本發(fā)明是涉及一種可對依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元進行定性和定量分析的方法，屬于分析化學(xué)和藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：肝素是由糖醛酸(l-艾杜糖醛酸idoa；d-葡萄糖醛酸，glca)和葡萄糖胺(α-d葡萄糖胺，glcn)所構(gòu)成的二糖重復(fù)單元組成的具有不同鏈長的一類線性硫酸化粘多糖，具有良好的抗凝血和抗血栓的特性，用于治療手術(shù)后所引發(fā)的靜脈血栓栓塞。依諾肝素鈉是由豬腸黏膜提取的肝素先經(jīng)酯化得到肝素鈉芐基酯衍生物，再通過堿性條件下β-消除裂解生成的低分子量肝素。由于硫酸化位點和硫酸化程度的差異，加上堿性條件的降解，使依諾肝素鈉結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。依諾肝素鈉重均分子量在3800-5000之間，分子量分布范圍要求：小于2000da不超過20％；2000到8000da之間的應(yīng)大于68％；分子量超過8000da不超過18％。一條具備藥理活性的肝素鏈通常含有三硫酸化二糖區(qū)，低硫酸化二糖區(qū)和一種獨特的抗凝血酶結(jié)合五糖結(jié)構(gòu)單元。肝素的抗凝血活性絕大部分是由該五糖序列貢獻的。需要指出的是，肝素糖鏈中含有抗凝血酶結(jié)合五糖結(jié)構(gòu)單元的糖鏈只有20％～50％(通常為三分之一)。含有抗凝血酶結(jié)合五糖結(jié)構(gòu)單元的糖鏈被稱為高親和肝素。還有些糖鏈可能含有不止一個抗凝血酶結(jié)合五糖結(jié)構(gòu)單元，因而表現(xiàn)出更強的抗凝血活性。在依諾肝素鈉生產(chǎn)過程中，堿性降解過程包括兩個競爭性的化學(xué)反應(yīng)：β-消除和芐基酯水解。降解后得到平均分子量在4500左右的低分子肝素寡糖鏈(us5389618)。依諾肝素鈉寡糖鏈中依然保留了原來肝素糖鏈中反映抗凝血活性的五糖結(jié)構(gòu)，在依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元約占15％～25％。肝素類藥物中抗凝血酶結(jié)合五糖結(jié)構(gòu)單元較為復(fù)雜，其序列通?？梢员硎緸閍ga*ia，各個糖殘基對肝素與抗凝血酶之間的親和力是不同的。如圖1所示：星號標(biāo)示的糖是一種少有的3-o-硫酸化glcn殘基，它是肝素與抗凝血酶結(jié)合不可或缺的；菱形標(biāo)記的三個硫酸基團對于肝素與抗凝血酶的高親和結(jié)合也是必不可少的；橢圓形標(biāo)記的硫酸基團略微重要；半月形標(biāo)記的glca殘基也是必需的；與五糖序列非還原端相連的idoa殘基(方形)雖然對抗凝血酶結(jié)合不是必需的，但是其始終會出現(xiàn)在肝素的抗凝血酶結(jié)合區(qū)；圖中還顯示了一些競爭結(jié)合抗凝血酶的天然變異體，例如：n-硫酸化取代第一個氨基糖殘基的n-乙?；?-o-硫酸化殘基的6-o-硫酸化。除此以外，肝素類藥物的五糖結(jié)構(gòu)單元含量不同，導(dǎo)致他們具有生物不等效性，這給其應(yīng)用造成很多不便。綜合以上原因使得對肝素類藥物的五糖結(jié)構(gòu)單元的定性定量分析任務(wù)非常艱巨，到目前為止，肝素類藥品都是通過生化測試的方法確定效價，這種實驗方法復(fù)雜，結(jié)果重現(xiàn)性差，而且只能進行相對定量。u.r.desai等(pharmacyandpharmacologycommol/lunications,1(1995)349-353)發(fā)展了核磁的方法測定了肝素類藥物糖鏈含有的平均五糖結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)，能夠反映多種藥物的抗fxa活性，這種方法不依賴生化測試，更加直接簡捷。但是核磁共振儀成本較高，維護和操作復(fù)雜，對專業(yè)技能要求較高，難于實現(xiàn)大范圍普及使用。因此，亟需一種可對肝素類藥品中的五糖結(jié)構(gòu)單元直接、簡便的定性和定量分析的方法。本申請的發(fā)明人多年來致力于依諾肝素鈉精細結(jié)構(gòu)的定性定量分析研究，并且申請了相關(guān)專利，例如：中國專利cn201280000857.2公開了一種基于毛細管電泳的依諾肝素鈉精細結(jié)構(gòu)測定方法，該專利采用混合肝素酶將依諾肝素鈉完全酶解，接著通過毛細管電泳對依諾肝素鈉完全酶解產(chǎn)物中的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-環(huán)苷結(jié)構(gòu)的寡糖進行分離，然后根據(jù)完全酶解后所得到的寡糖的電荷質(zhì)量比與其電泳淌度之間的線性關(guān)系對分離峰所對應(yīng)的酶解產(chǎn)物，即：構(gòu)成依諾肝素結(jié)構(gòu)的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-環(huán)苷結(jié)構(gòu)的寡糖進行鑒定，以實現(xiàn)對依諾肝素鈉精細結(jié)構(gòu)的分析。雖然采用此方法可以對依諾肝素鈉中的二糖、三糖、四糖以及具有1,6-環(huán)苷結(jié)構(gòu)的寡糖進行鑒定，但是該方法不能實現(xiàn)對其中的五糖結(jié)構(gòu)單元的定性和定量測定，因此還不能真正實現(xiàn)對依諾肝素鈉中的精細結(jié)構(gòu)的完全的定性和定量分析，還不能滿足依諾肝素鈉的質(zhì)量控制要求。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種可對依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元進行定性和定量分析的方法，以實現(xiàn)對依諾肝素鈉中的精細結(jié)構(gòu)的完全的定性和定量分析，以滿足依諾肝素鈉的質(zhì)量控制要求。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種可對依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元進行定性和定量分析的方法，包括如下步驟：a)利用抗凝血酶iii的親和色譜柱對依諾肝素鈉樣品按親和活性進行分離并制備成多個不同親和活性的組分；b)用混合肝素酶對依諾肝素鈉樣品及步驟a)所制備的多個不同親和活性的組分分別進行完全酶解；c)對步驟b)所得到的每一個完全酶解產(chǎn)物分別進行毛細管電泳分離分析；d)根據(jù)公式：計算步驟c)所分離的各個成分的電泳淌度，其中：lt和ld分別是毛細管的總長和有效長度，v為分離電壓，t為遷移時間；e)結(jié)合寡糖的電荷質(zhì)量比與電泳淌度之間的如下線性關(guān)系：對每一個完全酶解產(chǎn)物的毛細管電泳圖中的分離峰所對應(yīng)的酶解產(chǎn)物進行鑒定，以定性確定出五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰；其中：z/m為寡糖電荷質(zhì)量比，μ為對應(yīng)的電泳淌度；f)根據(jù)所確定的五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰的峰面積，采用面積百分數(shù)歸一化方法，定量計算出五糖結(jié)構(gòu)單元的含量。作為優(yōu)選方案，步驟a)中所述的抗凝血酶iii的親和色譜柱的制備，包括如下步驟：①使過量的依諾肝素鈉樣品與抗凝血酶iii進行孵育，以激活抗凝血酶iii并占據(jù)其活性位點；②使活性位點被保護的抗凝血酶iii以共價鍵固定到色譜柱內(nèi)的水化填料上。所述抗凝血酶iii為野生型或重組型。作為進一步優(yōu)選方案，進行孵育的緩沖溶液的ph為8.0～8.5、是由150～250mmol/l的碳酸氫鈉溶液與450～550mmol/l的氯化鈉溶液形成。作為進一步優(yōu)選方案，依諾肝素鈉與抗凝血酶iii的質(zhì)量比為2.5:1～5:1。作為進一步優(yōu)選方案，所述的水化填料是由nhs或cnbr官能團化的瓊脂糖。作為進一步優(yōu)選方案，1毫升水化填料中含抗凝血酶iii的質(zhì)量≤5毫克。步驟a)利用抗凝血酶iii的親和色譜柱制備不同親和活性組分的步驟包括：ⅰ)洗脫抗凝血酶iii所結(jié)合的依諾肝素鈉；ⅱ)平衡色譜柱；ⅲ)上樣；ⅳ)進行梯度洗脫和色譜分離。作為優(yōu)選方案，步驟ⅰ)采用含有1.5～4.0mol/l(以2.0～3.0mol/l較佳)氯化鈉的tris-hcl緩沖溶液進行洗脫。作為優(yōu)選方案，步驟ⅱ)采用含有5～30mmol/l(以10～20mmol/l較佳)氯化鈉的tris-hcl緩沖溶液進行平衡10～20分鐘。作為優(yōu)選方案，步驟ⅲ)先采用含有5～30mmol/l(以10～20mmol/l較佳)氯化鈉的 tris-hcl緩沖溶液溶解樣品，配制成濃度為10～140mg/ml(以40～100mg/ml較佳)的樣品溶液，然后以進樣量為1～30μl(以5～20μl較佳)進行上樣。作為優(yōu)選方案，步驟ⅳ)進行梯度洗脫的條件為：0～15分鐘：a相為100％，b相為0；15～20分鐘：a相為65％～75％，b相為25％～35％；20～35分鐘：a相為0％，b相為100％；所述的a相為含有5～30mmol/l(以10～20mmol/l較佳)氯化鈉的tris-hcl緩沖溶液，所述的b相為含有1.5～4.0mol/l(以2.0～3.0mol/l較佳)氯化鈉的tris-hcl緩沖溶液。作為優(yōu)選方案，步驟ⅳ)進行色譜分離的條件為：流動相為ph7.0～8.0(以7.2～7.6較佳)、濃度為5～20mmol/l(以10～15mmol/l較佳)的tris-hcl緩沖溶液；分離時，流動相和色譜柱均保持1～15℃(以4～10℃較佳)；檢測波長為紫外230～235nm。作為優(yōu)選方案，步驟b)中所述的混合肝素酶包括肝素酶i(ec4.2.2.7.)，肝素酶ii(無ec號)和肝素酶iii(ec4.2.2.8.)中的至少兩種。作為進一步優(yōu)選方案，所述混合肝素酶是包含肝素酶i、肝素酶ii和肝素酶iii的混合溶液。作為更進一步優(yōu)選方案，所述混合肝素酶是由肝素酶i、肝素酶ii和肝素酶iii按體積比為1:1:1混合得到。作為優(yōu)選方案，步驟c)進行毛細管電泳分離的分析條件為：石英毛細管總長為50～100cm，柱內(nèi)徑為25～75μm；緩沖溶液含有150～300mmol/ltris-h3po4和1～5mmol/l的mgcl2，ph為1.5～4.0，使用前需加入0.1～5.0％質(zhì)量濃度、分子量范圍為5000～100000的聚乙二醇；毛細管電泳時使用電壓為-15～-30kv；采用壓力進樣，進樣壓力為1～5psi，進樣時間為5～30s；在最后一個單硫酸化二糖(δiia)出峰之后施加1～10psi的壓力，將δiva推向檢測窗口實現(xiàn)檢測；電泳時毛細管柱溫為10～40℃，檢測波長為紫外230-235nm。作為進一步優(yōu)選方案，步驟c)進行毛細管電泳分離分析的條件為：石英毛細管總長為70～100cm，柱內(nèi)徑為40～60μm；緩沖溶液含有200～250mmol/ltris-h3po4和2～4mmol/l的mgcl2，ph為2～4，使用前需加入1～3％質(zhì)量濃度、分子量范圍為10000～50000的聚乙二醇；毛細管電泳時使用電壓為-15～-25kv；采用壓力進樣，進樣壓力為1～3psi，進樣時間為10～20s；在最后一個單硫酸化二糖(δiia)出峰之后施加4～6psi的壓力，將δiva 推向檢測窗口實現(xiàn)檢測；電泳時毛細管柱溫為20～30℃，檢測波長為紫外230-232nm。作為最優(yōu)方案，步驟c)進行毛細管電泳分離分析的條件為：石英毛細管總長為80cm，柱內(nèi)徑為50μm；緩沖溶液含有200mmol/ltris-h3po4和2.5mmol/l的mgcl2，ph為2.5，使用前需加入1.25％質(zhì)量濃度、分子量為10000的聚乙二醇；毛細管電泳時使用電壓為-25kv；采用壓力進樣，進樣壓力為1psi，進樣時間為10s；在最后一個單硫酸化二糖(δiia)出峰之后施加5psi的壓力，將δiva推向檢測窗口實現(xiàn)檢測；電泳時毛細管的柱溫為25℃，檢測波長為紫外232nm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著性有益效果：本發(fā)明通過采用親和色譜分離與毛細管電泳分離分析相結(jié)合的技術(shù)，不僅首次實現(xiàn)了對依諾肝素鈉五糖結(jié)構(gòu)單元的定性定量分析，而且同時實現(xiàn)了對依諾肝素鈉中的二糖、三糖、四糖和1,6-環(huán)苷寡糖結(jié)構(gòu)的更準確分析，真正實現(xiàn)了對依諾肝素鈉中的精細結(jié)構(gòu)的完全的定性和定量分析，為依諾肝素鈉的質(zhì)量控制提供了一種科學(xué)便捷的分析手段，具有顯著的工業(yè)應(yīng)用價值。附圖說明圖1為
背景技術(shù)：
中肝素抗凝血酶結(jié)合五糖序列：aga*ia：a為glcnac6so3或glcnso36so3；a*為glcnso36so3；g為glca；i為idoa2so3；圖2為本發(fā)明中的依諾肝素鈉親和富集色譜圖；圖3為本發(fā)明依諾肝素鈉和不同親和組分完全酶解產(chǎn)物的毛細管電泳分離分析譜圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明技術(shù)方案做進一步詳細、完整地說明。實施例一、樣品溶液的配制(1)孵育緩沖溶液的配制：分別稱取840.07mg碳酸氫鈉，1.461g氯化鈉溶解于40ml水中，用1m鹽酸溶液調(diào)至ph8.3后，將溶液轉(zhuǎn)至50ml容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔徑為0.45μm的過濾膜過濾。(2)結(jié)合緩沖溶液的配制：分別稱取302.85mg三(羥甲基)氨基甲烷，2.1915g氯化鈉溶解于230ml水中，用1m鹽酸溶液調(diào)至ph7.4后，將溶液轉(zhuǎn)至250ml容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔徑為0.45μm的過濾膜過濾。(3)洗脫緩沖溶液的配制：分別稱取302.85mg三(羥甲基)氨基甲烷，29.22g氯化鈉溶解于230ml水中，用1m鹽酸溶液調(diào)至ph7.4后，將溶液轉(zhuǎn)至250ml容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔徑為0.45μm的過濾膜過濾。(4)緩沖溶液a：量取乙醇胺1.512ml，稱取1.461g氯化鈉溶解于40ml水中，用1m鹽酸溶液調(diào)至ph8.3后，將溶液轉(zhuǎn)至50ml容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔徑為0.45μm的過濾膜過濾。(5)緩沖溶液b：分別稱取410.20mg乙酸鈉，1.461g氯化鈉溶解于40ml水中，用1m鹽酸溶液調(diào)至ph4.0后，將溶液轉(zhuǎn)至50ml容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔徑為0.45μm的過濾膜過濾。(6)ph7.0的醋酸鈉/醋酸鈣溶液的配制：分別稱取10mg牛血清白蛋白，32mg醋酸鈣溶解于60ml水中，加入580μl冰醋酸，用2m的naoh溶液調(diào)至ph7.0后，將溶液轉(zhuǎn)至100ml容量瓶中，定容至刻度；使用前，用孔徑為0.45μm的過濾膜過濾。(7)磷酸鉀ph7.0緩沖液的配制：68mg磷酸二氫鉀和10mg牛血清白蛋白溶于30毫升水中。用氫氧化鉀將溶液調(diào)至ph7.0，然后將溶液移至50毫升容量瓶中，加水定容。(8)依諾肝素酶溶液的配制：三種肝素酶分別用磷酸鉀ph7.0緩沖液溶解，得到的酶溶液濃度的為0.4iu/ml；溶液放置-20oc保存待用。(9)肝素酶i，ii，iii混合酶溶液的配制：將上述方法配置的肝素酶溶液按體積比為1:1:1的比例混合。(10)親和色譜分析依諾肝素鈉樣品溶液的配制：稱取肝素鈉樣品80mg，用1ml流動相a相溶解，配制成80mg/ml的溶液。(11)酶解反應(yīng)依諾肝素鈉樣品溶液的配制：稱取肝素鈉樣品20mg，用1ml水溶解，配制成20mg/ml的溶液。(12)依諾肝素鈉樣品完全酶解反應(yīng)：分別量取20μl依諾肝素鈉樣品溶液，70μl的醋酸鈉－醋酸鈣溶液(ph7.0)，和100μl肝素酶(i,ii,iii)混合溶液，緩慢地混合均勻，置于25℃的水浴中反應(yīng)48h；待酶解完全后，進樣分析。二、抗凝血酶iii親和色譜柱的制備1)將5mg抗凝血酶iii和20mg依諾肝素鈉溶于孵育緩沖溶液中，4℃孵育15min，以激活抗凝血酶iii并保護親和位點，避免在固定過程中活性位點的反應(yīng)；2)將激活后的抗凝血酶iii溶液加入到nhs活化(nhs活化基團可以高速率高產(chǎn)率的與含有氨基的抗體或酶反應(yīng)從而得到固定抗體或酶的色譜柱)的hitrapnhs-activatedhp 預(yù)裝柱(該預(yù)裝柱事先用1mmol/lhcl，4℃下進行清洗，以除去活化住中的儲存溶液異丙醇，使其處于最佳反應(yīng)條件下)中，4℃反應(yīng)4h，待所有加入的抗凝血酶iii被固定上后，依次使用緩沖溶液a、緩沖溶液b、緩沖溶液a沖柱，4℃靜置4h后再依次使用緩沖溶液b、緩沖溶液a、緩沖溶液b沖柱洗去活化未偶聯(lián)的nhs基團，并洗去非特異性吸附的蛋白，制得所述抗凝血酶iii親和色譜柱。制得的抗凝血酶iii親和色譜柱使用洗脫緩沖溶液洗脫起保護作用的依諾肝素鈉，暴露出柱上抗凝血酶iii的親和位點，即可用于不同親和活性依諾肝素鈉的富集。三、不同抗凝血酶iii親和活性依諾肝素鈉的分離制備將三根1ml制備好的抗凝血酶iii親和柱串聯(lián)使用。首次使用前，需先運行一針空白以驗證親和色譜柱中起保護作用的依諾肝素鈉已被徹底洗脫從而排除干擾。進樣之前需首先使用結(jié)合緩沖液平衡色譜柱10～20min。色譜梯度洗脫條件為：0～15min為a相100％，15～20min為a相65％～75％，20～35min為a相為0％，其中a相為上述結(jié)合緩沖液，b相為上述洗脫緩沖液；依諾肝素鈉樣品濃度為80mg/ml，進樣量為10μl；色譜分離時，流動相和色譜柱均保持4～10℃(以保持抗凝血酶iii的活性)；檢測波長為紫外232nm；通過親和色譜分離制備，得到依諾肝素鈉的低親和組分、中等親和組分和高親和組分三個不同親和活性的組分(如圖2所示)。為避免濃縮后的三個組分中的高濃度鹽影響后續(xù)酶解過程，因此，先對分離出的三個組分分別通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀預(yù)濃縮，然后分別通過體積排阻色譜徹底脫鹽后再濃縮備用。四、毛細管電泳條件及五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的確定所用毛細管電泳儀為貝克曼毛細管電泳儀(pacemdqce)。石英毛細管柱內(nèi)徑50μm，外徑370μm，總長81.7cm，有效長度71.5cm；緩沖溶液含200mmol/ltris-h3po4和2mmol/lmgcl2，ph為2.5，使用前加入1.25％質(zhì)量濃度(m/v)聚乙二醇(分子量為10000)；進樣壓力1psi，時間10s；分離電壓-25kv；在單硫酸化寡糖δiia出峰之后(約33min)施加5psi壓力，將δiva推向檢測窗口從而得到檢測；柱溫25℃；檢測波長紫外232nm。因由現(xiàn)有技術(shù)可知：依諾肝素鈉經(jīng)完全酶解后的產(chǎn)物中，存在以下4種1，6-環(huán)苷結(jié)構(gòu)的寡糖：存在以下結(jié)構(gòu)的三糖(trisaccharide)：存在如下結(jié)構(gòu)的8個二糖：及δiisgal和δivsgal，它們是由idoa(2s)-glcns(6s)-和idoa(2s)-glcns-的2-o-去硫酸化生成2種半乳糖醛酸形式：還存在以下三種結(jié)構(gòu)的四糖：δiia-iisglu、δiia-ivsglu(s.yamada,etal.,j.biol.chem.；270(7),4780-4787(1993))、δiis-iisglu表示：上述這些四糖鏈為能夠抵抗酶的降解作用，并能反映抗凝血酶iii親和力的序列片段，其中第三種四糖δiis-iisglu為本發(fā)明新鑒定的四糖。上述的二糖、三糖、四糖和1,6-環(huán)苷寡糖結(jié)構(gòu)鑒定亦可參見美國藥典(secondsupplement，usp-nf，chemicaltests/<207>1,6-anhydroderivativeforenoxaparinsodium)。另外，由于電泳淌度是物質(zhì)的物理化學(xué)常數(shù)，在特定溫度下和固定ph值的緩沖溶液中，特定的物質(zhì)具備固定的電泳淌度，因此可以作為帶電物質(zhì)(或離子)的定性的依據(jù)。根據(jù)電泳淌度的計算公式1，由實驗條件可以計算出各個成分的電泳淌度。公式中l(wèi)t和ld分別是毛細管的總長和有效長度，v為分離電壓，t為遷移時間。公式2為電泳淌度與物質(zhì)的電荷/質(zhì)量比呈線性關(guān)系方程。公式中z為離子的有效電荷，η為溶液的粘度，r為離子半徑。依諾肝素鈉18個完全酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)如前所述。本發(fā)明直接使用依諾肝素鈉完全酶解產(chǎn)物中的7個帶有so32-的二糖(δiva，δis，δiiis，δiis，δia，δiia，δiiia)的電泳淌度(μ)對其電荷質(zhì)量比z/m作圖，線性回歸分析可以得到描述電泳淌度μ和電荷質(zhì)量比z/m之間關(guān)系的線性方程，根據(jù)線性方程推算其它寡糖的電泳淌度并作為定性依據(jù)。通過改進，本發(fā)明根據(jù)酶解產(chǎn)物中的寡糖的電荷質(zhì)量比z/m與其電泳淌度μ之間如下的線性關(guān)系對酶解產(chǎn)物中各個寡糖進行定性鑒定：方程中z/m為寡糖電荷質(zhì)量比；μ為對應(yīng)的電泳淌度。根據(jù)完全酶解產(chǎn)物中各個寡糖的電荷質(zhì)量比，由方程3可以計算出相應(yīng)的電泳淌度(理論值)列于表1中。此外，表1還給出了依諾肝素鈉完全酶解產(chǎn)物中寡糖的其它物理化學(xué)常數(shù)，包括分子量、每個糖單元所帶的so32-數(shù)、電荷質(zhì)量比和實測的電泳淌度。表1.依諾肝素鈉完全酶解產(chǎn)物中寡糖的物理化學(xué)常數(shù)需要特別指出的是，在分離條件ph2.5時所有的磺酸鈉都是解離的，因此，本發(fā)明中計算電荷質(zhì)量比時使用寡糖的磺酸根離子的分子量，且電荷數(shù)為寡糖的總電荷數(shù)，這樣得到的結(jié)果更加準確。通過不同寡糖的理論值和實測值的對比也可以驗證這一點。因此，根據(jù)依諾肝素鈉及其三個不同親和組分的完全酶解產(chǎn)物的電泳圖(見圖3所示)，我們可以先確定圖3中除了峰18以外的其它17個峰，即：峰1-9依次為δis、δiiis、δiis、δia、δivs、δiiia、δiia、δiva、δiisgal、δivsgal；峰11-17依次為δiia-iisglu、δiia-ivsglu、trisaccharide、1,6-anhydroδis-is、1,6-anhydroδis、1,6-anhydroδiis和1,6-anhydroδiisepi。由于五糖結(jié)構(gòu)單元的酶解產(chǎn)物在依諾肝素鈉低親和組分中幾乎沒有，中等親和組分中含有少許，而在高親和組分中含量最多，進一步通過對比三個不同親和組分完全酶解產(chǎn)物的電泳圖，并結(jié)合寡糖的電泳淌度，可以確定依諾肝素鈉的五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰為四糖δiia-iisglu、δiia-ivsglu和δiis-iisglu，分別對應(yīng)峰11、12和18，分別簡稱四糖11、12和18，其中峰18是之前工作中未能鑒定的四糖，從而完成了對依諾肝素鈉中的五糖結(jié)構(gòu)單元酶解片段的分離峰的定性分析。五、實際樣品中五糖結(jié)構(gòu)定量分析因電泳圖中各組分的峰面積與寡糖的摩爾濃度成正比，因此本發(fā)明根據(jù)各組分的峰面積，采用面積百分數(shù)歸一化方法，對三個四糖實現(xiàn)定量測定，δiia-iisglu、δiia-ivsglu和δiis-iisglu總的質(zhì)量百分含量即五糖結(jié)構(gòu)單元的質(zhì)量百分含量公式如下所示：式中mw11、mw12和mw18分別代表四糖11、12和18的分子量，area11、area12和area18分別代表四糖11、12和18在電泳圖中的峰面積，mwx，areax分別代表完全酶解產(chǎn)物中各個寡糖成分的分子量和在電泳譜圖上相應(yīng)的峰面積；依諾肝素鈉樣品中五糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾百分數(shù)(pentasaccharide％)可以由如下公式計算：式中mw代表依諾肝素鈉的重均分子量。因而，根據(jù)圖3和上述公示，可計算得到依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾百分含量(已知依諾肝素鈉重均分子量為4500)，完成對依諾肝素鈉中五糖結(jié)構(gòu)單元的定量分析。按照上述方法，我們對賽諾菲兩批樣品(clexane1和clexane2)、歐洲藥典依諾肝素鈉標(biāo)準品(epcrs)、美國藥典標(biāo)準品(uspcrs)和杭州九源兩批樣品(w20140101和w20140604)分別進行了測定分析，通過計算得到六個依諾肝素鈉樣品中五糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾百分含量，詳見表2所示。表2實際樣品中五糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾百分含量樣品五糖含量％clexane125.85±2.0％clexane226.76±1.2％epcrs26.92±2.2％usrcrs27.26±2.4％w2014010128.35±1.7％w2014060429.95±1.8％由表2的分析結(jié)果表明：采用本發(fā)明的方法能實現(xiàn)對依諾肝素鈉樣品中的五糖結(jié)構(gòu)單元的定性和定量分析，具有可行性，可做為依諾肝素鈉的質(zhì)量控制分析的方法。當(dāng)前第1頁12