本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)的信號(hào)增強(qiáng)劑，此蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑可以顯著增加蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)過(guò)程中的信號(hào)強(qiáng)度。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是指以基因組編碼的所有蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，從細(xì)胞或組織整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，從而深入認(rèn)識(shí)有機(jī)體的各種生理和病理。與傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研究比較，蛋白質(zhì)組學(xué)研究體現(xiàn)了全面性、整體性、高通量、大規(guī)模的特點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對(duì)于已完成基因組計(jì)劃的理論預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行實(shí)證分析具有無(wú)法替代的重要作用。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)較為復(fù)雜，包括蛋白質(zhì)分離、鑒定和信息分析三方面的內(nèi)容。其中，凝膠電泳是分離和鑒定蛋白質(zhì)的核心技術(shù)之一。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)技術(shù)是繼凝膠電泳后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)之一，其主要是用來(lái)識(shí)別、量化、并確定特定蛋質(zhì)白的大小。蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)是由northernblot和southernblot演化而來(lái)，被稱作westernblot。westernblot的方法首先是使用凝膠電泳分離天然或變性的蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體承載物上，之后用未標(biāo)記的或已標(biāo)記的特異性一抗與轉(zhuǎn)移到固體承載物上的抗原識(shí)別并結(jié)合，再加入二抗(二抗上標(biāo)記有酶、熒光、生物素等基團(tuán))對(duì)結(jié)合抗原的一抗進(jìn)行識(shí)別放大免疫信號(hào)，最后針對(duì)一抗或者二抗上偶聯(lián)的探針基團(tuán)(探針種類主要有酶、熒光集團(tuán)和生物素，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)中常使用到的探針種類包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光標(biāo)記三種)并具有相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法。想要完成一次成功的westernblot操作并非易事，主要原因包括目的蛋白豐度低、抗體親和力弱、表位難以識(shí)別等等諸多問題。因此，如何增強(qiáng)免疫印跡膜上的目的蛋白的信號(hào)強(qiáng)度是非常重要以及亟待解決的技術(shù)問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的之一是提供一種能夠顯著增強(qiáng)蛋白質(zhì)免疫印跡膜上目標(biāo)蛋白信號(hào)的方法；本發(fā)明目的之二是提供一種能夠顯適用于不同載體材料上目標(biāo)蛋白信號(hào)的增強(qiáng)劑；本發(fā)明目的之三是提供一種能夠適用于多種顯色方法的蛋白質(zhì)免疫印跡膜上目標(biāo)蛋白信號(hào)的增強(qiáng)劑；本發(fā)明目的之四是提供一種可適用于從多種生物樣本中提取的蛋白質(zhì)的免疫印跡檢測(cè)過(guò)程中的信號(hào)的增強(qiáng)作用。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：針對(duì)蛋白的免疫印跡檢測(cè)(westernblot)中抗體親和力弱、表位難以識(shí)別等等諸多問題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，并經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期，反復(fù)多次試驗(yàn)，首先發(fā)現(xiàn)蛋白免疫印跡檢測(cè)中經(jīng)常使用到的固相支持物，主要包括硝酸纖維素膜和聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)兩種都是屬于海綿狀的多孔結(jié)構(gòu)物質(zhì)，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到這些固相支持膜上面后，有許多蛋白不僅是存在于膜的表面而是進(jìn)入到孔洞中隱藏起來(lái)，因此造成免疫印跡膜上的蛋白難以被一抗識(shí)別及結(jié)合的現(xiàn)象，一抗的識(shí)別及結(jié)合少就會(huì)導(dǎo)致二抗結(jié)合量的減少?gòu)亩a(chǎn)生免疫信號(hào)弱的現(xiàn)象。針對(duì)這個(gè)現(xiàn)象，我們使用高濃度低ph的甘氨酸溶液可以有效迅速剝離膜支持膜表面的細(xì)微的一層干性保護(hù)膜，使得藏在支持膜孔洞內(nèi)更多的蛋白質(zhì)外露并被一抗識(shí)別來(lái)增加免疫信號(hào)的強(qiáng)度。因此在不同的免疫印跡檢測(cè)操作的過(guò)程中封閉前和二抗反應(yīng)后都可以采用這種方法增強(qiáng)目的蛋白的免疫信號(hào)。此外，由于tween20是一種離子表面活性劑，高濃度的tween20和適量的sds在低ph的情況下，可以使支持膜上的大多數(shù)蛋白質(zhì)充分變性，使抗原暴露出更多的抗原表位，從而使一抗更加容易接近抗原表位。同時(shí)，高濃度的tween20還可以減少抗原和抗體的非特異性結(jié)合，降低了免疫印跡膜的背景，更進(jìn)一步地增加了免疫印跡膜上蛋白信號(hào)的強(qiáng)度。附圖說(shuō)明下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。1.實(shí)驗(yàn)材料：1.1小鼠肝組織、水稻、玉米、大豆、小麥的葉片組織；1.2抗體兔源多克隆特異抗體tubulin購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鼠源單克隆特異抗體β-actin購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊源非特異性辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記hrp-goat-anti-rabbit二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊源非特異性辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記hrp-goat-anti-mouse二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊源非特異性堿性磷酸酶標(biāo)記ap-goat-anti-rabbit二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊源非特異性堿性磷酸酶標(biāo)記ap-goat-anti-mouse二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；2.實(shí)驗(yàn)試劑：tris鹽：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司dtt(二硫蘇糖醇)：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司sds(十二烷基硫酸鈉)：mpbiomedicals(shanghai)co.，ltd.edta-na2(乙二胺四乙酸二鈉)：mpbiomedicals(shangha)co.，ltd.丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司過(guò)硫酸銨：北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限責(zé)任公司temed(n，n，n’，n’-四甲基乙二胺)：美國(guó)mpbiomedicals公司甘氨酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白：美國(guó)biorad公司甲醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司冰醋酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司氯化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司磷酸二氫鉀：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司磷酸氫二鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司甘油：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司溴酚藍(lán)：美國(guó)mpbiomedicals公司bradford蛋白濃度測(cè)定試劑：美國(guó)biorad公司tween-20：美國(guó)mpbiomedicals公司nbt/bcip底物顯色試劑：生工生物工程(上海)股份有限公司ecl-化學(xué)發(fā)光底物試劑盒：美國(guó)伯樂公司3.實(shí)驗(yàn)耗材及儀器：硝酸纖維素膜nc膜孔徑0.2μm：美國(guó)pall公司pallfluorotranspvdf轉(zhuǎn)印膜0.2μm：美國(guó)pall公司低溫高速離心機(jī)：美國(guó)sigma公司蛋白制膠及電泳系統(tǒng)：美國(guó)biorad公司濕式轉(zhuǎn)膜裝置：美國(guó)biorad公司las500成像儀器：美國(guó)ge公司azurec500成像儀器：美國(guó)azure公司4.主要試劑的配制：4.1sds-page電泳10％aps：稱取0.1g過(guò)硫酸銨，去離子水溶解并定容至1ml，4℃保存1周內(nèi)使用。10％sds：稱取10gsds，加去離水定容至100ml。1.5mtris-hcl(ph8.8)：稱取18.17gtris鹽，去離子水溶解后，用濃hcl調(diào)節(jié)ph值至8.8，最后用去離子水定容至100ml，4℃保存。0.5mtris-hcl(ph6.8)：稱取6.05gtris鹽，去離子水溶解后，用濃hcl調(diào)節(jié)ph至6.8，最后用去離子水定容至100ml，4℃保存。5×蛋白上樣緩沖液：0.2gsds，0.07571gtris，5ml甘油，0.05g溴酚藍(lán)，0.01dtt，5ml蒸餾水，混勻后用hcl調(diào)ph6.8，定容到10ml，分裝成1ml小份，-20℃保存。電泳緩沖液：稱取15gtris鹽、72g甘氨酸、5gsds，去離子水定容至1000ml。轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取3.028gtris鹽，14.414g甘氨酸加入去離子水定容至800ml后，再加入200ml甲醇定容至1000ml。1×tbs：稱取30.2gtris鹽，8.766g氯化鈉，加入去離子水定容至1000ml后。1×tbst：稱取30.2gtris鹽，8.766g氯化鈉，加入去離子水定容至1000ml后，再加入500μltween-20混勻。4.2蛋白免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取3.028gtris鹽，14.414g甘氨酸加入去離子水定容至800ml后，再加入200ml甲醇定容至1000ml。封閉液：稱取5g脫脂奶粉，加入1×tbs定容至100ml。1×tbst：稱取30.2gtris鹽，8.766g氯化鈉，加入去離子水定容至1000ml后，再加入500μltween-20混勻。一抗(二抗)反應(yīng)液：按比例將一抗(二抗)使用1×tbst稀釋成反應(yīng)液。圖1、pvdf膜封閉前使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑前后并使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的效果比對(duì)圖圖1a、pvdf膜未使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)膜封閉后與一抗β-actin(1∶1000稀釋度)及1∶5000稀釋度的hrp標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的結(jié)果；圖1b、pvdf膜封閉前使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)pvdf膜后將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理。再與一抗β-actin(1∶1000稀釋度)及1∶5000稀釋度的hrp標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的結(jié)果；圖2、硝酸纖維素膜封閉前使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑前后并使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的效果比對(duì)圖圖2a、硝酸纖維素膜未使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(nc膜)封閉后與一抗β-actin(1∶1000稀釋度)及1∶5000稀釋度的hrp標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的結(jié)果；圖2b、硝酸纖維素膜使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜(nc膜)后將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理與一抗β-actin(1∶1000稀釋度)及1∶5000稀釋度的hrp標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的結(jié)果；圖3、pvdf膜使用蛋轉(zhuǎn)膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用堿性磷酸酶底物顯色法檢測(cè)的效果比對(duì)圖圖3a、pvdf膜未使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)pvdf膜后與一抗β-actin(1∶1000稀釋度)及1∶1500稀釋度的ap標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用堿性磷酸酶底物顯色法檢測(cè)的結(jié)果；圖3b、pvdf膜使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)pvdf膜后將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理。再與一抗β-actin(1∶1000)稀釋度)及1∶1500稀釋度的ap標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用堿性磷酸酶底物顯色法檢測(cè)的結(jié)果；圖4、pvdf膜轉(zhuǎn)膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用熒光標(biāo)記二抗直接檢測(cè)法的效果比對(duì)圖圖4a、pvdf膜未使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡熒光顯色法檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；14泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，與一抗β-actin(1∶1000稀釋度)及1∶8000稀釋度的dylight800標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用儀器直接觀察熒光顯色法檢測(cè)的結(jié)果；圖4b、pvdf膜使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4泳道為提取的小鼠不同處理肺組織的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)pvdf膜后將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理。再與一抗β-actin(1∶1000稀釋度)及1∶8000稀釋度的dylight800標(biāo)記的二抗(goat-anti-mouse)反應(yīng)后，使用儀器直接觀察熒光顯色法檢測(cè)的結(jié)果；圖5、植物類蛋白電泳后轉(zhuǎn)pvdf膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的效果比對(duì)圖圖5a、植物蛋白轉(zhuǎn)pvdf膜后未使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：1-8泳道分別為水稻、玉米、大豆、小麥、大麥、煙草、番茄、泡桐的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，與一抗tubulin(1∶1000稀釋度)及1∶5000稀釋度的hrp標(biāo)記的二抗(goat-anti-rabbit)反應(yīng)后，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的結(jié)果；圖5b、植物蛋白轉(zhuǎn)pvdf膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)效果圖m為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-8泳道分別為水稻、玉米、大豆、小麥、大麥、煙草、番茄、泡桐的全蛋白，蛋白上樣量均為50μg，轉(zhuǎn)pvdf膜后封閉前使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑后與一抗tubulin(1∶1000稀釋度)及1∶5000稀釋度的hrp標(biāo)記的二抗(goat-anti-rabbit)反應(yīng)后，使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的結(jié)果；具體實(shí)施方式實(shí)施例11、實(shí)驗(yàn)方法(1)小鼠肝組織按照100mg動(dòng)物組織加入1毫升的比例加入通用型高效總蛋白質(zhì)提取試劑并勻漿處理。(2)冰上孵育45分鐘。(3)4℃，13000rpm離心30分鐘。(4)收集的上清即為動(dòng)物總蛋白提取物，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。(5)取24μl提取出的蛋白質(zhì)溶液，加入6μl的5×loadingbuffer充分混合均勻后，100℃加熱煮沸5分鐘后放置為室溫后4℃，13000rpm離心20分鐘并吸取上清備用。(6)蛋白濃度的測(cè)定：采用bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。(7)將清洗過(guò)的1.0mm厚的玻璃板固定于灌膠架上。(8)配制10％的聚丙烯酰胺分離膠混合液，聚丙烯酰胺凝分離膠混合液的組成為30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、1.5mtris-cl(ph8.8)、10％sds、10％過(guò)硫酸銨、temed。取一定量的上述溶液或試劑混合均勻后全量加樣于玻璃板中，并緩慢加入去離子水為封水層，室溫下放置30min等待分離膠凝固。(9)待分離膠凝固后倒掉所封水層，加入2ml聚丙烯酰胺濃縮膠，同時(shí)在膠面上插上梳子。(10)待濃縮膠凝固后，緩慢拔掉梳子，加樣于上樣孔中，80v電壓跑電泳，待樣品在濃縮膠和分離膠的界面處壓成一條線時(shí)，調(diào)電壓至150v。(11)電泳結(jié)束后，分開兩塊玻璃板，切除濃縮膠。(12)將轉(zhuǎn)膜用的夾子(夾子的黑色部分在最下方)按照海綿-whatman濾紙-膠-pvdf膜-whatman濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后，用bio-rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作：將整個(gè)裝置放置于大的冰盒中，同時(shí)轉(zhuǎn)兩張膜，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液(恒流：400ma)轉(zhuǎn)2個(gè)小時(shí)；(13)轉(zhuǎn)膜完成后一張膜使用去離子水沖凈膜后，將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理；另一張膜直接進(jìn)行封閉操作；(14)封閉：用5％的脫脂奶粉(使用tbs配置)封閉液進(jìn)行封閉，室溫下反應(yīng)2小時(shí)；(15)加入一抗(小鼠β-actin)：稀釋比例為1∶1000，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(16)洗膜：tbst(tbs+0.1％tween20)洗5次，每次5min；(17)加入二抗(hrp-goat-anti-mouse)，稀釋比例為1∶5000，室溫反應(yīng)1-2小時(shí)；(18)洗膜：tbst洗5次，每次5min。(19)采用化學(xué)底物發(fā)光試劑盒進(jìn)行免疫印跡膜的顯色觀察。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，封閉前經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理的印跡膜的信號(hào)強(qiáng)度(圖1b)顯著高于未經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理過(guò)的印跡膜(圖1a)，信號(hào)增強(qiáng)倍數(shù)平均為4倍(表1)。實(shí)施例2(1)小鼠肝組織按照100mg動(dòng)物組織加入1毫升的比例加入通用型高效總蛋白質(zhì)提取試劑并勻漿處理。(2)冰上孵育45分鐘。(3)4℃，13000rpm離心30分鐘。(4)收集的上清即為動(dòng)物總蛋白提取物，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。(5)取24μl提取出的蛋白質(zhì)溶液，加入6μl的5×loadingbuffer充分混合均勻后，100℃加熱煮沸5分鐘后放置為室溫后4℃，13000rpm離心20分鐘并吸取上清備用。(6)蛋白濃度的測(cè)定：采用bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。(7)將清洗過(guò)的1.0mm厚的玻璃板固定于灌膠架上。(8)配制10％的聚丙烯酰胺分離膠混合液，聚丙烯酰胺凝分離膠混合液的組成為30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、1.5mtris-cl(ph8.8)、10％sds、10％過(guò)硫酸銨、temed。取一定量的上述溶液或試劑混合均勻后全量加樣于玻璃板中，并緩慢加入去離子水為封水層，室溫下放置30min等待分離膠凝固。(9)待分離膠凝固后倒掉所封水層，加入2ml聚丙烯酰胺濃縮膠，同時(shí)在膠面上插上梳子。(10)待濃縮膠凝固后，緩慢拔掉梳子，加樣于上樣孔中，80v電壓跑電泳，待樣品在濃縮膠和分離膠的界面處壓成一條線時(shí)，調(diào)電壓至150v。(11)電泳結(jié)束后，分開兩塊玻璃板，切除濃縮膠。(12)將轉(zhuǎn)膜用的夾子(夾子的黑色部分在最下方)按照海綿-whatman濾紙-膠-硝酸纖維素膜-whatman濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后，用bio-rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作：將整個(gè)裝置放置于大的冰盒中，同時(shí)轉(zhuǎn)兩張膜，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液(恒流：400ma)轉(zhuǎn)2個(gè)小時(shí)；(13)轉(zhuǎn)膜完成后一張膜使用去離子水沖凈膜后，將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理；另一張膜直接進(jìn)行封閉操作；(14)封閉：用5％的脫脂奶粉(使用tbs配置)封閉液進(jìn)行封閉，室溫下反應(yīng)2小時(shí)；(15)加入一抗(小鼠β-actin)：稀釋比例為1∶1000，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(16)洗膜：tbst(tbs+0.1％tween20)洗5次，每次5min；(17)加入二抗(hrp-goat-anti-mouse)，稀釋比例為1∶5000，室溫反應(yīng)1-2小時(shí)；(18)洗膜：tbst洗5次，每次5min。(19)采用化學(xué)底物發(fā)光試劑盒進(jìn)行免疫印跡膜的顯色觀察。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用硝酸纖維素膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，封閉前經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理的印跡膜的信號(hào)強(qiáng)度(圖3b)顯著高于未經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理過(guò)的印跡膜(圖3a)，信號(hào)增強(qiáng)倍數(shù)平均為1.7～3.8倍(表3)。實(shí)施例31、實(shí)驗(yàn)方法(1)小鼠肝組織按照100mg動(dòng)物組織加入1毫升的比例加入通用型高效總蛋白質(zhì)提取試劑并勻漿處理；(2)冰上孵育45分鐘；(3)4℃，13000rpm離心30分鐘；(4)收集的上清即為動(dòng)物總蛋白提取物，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。(5)取24μl提取出的蛋白質(zhì)溶液，加入6μl的5×loadingbuffer充分混合均勻后，100℃加熱煮沸5分鐘后放置為室溫后4℃，13000rpm離心20分鐘并吸取上清備用。(6)蛋白濃度的測(cè)定：采用bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。(7)將清洗過(guò)的1.0mm厚的玻璃板固定于灌膠架上。(8)配制10％的聚丙烯酰胺分離膠混合液，聚丙烯酰胺凝分離膠混合液的組成為30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、1.5mtris-cl(ph8.8)、10％sds、10％過(guò)硫酸銨、temed。取一定量的上述溶液或試劑混合均勻后全量加樣于玻璃板中，并緩慢加入去離子水為封水層，室溫下放置30min等待分離膠凝固。(9)待分離膠凝固后倒掉所封水層，加入2ml聚丙烯酰胺濃縮膠，同時(shí)在膠面上插上梳子。(10)待濃縮膠凝固后，緩慢拔掉梳子，加樣于上樣孔中，80v電壓跑電泳，待樣品在濃縮膠和分離膠的界面處壓成一條線時(shí)，調(diào)電壓至150v。(11)電泳結(jié)束后，分開兩塊玻璃板，切除濃縮膠。(12)將轉(zhuǎn)膜用的夾子(夾子的黑色部分在最下方)按照海綿-whatman濾紙-膠-pvdf膜-whatman濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后，用bio-rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作：將整個(gè)裝置放置于大的冰盒中，同時(shí)轉(zhuǎn)兩張膜，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液(恒流：400ma)轉(zhuǎn)2個(gè)小時(shí)；(13)轉(zhuǎn)膜完成后一張膜使用去離子水沖凈膜后，將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理；另一張膜直接進(jìn)行封閉操作；(14)封閉：用5％的脫脂奶粉(使用tbs配置)封閉液進(jìn)行封閉，室溫下反應(yīng)2小時(shí)；(15)加入一抗(小鼠β-actin)：稀釋比例為1∶1000，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(16)洗膜：tbst(tbs+0.1％tween20)洗5次，每次5min；(17)加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(ap-goat-anti-mouse)，稀釋比例為1∶1500，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(18)洗膜：tbst洗5次，每次5min。(19)采用堿性磷酸酶底物顯色試劑進(jìn)行免疫印跡膜的顯色觀察并照相。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，封閉之前經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理的pvdf印跡膜采用堿性磷酸酶底物顯色法的信號(hào)強(qiáng)度(圖4b)顯著高于未經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理過(guò)的印跡膜(圖4a)，信號(hào)增強(qiáng)倍數(shù)平均為23～73倍(表4)。實(shí)施例4(1)小鼠肝組織按照100mg動(dòng)物組織加入1毫升的比例加入通用型高效總蛋白質(zhì)提取試劑并勻漿處理；(2)冰上孵育45分鐘；(3)4℃，13000rpm離心30分鐘；(4)收集的上清即為動(dòng)物總蛋白提取物，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。(5)取24μl提取出的蛋白質(zhì)溶液，加入61μl的5×loadingbuffer充分混合均勻后，100℃加熱煮沸5分鐘后放置為室溫后4℃，13000rpm離心20分鐘并吸取上清備用。(6)蛋白濃度的測(cè)定：采用bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。(7)將清洗過(guò)的1.0mm厚的玻璃板固定于灌膠架上。(8)配制10％的聚丙烯酰胺分離膠混合液，聚丙烯酰胺凝分離膠混合液的組成為30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、1.5mtris-cl(ph8.8)、10％sds、10％過(guò)硫酸銨、temed。取一定量的上述溶液或試劑混合均勻后全量加樣于玻璃板中，并緩慢加入去離子水為封水層，室溫下放置30min等待分離膠凝固。(9)待分離膠凝固后倒掉所封水層，加入2ml聚丙烯酰胺濃縮膠，同時(shí)在膠面上插上梳子。(10)待濃縮膠凝固后，緩慢拔掉梳子，加樣于上樣孔中，80v電壓跑電泳，待樣品在濃縮膠和分離膠的界面處壓成一條線時(shí)，調(diào)電壓至150v。(11)電泳結(jié)束后，分開兩塊玻璃板，切除濃縮膠。(12)將轉(zhuǎn)膜用的夾子(夾子的黑色部分在最下方)按照海綿-whatman濾紙-膠-pvdf膜-whatman濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后，用bio-rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作：將整個(gè)裝置放置于大的冰盒中，同時(shí)轉(zhuǎn)兩張膜，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液(恒流：400ma)轉(zhuǎn)2個(gè)小時(shí)；(13)轉(zhuǎn)膜完成后一張膜使用去離子水沖凈膜后，將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理；另一張膜直接進(jìn)行封閉操作；(14)封閉：用5％的脫脂奶粉(使用tbs配置)封閉液進(jìn)行封閉，室溫下反應(yīng)2小時(shí)；(15)加入一抗(小鼠β-actin)：稀釋比例為1∶1000，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(16)洗膜：tbst(tbs+0.1％tween20)洗5次，每次5min；(17)加入紅外熒光標(biāo)記的二抗(dylight800-goat-anti-mouse)，稀釋比例為1∶8000，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(18)洗膜：tbst洗5次，每次5min。(19)采用儀器直接對(duì)免疫印跡膜顯色觀察并照相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，封閉之前經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理的印跡膜采用紅外熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng)后印跡膜的信號(hào)強(qiáng)度(圖5b)顯著高于未經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理過(guò)的印跡膜(圖5a)，信號(hào)增強(qiáng)倍數(shù)平均為4～17倍(表5)。實(shí)施例51、實(shí)驗(yàn)方法(1)分別稱取水稻、玉米、大豆、小麥葉片組織使用液氮磨成粉末按照100mg加入1毫升的比例加入通用型高效總蛋白質(zhì)提取試劑并充分混勻。(2)冰上孵育45分鐘。(3)4℃，13000rpm離心30分鐘。(4)收集的上清即為植物總蛋白提取物，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。(5)取24μl提取出的蛋白質(zhì)溶液，加入6μl的5×loadingbuffer充分混合均勻后，100℃加熱煮沸5分鐘后放置為室溫后4℃，13000rpm離心20分鐘并吸取上清備用。(6)蛋白濃度的測(cè)定：采用bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定。(7)將清洗過(guò)的1.0mm厚的玻璃板固定于灌膠架上。(8)配制10％的聚丙烯酰胺分離膠混合液，聚丙烯酰胺凝分離膠混合液的組成為30％丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺、1.5mtris-cl(ph8.8)、10％sds、10％過(guò)硫酸銨、temed。取一定量的上述溶液或試劑混合均勻后全量加樣于玻璃板中，并緩慢加入去離子水為封水層，室溫下放置30min等待分離膠凝固。(9)待分離膠凝固后倒掉所封水層，加入2ml聚丙烯酰胺濃縮膠，同時(shí)在膠面上插上梳子。(10)待濃縮膠凝固后，緩慢拔掉梳子，加樣于上樣孔中，80v電壓跑電泳，待樣品在濃縮膠和分離膠的界面處壓成一條線時(shí)，調(diào)電壓至150v。(11)電泳結(jié)束后，分開兩塊玻璃板，切除濃縮膠。(12)將轉(zhuǎn)膜用的夾子(夾子的黑色部分在最下方)按照海綿-whatman濾紙-膠-pvdf膜-whatman濾紙-海綿-透明夾子部分夾好后，用bio-rad濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作：將整個(gè)裝置放置于大的冰盒中，同時(shí)轉(zhuǎn)兩張膜，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液(恒流：400ma)轉(zhuǎn)2個(gè)小時(shí)；(13)轉(zhuǎn)膜完成后一張膜使用去離子水沖凈膜后，將膜浸入蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑中于搖床上晃動(dòng)30分鐘后，使用pbs洗滌膜2次，每次10分鐘，洗滌后封閉處理；另一張膜直接進(jìn)行封閉操作；(14)封閉：用5％的脫脂奶粉(使用tbs配置)封閉液進(jìn)行封閉，室溫下反應(yīng)2小時(shí)；(15)加入一抗(tubulin)：稀釋比例為1∶1000，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(16)洗膜：tbst(tbs+0.1％tween20)洗5次，每次5min；(17)加入二抗(hrp-goat-anti-rabbit)，稀釋比例為1∶5000，室溫反應(yīng)2小時(shí)；(18)洗膜：tbst洗5次，每次5min。(19)采用化學(xué)底物發(fā)光試劑盒進(jìn)行免疫印跡膜的顯色觀察。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同植物種類的全蛋白在轉(zhuǎn)膜后經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理的印跡膜的信號(hào)強(qiáng)度(圖5b)顯著高于未經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理過(guò)的印跡膜(圖5a)，信號(hào)增強(qiáng)倍數(shù)平均為3.39倍(表5)。表1、pvdf膜轉(zhuǎn)膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)表；volumeavolumeb增強(qiáng)倍數(shù)120158612911361.444227214746522828881.91834317333032433931.40421748403441734092.063558表2、硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)表volumeavolumeb增強(qiáng)倍數(shù)1226513.413939571.7392212126280.124844803.8365523229178.334220751.8416884120042.742155001.795194表3、pvdf膜轉(zhuǎn)膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用堿性磷酸酶底物顯色法檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)表volumeavolumeb增強(qiáng)倍數(shù)121683.981158743873.20787238577.042157529740.83509358220.993164409728.2389475616.464177260123.442表4、pvdf膜轉(zhuǎn)膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用熒光顯色法檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)表volumeavolumeb增強(qiáng)倍數(shù)1313323.3113436344.2883312296347.6212182074.1107373165340.5310254296.201923450531.15488905217.59414表5、植物蛋白類轉(zhuǎn)pvdf膜后使用蛋白質(zhì)免疫印跡信號(hào)增強(qiáng)劑處理前后并使用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)表當(dāng)前第1頁(yè)12