構(gòu)象及賴氨酸局部結(jié)構(gòu)微環(huán)境的相關(guān)信息。本發(fā)明提供一種質(zhì)譜技術(shù)檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法，具體為一種結(jié)合活性共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜技術(shù)來檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法：通過甲醛和氰基硼氫化鈉對賴氨酸側(cè)鏈上的伯胺進(jìn)行還原二甲基化標(biāo)記反應(yīng)，再用質(zhì)譜技術(shù)檢測賴氨酸殘基的標(biāo)記效率。本發(fā)明提供的方法是利用在整體蛋白質(zhì)層次上對賴氨酸殘基進(jìn)行活性化學(xué)標(biāo)記，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)變性、酶解并用質(zhì)譜進(jìn)行檢測，通過質(zhì)譜的鑒定結(jié)果計(jì)算賴氨酸殘基的標(biāo)記效率。具體的,對于構(gòu)象發(fā)生變化的同種蛋白或蛋白復(fù)合物，分別在蛋白層次上通過甲醛和氰基硼氫化鈉進(jìn)行還原二甲基化標(biāo)記反應(yīng)，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的變性和酶解得到肽段溶液，用色譜對肽段溶液進(jìn)行分離再用質(zhì)譜進(jìn)行檢測，通過質(zhì)譜的鑒定結(jié)果計(jì)算賴氨酸殘基的標(biāo)記效率。計(jì)算后若同一賴氨酸殘基的標(biāo)記效率相差25％以上，則視為蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。所述蛋白質(zhì)構(gòu)象變化是指蛋白質(zhì)原本緊密有序的空間結(jié)構(gòu)變得松散，甚至部分氨基酸序列發(fā)生脫落。該方法快速簡單、穩(wěn)定高效，能夠用于考察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的細(xì)微構(gòu)象變化，在標(biāo)記過程中蛋白質(zhì)活性保持不變，不受蛋白質(zhì)大小、溶解度、純度等限制，能夠更加真實(shí)的反應(yīng)蛋白質(zhì)在生理活性狀態(tài)下的構(gòu)象。本發(fā)明提供但不限制于下述質(zhì)譜技術(shù)檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法:(1)取蛋白質(zhì)樣品，溶于ph7.0-8.0的hepes溶液中，得到蛋白質(zhì)溶液；(2)向上述步驟(1)得到的蛋白質(zhì)溶液中加入甲醛(ch2o)和氰基硼氫化鈉 (nabh3cn)；(3)向上述步驟(2)得到的溶液中加入碳酸氫銨(nh4hco3)；(4)將上述步驟(3)得到的溶液煮沸，使蛋白變性，然后加入蛋白酶，20-40℃水浴中酶解得到肽段溶液；(5)對上述步驟(4)得到的酶解肽段溶液酸化處理，進(jìn)行液相色譜分離和質(zhì)譜檢測；(6)將上述步驟(5)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，根據(jù)檢索結(jié)果計(jì)算各個(gè)賴氨酸殘基的標(biāo)記效率。本發(fā)明采用有機(jī)溶劑、紫外光照、高溫加熱等處理得到發(fā)生構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)。步驟(1)所述的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的濃度為0.01-10μg/μl，較低的蛋白質(zhì)濃度使得進(jìn)行活性標(biāo)記反應(yīng)時(shí)速度較緩慢。步驟(2)所述的ch2o和nabh3cn的終濃度為0.01-100mmol/l，反應(yīng)溫度為4-40℃，反應(yīng)時(shí)間為5-200min，保證蛋白保持活性，且能夠體現(xiàn)位于蛋白質(zhì)不同位置的賴氨酸殘基的標(biāo)記效率差異。步驟(2)中甲醛和氰基硼氫化鈉的摩爾濃度比的范圍為1-10；步驟(3)中碳酸氫銨與甲醛的摩爾濃度比的范圍為10-100；步驟(4)中煮沸溫度控制在90-100℃范圍內(nèi)。步驟(5)中所述液相色譜分離的具體步驟和參數(shù)條件為：液相色譜儀：thermoaccela600；色譜柱：c18填料填裝的毛細(xì)管柱(75μm內(nèi)徑,15cm長)；流動(dòng)相：水(a)和乙腈(b)；梯度洗脫程序：0-2min，1％b-10％b；2-92min，10％b-35％；92-95min，35％b-80％b；95-105min，80％b；105-120min，0％b；流速：300nl/min；進(jìn)樣量：10μl；步驟(5)中所述質(zhì)譜檢測的具體步驟和參數(shù)條件為：質(zhì)譜儀：thermoltq-orbitrapvelos；離子傳輸毛細(xì)管：250℃；噴霧電壓：1.8kv；歸一化碰撞能量：35％；采用數(shù)據(jù)依賴模式進(jìn)行采集，包含一次全掃描(m/z400-2000)；分辨率：60000；動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為：重復(fù)次數(shù)為1，重復(fù)容忍時(shí)間為30s，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為120s。所有樣品均按上述的液相色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測。所述賴氨酸殘基標(biāo)記效率的計(jì)算方法是：l賴氨酸＝(n1/n2)×100％式中，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標(biāo)記效率，n1為質(zhì)譜鑒定到的標(biāo)記肽段的譜 圖數(shù)，n2為質(zhì)譜鑒定到的相應(yīng)標(biāo)記和非標(biāo)記形式肽段的總譜圖數(shù)；或,l賴氨酸＝(a1/a2)×100％式中，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標(biāo)記效率，a1為質(zhì)譜鑒定到的標(biāo)記肽段的質(zhì)譜檢測峰面積，n2為質(zhì)譜鑒定到的相應(yīng)標(biāo)記和非標(biāo)記形式肽段的總峰面積。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：通過賴氨酸活性條件下共價(jià)化學(xué)標(biāo)記的效率體現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，賴氨酸標(biāo)記效率通過質(zhì)譜檢測得到。該方法快速簡單、穩(wěn)定高效，能夠用于考察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的細(xì)微構(gòu)象變化，在標(biāo)記過程中蛋白質(zhì)活性保持不變，不受蛋白質(zhì)大小、溶解度、純度等限制，能夠更加真實(shí)的反應(yīng)蛋白質(zhì)在生理活性狀態(tài)下的構(gòu)象。附圖說明圖1為本方法的示意圖，在整體蛋白質(zhì)層次上對賴氨酸殘基進(jìn)行活性化學(xué)標(biāo)記，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)變性、酶解并用質(zhì)譜進(jìn)行檢測，通過質(zhì)譜的鑒定結(jié)果計(jì)算賴氨酸殘基的標(biāo)記效率。圖2為實(shí)施例1肌紅蛋白和脫輔基肌紅蛋白的紫外-可見光譜圖，橫坐標(biāo)為測定波長，縱坐標(biāo)為吸光度。圖3為實(shí)施例1肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)圖，來源于pdb文件1ymb。(1)lys-46局部結(jié)構(gòu)的微環(huán)境。(2)lys-78局部結(jié)構(gòu)的微環(huán)境。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。實(shí)施例1蛋白質(zhì)樣品的活性共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜檢測選取肌紅蛋白(myoglobin，mb)和脫輔基肌紅蛋白(apomyoglobin，apomb)為蛋白質(zhì)樣品。apomb是mb脫去輔基血紅素后的產(chǎn)物，二者的結(jié)構(gòu)十分相近，除了apomb的ef、f和fg區(qū)結(jié)構(gòu)變得松散(eliezerd,wrightpe.isapomyoglobinamoltenglobule？structuralcharacterizationbynmr.journalofmolecularbiology,1996,263(4):531-538)。(1)取mb和apomb，質(zhì)量分別為100μg，溶于1ml的20mmol/lph7.0的hepes溶液中，使溶液中蛋白質(zhì)的濃度為0.1μg/μl；(2)向上述步驟(1)得到的蛋白質(zhì)溶液中加入3.2μl4％ch2o和3.2μl0.6mol/lnabh3cn，使nabh3cn的終濃度為2mmol/l，室溫下反應(yīng)30min；(3)向上述步驟(2)得到的溶液中加入50μl1mol/lnh4hco3，至nh4hco3的終濃度為50mmol/l，室溫下反應(yīng)20min；(4)將上述步驟(3)得到的溶液在100℃煮沸3min，使蛋白變性，然后加入糜蛋白酶(chymotrypsin)，糜蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:25，37℃水浴中酶解5-6h，得到肽段溶液；(5)對上述步驟(4)得到的酶解肽段溶液酸化處理，進(jìn)行液相色譜分離和質(zhì)譜檢測，檢測條件如下：液相色譜儀：thermoaccela600；色譜柱：c18填料填裝的毛細(xì)管柱(75μm內(nèi)徑,15cm長)；流動(dòng)相：水(a)和乙腈(b)；梯度洗脫程序：0-2min，1％b-10％b；2-92min，10％b-35％b；92-95min，35％b-80％b；95-105min，80％b；105-120min，0％b；流速：300nl/min；進(jìn)樣量：10μl；質(zhì)譜儀：thermoltq-orbitrapvelos；離子傳輸毛細(xì)管：250℃；噴霧電壓：1.8kv；歸一化碰撞能量：35％；采用數(shù)據(jù)依賴模式進(jìn)行采集，包含一次全掃描(m/z400-2000)；分辨率：60000；動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為：重復(fù)次數(shù)為1，重復(fù)容忍時(shí)間為30s，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為120s；(6)將上述步驟(5)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，根據(jù)檢索結(jié)果計(jì)算各個(gè)賴氨酸殘基的標(biāo)記效率，計(jì)算方法如下：l賴氨酸＝(n1/n2)×100％式中，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標(biāo)記效率，n1為質(zhì)譜鑒定到的標(biāo)記肽段的譜圖數(shù)，n2為質(zhì)譜鑒定到的相應(yīng)標(biāo)記和非標(biāo)記形式肽段的譜圖數(shù)。表1為mb和apomb中賴氨酸殘基的標(biāo)記效率，n1為質(zhì)譜鑒定到的標(biāo)記肽段的譜圖數(shù)，n2為質(zhì)譜鑒定到的相應(yīng)標(biāo)記和非標(biāo)記形式肽段的總譜圖數(shù)，l賴氨酸為賴氨酸殘基的標(biāo)記效率。根據(jù)表1可得出，大部分賴氨酸殘基標(biāo)記效率在mb和apomb中一致(標(biāo)記效率相差25％以上視為變化)，這一結(jié)果與已知結(jié)論相符，即mb和apomb的構(gòu)象十分相近，除了apomb的ef、f和fg區(qū)結(jié)構(gòu)變得松散。從表1中也可看出，極少數(shù)賴氨酸殘基的標(biāo)記效率在兩種蛋白質(zhì)中不一致，例如，lys-46在mb中標(biāo)記效率為49％，而在apomb中為99％。還有l(wèi)ys-78,在mb中標(biāo)記效率為69％，而在apomb中為95％。表1圖2所示為mb溶液和apomb溶液的紫外-可見光譜圖。a410/a280小于5％時(shí)，可視為溶液中不含血紅素，其中a410為血紅素在410nm的吸收峰，a280為蛋白在280nm的吸收峰。根據(jù)圖2所示，a410/a280，證明實(shí)驗(yàn)所制備的apomb較純凈，不含血紅素。圖3所示為mb的結(jié)構(gòu)圖，來源于pdb文件1ymb。由圖3(1)可看出，在mb中，lys-46側(cè)鏈的氨基與血紅素的羰基形成氫鍵，因此標(biāo)記效率較低；而在apomb中血紅素被脫去后，這種相互作用不存在，因此lys-46幾乎被完全標(biāo)記。由圖3(2)可看出，在mb中，lys-78側(cè)鏈的氨基與glu-19側(cè)鏈的羰基形成氫鍵，而lys-78非常接近ef區(qū)，因此在apomb中這種相互作用被破壞，導(dǎo)致lys-78的標(biāo)記效率明顯不同。前文已提及，mb和apomb的構(gòu)象十分相近，除了apomb的ef、f和fg區(qū)結(jié)構(gòu)變得松散，lys-46和lys-78在mb和apomb中標(biāo)記效率的變化正體現(xiàn)了apomb相較于mb在結(jié)構(gòu)上的細(xì)微變化，說明這種結(jié)合活性共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法是切實(shí)可行的，這種方法綜合了化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜技術(shù)在提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息上的優(yōu)點(diǎn)，并且首次將還原性二甲基標(biāo)記反應(yīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種結(jié)合活性共價(jià)化學(xué)標(biāo)記和質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法。該方法快速簡單、穩(wěn)定高效，賴氨酸殘基標(biāo)記效率的變化(25％以上)反應(yīng)了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，該方法能夠用于考察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的細(xì)微構(gòu)象變化，在標(biāo)記過程中蛋白質(zhì)活性保持不變，不受蛋白質(zhì)大小、溶解度、純度等限制，能夠更加真實(shí)的反應(yīng)蛋白質(zhì)在生理活性狀態(tài)下的構(gòu)象。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12