本發(fā)明涉及熒光標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光標(biāo)記抗體試劑是一種重要的生物學(xué)/醫(yī)學(xué)檢測(cè)試劑，其熒光檢測(cè)原理是：抗體與待測(cè)樣品中的抗原特異性結(jié)合后，用特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射樣品，激發(fā)抗體上標(biāo)記的熒光素，然后檢測(cè)熒光素發(fā)射的熒光。熒光的波長(zhǎng)與激發(fā)光有一定差異(一般大于激發(fā)光)，因此可以用濾光片或單色器將熒光與激發(fā)光分離，實(shí)現(xiàn)高信噪比的檢測(cè)。運(yùn)用此原理的檢測(cè)儀器有流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、熒光光譜儀等；檢測(cè)方法有流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光成像等。

熒光檢測(cè)的一個(gè)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)是，可以對(duì)同一樣品進(jìn)行多通道檢測(cè)。即用超過2種抗體與樣品進(jìn)行反應(yīng)，不同抗體上標(biāo)記不同熒光素，而這些熒光素可以被相同或不同的激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射出不同波段的熒光，用濾光片或單色器將不同波段熒光分離后進(jìn)行檢測(cè)，可以獲得樣品中多種抗原的相關(guān)信息。

隨著熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，更多參數(shù)檢測(cè)成為了科研或臨床應(yīng)用的新需求，參數(shù)的增多需要更多的檢測(cè)通道以及更多種類熒光素的支持，且這些熒光素應(yīng)能夠被同一波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)以簡(jiǎn)化儀器配置并降低儀器成本。

然而，目前的多種熒光素支持的多通道熒光檢測(cè)技術(shù)仍有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種制備過程簡(jiǎn)單，成本低，且回收率高，推廣應(yīng)用價(jià)值高的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物以及利用其的多通道熒光檢測(cè)手段。

需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

針對(duì)多種熒光素支持的多通道熒光檢測(cè)技術(shù)，目前流式廠商為多參數(shù)分析所提供的熒光素除常規(guī)的fitc、pe等熒光素外，串聯(lián)熒光素(tandemdye)成為了一種很好的選擇。例如，cyanine7熒光素本身不能被480～540nm或630nm的激發(fā)光激發(fā)；但將cyanine7與pe或apc串聯(lián)后形成pe-cyanine7或apc-cyanine7串聯(lián)熒光素，則pe-cyanine7與pe都可以被480～540nm的激發(fā)光激發(fā)，pe-cyanine7發(fā)射cyanine7的熒光，可以與pe組成2個(gè)檢測(cè)通道；apc-cyanine7與apc都可以被630nm的激發(fā)光激發(fā)，apc-cyanine7發(fā)射cyanine7的熒光，可以與apc組成2個(gè)檢測(cè)通道。

串聯(lián)熒光素形成熒光依據(jù)據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理(fluorescence/resonanceenergytransfer，fret)，即當(dāng)一種熒光素(能量供體donor)的發(fā)射光譜與另一種熒光素(能量受體acceptor)的激發(fā)光譜重疊或更偏短波方向，被激發(fā)光照射的供體可能以非輻射方式將能量轉(zhuǎn)移給受體，受體接受能量發(fā)射熒光。

但是，目前串聯(lián)染料依賴于熒光蛋白如pe、apc等作為供體，且制備熒光標(biāo)記抗體的過程比較復(fù)雜：首先要將受體與供體熒光蛋白共價(jià)偶聯(lián)，第二步將結(jié)合受體的熒光蛋白純化得到串聯(lián)熒光素，第三步將串聯(lián)熒光素和抗體分別用雙功能試劑或二硫鍵還原劑活化，第四部將抗體與串聯(lián)熒光素偶聯(lián)，最后純化得到偶聯(lián)產(chǎn)物。并且，依賴熒光蛋白的串聯(lián)染料標(biāo)記抗體生產(chǎn)成本昂貴，原因是：1、熒光蛋白需從藻類中提取和純化,成本遠(yuǎn)超化學(xué)合成制備的熒光素高；2、制備步驟復(fù)雜，原材料損失大。3.熒光蛋白分子空間位阻大，與抗體標(biāo)記的偶聯(lián)產(chǎn)率低，導(dǎo)致抗體整體回收率低。

而發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，理論分析和實(shí)驗(yàn)顯示，受體和供體無需預(yù)先共價(jià)偶聯(lián)結(jié)合成一個(gè)“串聯(lián)熒光素”，只要其空間位置足夠近就可能發(fā)生fret。并且fret現(xiàn)象并不依賴于熒光蛋白，小分子熒光素之間也可以產(chǎn)生fret能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)一種熒光團(tuán)(受體)的激發(fā)光譜與另一種熒光團(tuán)(配體)的發(fā)射光譜存在重疊，并且這兩種熒光團(tuán)之間的距離小于10nm時(shí)，這兩個(gè)熒光團(tuán)之間可能發(fā)生非輻射的fret作用；而當(dāng)兩種熒光距離較遠(yuǎn)時(shí)，不會(huì)發(fā)生fret作用。由此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將適于發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的多種熒光素同時(shí)標(biāo)記在同一個(gè)抗體分子上，能夠基于fret作用開發(fā)出新的熒光標(biāo)記抗體，其性能與串聯(lián)熒光素標(biāo)記的抗體類似，即可以與熒光供體共用一種波長(zhǎng)的激發(fā)光，而可以發(fā)射熒光受體的熒光，應(yīng)用于熒光檢測(cè)時(shí)，能夠拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，但相對(duì)于串聯(lián)熒光素制備過程簡(jiǎn)單，成本大大降低。

進(jìn)而，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物由以下部分組成：生物高聚物；以及多種熒光素，其中，所述多種熒光素中的每一種各自獨(dú)立地與所述生物高聚物偶聯(lián)，且所述多種熒光素被選擇為適于發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物，其性能與串聯(lián)熒光素標(biāo)記類似，即基于fret原理，其可以與熒光供體共用一種波長(zhǎng)的激發(fā)光，而可以發(fā)射熒光受體的熒光，應(yīng)用于熒光檢測(cè)時(shí)，能夠拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，但相對(duì)于串聯(lián)熒光素，其制備過程簡(jiǎn)單，成本也大大降低，，且回收率高，推廣應(yīng)用價(jià)值高。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種制備摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：將多種熒光素與待標(biāo)記生物高聚物混合，以便獲得所述摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物，其中，所述多種熒光素被選擇為適于發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地制備獲得上述摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物，且制備過程簡(jiǎn)單，操作方便，成本低，得到的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物性能與串聯(lián)熒光素標(biāo)記類似，能夠有效用于熒光檢測(cè)，拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的 要求，且回收率高，易于推廣應(yīng)用。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含：至少一種前面所述的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的試劑盒，其中的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物性能與串聯(lián)熒光素標(biāo)記類似，能夠有效用于熒光檢測(cè)，拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，且生產(chǎn)成本低，回收率高，推廣應(yīng)用價(jià)值高。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了前面所述的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物在流式檢測(cè)或免疫熒光顯微檢測(cè)中的用途。由此，利用摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物進(jìn)行流式檢測(cè)或免疫熒光顯微檢測(cè)等熒光檢測(cè)，能夠拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，且生產(chǎn)成本低，推廣應(yīng)用價(jià)值高。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，cd4-cyanine5單獨(dú)標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，cd4-fitc/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，cd3-cyanine5單獨(dú)標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，cd3-cyanine3/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖；

圖5和圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，cd45-fitc、cd4-fitc/rhodamineb雙抗體流式染色的散點(diǎn)圖；

圖7和圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，cd3-cyanine5單獨(dú)標(biāo)記抗體流式染色的直方圖；

圖9和圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，cd3-fitc/rhodamineb/cyanine5三熒光素?fù)诫s熒光標(biāo)記抗體流式染色的直方圖；

圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物由以下部分組成：生物高聚物；以及多種熒光素，其中，所 述多種熒光素中的每一種各自獨(dú)立地與所述生物高聚物偶聯(lián)，且所述多種熒光素被選擇為適于發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物，無需熒光素間共價(jià)偶聯(lián)，而是均摻雜標(biāo)記在生物高聚物上，也即各自獨(dú)立地與該生物高聚物偶聯(lián)，從而由于位置靠近，也可以實(shí)現(xiàn)和串聯(lián)熒光素類似的能量傳遞，發(fā)生fret，從而其性能與串聯(lián)熒光素類似，其可以與熒光供體共用一種波長(zhǎng)的激發(fā)光，而可以發(fā)射熒光受體的熒光，應(yīng)用于熒光檢測(cè)時(shí)，能夠提供更多的熒光素選擇，但相對(duì)于串聯(lián)熒光素，其制備過程簡(jiǎn)單，成本也大大降低，且回收率高，推廣應(yīng)用價(jià)值高。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，，參照?qǐng)D11，本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物還可以被認(rèn)為是至少由三個(gè)部分組成：熒光供體、熒光受體以及被標(biāo)記生物高聚物，其中熒光供體及熒光受體直接摻雜標(biāo)記在被標(biāo)記生物高聚物上，由熒光供體吸收激發(fā)光，通過fert方式將能量傳遞給熒光受體，熒光受體發(fā)射熒光。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述生物高聚物為蛋白質(zhì)、多肽、核酸或多糖。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述生物高聚物為抗體或抗原，則本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物即為摻雜熒光標(biāo)記抗體或摻雜熒光標(biāo)記抗原。其中，摻雜熒光標(biāo)記抗體中的被標(biāo)記抗體，在免疫檢測(cè)中承擔(dān)特異性識(shí)別抗原的功能，同時(shí)也為熒光供體和熒光受體提供結(jié)合位點(diǎn)。該摻雜熒光標(biāo)記抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，其被標(biāo)記抗體可以來源于動(dòng)物免疫，也可以來源于體外細(xì)胞培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述生物高聚物為抗人cd4單克隆抗體或抗人cd3單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多種熒光素中的每一種均不為熒光蛋白。如前所述，這是因?yàn)椋簾晒獾鞍仔鑿脑孱愔刑崛『图兓?，成本遠(yuǎn)超化學(xué)合成制備的熒光素高；制備步驟復(fù)雜，原材料損失大；熒光蛋白分子空間位阻大，與待標(biāo)記生物高聚物的偶聯(lián)產(chǎn)率低，從而導(dǎo)致制得的摻雜標(biāo)記生物高聚物抗體整體回收率低。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多種熒光素中的每一種均為小分子熒光素。由此，該摻雜標(biāo)記生物高聚物中各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果好，應(yīng)用時(shí)整體回收率高。

需要說明的是，為了與被標(biāo)記生物高聚物結(jié)合，參與標(biāo)記反應(yīng)的熒光素需具有活化的反應(yīng)基團(tuán)。生物高聚物表面通常含有一定數(shù)目的氨基，因此通常選擇含有能與氨基直接進(jìn)行反應(yīng)的活化基團(tuán)，如異硫氰酸基、琥珀酰亞胺基等即可。而熒光供體與熒光受體可以含有相同的活化反應(yīng)基團(tuán)，也可以含有不同的活化反應(yīng)基團(tuán)，但如果含有不同的反應(yīng)基團(tuán)，兩種反應(yīng)基團(tuán)應(yīng)有相似的反應(yīng)條件，如酸堿度、反應(yīng)溫度、離子強(qiáng)度等。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素中的每一種各自獨(dú)立地具有選自異硫氰酸基、琥珀酰亞胺基、氟化苯基、硫代琥珀酰亞胺基、硫代四氟化苯基和氯化磺?；闹辽僖环N活性基團(tuán)。由此，該摻雜標(biāo)記生物高聚物中各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多種熒光素中的每一種各組獨(dú)立地選自cyanine類熒光素和羅丹明類熒光素的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，cyanine類熒光素為選自cyanine3，cyanine3.5，cyanine5，cyanine5.5和cyanine7的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，羅 丹明類熒光素為選自fitc，tritc，rhodamineb，rhodamine101，rhodamine110，rhodamine123，rhodamine700，rhodamine800和rhodamine6g的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為fitc和cyanine5。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為cyanine3和cyanine5。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為fitc和rhodamineb。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為fitc、rhodamineb和cyanine5。由此，利用本發(fā)明的摻雜標(biāo)記生物高聚物進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)，能夠拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求。

此外，需要說明的是，在本文中所采用的表達(dá)方式“多種熒光素”是指至少兩種熒光素。也即，本發(fā)明的摻雜標(biāo)記生物高聚物由生物高聚物和至少兩種熒光素組成，且各種熒光素中的每一種各自獨(dú)立地與所述生物高聚物偶聯(lián)，且各種熒光素被選擇為適于發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

進(jìn)一步，為方便理解，下面以標(biāo)記了3種熒光素的摻雜標(biāo)記生物高聚物為例，列舉本發(fā)明的摻雜標(biāo)記生物高聚物的其中兩種情形：

a.可以以其中的2種熒光素為熒光供體，第3種熒光素為熒光受體，形成本發(fā)明的標(biāo)記了3種熒光素的摻雜標(biāo)記生物高聚物，由此，該摻雜標(biāo)記生物高聚物可以被兩種不同的激發(fā)光激發(fā)，但是兩種不同的激發(fā)光下，發(fā)射的熒光相同，都為熒光受體的熒光。在此情況下，選擇的兩種熒光供體需分別可以與熒光受體發(fā)生fret，并且兩種熒光供體間不發(fā)生fret或fret較弱；

b.可以以其中的1種熒光素為熒光供體，另外2種熒光素為熒光受體，形成本發(fā)明的標(biāo)記了3種熒光素的摻雜標(biāo)記生物高聚物，由此，該摻雜標(biāo)記生物高聚物只能被一種激發(fā)光激發(fā)，但是可以同時(shí)發(fā)出兩種不同的熒光。在此情況下，選擇的兩種熒光受體需分別可以與熒光供體發(fā)生fret，并且兩種熒光受體間不發(fā)生fret或fret較弱。

另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物例如摻雜熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記抗體，對(duì)處理過的組織切片或細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)過清洗、固定等步驟，然后使用熒光顯微鏡對(duì)樣本進(jìn)行觀測(cè)或拍照，能夠有效確定待檢測(cè)物在組織或細(xì)胞中的分布。

其中，將本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物例如摻雜熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記抗體應(yīng)用于免疫熒光顯微檢測(cè)時(shí)，可以將摻雜熒光標(biāo)記抗體與其他熒光標(biāo)記抗體配合使用，條件是：摻雜熒光標(biāo)記抗體以及配合使用的一種或多種熒光標(biāo)記抗體發(fā)出的熒光顏色具有肉眼可以辨別的差異，如此才能通過不同的熒光確認(rèn)不同的待檢測(cè)物質(zhì)的分布。

并且，需要注意的是，當(dāng)摻雜熒光標(biāo)記抗體與其他單色熒光標(biāo)記抗體共同使用并應(yīng)用于流式檢測(cè)時(shí)，摻雜熒光標(biāo)記抗體中參與標(biāo)記的兩種熒光素可以都不與單色熒光標(biāo)記抗體的熒光素相同，但必須滿足：兩種熒光標(biāo)記抗體的激發(fā)光或發(fā)射光(熒光)光譜具有可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的差異，具體地，例如：

1、摻雜熒光標(biāo)記抗體及另一種單色熒光標(biāo)記抗體具有相近的激發(fā)光譜(例如都能被488nm激發(fā)光激發(fā))，但是二者發(fā)出的熒光光譜差異較大，可以被儀器的不同波長(zhǎng)的檢測(cè)通道檢測(cè)(如fitc通道及pe通道)，這種情況是可以配合使用的；

2、摻雜熒光標(biāo)記抗體及另一種單色熒光標(biāo)記抗體所需的激發(fā)光波長(zhǎng)不同(比如一種可被488nm激光激發(fā)，另一種可被630nm激光激發(fā))，但是二者被激發(fā)后發(fā)射出的熒光光譜接近(例如都可被percp通道檢測(cè))，這樣在檢測(cè)時(shí)，流式細(xì)胞儀分兩次分別發(fā)射出兩種不同的激發(fā)光，分別檢測(cè)每次樣品發(fā)出的熒光，獲得兩個(gè)信號(hào)值，這種情況也是可以配合使用的；

3、摻雜熒光標(biāo)記抗體及另一種單色熒光標(biāo)記抗體所需的激發(fā)光波長(zhǎng)不同，二者被激發(fā)后發(fā)射出的熒光光譜也不同時(shí)，也可以配合使用；

4、只有當(dāng)摻雜熒光標(biāo)記抗體及另一種單色熒光標(biāo)記抗體的激發(fā)光或發(fā)射光的光譜均無差異，或者差異不足以被流式細(xì)胞儀檢測(cè)出，那這種情況下兩種熒光標(biāo)記抗體就不能配合使用。

制備摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的方法

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種制備摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括：將多種熒光素與待標(biāo)記生物高聚物混合，以便獲得所述摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物，其中，所述多種熒光素被選擇為適于發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地制備獲得上述摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物，且制備過程簡(jiǎn)單，操作方便，成本低，得到的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物性能與串聯(lián)熒光素標(biāo)記的類似，能夠有效用于熒光檢測(cè)，拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，且回收率高，易于推廣應(yīng)用。

首先，需要說明的是，實(shí)施本發(fā)明的制備摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的方法時(shí)可以從以下幾個(gè)方面著手：

(1)選擇活化熒光供體及活化熒光受體

為了與被標(biāo)記生物高聚物結(jié)合，參與標(biāo)記反應(yīng)的熒光素應(yīng)該具有活化的反應(yīng)基團(tuán)。生物高聚物表面通常含有一定數(shù)目的氨基，因此通常選擇含有能與氨基直接進(jìn)行反應(yīng)的活化基團(tuán)，如異硫氰酸基、琥珀酰亞胺基等。

熒光供體與熒光受體可以含有相同的活化反應(yīng)基團(tuán)，也可以含有不同的活化反應(yīng)基團(tuán)，但如果含有不同的反應(yīng)基團(tuán)，兩種反應(yīng)基團(tuán)應(yīng)有相似的反應(yīng)條件，如酸堿度、反應(yīng)溫度、離子強(qiáng)度等。

(2)熒光供體及熒光受體與被標(biāo)記生物高聚物共價(jià)結(jié)合

將兩種熒光素加入抗體溶液中進(jìn)行反應(yīng)?？梢詫?種熒光素同時(shí)加入生物高聚物溶液反應(yīng)，也可以先加入一種反應(yīng)一定時(shí)間后再加入另一種熒光素進(jìn)行分步反應(yīng)。分步反應(yīng)對(duì)熒光供體和熒光受體反應(yīng)的先后順序沒有要求。具有相同活化反應(yīng)基團(tuán)的熒光素同時(shí)反應(yīng)效果較好，同時(shí)可節(jié)省反應(yīng)時(shí)間；具有不同活化反應(yīng)基團(tuán)的熒光素分步反應(yīng)效果較好。

而反應(yīng)時(shí)間則可以根據(jù)反應(yīng)基團(tuán)種類、反應(yīng)溫度、反應(yīng)溶液體系靈活選擇。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述反應(yīng)時(shí)間根據(jù)反應(yīng)基團(tuán)種類、反應(yīng)溫度、反應(yīng)溶液體系有所不同，通常反應(yīng)時(shí)間為10分鐘-4小時(shí)；所述反應(yīng)溫度范圍在4℃-35℃均可。反應(yīng)在低溫時(shí)需要的反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，高溫時(shí)反應(yīng)時(shí)間較短，根據(jù)被標(biāo)記抗體可耐受的溫度進(jìn)行選擇。優(yōu)選的時(shí)間范圍 與溫度范圍為：20分鐘-2小時(shí)，15℃-30℃。

所述反應(yīng)溶液為一種緩沖溶液，可以為反應(yīng)提供穩(wěn)定的酸堿度、離子強(qiáng)度。緩沖體系可以為磷酸鈉緩沖體系、碳酸鈉緩沖體系、硼酸緩沖體系等任何可以提供所需條件的緩沖體系。所述緩沖體系應(yīng)能夠提供ph值在7.0-10.0的酸堿度，優(yōu)選的ph值范圍為8.5-9.5。緩沖液中可加入氯化鈉、氯化鉀等鹽類調(diào)節(jié)溶液離子強(qiáng)度，也可以不加。

摻雜熒光標(biāo)記反應(yīng)中，熒光素與抗體的比例沒有特別限制，但通常情況下熒光素與抗體的摩爾比為2:1到200:1范圍內(nèi)，優(yōu)選5:1到50:1的比例。熒光供體與熒光受體的比例也無特別限制，通常選擇熒光供體與熒光受體的摩爾比為1:50到50:1的范圍內(nèi)，優(yōu)選1:20到20:1的比例。

(3)摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的純化

標(biāo)記反應(yīng)結(jié)束后可以進(jìn)行純化，從而將摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物與未結(jié)合的游離熒光素進(jìn)行分離。摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的純化方法有很多，常規(guī)的可將抗體與熒光素分離的純化方法均可，如層析法、透析法或超濾法。具體地，例如：針對(duì)2種熒光素同時(shí)加入生物高聚物溶液進(jìn)行反應(yīng)的方式，僅需在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行一步純化；針對(duì)2種熒光素分步加入生物高聚物溶液中、分2個(gè)階段進(jìn)行反應(yīng)的方式，可以選擇只在最終反應(yīng)完畢后進(jìn)行一步純化，也可以進(jìn)行2次純化，即在第1種熒光素反應(yīng)完畢后增加一次純化過程。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，通過凝膠層析柱分離純化摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物。反應(yīng)混合液加入預(yù)平衡的凝膠層析柱，通過離心的方式獲得含有摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的流出液，未結(jié)合熒光素保留在層析柱中。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的方法包括：在4℃-35℃的溫度下，將所述多種熒光素與所述待標(biāo)記生物高聚物混合，并使所得到的混合物反應(yīng)10分鐘～4小時(shí)。由此，各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果好，獲得的摻雜標(biāo)記生物高聚物應(yīng)用時(shí)整體回收率高。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，在15℃-30℃的溫度下，將所述多種熒光素與所述待標(biāo)記生物高聚物混合，并使所得到的混合物反應(yīng)20分鐘-2小時(shí)。由此，各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果突出，獲得的摻雜標(biāo)記生物高聚物應(yīng)用時(shí)整體回收率很高。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述混合是在ph為7.0～10.0的溶液中進(jìn)行的，優(yōu)選地，所述溶液的ph為8.5～9.5。由此，各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述待標(biāo)記生物高聚物被預(yù)先溶解在緩沖液中，所述緩沖液的ph為7.0～10.0，優(yōu)選8.5～9.5，其中，所述緩沖液為選自磷酸鈉緩沖液、碳酸鈉緩沖液、硼酸緩沖液的至少之一。由此，反應(yīng)效果好，各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果突出，獲得的摻雜標(biāo)記生物高聚物應(yīng)用時(shí)整體回收率高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述待標(biāo)記生物高聚物在溶解得到的混合溶液中的濃度為3-7mg/ml，優(yōu)選5mg/ml。由此，有利于反應(yīng)的進(jìn)行，使得各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果好，獲得的摻雜標(biāo)記生物高聚物應(yīng)用時(shí)整體回收率高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多種熒光素中的每一種與所述待標(biāo)記生物高聚物的摩爾比為2:1-200:1，優(yōu)選5:1-50:1。由此，各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果好，且容易控制各種 熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)比例。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多種熒光素中作為熒光供體的熒光素與作為熒光受體的熒光素的摩爾比為1:50-50:1，優(yōu)選1:20-20:1。由此，能夠很好地控制熒光供體與熒光受體的比例，從而有利于有效獲得目的摻雜標(biāo)記生物高聚物。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述生物高聚物為蛋白質(zhì)、多肽、核酸或多糖。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述生物高聚物為抗體或抗原，則本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物即為摻雜熒光標(biāo)記抗體或摻雜熒光標(biāo)記抗原。其中，摻雜熒光標(biāo)記抗體中的被標(biāo)記抗體，在免疫檢測(cè)中承擔(dān)特異性識(shí)別抗原的功能，同時(shí)也為熒光供體和熒光受體提供結(jié)合位點(diǎn)。該摻雜熒光標(biāo)記抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體，其被標(biāo)記抗體可以來源于動(dòng)物免疫，也可以來源于體外細(xì)胞培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述生物高聚物為抗人cd4單克隆抗體或抗人cd3單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素中的每一種各自獨(dú)立地具有選自異硫氰酸基、琥珀酰亞胺基、氟化苯基、硫代琥珀酰亞胺基、硫代四氟化苯基和氯化磺酰基的至少一種活性基團(tuán)。由此，各種熒光素與生物高聚物的偶聯(lián)效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多種熒光素中的每一種各組獨(dú)立地選自cyanine類熒光素和羅丹明類熒光素的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，cyanine類熒光素為選自cyanine3，cyanine3.5，cyanine5，cyanine5.5和cyanine7的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，羅丹明類熒光素為選自fitc，tritc，rhodamineb，rhodamine101，rhodamine110，rhodamine123，rhodamine700，rhodamine800和rhodamine6g的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為fitc和cyanine5。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為cyanine3和cyanine5。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為fitc和rhodamineb。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述多種熒光素為fitc、rhodamineb和cyanine5。由此，利用制得的摻雜標(biāo)記生物高聚物進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)，能夠拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求。

試劑盒

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試劑盒包含：至少一種前面所述的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的試劑盒，其中的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物性能與串聯(lián)熒光素標(biāo)記的類似，能夠有效用于熒光檢測(cè)，拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，且生產(chǎn)成本低，回收率高，推廣應(yīng)用價(jià)值高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述生物高聚物為蛋白質(zhì)、多肽、核酸或多糖，優(yōu)選抗體或蛋白類抗原。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述生物高聚物為抗人cd4單克隆抗體或抗人cd3單克隆抗體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包含：至少一種熒光標(biāo)記生物高聚物。由此，可以將摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物與其他熒光標(biāo)記生物高聚物聯(lián)合使用，用于熒光檢測(cè)例 如免疫熒光顯微檢測(cè)或流式檢測(cè)。如前所述，當(dāng)將摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物與其他熒光標(biāo)記生物高聚物配合使用并應(yīng)用于免疫熒光顯微檢測(cè)時(shí)，條件是：摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物以及配合使用的一種或多種熒光標(biāo)記生物高聚物發(fā)出的熒光顏色具有肉眼可以辨別的差異，如此才能通過不同的熒光確認(rèn)不同的待檢測(cè)物質(zhì)的分布。當(dāng)摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物與其他單色熒光標(biāo)記生物高聚物共同使用并應(yīng)用于流式檢測(cè)時(shí)，摻雜熒光標(biāo)記抗體中參與標(biāo)記的兩種熒光素可以都不與單色熒光標(biāo)記生物高聚物的熒光素相同，但必須滿足：兩種熒光標(biāo)記生物高聚物的激發(fā)光或發(fā)射光(熒光)光譜具有可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的差異。

根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述熒光標(biāo)記生物高聚物的熒光標(biāo)記物為小分子熒光素、熒光蛋白或串聯(lián)染料，所述熒光標(biāo)記生物高聚物和所述摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物能夠聯(lián)合使用。

需要說明的是，前面描述的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于本發(fā)明的試劑盒，在此不再贅述。

用途

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了前面所述的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物在流式檢測(cè)或免疫熒光顯微檢測(cè)中的用途。由此，利用本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物進(jìn)行流式檢測(cè)或免疫熒光顯微檢測(cè)等熒光檢測(cè)，能夠提供更多的激發(fā)光或檢測(cè)通道的選擇，從而拓寬熒光標(biāo)記物種類的選擇空間，增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，并降低對(duì)檢測(cè)儀器的要求，且生產(chǎn)成本低，且回收率高，推廣應(yīng)用價(jià)值高。

如前所述，本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物在用于熒光檢測(cè)時(shí)，提供了更多的激發(fā)光或檢測(cè)通道的選擇性。其中，兩種熒光素的摻雜熒光標(biāo)記物，只具有一種激發(fā)光譜(一種最適的激發(fā)波長(zhǎng))和一種發(fā)射光譜(一種最適的檢測(cè)通道)；而三種或以上熒光素的摻雜熒光標(biāo)記物，可能具有多種激發(fā)光譜(適用多種激發(fā)波長(zhǎng))和多種發(fā)射光譜(多種檢測(cè)通道)。

對(duì)于兩種熒光素標(biāo)記的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物來說，一種熒光素作為供體，決定了摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的激發(fā)光譜(從而決定了適用儀器的激發(fā)波長(zhǎng))；另一種熒光素作為受體，決定了摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物的發(fā)射光譜(從而決定了適用儀器的檢測(cè)通道)。因此，如果與單純標(biāo)記有一種熒光素的生物高聚物相比，例如與供體相比，摻雜熒光標(biāo)記物具有相同的激發(fā)光譜和不同的發(fā)射光譜，相當(dāng)于在檢測(cè)時(shí)多了對(duì)于檢測(cè)通道的選擇；如果與受體相比，摻雜熒光標(biāo)記物具有相同的發(fā)射光譜和不同的激發(fā)光譜，相當(dāng)于在檢測(cè)時(shí)多了對(duì)儀器激發(fā)波長(zhǎng)的選擇。無論是增加對(duì)檢測(cè)通道的選擇，還是增加對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)的選擇，都是對(duì)熒光檢測(cè)技術(shù)中多參數(shù)檢測(cè)需求的滿足。

以fitc/cyanine5摻雜標(biāo)記熒光抗體為例，它可以被488nm激光激發(fā)，發(fā)出的熒光可被percp檢測(cè)通道檢測(cè)(＞670nm)。它與fitc具有相同的激發(fā)波長(zhǎng)，但檢測(cè)通道不同；與cyanine5具有相同的檢測(cè)通道，但激發(fā)波長(zhǎng)不同(詳見下表)。

由此，當(dāng)在一項(xiàng)流式檢測(cè)中需要對(duì)兩個(gè)參數(shù)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果一種抗體標(biāo)記fitc，另一種抗體標(biāo)記cyanine5，那就需要檢測(cè)儀器同時(shí)具有488nm及630nm兩種激發(fā)光，并且具有fitc及percp兩種檢測(cè)通道。而本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記抗體，提供了fitc/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體，當(dāng)它與fitc配合使用時(shí)，降低了對(duì)儀器激發(fā)波長(zhǎng)的要求；當(dāng)與cyanine5配合使用時(shí)，降低了對(duì)儀器檢測(cè)通道的要求。

更進(jìn)一步，當(dāng)進(jìn)行三參數(shù)或更多參數(shù)的檢測(cè)時(shí)，熒光素的選擇變得更加復(fù)雜也更加困難，對(duì)儀器的要求也變得更高。而本發(fā)明的摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物，能夠?yàn)闄z測(cè)提供更大的熒光素選擇空間，從而增加了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，也降低了對(duì)檢測(cè)儀器的要求，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有顯著的進(jìn)步。

需要說明的是，前面針對(duì)摻雜熒光標(biāo)記生物高聚物應(yīng)用方面的描述，同樣適用于本發(fā)明的用途，在此不再贅述。

下面通過具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。這些實(shí)施例僅僅為了說明的目的，而不以任何方式限制本發(fā)明。需要說明的是，除非特別說明，在下面的實(shí)施例中所采用的試劑和設(shè)備均為市售可得的。

以下所有實(shí)施例中所使用的流式細(xì)胞儀為深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)的bricytee6流式細(xì)胞分析儀。

以下實(shí)施例中使用的試劑純度均為分析純。

實(shí)施例中所使用的試劑：

碳酸鈉緩沖液：稱取na2co31.0g，nahco37.6g溶解在蒸餾水中，naoh調(diào)節(jié)ph值至9.5，定容至500ml。

pbs：稱取nah2po4·2h2o0.4g，na2hpo4·12h2o2.2g，nacl8.5g，溶解在蒸餾水中，定容至1l。

溶血?jiǎng)毫魇郊?xì)胞儀用溶血?jiǎng)?；品牌：邁瑞；規(guī)格：50ml。

實(shí)施例1：fitc和cyanine5摻雜

選取fitc(異硫氰酸熒光素，含有異硫氰酸基)為熒光供體，cyanine5-琥珀酰亞胺酯(含有琥珀酰亞胺基)為熒光受體，對(duì)抗人cd4單克隆抗體進(jìn)行摻雜熒光標(biāo)記。

使用碳酸鈉緩沖液將5.0mg抗體溶液稀釋至5mg/ml，向抗體溶液中加入dmso溶解的fitc，使反應(yīng)液中fitc與抗體的摩爾比為5:1，充分混勻后避光室溫反應(yīng)2小時(shí)。再向抗體溶液中加入dmso溶解的cyanine5，使反應(yīng)液中cyanine5與抗體的摩爾比為10:1，充分混勻后避光室溫繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)后的抗體溶液加入到使用pbs平衡的離心脫鹽柱中，離心獲得純化的cd4-fitc/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體共計(jì)4.7mg。計(jì)算整個(gè)標(biāo)記過程中抗體的整體回收率為94％。

取100μl人外周血樣本，再加入1.0μgcd4-fitc/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體共同孵育， 經(jīng)過溶血、洗滌后使用流式細(xì)胞分析儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。使用cyanine5單獨(dú)標(biāo)記的cd4抗體，以相同方式進(jìn)行流式檢測(cè)，作為對(duì)照。

cd4-cyanine5單獨(dú)標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖，如圖1。其中q3區(qū)域?yàn)榱馨图?xì)胞。由于cyanine5不能被488nm激光激發(fā)，因此無法區(qū)分外周血樣本中的cd4陰/陽(yáng)性淋巴細(xì)胞。

cd4-fitc/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖，如圖2。經(jīng)過摻雜熒光標(biāo)記抗體染色后，原本不能被488nm激光激發(fā)的cyanine5熒光素，在fitc存在的情況下發(fā)生了fret，由fitc吸收激發(fā)光，由cyanine5發(fā)出可被percp通道(＞670nm)檢測(cè)的熒光，從而區(qū)分出外周血樣本中的cd4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞(q4)及cd4陰性淋巴細(xì)胞(q3)。

結(jié)論：

1.以fitc為熒光供體，cyanine5為熒光受體，可以制備摻雜熒光標(biāo)記抗體；

2.熒光供體及熒光受體分別含有異硫氰酸基、琥珀酰亞胺基，可以用于制備摻雜熒光標(biāo)記抗體；

3.按上述制備方法制備的摻雜熒光標(biāo)記抗體，其回收率可以達(dá)到92％，遠(yuǎn)高于熒光蛋白標(biāo)記抗體及串聯(lián)染料標(biāo)記抗體；

4.按上述制備方法制備的摻雜熒光標(biāo)記抗體，可以用于流式檢測(cè)。

實(shí)施例2：cyanine3和cyanine5摻雜

選取cyanine3-琥珀酰亞胺酯(含有琥珀酰亞胺基)為熒光供體，cyanine5-琥珀酰亞胺酯(含有琥珀酰亞胺基)為熒光受體，對(duì)抗人cd3單克隆抗體進(jìn)行摻雜熒光標(biāo)記。

使用碳酸鈉緩沖液將2mg抗體溶液稀釋至5mg/ml，向抗體溶液中分別加入dmso溶解的cyanine3及cyanine5熒光素，使反應(yīng)液中cyanine3與抗體的摩爾比為20:1，cyanine5與抗體的摩爾比為30:1。充分混勻后避光室溫反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)后的抗體溶液加入到使用pbs平衡的離心脫鹽柱中，離心獲得純化的cd3-cyanine3/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體共計(jì)1.78mg。計(jì)算整個(gè)標(biāo)記過程中抗體的整體回收率為89％。

取100μl人外周血樣本，再加入2.0μgcd3-cyanine3/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體共同孵育，經(jīng)過溶血、洗滌后使用流式細(xì)胞分析儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。使用cyanine5單獨(dú)標(biāo)記的cd3抗體，以相同方式進(jìn)行流式檢測(cè)，作為對(duì)照。

cd3-cyanine5單獨(dú)標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖，如圖3。其中q3區(qū)域?yàn)榱馨图?xì)胞。由于cyanine5不能被488nm激光激發(fā)，因此無法區(qū)分外周血樣本中的cd3陰/陽(yáng)性淋巴細(xì)胞。

cd3-cyanine3/cyanine5摻雜熒光標(biāo)記抗體流式染色的散點(diǎn)圖，如圖4。經(jīng)過摻雜熒光標(biāo)記抗體染色后，原本不能被488nm激光激發(fā)的cyanine5熒光素，在cyanine3存在的情況下發(fā)生了fret，由cyanine3吸收激發(fā)光，由cyanine5發(fā)出可被percp通道(＞670nm)檢測(cè)的熒光，從而區(qū)分出外周血樣本中的cd3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞(q1)及cd3陰性淋巴細(xì)胞(q3)。

結(jié)論：

1.以cyanine3為熒光供體，cyanine5為熒光受體，可以制備摻雜熒光標(biāo)記抗體；

2.熒光供體及熒光受體含有相同的琥珀酰亞胺基，可以用于制備摻雜熒光標(biāo)記抗體；

3.按上述制備方法制備的摻雜熒光標(biāo)記抗體，其回收率可以達(dá)到89％，遠(yuǎn)高于熒光蛋白 標(biāo)記抗體及串聯(lián)染料標(biāo)記抗體；

4.按上述制備方法制備的摻雜熒光標(biāo)記抗體，可以用于流式檢測(cè)。

實(shí)施例3：fitc和rhodamineb摻雜

選取fitc(異硫氰酸熒光素，含有異硫氰酸基)為熒光供體，rhodamineb(含有異硫氰酸基)為熒光受體，對(duì)抗人cd4單克隆抗體進(jìn)行摻雜熒光標(biāo)記。

使用碳酸鈉緩沖液將5.0mg抗體溶液稀釋至5mg/ml，向抗體溶液中分別加入dmso溶解的fitc及rhodamineb，使反應(yīng)液中fitc與抗體的摩爾比為20:1，rhodamineb與抗體的摩爾比為20:1。充分混勻后避光室溫反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)后的抗體溶液加入到使用pbs平衡的離心脫鹽柱中，離心獲得純化的cd4-fitc/rhodamineb摻雜熒光標(biāo)記抗體共計(jì)4.5mg。計(jì)算整個(gè)標(biāo)記過程中抗體的整體回收率為90％。

由一瓶cd4-fitc/rhodamineb摻雜熒光標(biāo)記抗體試劑，與一瓶cd45-fitc單獨(dú)標(biāo)記熒光抗體組合成一種cd45/cd4雙色檢測(cè)試劑盒。

取100μl人外周血樣本，分別加入2.0μgcd45-fitc單獨(dú)標(biāo)記熒光抗體及1.0μgcd4-fitc/rhodamineb摻雜熒光標(biāo)記抗體共同孵育，經(jīng)過溶血后使用流式細(xì)胞分析儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

cd45-fitc、cd4-fitc/rhodamineb雙抗體流式染色的散點(diǎn)圖，如圖5(fitc通道為橫坐標(biāo)，ssc通道為縱坐標(biāo))及圖6(pe通道為橫坐標(biāo)，fitc通道為縱坐標(biāo))。

經(jīng)過摻雜熒光標(biāo)記抗體染色后，原本不能被488nm激光激發(fā)的rhodamineb熒光素，在fitc存在的情況下發(fā)生了fret，由fitc吸收激發(fā)光，由rhodamineb發(fā)出可被pe通道(565nm-605nm)檢測(cè)的熒光，從而區(qū)分出外周血樣本中的cd4陽(yáng)性淋巴細(xì)胞(圖6-q2)及cd4陰性淋巴細(xì)胞(圖6-q1)。

cd4-fitc/rhodamineb摻雜熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行流式染色時(shí)，加入cd45-fitc熒光標(biāo)記抗體，可以起到區(qū)分淋巴細(xì)胞及紅細(xì)胞碎片的作用。人外周血樣本中的淋巴細(xì)胞高表達(dá)cd45抗原，同時(shí)具有較低的側(cè)向散射熒光，淋巴細(xì)胞在以fitc通道為橫坐標(biāo)，ssc通道為縱坐標(biāo)的散點(diǎn)圖中的位置如圖5-p1所示。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析淋巴細(xì)胞中cd4抗原的表達(dá)情況(圖6)，使得檢測(cè)結(jié)果更加精確，同時(shí)省去了流式檢測(cè)樣本制備中的洗滌步驟。

結(jié)論：

1.以ftic為熒光供體，rhodamineb為熒光受體，可以制備摻雜熒光標(biāo)記抗體；

2.熒光供體及熒光受體含有相同的異硫氰酸基，可以用于制備摻雜熒光標(biāo)記抗體；

3.按上述制備方法制備的摻雜熒光標(biāo)記抗體，其回收率可以達(dá)到90％，遠(yuǎn)高于熒光蛋白標(biāo)記抗體及串聯(lián)染料標(biāo)記抗體；

4.按上述制備方法制備的摻雜熒光標(biāo)記抗體，可以與其他熒光標(biāo)記抗體組合成一種試劑盒，并用于流式檢測(cè)。

實(shí)施例4：fitc、rhodamineb和cyanine5摻雜

選取fitc(異硫氰酸熒光素，含有異硫氰酸基)為第一熒光供體，rhodamineb(異硫氰酸基)為第二熒光供體，cyanine5-琥珀酰亞胺酯(含有琥珀酰亞胺基)為熒光受體，對(duì)抗 人cd3單克隆抗體進(jìn)行摻雜熒光標(biāo)記。

使用碳酸鈉緩沖液將5.0mg抗體溶液稀釋至5mg/ml，向抗體溶液中分別加入dmso溶解的fitc、及rhodamineb，使反應(yīng)液中fitc及rhodamineb與抗體的摩爾比均為10:1，充分混勻后避光室溫反應(yīng)2小時(shí)。再向抗體溶液中加入dmso溶解的cyanine5，使反應(yīng)液中cyanine5與抗體的摩爾比為10:1，充分混勻后避光室溫繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。將反應(yīng)后的抗體溶液加入到使用pbs平衡的離心脫鹽柱中，離心獲得純化的cd3-fitc/rhodamineb/cyanine5三熒光素?fù)诫s熒光標(biāo)記抗體共計(jì)4.6mg。計(jì)算整個(gè)標(biāo)記過程中抗體的整體回收率為92％。

取100μl人外周血樣本，加入2.0μgcd3-fitc/rhodamineb/cyanine5三熒光素?fù)诫s熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行孵育，經(jīng)過溶血后使用流式細(xì)胞分析儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。使用cyanine5單獨(dú)標(biāo)記的cd3抗體，以相同方式進(jìn)行流式檢測(cè)，作為對(duì)照。

cd3-cyanine5單獨(dú)標(biāo)記抗體流式染色的直方圖，如圖7及圖8。其中圖7為使用488nm激光激發(fā)，圖8為使用532nm激光激發(fā)。由于cyanine5不能被上述兩種激光激發(fā)，因此無法區(qū)分外周血樣本中的cd3陰/陽(yáng)性淋巴細(xì)胞。

cd3-fitc/rhodamineb/cyanine5三熒光素?fù)诫s熒光標(biāo)記抗體流式染色的直方圖，如圖9及圖10。其中圖9為使用488nm激光激發(fā)，圖10為使用532nm激光激發(fā)。

經(jīng)過cd3-fitc/rhodamineb/cyanine5三熒光素?fù)诫s熒光標(biāo)記抗體染色后，原本不能被488nm激光激發(fā)的cyanine5熒光素，在fitc存在的情況下發(fā)生了fret，由fitc吸收488nm激發(fā)光，由cyanine5發(fā)出可被percp通道(＞670nm)檢測(cè)的熒光，從而區(qū)分出外周血樣本中的cd3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞(b3-r)及cd3陰性淋巴細(xì)胞(b3-l)。原本不能被532nm激光激發(fā)的cyanine5熒光素，在rhodamineb存在的情況下發(fā)生了fret，由rhodamineb吸收532nm激發(fā)光，由cyanine5發(fā)出可被percp通道(＞670nm)檢測(cè)的熒光，從而區(qū)分出外周血樣本中的cd3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞(b3-r)及cd3陰性淋巴細(xì)胞(b3-l)。

結(jié)論：

1.以ftic為熒光供體，rhodamineb為第二熒光供體，cyanine5為熒光受體，可以制備三熒光素?fù)诫s熒光標(biāo)記抗體；

2.上述三熒光素?fù)诫s標(biāo)記熒光抗體，兩種熒光供體可以分別被不同的激光激發(fā)，分別與熒光受體發(fā)生fret；

3.按上述制備方法制備的摻雜熒光標(biāo)記抗體，其回收率可以達(dá)到92％，遠(yuǎn)高于熒光蛋白標(biāo)記抗體及串聯(lián)染料標(biāo)記抗體。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。