本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及化合物提取方法，具體涉及一種生物樣品中原人參二醇及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物提取方法。特別涉及一種基于c8烷基修飾磁性介孔材料的大鼠血漿內(nèi)原人參二醇及其代謝產(chǎn)物提取方法。
背景技術(shù)：
：本領(lǐng)域公知，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是檢測(cè)體內(nèi)藥物及其代謝產(chǎn)物的主要手段之一。使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)生物樣品時(shí)，必須首先對(duì)樣品進(jìn)行前處理，去除樣品中的蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽以及其他干擾分離和檢測(cè)的雜質(zhì)。目前常用的前處理方法包括：蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等。其中，蛋白沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，但缺點(diǎn)是，無法去除樣品中的無機(jī)鹽等小分子化合物，且大幅降低樣品濃度；液液萃取法的優(yōu)點(diǎn)是所用試劑、裝置廉價(jià)易得，除雜效果顯著，但存在的缺點(diǎn)是所使用試劑高毒，且提取范圍窄；固相萃取法的優(yōu)點(diǎn)是除雜效果明顯，親環(huán)境，但存在耗材昂貴，步驟較多等缺點(diǎn)。因此，建立一種簡(jiǎn)便、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的生物體內(nèi)藥物及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)前處理方法，將可以為液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)和藥物代謝研究提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。原人參二醇是原人參二醇型人參皂苷的體外水解產(chǎn)物，從結(jié)構(gòu)上看，它屬于達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類人參皂苷元化合物，分子式為c30h52o3，分子量為460.70，熔點(diǎn)197.5-198.5攝氏度。前期研究顯示，原人參二醇體內(nèi)代謝產(chǎn)物以羥基化為主，極性較原藥逐步加大。本發(fā)明的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，c8基團(tuán)對(duì)原人參二醇及其代謝產(chǎn)物均具有良好的吸附活性，基于此，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、環(huán)保的適用于原人參二醇及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物的前處理方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、環(huán)保的適用于原人參二醇及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)的前處理方法。具體涉及一種生物樣品中原人參二醇及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物提取方法，尤其涉及一種基于c8烷基修飾磁性介孔材料的大鼠血漿內(nèi)原人參二醇及其代謝產(chǎn)物提取方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案為:一種基于c8烷基修飾磁性介孔材料的大鼠血漿內(nèi)原人參二醇及其代謝產(chǎn)物提取方法，使用c8烷基修飾磁性介孔材料為載體,從生物樣品中提取大鼠血漿內(nèi)原人參二醇及其代謝產(chǎn)物，提取物兼容后續(xù)液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。本發(fā)明中，所述c8烷基修飾磁性介孔材料為磁性材料；磁性材料可在磁鐵作用下實(shí)現(xiàn)固液分離，免除離心操作，簡(jiǎn)便易行。本發(fā)明中，所述生物樣品為血漿；血漿是最常用的生物樣品，易獲得，易分析，而且結(jié)果能準(zhǔn)確反映藥物代謝過程。本發(fā)明中，所述c8烷基修飾磁性介孔材料加入量為1mg/100μl生物樣品；每100μl生物樣品加入1mg的c8烷基修飾磁性介孔材料可以將目標(biāo)化合物完全提取。本發(fā)明中，提取時(shí)長(zhǎng)為10min；提取時(shí)間10min可以使c8烷基修飾磁性介孔材料與化合物吸附完全。本發(fā)明中，洗脫溶劑為甲醇；甲醇與目標(biāo)化合物極性相似，能高效洗脫目標(biāo)化合物。本發(fā)明中，洗脫溶劑量為50μl；50μl甲醇即可將目標(biāo)化合物洗脫完全，且較小的洗脫體積可以濃縮目標(biāo)化合物，提高檢測(cè)靈敏度。僅使用微量有機(jī)溶劑更加環(huán)保。本發(fā)明中，洗脫時(shí)長(zhǎng)為5min；目標(biāo)化合物可在5min內(nèi)被完全洗脫。短時(shí)間操作有利于提高提取效率。本發(fā)明技術(shù)方案的有益之處在于：與蛋白沉淀法相比，本方法具有提取富集作用，可大幅提高檢測(cè)靈敏度，適用于生物樣品中痕量代謝產(chǎn)物的提取檢測(cè)；與液液萃取法相比，本方法僅使用微量有機(jī)溶劑，更加綠色環(huán)保；與傳統(tǒng)固相萃取法相比，本方法無需淋洗過程，更加快捷簡(jiǎn)便。此外，本方法使用磁鐵即可實(shí)現(xiàn)固液分離，無需專業(yè)設(shè)備，適用性廣。附圖說明圖1是本發(fā)明的操作示意圖。圖2是使用本發(fā)明方法提取大鼠血漿中原人參二醇及其代謝產(chǎn)物的超高效液相串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜的檢測(cè)色譜圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例11.試驗(yàn)給藥方案1.1ppd混懸液配制取0.5g羧甲基纖維素鈉加入100ml去離子水，40℃水浴加熱并攪拌，直至其完全溶解，取500mg的ppd原料藥，加入上述0.5%羧甲基纖維素鈉溶液100ml，充分混勻后4℃保存待用；1.2給藥與樣品收集取雄性s.d.大鼠10只，每只體重在250~300g之間，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，次日上午10點(diǎn)按100mg/kg體重灌胃給藥1次，當(dāng)日13點(diǎn)取靜脈血，離心取血漿待用；2.樣品前處理與分析2.1樣品前處理取上述大鼠血漿100μl置于1.5ml離心管中，加入c8烷基修飾磁性介孔材料1mg，渦旋震蕩10min，用磁鐵將c8烷基修飾磁性介孔材料吸引于離心管一側(cè)后，棄去上清液，加入50ul甲醇，渦旋震蕩5min，用磁鐵將c8烷基修飾磁性介孔材料吸引于離心管一側(cè)后，取上清5μl進(jìn)樣（如圖1所示）；2.2色譜分離條件色譜柱：agilenteclipseplusc18rrhd1.8μm，2.1x50mm；流動(dòng)相：0.5%甲酸水溶液（a）、乙腈(b)梯度洗脫，流速0.3ml/min，柱溫30℃。色譜梯度洗脫條件如下表1所示：表1uplc梯度洗脫條件time(min)a(%)b(%)flow(ml/min)09550.319550.31.575250.36.025750.312.001000.313.001000.315.09550.32.3質(zhì)譜檢測(cè)條件離子源為電噴霧電離源（esi），正離子掃描模式檢測(cè)，掃描范圍為10-1000da，源溫度為120℃，電離源氣體1（n2）壓力為50psi，電離源氣體2（n2）壓力為50psi，氣簾氣體（n2）壓力為30psi，離子噴射電壓為5500v，去簇電壓（dp）為80v，ce為10ev；本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：通過對(duì)所有大鼠血漿樣品和血漿空白對(duì)照總離子色譜圖的比較，兩者均無明顯差異，提取離子色譜具有可比性；通過對(duì)血漿樣品和空白對(duì)照中提取離子色譜逐一比對(duì)，在大鼠血漿中發(fā)現(xiàn)原型藥物ppd和8種27個(gè)代謝產(chǎn)物（如圖2所示）；原人參二醇藥物原型+h峰的m/z為461.3989，保留時(shí)間為8.742min，其代謝產(chǎn)物m/z分別為445.3676、457.3676、459.3832、475.3782、477.3938、493.3887、509.3836、441.3714，保留時(shí)間介于4.620至8.219min之間；根據(jù)提取離子色譜圖結(jié)果所示，本方法對(duì)原人參二醇原藥及其代謝產(chǎn)物提取準(zhǔn)確、完全，除雜作用顯著，可與液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)器相匹配，且具有富集濃縮作用，大幅提高檢測(cè)靈敏度，目標(biāo)化合物峰型良好，分離度高，響應(yīng)強(qiáng)，無雜質(zhì)干擾，僅需100μl樣品即可完成代謝產(chǎn)物檢測(cè)。以上實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動(dòng)，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12