本發(fā)明涉及一種階梯式定量檢測血漿中血清白蛋白及纖維蛋白原的方法，具體涉及一種階梯式點亮型定量檢測血漿中血清白蛋白及纖維蛋白原的方法，屬于生物熒光標(biāo)記領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
血清白蛋白作為一種人血漿內(nèi)主要的蛋白質(zhì)，占血漿蛋白質(zhì)總量的50％。對于一個正常人來說，每天10-15克的血清白蛋白在肝臟內(nèi)被合成，其中40％的血清白蛋白通過血液與間質(zhì)的交換作用被釋放到血管中。血清白蛋白含有一條具有585個氨基酸殘基的多肽鏈、一個色氨酸殘基、一個半胱氨巰基自由基，在血漿中的半衰期為15-19天。它的二級結(jié)構(gòu)由三個結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域含有兩個子域。三個二維結(jié)構(gòu)域組成了一個心形，微小的pH值變化顯示出中心結(jié)構(gòu)的靈活性。由于具有鍵合脂多糖、其它細(xì)菌的產(chǎn)物(磷脂壁酸、肽多糖)、活性氧、一氧化氮、其它活性氮及前列腺素等的能力，血清白蛋白在血液中主要功能是調(diào)節(jié)血液滲透壓、轉(zhuǎn)運內(nèi)源生理代謝產(chǎn)物(如膽紅素、脂肪酸)及外源配體(如華法林、布洛芬)，以增強它們在血液中的溶解度，將它們運送到特定的組織或器官，并銷毀掉具有毒性的一部分配體。纖維蛋白原作為血漿內(nèi)一種主要的止血成分，在白細(xì)胞介素IL-6和IL-1β的刺激下產(chǎn)生于肝臟內(nèi)的一種促炎性蛋白質(zhì)，屬于功能性自我平衡分子。它經(jīng)常扮演著急性時相蛋白的角色，其含量的增加反映了傷口的愈合、炎癥、感染。另外，纖維蛋白原與癌癥轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)，它通過凝血酶轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并結(jié)合血小板的聚集進(jìn)行初始的和繼發(fā)性的止血。因此，纖維蛋白原的含量與臨床病理因素息息相關(guān)，反映了化學(xué)治療，并能預(yù)測胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、宮頸癌、食道癌的術(shù)后復(fù)發(fā)。血清白蛋白和纖維蛋白原共存于血漿中，對于維持血液滲透壓和動力學(xué)過程，并反映各種生理疾病有著極其重要的臨床意義，兩者缺一不可。目前，血清白蛋白已作為一種指標(biāo)來評估各種疾病。例如最常見的Child-Pugh分級標(biāo)準(zhǔn)用來量化評估肝臟的損害程度，而血清白蛋白含量作為五項評估指標(biāo)中極其重要的一項，含量越高表示損害越嚴(yán)重，嚴(yán)重時會導(dǎo)致肝腹水。但是現(xiàn)有檢測手段檢出血清白蛋白的含量可能受樣本溶血、脂血、膽紅素及血液中其它組分的干擾而不太精準(zhǔn)，嚴(yán)重影響到對疾病的判斷。此時需要對血液進(jìn)行繁瑣的預(yù)先分離提純，才能得到更高純度的血清白蛋白，然而分離過程所產(chǎn)生的損失會影響到血清白蛋白準(zhǔn)確含量的確定。因此，研發(fā)一種新型的、簡單快速、免分離提純的精確定量檢測血清白蛋白的方法成為目前臨床醫(yī)學(xué)的迫切需要。專利申請“一種檢測微量血清白蛋白的熒光試劑、制備方法及應(yīng)用”(專利申請?zhí)枺?01410389582.7)中報道過用一種熒光試劑DP-TPPNa成功定量檢測血清里血清白蛋白的方法。成果已證明DP-TPPNa對血清白蛋白的特異性與快速響應(yīng)性，而對其它多種蛋白質(zhì)(如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、卵清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等)以及氨基酸沒有響應(yīng)，同時血清里其它組分對白蛋白的檢測無明顯干擾，能達(dá)到快速、定量檢測的目的。但是這一檢測的前提是針對血清。而血清的獲得需要血液通過一系列復(fù)雜的化學(xué)提純，這在普通的醫(yī)院、小診所或醫(yī)療器械匱乏的條件下是無法完成的，沒法真正達(dá)到簡單的、免除分離提純的檢測目的。另外，血清與血漿的主要區(qū)別是血清不含有纖維蛋白原，而纖維蛋白原作為止血蛋白在血漿中具有不可替代的作用，通過熒光試劑在血漿中原位精確檢測血清白蛋白含量的同時，研究血清白蛋白與纖維蛋白原的相互作用是目前文獻(xiàn)沒有報道過的。(Arroyo,V.；Garcia-Martinez,R.；Salvatella,X.J.Hepatol.,2014,61,396-407.Arques,S.；Ambrosi,P.J.Car.Fail.,2011,17,451-458.Ha,C.E.；Bhagavan,N.V.Biochim.Biophys.Acta,2013,1830,5486-5493.Shao,Z.X.；Zhao,Y.；Feng,L.M.；Feng,G.F.；Zhang,J.W.；Zhang,J.Dis.Markers,2015,468596.Matsuda,S.；Takeuchi,H.；Fukuda,K.；Nakamura,R.；Takahashi,T.；Wada,N.；Kawakubo,H.；Saikawa,Y.；Omori,T.；Kitagawa,Y.Dis.Esophagus,2013,27,654-661.)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種階梯式定量檢測血漿中血清白蛋白及纖維蛋白原的方法，所述方法簡單易操作，可以定量檢測血漿樣本中血清白蛋白和纖維蛋白原的濃度。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)方案實現(xiàn)：一種階梯式定量檢測血漿中血清白蛋白及纖維蛋白原的方法，所述方法具體步驟如下：步驟一：檢測DP-TPPNa對血清白蛋白的響應(yīng)情況，具體如下：(1)將DP-TPPNa溶解于磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為1×10-3～1×10-6mol/L的溶液a；(2)將血清白蛋白溶液稀釋于磷酸鹽緩沖液中，得到不同血清白蛋白濃度的溶液b；其中，溶液b的濃度取值范圍為5～40mg/mL；(3)檢測溶液a中DP-TPPNa的初始熒光強度I0；(4)取60μL濃度為C1的溶液b，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均測量溶液a中DP-TPPNa的熒光強度Ii；其中，溶液b每次滴加的體積優(yōu)選為1～6μL；(5)僅變化溶液b的濃度C1，重復(fù)步驟(4)；其中，C1的取值范圍為5～40mg/mL；(6)根據(jù)步驟(3)、步驟(4)和步驟(5)的測試結(jié)果繪制在不同濃度溶液b的情況下，溶液a中DP-TPPNa的熒光強度變化率(Ii-I0)/I0隨溶液b體積的變化曲線；在所述變化曲線中選取線性關(guān)系最好的曲線，記為曲線Ⅰ，將曲線Ⅰ對應(yīng)的溶液b的濃度設(shè)為最優(yōu)濃度C；并根據(jù)曲線Ⅰ計算得到DP-TPPNa對血清白蛋白的檢測范圍為2.02-110μg/mL；其中，所述磷酸鹽緩沖液的pH＝7.4；步驟二：檢測DP-TPPNa對血清白蛋白與纖維蛋白原的響應(yīng)情況，具體如下：(1)將血清白蛋白溶液稀釋于磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為C的溶液c；向溶液c中加入不同質(zhì)量的纖維蛋白原，得到血清白蛋白與纖維蛋白原質(zhì)量比為10.5～21:1的溶液d；(2)取60μL血清白蛋白與纖維蛋白原質(zhì)量比為x的溶液d，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均測量溶液a中DP-TPPNa的熒光強度Ik；其中，每次滴加溶液d的量優(yōu)選為1～6μL；(3)僅變化x的值，重復(fù)步驟(2)；其中，x的取值為10.5～21:1；(4)根據(jù)步驟(2)和步驟(3)中測試結(jié)果繪制DP-TPPNa熒光強度變化率(Ik-I0)/I0隨溶液d中血清白蛋白濃度的變化曲線，記為曲線Ⅱ；步驟三：血清白蛋白與纖維蛋白原的定量計算，具體如下：(1)當(dāng)曲線Ⅱ中橫坐標(biāo)的取值為20～100μg/mL時，選取曲線Ⅰ作為標(biāo)準(zhǔn)曲線；此時，將血清白蛋白濃度未知的血漿樣本加入溶液a中，得到待測溶液1；檢測待測溶液1的熒光強度I1；將待測溶液1中DP-TPPNa的熒光強度變化率(I1-I0)/I0代入曲線Ⅰ的線性方程，即可計算出血漿樣本中血清白蛋白的濃度；其中，血漿樣本的添加量為使待測溶液1中DP-TPPNa的熒光強度變化率(I1-I0)/I0落入曲線Ⅰ的檢測范圍內(nèi)；(2)將曲線Ⅱ中橫坐標(biāo)取值為120～200μg/mL時，以(Ik-I0)/I0為縱坐標(biāo)，以纖維蛋白原與血清白蛋白的質(zhì)量比x為橫坐標(biāo)作圖，得到不同血清白蛋白濃度下(Ik-I0)/I0隨x變化曲線，并將所述變化曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，記為曲線Ⅲ；此時，將步驟(1)中已測出血清白蛋白濃度的血漿樣本加入到溶液a中，得到待測溶液2；檢測待測溶液2中DP-TPPNa的熒光強度I2；將待測溶液2中DP-TPPNa的熒光強度變化率(I2-I0)/I0代入曲線Ⅲ的線性方程，計算得到所述血漿樣本中血清白蛋白與纖維蛋白原的質(zhì)量比x，從而結(jié)合步驟(1)的測試結(jié)果即可計算出所述血漿樣本中纖維蛋白原的濃度；其中，血漿樣本的添加量為使待測溶液2中血清白蛋白濃度落入140～200μg/mL的范圍內(nèi)；其中，所述DP-TPPNa的結(jié)構(gòu)式如下：有益效果(1)本發(fā)明所述方法采用熒光試劑對人血漿中血清白蛋白進(jìn)行原位定量檢測，對血清白蛋白具有很強的特異性響應(yīng)，具有實時“點亮”效果；(2)本發(fā)明所述方法采用熒光試劑對單一的人血漿中纖維蛋白原沒有特異性響應(yīng)，但是當(dāng)血清白蛋白與纖維蛋白原處于適當(dāng)?shù)谋壤那闆r下，兩者對熒光試劑的熒光增加是具有明顯的協(xié)同效應(yīng)的，并通過此協(xié)同效應(yīng)定量檢測纖維蛋白原，達(dá)到同時精確檢測血漿中兩種主要蛋白含量的目的。(3)本發(fā)明所述方法采用熒光試劑對血漿中其它主要組成成分(如：γ-球蛋白、葡萄糖、膽固醇、尿素)無明顯響應(yīng)，因此對血清白蛋白及纖維蛋白原的檢測可以免除血漿的分離提純過程，直接原位檢測，血漿只需將血液通過簡單的物理離心即可得到，操作簡單方便。(4)本發(fā)明所述方法采用熒光試劑對血漿中的血清白蛋白在10～30mg/mL濃度范圍內(nèi)時，熒光強度增加倍數(shù)與被加入的血漿體積在0～30μL范圍內(nèi)呈現(xiàn)非常好的線性關(guān)系，可作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線用于待測血漿中的血清白蛋白。為此可以在1～30μL范圍內(nèi)確定血清白蛋白的準(zhǔn)確含量，在30～60μL范圍內(nèi)確定纖維蛋白原的含量。附圖說明圖1為實施例1中DP-TPPNa熒光強度變化率隨加入血漿體積的變化曲線；圖2為實施例1中DP-TPPNa熒光強度變化率隨溶液b體積的變化曲線；圖3為實施例1中溶液b的濃度為10mg/mL時，DP-TPPNa熒光強度變化率隨溶液b體積的變化曲線；圖4為實施例1中DP-TPPNa熒光強度變化率隨纖維蛋白原溶液加入體積的變化曲線；圖5為實施例1中DP-TPPNa熒光強度變化率隨溶液d中血清白蛋白濃度的變化曲線；圖6為實施例1中DP-TPPNa熒光強度變化率隨纖維蛋白原與血清白蛋白的質(zhì)量比x的變化曲線；圖7為實施例1中DP-TPPNa熒光強度變化率隨溶液e中血清白蛋白濃度的變化曲線。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施例來詳述本發(fā)明，但不限于此。以下實施例中提到的主要試劑信息見表1；主要儀器與設(shè)備信息見表2。表1表2以下實施例中所述PBS的pH＝7.4；所述熒光強度的檢測均檢測3～5次，然后取平均值；所述血清白蛋白溶液為人血清白蛋白溶液，血清白蛋白溶液中血清白蛋白含量為50mg/mL；所述纖維蛋白原為人纖維蛋白原。實施例1一種階梯式定量檢測血漿中血清白蛋白及纖維蛋白原的方法，所述方法具體步驟如下：步驟一：檢測DP-TPPNa對血漿的熒光響應(yīng)情況，具體如下：(1)將19.35μg的DP-TPPNa溶解于3mLPBS中，得到DP-TPPNa的濃度為1×10-5mol/L的溶液a；(2)將正常人血樣本以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上層黃色液體得到血漿；(3)采用熒光分光光度計檢測DP-TPPNa溶液的初始熒光強度I0；(4)取36μL血漿分次滴加到溶液a中，并測出每次滴加血漿后混合均勻后溶液a中DP-TPPNa的熒光強度Ij；其中每次血漿的加入量為3μL；(5)根據(jù)步驟(3)和(4)中測試結(jié)果繪制DP-TPPNa熒光強度變化率(Ij-I0)/I0隨加入血漿體積的變化曲線，如圖1所示，可知，DP-TPPNa熒光強度隨加入血漿體積的增加而增加。步驟二：檢測DP-TPPNa對血清白蛋白的響應(yīng)情況，具體如下：(1)將血清白蛋白溶液稀釋于PBS中，分別得到濃度為5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL和40mg/mL的溶液b；(2)取60μL濃度為5mg/mL的溶液b，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均測量溶液a中DP-TPPNa的熒光強度Ii；其中，溶液b每次滴加的體積為6μL；(3)分別將溶液b的濃度變化為10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL和40mg/mL，重復(fù)步驟(2)；(4)根據(jù)步驟測試結(jié)果繪制DP-TPPNa熒光強度變化率(Ii-I0)/I0隨溶液b體積VHSA的變化曲線，如圖2所示，可知，當(dāng)溶液b的濃度為10mg/mL時的線性關(guān)系最好，對應(yīng)曲線記為曲線Ⅰ；且曲線Ⅰ如圖3所示，可知當(dāng)溶液b加入體積為3-33μL，即溶液b中血清白蛋白的濃度為10～110μg/mL時，DP-TPPNa熒光強度變化率(Ii-I0)/I0與溶液b的加入體積存在一定的線性關(guān)系，線性方程為：(Ii-I0)/I0＝0.2338×VHSA+0.74708，R2＝0.9942。根據(jù)此線性關(guān)系可以計算DP-TPPNa對血清白蛋白的檢測范圍為：2.02-110μg/mL，最低檢出限為：2.02μg/mL。當(dāng)溶液b的加入體積為45μL，即溶液b中血清白蛋白的濃度為150μg/mL時，DP-TPPNa熒光強度不再隨溶液b的加入體積的變化而變化。其中，i表示1-20的正整數(shù)，R表示線性相關(guān)度。步驟三：檢測DP-TPPNa對纖維蛋白原的響應(yīng)情況，具體為：(1)將纖維蛋白原溶解于PBS中，得到濃度為10mg/mL的人纖維蛋白原溶液；(2)取60μL濃度為5mg/mL的人纖維蛋白原溶液，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均測量溶液a中DP-TPPNa的熒光強度Im；(3)根據(jù)測試結(jié)果繪制DP-TPPNa熒光強度變化率(Im-I0)/I0隨人纖維蛋白原溶液加入體積的變化曲線，如圖4所示，可知，DP-TPPNa對纖維蛋白原沒有特異性響應(yīng)。步驟四：檢測DP-TPPNa對血漿中除血清白蛋白和纖維蛋白原以外的其它主要組分的響應(yīng)情況，具體如下：(1)將血清白蛋白溶液稀釋PBS中，得到濃度為10mg/mL的溶液c；向溶液c中加入不同質(zhì)量的纖維蛋白原，得到纖維蛋白原與血清白蛋白的質(zhì)量比分別為1:10.5、1:14、1:18和1:21的溶液d；(2)取60μL血清白蛋白與纖維蛋白原質(zhì)量比為1:10.5的溶液d，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均測量溶液a中DP-TPPNa的熒光強度Ik；其中，每次滴加溶液d的量為6μL；(3)將血清白蛋白與纖維蛋白原質(zhì)量比分別變化為1:14、1:18和1:21，重復(fù)步驟(2)；(4)根據(jù)步驟(2)和步驟(3)中測試結(jié)果繪制DP-TPPNa熒光強度變化率(Ik-I0)/I0隨溶液d中血清白蛋白濃度的變化曲線，記為曲線Ⅱ，如圖5所示；步驟五：血清白蛋白與纖維蛋白原的定量計算，具體如下：(1)當(dāng)曲線Ⅱ中橫坐標(biāo)的取值為20～100μg/mL時，無論血清白蛋白與纖維蛋白原以何質(zhì)量比混合，當(dāng)體積較少血清白蛋白和纖維蛋白原混合液被加入到固定濃度的溶液a中時，因纖維蛋白原含量較少，DP-TPPNa熒光強度變化率與血清白蛋白濃度存在一定的線性關(guān)系，且與曲線Ⅰ的線性基本重合；這說明在恒定血清白蛋白濃度的條件下，當(dāng)加入血清白蛋白和纖維蛋白原混合液體積較少時，DP-TPPNa熒光強度的增加只是由血清白蛋白占主導(dǎo)因素，原因是DP-TPPNa分子進(jìn)入血清白蛋白疏水空腔導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)受限而促進(jìn)了熒光的增強(聚集誘導(dǎo)發(fā)光作用)，而纖維蛋白原并未通過與血清白蛋白的相互作用而對熒光的增強有明顯的促進(jìn)作用，此時可忽略纖維蛋白原的影響，選取曲線Ⅰ作為標(biāo)準(zhǔn)曲線；將血清白蛋白濃度未知的血漿樣本加入溶液a中，得到待測溶液1；檢測待測溶液1的熒光強度I1；將待測溶液1中DP-TPPNa的熒光強度變化率(I1-I0)/I0代入曲線Ⅰ的線性方程，計算出血漿樣本中血清白蛋白的濃度為30.711g/L；其中，血漿樣本的添加量為使待測溶液1中DP-TPPNa的熒光強度變化率(I1-I0)/I0落入曲線Ⅰ的檢測范圍內(nèi)；(2)將曲線Ⅱ中橫坐標(biāo)取值為120～200μg/mL時，以(Ik-I0)/I0為縱坐標(biāo)，以纖維蛋白原與血清白蛋白的質(zhì)量比x為橫坐標(biāo)作圖，得到不同血清白蛋白濃度下(Ik-I0)/I0隨x變化曲線，并將所述變化曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，記為曲線Ⅲ；此時，將步驟(1)中已測出血清白蛋白濃度的血漿樣本加入到溶液a中，得到待測溶液2；檢測待測溶液2中DP-TPPNa的熒光強度I2；將待測溶液2中DP-TPPNa的熒光強度變化率(I2-I0)/I0代入曲線Ⅲ的線性方程，計算得到所述血漿樣本中血清白蛋白與纖維蛋白原的質(zhì)量比x，從而結(jié)合步驟(1)的測試結(jié)果即可計算出所述血漿樣本中纖維蛋白原的濃度為2.239g/L；其中，血漿樣本的添加量為使待測溶液2中血清白蛋白濃度落入140～200μg/mL的范圍內(nèi)；步驟六：血清白蛋白與纖維蛋白原的定量計算結(jié)果的驗證，具體如下：(1)將纖維蛋白原、γ-球蛋白、膽固醇、葡萄糖和尿素加入到溶液b中，，混合均勻，得到溶液e；其中，溶液e中纖維蛋白原與血清白蛋白質(zhì)量比分別為1:10.5，1:14，1:1，1:21；血清白蛋白與γ-球蛋白、膽固醇、葡萄糖、尿素的質(zhì)量比分別為400:300:4:6.7:1和400:300:4:13.3:1；(2)取60μL溶液e，分次滴加到溶液a中，每次滴加后均測量溶液a中DP-TPPNa的熒光強度Ip；(3)根據(jù)步驟(2)的測試結(jié)果繪制DP-TPPNa熒光強度變化率(Ip-I0)/I0隨加入的溶液e中血清白蛋白濃度的變化曲線，如圖6所示，可知，加入γ-球蛋白、膽固醇、葡萄糖、尿素后的曲線與未加入這些組分前的曲線基本重合，說明這些組分對血清白蛋白與纖維蛋白原的協(xié)同作用無明顯干擾，進(jìn)而表明步驟五中的計算結(jié)果真實可靠。本發(fā)明包括但不限于以上實施例，凡是在本發(fā)明精神的原則之下進(jìn)行的任何等同替換或局部改進(jìn)，都將視為在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。