本發(fā)明涉及體外診斷領(lǐng)域，更具體地說涉及一種羊水檢測試紙及其制備方法。

背景技術(shù)：

羊水(amnioticfluid)是羊膜腔中的液體。作用是保護(hù)胎兒免受損傷、緩沖外來壓力使胚胎免受震蕩、防止羊膜和胚體的粘連并提供胚胎自由生長活動的條件，維持胚胎發(fā)育所需的液態(tài)環(huán)境。分娩時，有助于擴(kuò)張宮頸、清洗及潤滑產(chǎn)道，以便于胎兒產(chǎn)出。羊水的容量、來源及其組成隨人妊娠期的不同而有變化。妊娠早期羊水清澈，98％為水分，含無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酶、脂肪和激素等。這些物質(zhì)主要為羊膜細(xì)胞所分泌。妊娠后期的羊水略有混濁，這是因?yàn)榧尤肓颂旱姆置谖?、排泄物如尿素、尿酸、皮脂質(zhì)、激素以及胎兒脫落的上皮細(xì)胞。羊水檢查是診斷產(chǎn)科疾病的重要方法之一，及時發(fā)現(xiàn)羊水滲漏，才能減少孕期風(fēng)險。

因胎膜破裂或早破引起孕婦羊水滲漏是無意識的，不能控制，并且是持續(xù)性的，羊水滲漏到一定程度會因羊水過少造成胎兒窒息，危害極大。

現(xiàn)有監(jiān)測羊水滲漏技術(shù)中，采用的金標(biāo)準(zhǔn)是監(jiān)測的一種準(zhǔn)確方法，即在孕婦羊膜腔內(nèi)經(jīng)穿刺注入染料(如美藍(lán))，若陰道內(nèi)有被感染著色的液體流出即可診斷為羊水滲漏，但采用金標(biāo)準(zhǔn)檢測臨床風(fēng)險極大，并且造成患者的痛苦，故臨床基本不用。而臨床上通常采用詢問病史、患者自訴陰道有羊水流出、陰道分泌物ph值變味偏堿性(正常陰道分泌物ph為4.5～5.5)、顯微鏡下查見陰道分泌物涂片中出現(xiàn)羊水結(jié)晶等方法，這些方法雖然操作簡單，但準(zhǔn)確性、敏感性均較低，也不為采用。

羊水檢測試紙應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤物，利用抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。層析過程中，金標(biāo)記物于事先固相化于層析材料：如硝酸纖維素膜即nc膜上的抗原或抗體發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)而被截留，進(jìn)一步富集，形成肉眼可見紫紅色條帶，從而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，達(dá)到檢測的目的。

國際專利pct/us2003/025125公開了一種采用雙抗夾心膠體金免疫層析法檢測陰道分泌物中羊水的裝置和方法，其使用的兩種單克隆抗體是針對a1-微球蛋白(pamg-1)的不同抗原表位有。中國專利申請200620083734.1公開了一種一次性羊水滲漏ph試紙診斷棒，但其敏感度不高，易引起假陰性。國際專利wo2007030890公開了一種利用elisa方法檢測羊水的方法，該法耗時長，需要操作儀器，對操作人員要求較高。因此亟需一種靈敏度高又便于操作、快捷的新型羊水監(jiān)測試紙。

本發(fā)明通過研究優(yōu)化到一對胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1(igfbp-1)抗體， 以最佳的包被及標(biāo)記抗體濃度，制備出羊水檢測試紙，該試紙?zhí)禺愋院谩㈧`敏度高、檢測快速且使用過程安全簡便，宮頸黏液、精液和尿液對試紙均無影響，優(yōu)于目前臨床應(yīng)用的ph試紙等方法。

在漫長的孕期，孕婦會因各種意外導(dǎo)致胎膜破裂，產(chǎn)生羊水滲漏，而去醫(yī)院則面臨無盡的等待，哪怕一個小小檢查，這又給孕婦帶來無盡的風(fēng)險。本發(fā)明試紙適合長期監(jiān)測使用，操作簡便可以進(jìn)行家庭自測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高、檢測快速且對孕婦使用方便的羊水檢測試紙：使用時取陰道分泌物進(jìn)行體外檢測，安全可靠，可用于家庭自測及床邊及時檢驗(yàn)。

本發(fā)明的另一目的在于提供這種羊水檢測試紙的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種羊水檢測試紙及其制備方法，其特征在于：試紙條由在檢測區(qū)(t)硝酸纖維素膜上包被的鼠抗人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1單克隆抗體1和質(zhì)控區(qū)(c)硝酸纖維素膜上包被羊抗鼠多克隆抗體及聚酯膜上吸附的膠體金-鼠抗人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1單克隆抗體2組成，

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述檢測試紙為試紙條，由下往上依次由浸入?yún)^(qū)、膠體金鰲合區(qū)、檢測區(qū)、質(zhì)控區(qū)和手持區(qū)組成。

一種羊水檢測試紙的制備方法，其特征在于工藝步驟如下：

(1)處理液的配置步驟：按濃度比例配置金標(biāo)墊處理液、樣品墊處理液、點(diǎn)膜抗體稀釋液、標(biāo)記抗體稀釋液和膠體金復(fù)合物稀釋液；

(2)試紙的制備步驟：通過膜材的處理、點(diǎn)膜、膠體金復(fù)合物的制備、噴金、膜材的切割、組裝、大板的切割和包裝步驟得到鋁箔袋封裝完整的試紙。

在點(diǎn)膜配液時，取羊抗鼠多克隆抗體，用pbs稀釋成0.5mg/ml的抗體溶液。取胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1單克隆抗體1，用pbs稀釋成1.0mg/ml的抗體溶液。

在膠體金復(fù)合物的制備過程中，所述膠體金復(fù)合物中每1ml膠體金加入5～20μlk2co3，選擇能夠保持顏色不變的最低的ph值，一般選擇1ml膠體金加入15μlk2co3

在膠體金復(fù)合物的制備過程中，所述膠體金復(fù)合物中每1ml膠體金結(jié)合5～15μg的鼠抗人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1單克隆抗體2。選擇能夠保持顏色不變的最小的蛋白量，一般為1ml膠體金結(jié)合10μg的蛋白，在實(shí)際操作中每1ml膠體金多補(bǔ)加10％的抗體蛋白。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有：(1)能檢測出陰道分泌物中少至1ul的羊水，提前發(fā)現(xiàn)臨床尚未發(fā)覺的微小破膜；(2)該指標(biāo)診斷羊水滲漏的靈敏度為98.0％，特異性達(dá)100.0％；(3)該試紙?zhí)禺愋院?、靈敏度高、檢測快速且使用對患者無痛苦；(4)操作簡單，5分鐘即可得到結(jié)果，在羊水滲漏的臨床診斷中具有較高的實(shí)用價值，可作為常規(guī)檢查方法加以推廣。

附圖說明

圖1為羊水滲漏檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合圖1對本發(fā)明做進(jìn)一步展開說明，但需要指出的是，本發(fā)明的羊水滲漏檢測試紙條并不限于這種特定的形狀或結(jié)構(gòu)。對于本領(lǐng)域接術(shù)人員顯然可以理解的是，以下的說明內(nèi)容即使不做任何調(diào)整或修正，也可以直接適用于在此未指明的其他類型或結(jié)構(gòu)的試紙條。

圖1為羊水滲漏檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖，包括：其中，浸入?yún)^(qū)1、膠體金鰲合區(qū)2、檢測區(qū)3、質(zhì)控區(qū)4、手持區(qū)5。在檢測區(qū)(t)3包被有鼠抗人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1單克隆抗體1，質(zhì)控區(qū)(c)4包被有羊抗鼠多克隆抗體，膠體金鰲合區(qū)2包被有鼠抗人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1單克隆抗體2。

試紙使用方法如下：1)將試紙內(nèi)鋁箔袋和緩沖液取出在室溫下平衡。2)打開鋁箔袋，取出檢測試紙條，標(biāo)明被檢樣品和病人信息。從鋁箔袋中取出試紙條后，應(yīng)在1小時內(nèi)盡快使用。3)打開緩沖液，豎放在桌面，將采集好標(biāo)本的陰道棉拭子放入緩沖液瓶內(nèi)，在緩沖液中旋轉(zhuǎn)稀釋1分鐘。4)將試紙條沿箭頭方向垂直向下插入稀釋標(biāo)本后的緩沖液中。5)待試紙條出現(xiàn)色帶時拿出試紙條，試紙條放置桌面，15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果。

可通過檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)的色帶情況判斷結(jié)果如下：1)陽性：在檢測區(qū)(t)及控制區(qū)(c)各出現(xiàn)一條色帶，檢測結(jié)果為陽性。2)陰性：僅在控制區(qū)(c)出現(xiàn)一條色帶，檢測結(jié)果為陰性。3)無效：控制區(qū)(c)無色帶出現(xiàn)，表明試驗(yàn)無效，應(yīng)重新進(jìn)行檢測。該試紙能檢測出的人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1的最低檢出量為20ng/ml。

家庭自測時需仔細(xì)閱讀說明書，詳細(xì)按照說明書操作步驟進(jìn)行，如出現(xiàn)異常情況，及時前往醫(yī)院做進(jìn)一步檢測及確診。

羊水滲漏檢測試紙的制備方法，包括處理液的配置和試紙的制備兩個大步驟，具體步驟明細(xì)如下：

1)處理液的配制

a金標(biāo)墊處理液的配制：tris-hcl(10mm，ph＝7.4)+0.5％pvp+0.5％tw-20

b樣品墊處理液配制：tris-hcl(0.1m，ph＝9.0)+1％pvp+1.0％s17+0.8％casein+0.3％tritonx-100

c點(diǎn)膜抗體稀釋液配制：pbs{pb(10mm，ph＝7.4)，0.85％nacl}

d標(biāo)記抗體稀釋液的配制：pb(10mm，ph＝7.4)

e膠體金復(fù)合物稀釋液的配制：pb(10mm，ph＝7.4)+20％蔗糖+1％bsa

2)試紙的制備

a膜材的處理：

a樣品墊的處理：將備好的微孔濾膜貼于樣品墊(sb08)上，用已經(jīng)配制好的處理液浸泡，充分浸泡后置手烘房烘至濕度降到30％以下就可以收取膜材，收取的膜材要放置于鋁箔袋中(鋁箔袋中要放置一些干燥劑)，最后封口待用。

b金標(biāo)墊的處理：將備好的金標(biāo)墊(kb50)，用已經(jīng)配制好的處理液浸泡，充分浸泡后置于烘房烘至濕度降到30％以下就可以收取膜材，收取的膜材要放置于鋁箔袋中(鋁箔袋中要放置一些干燥劑)，最后封口待用。

b點(diǎn)膜：

a配液：取羊抗鼠多克隆抗體，用pbs稀釋成0.5mg/ml的抗體溶液。取鼠抗人胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1單克隆抗體1，用pbs稀釋成1.0mg/ml的抗體溶液。

b貼膜：取nc膜和pvc膠板，將nc膜貼于pvc膠板的指定區(qū)域。

c點(diǎn)膜：開啟點(diǎn)膜噴金儀，設(shè)置好對應(yīng)的參數(shù)，點(diǎn)膜濃度為1μl/cm，開始點(diǎn)膜。點(diǎn)好膜的膠板置于37℃烘箱中，烘12個小時，通過除濕機(jī)使烘箱所處的環(huán)境濕度降為30％后即可收取膠板，收取的膠板置于鋁箔袋中(鋁箔袋中要放置一些干燥劑)，最后封口備用。

c膠體金復(fù)合物的制備

a最佳ph值的測定

按上表配制膠體金復(fù)合物，選擇能夠保持顏色不變的最低的ph值，一般選擇1ml膠體金+15μlk2co3配制。

b最小蛋白結(jié)合量

按上表配制膠體金復(fù)合物，選擇能夠保持顏色不變的最小的蛋白量，一般為1ml膠體金結(jié)合10μg的蛋白，在實(shí)際操作中每1ml膠體金多補(bǔ)加10％的抗體蛋白。在每次制備時，每更換一次膠體金或者抗體，將重新找最佳ph值和最小蛋白結(jié)合量。

c膠體金復(fù)合物的制備：取一定量的膠體金，加入相應(yīng)量的0.1mk2co3，在磁力攪拌器上混勻，加入相應(yīng)量的抗體溶液，磁力攪拌30min，再加入peg20000使終濃度為0.1％，再磁力攪拌30min，4℃8000r離心40min，棄上清液，沉淀用金標(biāo)稀釋液復(fù)溶(每20ml膠體金最后濃縮為1ml)。4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

d噴金

a調(diào)試：開啟噴金儀，取出已處理好的的金標(biāo)墊，用配制好的膠體金復(fù)合物進(jìn)行噴金，先調(diào)試不同的噴金濃度(如2μl/cm、3μl/cm、4μl/cm、5μl/cm)置于37℃烘箱中，烘兩個小時。

b噴金：按照調(diào)試的結(jié)果用點(diǎn)膜噴金儀進(jìn)行噴金，噴好后置3℃烘箱中，烘兩個小時，開啟除濕機(jī)使烘箱所處的環(huán)境濕度降為30％后即可收取金標(biāo)墊，收取的金標(biāo)墊置于鋁箔袋中(鋁箔袋中要放置一些干燥劑)，最后封口備用。

e膜材的切割：取吸水紙ch27、已處理的樣品墊和已噴金的金標(biāo)墊，開啟除濕機(jī)，使環(huán)境的濕度降為30％以下后，按照一定的尺寸進(jìn)行切割，切割好后的金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙置于不同的鋁箔袋中(鋁箔袋中要放置一些干燥劑)，最后封口備用。

f組裝：取pe膜條和max線，開啟除濕機(jī)，使環(huán)境的濕度降為30％以下后取出已切割好的金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙和點(diǎn)過膜韻膠板，揭掉金標(biāo)墊位置的貼條，貼上金標(biāo)墊，使金標(biāo)墊少部分壓著nc膜，再貼上樣品墊，使使樣品墊部分壓著金標(biāo)墊，貼上吸水紙，吸水紙少部分壓著nc膜，最后貼上pe膜條和max線。組裝好的膠板置于鋁箔袋中(鋁箔袋中要放置一些干燥劑)，最后封口備用。

g大板的切割：開啟除濕機(jī)，使環(huán)境的濕度降為30％以下后取出已組裝好的大板，再開啟切割機(jī)，按照一定的尺寸切割，將切割好的試紙條置于鋁箔袋中(鋁箔袋中要放置一些干燥劑)，最后封口備用。

h內(nèi)包封口：將試紙條和干燥劑放入鋁箔袋內(nèi)，一個鋁箔袋放一個試紙條和干燥劑。

在上述制備過程中，每一步驟都必須開啟除濕機(jī)使所處的環(huán)境濕度降為30％后 方可進(jìn)行，因試紙如果濕度過大就會影響層析的效果，造成試紙失效，

通過采用前述使用方法對本發(fā)明的羊水滲漏檢測試紙進(jìn)行了200例臨床樣本的驗(yàn)證試驗(yàn)，對照組采用傳統(tǒng)的羊水滲漏診斷標(biāo)準(zhǔn)，即采用ph試紙檢測陰道分泌物ph＞7或直接鏡檢陰道分泌物見到羊齒狀結(jié)晶及陰道窺器檢查可見少量液體自宮頸口流出為判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示試驗(yàn)產(chǎn)品與對照組無顯著性差異，試驗(yàn)產(chǎn)品達(dá)到臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。

200例臨床樣本的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見下表：

盡管上文對本發(fā)明的具體實(shí)施方式給予了詳細(xì)描述和說明，但是應(yīng)該指明的是，我們可以依據(jù)本發(fā)明的構(gòu)想對上述實(shí)施方式進(jìn)行各種等效改變和修改，其所產(chǎn)生的功能作用仍未超出說明書及附圖所涵蓋的精神時，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。