本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及了一種檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥由于其殺蟲譜廣，藥效高，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛的應(yīng)用。由于其使用量大，應(yīng)用面廣，在食品安全和環(huán)境保護(hù)方面受到了普遍關(guān)注。尤其是一些劇毒、高毒的農(nóng)藥品種，如甲胺磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷等農(nóng)藥，由于其造成的急性毒性和殘留毒性問(wèn)題，已被禁止在蔬菜和水果上使用。但由于農(nóng)民缺乏科學(xué)用藥知識(shí)，常常出現(xiàn)高毒、劇毒農(nóng)藥的亂用和濫用問(wèn)題。即使是那些毒性相對(duì)較低的農(nóng)藥，也存在農(nóng)民加大用藥劑量或采收前施藥（不遵循安全間隔期）等問(wèn)題，給消費(fèi)者和環(huán)境安全造成了極大危害。因此開展農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的方法是酶抑制法和色譜分析法。色譜法的測(cè)定準(zhǔn)確度和靈敏度都較高，但存在儀器化程度高、前處理操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)的問(wèn)題。酶抑制法采用膽堿酯酶檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，具有廣譜性，且簡(jiǎn)便、快捷，但是其靈敏性較低（遠(yuǎn)達(dá)不到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量要求），而且需要復(fù)雜和昂貴的輔助設(shè)備，進(jìn)一步限定其應(yīng)用。

近年來(lái)，免疫測(cè)定技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域得到迅猛發(fā)展，它以特異性好、簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛的應(yīng)用。隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其在農(nóng)藥殘留中的檢測(cè)應(yīng)用也越來(lái)越深入，其中酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中表現(xiàn)最為活躍，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了殺菌劑、殺蟲劑、除草劑和一些植物（昆蟲）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的elisa檢測(cè)技術(shù)方法的建立，其檢測(cè)水平可達(dá)到ng、甚至pg級(jí)。免疫層析法是另外一種廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床、獸藥檢測(cè)領(lǐng)域。目前，在農(nóng)殘檢測(cè)領(lǐng)域也有免疫層析檢測(cè)產(chǎn)品出現(xiàn)。但是不管是elisa還是免疫層析試紙法都只能一次檢測(cè)一兩種（多的五六種）農(nóng)藥殘留，根本無(wú)法滿足目前在用農(nóng)藥達(dá)幾百種的現(xiàn)實(shí)需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法，該方法具有廣譜性，簡(jiǎn)便、快捷、低成本，且具有高靈敏性。本發(fā)明還提供了檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的試劑盒。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法，所述方法是通過(guò)雙抗體夾心檢測(cè)膽堿酯酶實(shí)現(xiàn)的。

所述方法可以是任何一種免疫學(xué)分析方法，如：免疫層析法（immunochromatography）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（elisa）、時(shí)間分辨免疫分析（time-resolvedfluoroimmunoassay，trfia）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，clia）、液相芯片（liquidchip）、表面等離子共振免疫分析(surfaceplasmonresonance，spr)、蛋白質(zhì)芯片（proteinchiptechnology）、生物膜干涉分析（bio-layerinterferometry，bli）等。

在本發(fā)明中，所述膽堿酯酶是乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶。

在本發(fā)明中，所述雙抗體包括第一抗體和第三抗體：所述第一抗體為與活性膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與老化膽堿酯酶結(jié)合的抗體，所述第三抗體與活性膽堿酯酶和老化膽堿酯酶均發(fā)生結(jié)合；或者，

所述雙抗體包括第二抗體和第三抗體：所述第二抗體與老化膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與活性膽堿酯酶結(jié)合，所述第三抗體與活性膽堿酯酶和老化膽堿酯酶均發(fā)生結(jié)合。

在本發(fā)明中，所述第一抗體是用活性膽堿酯酶免疫動(dòng)物獲得或是用膽堿酯酶的多肽免疫動(dòng)物獲得；所述第二抗體是用老化膽堿酯酶免疫動(dòng)物獲得或是用膽堿酯酶的多肽免疫動(dòng)物獲得。所述抗體可以是單克隆抗體，也可以是單克隆抗體，本發(fā)明優(yōu)選采用單克隆抗體。

一種檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的免疫層析試劑盒，包括含有活性膽堿酯酶的第一容器、第一免疫層析試紙條；所述第一免疫層析試紙條的層析膜和結(jié)合墊分別包被有第三抗體和納米顆粒標(biāo)記的第二抗體，所述第三抗體與活性膽堿酯酶和老化膽堿酯酶均發(fā)生結(jié)合，所述第二抗體與老化膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與活性膽堿酯酶結(jié)合。

一種檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的免疫層析試劑盒，包括含有活性膽堿酯酶的第一容器、第一免疫層析試紙條；所述第一免疫層析試紙條的層析膜和結(jié)合墊分別包被有第三抗體和納米顆粒標(biāo)記的第一抗體，所述第三抗體與活性膽堿酯酶和老化膽堿酯酶均發(fā)生結(jié)合，所述第一抗體與活性膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與老化膽堿酯酶結(jié)合。

一種檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的免疫層析試劑盒，包括含有活性膽堿酯酶的第一容器、含有納米顆粒標(biāo)記的第一抗體的第二容器、第二免疫層析試紙條；所述第二免疫層析試紙條的層析膜包被有第三抗體，所述第三抗體與活性膽堿酯酶和老化膽堿酯酶均發(fā)生結(jié)合，所述第一抗體與活性膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與老化膽堿酯酶結(jié)合；

或者，

包括含有活性膽堿酯酶的第一容器、含有納米顆粒標(biāo)記的第二抗體的第二容器、第二免疫層析試紙條；所述第二免疫層析試紙條的層析膜包被有第三抗體，所述第三抗體與活性膽堿酯酶和老化膽堿酯酶均發(fā)生結(jié)合，所述第二抗體與老化膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與活性膽堿酯酶結(jié)合。

一種檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的elisa試劑盒，包括活性膽堿酯酶、包被有第一抗體或第二抗體的微孔板、酶標(biāo)記的第三抗體；所述第一抗體與活性膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與老化膽堿酯酶結(jié)合，所述第二抗體與老化膽堿酯酶特異性結(jié)合但不與活性膽堿酯酶結(jié)合，所述第三抗體與活性膽堿酯酶和老化膽堿酯酶均發(fā)生結(jié)合。

如上所述的檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的elsia試劑盒，還包括顯色液、終止液、洗滌液、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品。

本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明公開的一種快速檢測(cè)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法，其原理是：有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致膽堿酯酶構(gòu)象發(fā)生變化，采用免疫學(xué)方法測(cè)定膽堿酯酶的構(gòu)象變化情況可知待檢樣品中有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況。

本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)膽堿酯酶的構(gòu)象變化來(lái)判定被檢樣品中有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況，具有檢測(cè)范圍廣（能夠有效檢測(cè)出絕大多數(shù)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥）、高靈敏（檢測(cè)下限遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有的酶抑制法，達(dá)到或超過(guò)農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)要求）、簡(jiǎn)便易行（整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不需要用到昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員，幾乎任何場(chǎng)合均可開展檢測(cè)）、費(fèi)用低廉（試紙條和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是公認(rèn)的低成本檢測(cè)方法，而且本發(fā)明所公開的方法僅需一個(gè)檢測(cè)反應(yīng)就可知曉樣本有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況，大大節(jié)省了檢測(cè)成本）。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，實(shí)施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不是對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1待檢樣品處理方法

1.肉類：1）取0.5g肉置于10ml燒杯中，加入5ml丙酮浸泡5min，每隔1min渦旋混勻1次，再加0.2g碳酸鈣；2）取0.5ml上述液體于5ml燒杯中，用氮?dú)獯蹈杀?；加?.3ml0.1mtris-hcl（ph8.0）緩沖液溶解；3）加入0.1ml0.3%次氯酸鈣，放置10min；4）再加入0.3ml10%亞硝酸鈉，搖勻，備檢。

2.乳：1）生鮮乳、巴氏滅菌乳不需處理。2）發(fā)酵乳：用兩倍質(zhì)量的0.1mtris-hcl（ph8.0）調(diào)節(jié)ph至ph8.0，備檢。3）乳粉：取1g乳粉，加入9ml去離子水，溶解，備檢。

3.蜂蜜：用0.1mtris-hcl（ph8.0）稀釋10倍，備檢。

4.尿液：用0.1mtris-hcl（ph8.0）稀釋2倍，備檢。

5.果蔬：取1g菜葉，用5ml去離子水浸泡1min，取液體，備檢。

6.水：1）自來(lái)水、河水、湖水等較潔凈的水：直接加測(cè)。2）污水：用中速定性濾紙過(guò)濾，收集濾液，備檢。

7.血液：分離血清或血漿，備檢。

實(shí)施例2單克隆抗體的制備

1.第一單克隆抗體的制備

a、采用對(duì)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥高度敏感的活性膽堿酯酶（如來(lái)源于動(dòng)物、植物、基因重組的乙酰膽堿酯酶/丁酰膽堿酯酶）免疫balb/c小鼠，免疫劑量：100μg/只，每隔2周免疫一次，連續(xù)免疫四次；

b、免疫后的小鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合，然后用相應(yīng)的活性膽堿酯酶包被的微孔板篩選出單克隆抗體；

c、老化膽堿酯酶的制備：往活性膽堿酯酶中添加過(guò)量甲基對(duì)硫磷；置于37℃下1h；超濾去除小分子；用pbs重懸膽堿酯酶，即為老化膽堿酯酶。

d、第一單克隆抗體的篩選：用碳酸鹽緩沖液將老化膽堿酯酶稀釋到1~10μg/ml，4℃包被酶標(biāo)微孔；用1%bsa于37℃封閉酶標(biāo)微孔2h；檢測(cè)步驟b篩選到的單克隆抗體，篩選出與老化膽堿酯酶不發(fā)生特異性結(jié)合的單克隆抗體，即為第一單克隆抗體。

e、在篩選過(guò)程中，既與活性膽堿酯酶結(jié)合又與老化膽堿酯酶結(jié)合的單克隆抗體即為第三單克隆抗體。

具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，可增加通過(guò)其他有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥老化的膽堿酯酶進(jìn)行多次篩選的步驟，以獲得只與活性膽堿酯酶發(fā)生特異性結(jié)合，而與絕大多數(shù)農(nóng)藥老化的老化膽堿酯酶不發(fā)生特異性結(jié)合的第一單克隆抗體，進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.第二單克隆抗體的制備

a、老化膽堿酯酶的制備：往活性膽堿酯酶（如來(lái)源于動(dòng)物、植物、基因重組的乙酰膽堿酯酶/丁酰膽堿酯酶）中添加過(guò)量甲基對(duì)硫磷；置于37℃下1h；超濾去除小分子；用pbs重懸膽堿酯酶，即為老化膽堿酯酶。

b、采用上述步驟a制得的老化膽堿酯酶免疫balb/c小鼠，免疫劑量：80μg/只，每隔2周免疫一次，連續(xù)免疫四次；

c、免疫后的小鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合，然后用步驟a制得的老化膽堿酯酶包被的微孔板篩選出單克隆抗體；

d、第二單克隆抗體的篩選：用碳酸鹽緩沖液將活性膽堿酯酶稀釋到1~10μg/ml，4℃包被酶標(biāo)微孔；用1%bsa于37℃封閉酶標(biāo)微孔2h；檢測(cè)步驟c篩選到的單克隆抗體；篩選出與活性膽堿酯酶不發(fā)生特異性結(jié)合的單克隆抗體，即第二單克隆抗體。

e、在篩選過(guò)程中，既與活性膽堿酯酶結(jié)合又與老化膽堿酯酶結(jié)合的單克隆抗體即為第三單克隆抗體。

具體實(shí)現(xiàn)時(shí)，用其他有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥老化的膽堿酯酶包被微孔板，檢測(cè)步驟c篩選到的單克隆抗體，篩選出與之發(fā)生特異性結(jié)合的單克隆抗體，以獲得只與老化膽堿酯酶發(fā)生特異性結(jié)合，而與活性膽堿酯酶不發(fā)生特異性結(jié)合的第二單克隆抗體，進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

實(shí)施例3檢測(cè)活性膽堿酯酶的免疫層析方法

1.金標(biāo)第一單克隆抗體的制備：取10ml粒徑40nm的納米金顆粒，加入40μg第一單克隆抗體；室溫反應(yīng)15min；加入bsa至終濃度1%(w/v)，繼續(xù)室溫反應(yīng)15min；離心，用1ml復(fù)溶液（10mmtris-hcl（ph8.0）、0.5%bsa）重懸顆粒，備用。

2.層析膜的制備：往密理博公司的135硝酸纖維素膜上按照1.0μl/cm的量依次噴涂濃度為2mg/ml的第三單克隆抗體（檢測(cè)區(qū)）、0.02mg/ml羊抗鼠igg（質(zhì)控區(qū)），置于37℃干燥2h，備用。

3.樣品墊的制備：用20mmtris-hcl(ph8.0)、1%bsa、0.5%tween20浸泡奧斯龍8964玻璃纖維10min；置于37℃干燥，備用。

4.試紙條的組裝：試紙條包括底板，以及依次搭接粘貼在底板上的樣品墊、層析膜、吸水墊；試紙條的層析膜上由樣品墊到吸水墊方向依次為膽堿酯酶檢測(cè)區(qū)、質(zhì)控區(qū)。

5.檢測(cè)樣品：1）往微孔中加入0.5u丁酰膽堿酯酶，加入200μl待檢樣品（乳汁、尿液、洗滌果蔬所得液體、其他液體樣品），吹打混勻；置于40℃孵育10min；2）將上述步驟1）微孔中的液體轉(zhuǎn)至含有10μl金標(biāo)第一單克隆抗體的微孔中，吹打混勻，置于40℃3min；3）將試紙條的樣品墊一端插入微孔中，3min后觀察結(jié)果，不同待檢樣品通過(guò)不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果如表1~2所示。

表1檢測(cè)果蔬中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表2本法檢測(cè)尿液中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

實(shí)施例4檢測(cè)活性膽堿酯酶的免疫層析法

1.熒光納米顆粒標(biāo)記第一單克隆抗體的制備：取1ml粒徑120nm的聚苯乙烯熒光納米顆粒，用50mmmes（ph6.0）洗滌兩次；1ml50mmmes（ph6.0）重選顆粒；加入edc，使其終濃度為5mg/ml；室溫避光反應(yīng)30min；13000rpm10min，棄掉上清；用50mmmes（ph6.0）洗滌1次；加入200μg第一單克隆抗體；室溫反應(yīng)60min；加入bsa至終濃度1%(w/v)，繼續(xù)室溫反應(yīng)60min；13000rpm10min，棄掉上清；50mmmes（ph6.0）洗滌兩次；離心，用1ml復(fù)溶液（10mmtris-hcl（ph8.0）、0.5%bsa）重懸顆粒，備用。

2.層析膜的制備：往賽多利斯cn95硝酸纖維素膜上按照0.8μl/cm的量依次噴涂濃度為2mg/ml的第三單克隆抗體（檢測(cè)區(qū)）、0.02mg/ml羊抗鼠igg（質(zhì)控區(qū)），置于37℃干燥2h，備用。

3.樣品墊的制備：用20mmtris-hcl(ph8.0)、1%bsa、0.5%tween20浸泡奧斯龍8964玻璃纖維10min；置于37℃干燥，備用。

4.結(jié)合墊的制備：將制備好的熒光納米顆粒標(biāo)記第一單克隆抗體按照1μl/cm噴涂奧斯龍8964玻璃纖維，置于37℃干燥，備用。

5.試紙條的組裝：試紙條包括底板，以及依次搭接粘貼在底板上的樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊；試紙條的層析膜上由樣品墊到吸水墊方向依次為膽堿酯酶檢測(cè)區(qū)、質(zhì)控區(qū)。

6.檢測(cè)樣品：1）往微孔中加入0.5u丁酰膽堿酯酶，加入200μl待檢樣品（乳汁、蜂蜜、洗滌果蔬所得液體、水、其他液體樣品），吹打混勻；置于40℃孵育10min；2）將試紙條的樣品墊一端插入微孔中，3min后于紫外光下觀察結(jié)果，不同待檢樣品通過(guò)不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果如表3~6所示。

表3檢測(cè)果蔬中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表4本法檢測(cè)牛乳中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表5檢測(cè)蜂蜜中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表6檢測(cè)水中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

實(shí)施例5檢測(cè)老化膽堿酯酶的免疫層析方法

1.金標(biāo)第二單克隆抗體的制備：取10ml粒徑40nm的納米金顆粒，加入25μg第二單克隆抗體；室溫反應(yīng)15min；加入bsa至終濃度1%(w/v)，繼續(xù)室溫反應(yīng)15min；離心，用1ml復(fù)溶液（10mmtris-hcl（ph8.0）、0.5%bsa）重懸顆粒，備用。

2.層析膜的制備：往密理博公司的135硝酸纖維素膜上按照1.0μl/cm的量依次噴涂濃度為2mg/ml的第三單克隆抗體（檢測(cè)區(qū)）、0.02mg/ml羊抗鼠igg（質(zhì)控區(qū)），置于37℃干燥2h，備用。

3.樣品墊的制備：用20mmtris-hcl(ph8.0)、1%bsa、0.5%tween20浸泡無(wú)紡布10min；置于37℃干燥，備用。

4.試紙條的組裝：試紙條包括底板，以及依次搭接粘貼在底板上的樣品墊、層析膜、吸水墊；試紙條的層析膜上由樣品墊到吸水墊方向依次為膽堿酯酶檢測(cè)區(qū)、質(zhì)控區(qū)。

5.檢測(cè)樣品：1）往微孔中加入0.5u乙酰膽堿酯酶，加入200μl待檢樣品（乳汁、尿液、洗滌果蔬所得液體、其他液體樣品），吹打混勻；置于40℃孵育10min；2）將上述步驟1）微孔中的液體轉(zhuǎn)至含有5μl金標(biāo)第二單克隆抗體的微孔中，吹打混勻，置于40℃3min；3）將試紙條的樣品墊一端插入微孔中，3min后觀察結(jié)果，不同待檢樣品通過(guò)不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果如表7~8所示。

表7檢測(cè)果蔬中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表8本法檢測(cè)尿液中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

實(shí)施例6檢測(cè)老化膽堿酯酶的免疫層析法

1.金標(biāo)第二單克隆抗體的制備：取10ml粒徑40nm的納米金顆粒，加入25μg第一單克隆抗體；室溫反應(yīng)15min；加入bsa至終濃度1%(w/v)，繼續(xù)室溫反應(yīng)15min；離心，用1ml復(fù)溶液（10mmtris-hcl（ph8.0）、0.5%bsa）重懸顆粒，備用。

2.層析膜的制備：往賽多利斯cn90硝酸纖維素膜上按照0.8μl/cm的量依次噴涂濃度為2.5mg/ml的第三單克隆抗體（檢測(cè)區(qū)）、0.02mg/ml羊抗鼠igg（質(zhì)控區(qū)），置于37℃干燥2h，備用。

3.樣品墊的制備：用20mmtris-hcl(ph8.0)、1%bsa、0.5%tween20浸泡聚酯膜10min；置于37℃干燥，備用。

4.結(jié)合墊的制備：將制備好的金標(biāo)第二單克隆抗體按照2μl/cm噴涂奧斯龍8964玻璃纖維，置于37℃干燥，備用。

5.試紙條的組裝：試紙條包括底板，以及依次搭接粘貼在底板上的樣品墊、結(jié)合墊、層析膜、吸水墊；試紙條的層析膜上由樣品墊到吸水墊方向依次為膽堿酯酶檢測(cè)區(qū)、質(zhì)控區(qū)。

6.檢測(cè)樣品：1）往微孔中加入0.5u丁酰膽堿酯酶，加入200μl待檢樣品（乳汁、蜂蜜、洗滌果蔬所得液體、水、其他液體樣品），吹打混勻；置于40℃孵育10min；2）將試紙條的樣品墊一端插入微孔中，3min后觀察結(jié)果，不同待檢樣品通過(guò)不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果如表9~12所示。

表9檢測(cè)果蔬中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表10本法檢測(cè)牛乳中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表11檢測(cè)蜂蜜中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

表12檢測(cè)水中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

實(shí)施例7檢測(cè)活性膽堿酯酶的elisa檢測(cè)方法

1.用碳酸鹽緩沖液（ph9.6）將第一單克隆抗體稀釋成2000ng/ml，按照100μl/孔分裝至酶標(biāo)微孔中，4℃孵育18h；

2.用pbst（吐溫-20含量0.05%）洗滌酶標(biāo)微孔5次；

3.用1%bsa封閉酶標(biāo)微孔：150μl/孔，37℃2h；

4.棄掉bsa，備用；

5.按照200μl/孔將待檢樣品（或者處理后所得液體）分裝至干凈的微孔中，并往微孔中加入5u/孔乙酰膽堿酯酶，混勻，置于37℃孵育15min；

6.按照100μl/孔將步驟5制得的液體轉(zhuǎn)至步驟4的酶標(biāo)微孔中；于37℃孵育45min；

7.pbst洗滌5次；

8.按照100μl/孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第三單克隆抗體，混勻，置于37℃孵育30min；

9.用pbst（吐溫-20含量0.05%）洗滌酶標(biāo)微孔6次；

10.按照100μl/孔加入底物顯色；

11.按照50μl/孔加入2m硫酸終止反應(yīng)，于450nm檢測(cè)結(jié)果，果蔬通過(guò)本檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果如表13所示。

表13檢測(cè)果蔬中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

實(shí)施例8檢測(cè)老化膽堿酯酶的elisa檢測(cè)方法

1.用碳酸鹽緩沖液（ph9.6）將第二單克隆抗體稀釋成3000ng/ml，按照100μl/孔分裝至酶標(biāo)微孔中，4℃孵育18h；

2.用pbst（吐溫-20含量0.05%）洗滌酶標(biāo)微孔5次；

3.用1%bsa封閉酶標(biāo)微孔：150μl/孔，37℃2h；

4.棄掉bsa，備用；

5.按照200μl/孔將待檢樣品（或者處理后所得液體）分裝至干凈的微孔中，并往微孔中加入5u/孔乙酰膽堿酯酶，混勻，置于37℃孵育15min；

6.按照100μl/孔將步驟5制得的液體轉(zhuǎn)至步驟4的酶標(biāo)微孔中；于37℃孵育45min；

7.pbst洗滌5次；

8.按照100μl/孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第三單克隆抗體，混勻，置于37℃孵育30min；

9.用pbst（吐溫-20含量0.05%）洗滌酶標(biāo)微孔6次；

10.按照100μl/孔加入底物顯色；

11.按照50μl/孔加入2m硫酸終止反應(yīng)，于450nm檢測(cè)結(jié)果，果蔬通過(guò)本檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果如表14所示。

表14檢測(cè)果蔬中部分有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限（單位：mg/kg）

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。