本發(fā)明涉及一種黃酮類成分的檢測(cè)方法，尤其是無籽刺梨果實(shí)中3種黃酮類成分的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

無籽刺梨(Rosa sterilis S.D.Shi)屬薔薇科薔薇屬多年生攀援類果樹，為貴州特有種，是一種藥食同源的植物，2015年被國家林業(yè)局授權(quán)為植物新品種，其生態(tài)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值對(duì)于喀斯特石漠化地區(qū)具有重要意義。其生態(tài)價(jià)值主要體現(xiàn)在石漠化治理、水土保持和生態(tài)修復(fù)等方面，藥用和保健價(jià)值主要體現(xiàn)在無籽刺梨醫(yī)藥和保健產(chǎn)品逐步上市，市場(chǎng)前景較好。

已有研究表明，無籽刺梨生物活性成分中黃酮類物質(zhì)含量最高。黃酮類物質(zhì)是小分子化合物，廣泛存是許多中草藥的有用成分，有較好的抗氧化性和清除自由基的能力。國內(nèi)外已有研究表明某些黃酮類化合物既是藥理因子，又是重要的營養(yǎng)因子，為一種新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)素，不同分子結(jié)構(gòu)的黃酮可作用于身體不同器官，對(duì)人體具有重要的生理保健功效。然而，就目前研究現(xiàn)狀而言，關(guān)于無籽刺梨質(zhì)量控制的報(bào)道很少，采用HPLC法測(cè)定其中某類成分的研究更少，已有研究中測(cè)定的成分較為單一，如單獨(dú)測(cè)定無籽刺梨果實(shí)中蘆丁、沒食子酸。尚未見使用HPLC同時(shí)測(cè)定無籽刺梨中3類以上成分的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為進(jìn)一步加深無籽刺梨活性成分的深入研究，采用HPLC法建立無籽刺梨的多指標(biāo)含量測(cè)定方法，同時(shí)測(cè)定蘆丁、槲皮素和山奈酚3種黃酮類成分的含量，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，加深對(duì)無籽刺梨黃酮類物質(zhì)成分的了解及其含量測(cè)定，為其合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供同時(shí)檢測(cè)無籽刺梨果實(shí)中蘆丁、槲皮素和山奈酚的方法，它包括如下操作步驟：

（1）取待檢無籽刺梨果實(shí)干燥粉末，以甲醇或含水甲醇提取，減壓旋干濾液，加入10ml超純水，分別水飽和正丁醇萃取兩次（醇水比4:1），10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并濾液，減壓旋干并定容至10ml，為制備供試品溶液；

（2）選擇蘆丁、槲皮素、山奈酚為對(duì)照品，制備對(duì)照品溶液；

（3）分別將對(duì)照品、供試品溶液在同一色譜條件下的高效液相色譜儀中進(jìn)行進(jìn)樣分析，根據(jù)外標(biāo)法監(jiān)測(cè)無籽刺梨中上述3種成分即可，色譜條件如下：

色譜柱：十八烷基鍵合硅膠為填料；

檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；

流速：0.6-1.0ml/min；

流動(dòng)相：流動(dòng)相為A：乙腈，B：0.05-0.4%磷酸水溶液；

梯度洗脫程序： 0-5min，90-87%B；5-10min，87%B；10-15min，87%-85%B；15-20min，85%-84%B；20-32min，84%-82%B；32-35min，82%-80%B；35-40min，80%-78%B；40-55min，78%-75%B；55-70min，75%-70%B；70-80min，70%-60%B；80-90min，60%-35%B；90-95min，35%-20%B；95-105min，20%-10%B；105-110min，10%-5%B；110-115min，5%-10%B；115-120min，10%-20%B；120-130min，20%-90%B；130-150min，90%B。

本發(fā)明需要指出，由于無籽刺梨中糖、酸等含量較高，待提取液制備完全后，應(yīng)盡可能的將其中大極性物質(zhì)最大可能去除，以保持譜圖基線平穩(wěn)和各未知物良好的分離，同時(shí)還需保證前處理方法的回收率達(dá)標(biāo)。因此在HPLC法分析過程中，實(shí)現(xiàn)無籽刺梨提取液中各物質(zhì)基線分離和目標(biāo)物含量測(cè)定是難點(diǎn)。本發(fā)明所建立的方法可同時(shí)分離測(cè)定蘆丁、槲皮素和山奈酚3種成分。目前公開的刺梨色譜條件均不能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)本發(fā)明中的3種成分進(jìn)行含量測(cè)定。

進(jìn)一步地，步驟（1）中，在以甲醇或含水甲醇提取時(shí)，提取溶劑甲醇濃度為50-100%v/v，優(yōu)選為100%v/v，在采用100%v/v濃度時(shí)提取效果遠(yuǎn)高于采用50%v/v濃度。

更進(jìn)一步地，步驟（1）中，在以甲醇或含水甲醇提取時(shí)，提取方法選自回流、超聲以及超聲加回流3種之一。

進(jìn)一步地，色譜條件中，流速為0.7ml/min。

進(jìn)一步地，色譜條件中，磷酸水溶液濃度為0.1%。

進(jìn)一步地，色譜條件中，色譜柱尺寸為4.6mm×250mm，5μm。

更進(jìn)一步地，色譜條件中，色譜柱柱溫為30℃±2℃。

本發(fā)明檢測(cè)方法中，出峰數(shù)量較多，分離度良好，基線平穩(wěn)，能夠?qū)o籽刺梨果實(shí)中主要黃酮類成分進(jìn)行有效檢測(cè)，為其深入研究提供可靠檢測(cè)手段。本發(fā)明首次在同一色譜條件下檢測(cè)了上述無籽刺梨果實(shí)中主要黃酮類成分，共指認(rèn)了3個(gè)具體化合物，可更全面跟準(zhǔn)確地用于無籽刺梨果實(shí)黃酮類活性成分的深入研究。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1：

本發(fā)明檢測(cè)方法包括如下步驟：

（1）取待檢無籽刺梨果實(shí)干燥粉末，以甲醇或含水甲醇提取，減壓旋干濾液，加入10ml超純水，分別水飽和正丁醇萃取兩次（醇水比4:1，體積比），10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并濾液，減壓旋干并定容至10ml，為制備供試品溶液；

（2）選擇蘆丁、槲皮素、山奈酚為對(duì)照品，制備對(duì)照品溶液；

（3）分別將對(duì)照品、供試品溶液在同一色譜條件下的高效液相色譜儀中進(jìn)行進(jìn)樣分析，根據(jù)外標(biāo)法監(jiān)測(cè)無籽刺梨中上述3種成分即可，色譜條件如下：

色譜柱：十八烷基鍵合硅膠為填料；

檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；

流速：0.7ml/min；

流動(dòng)相：流動(dòng)相為A：乙腈，B：0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫程序： 0-5min，90-87%B；5-10min，87%B；10-15min，87%-85%B；15-20min，85%-84%B；20-32min，84%-82%B；32-35min，82%-80%B；35-40min，80%-78%B；40-55min，78%-75%B；55-70min，75%-70%B；70-80min，70%-60%B；80-90min，60%-35%B；90-95min，35%-20%B；95-105min，20%-10%B；105-110min，10%-5%B；110-115min，5%-10%B；115-120min，10%-20%B；120-130min，20%-90%B；130-150min，90%B。

本實(shí)施例所用無籽刺梨粉末是指無籽刺梨果實(shí)部分。

試驗(yàn)例2：方法學(xué)考查

1 材料

島津LC-20A高效液相色譜儀（包括二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測(cè)器，LC solution色譜工作站），電子分析天平，超純水機(jī)。

蘆丁、槲皮素和山奈酚對(duì)照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司（供含量測(cè)定用，純度≥98%）。乙腈、甲醇、正丁醇和乙酸乙酯（色譜純，科密歐），水為超純水，其余試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件安捷倫C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為A：乙腈，B：0.1％磷酸水溶液，梯度洗脫程序：0-5min，90-87％B；5-10min，87％B；10-15min，87％-85％B；15-20min，85％-84％B；20-32min，84％-82％B；32-35min，82％-80％B；35-40min，80％-78％B；40-55min，78％-75％B；55-70min，75％-70％B；70-80min，70％-60％B；80-90min，60％-35％B；90-95min，35％-20％B；95-105min，20％-10％B；105-110min，10％-5％B；110-115min，5％-10％B；115-120min，10％-20％B；120-130min，20％-90％B；130-150min，90％B；體積流量0.7ml/min,；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，各成分分離度良好。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

稱取減壓干燥至恒重的對(duì)照品適量，加入甲醇配制成沒每1ml含蘆丁1.05mg、槲皮素0.64mg、山奈酚1mg的單標(biāo)，分別取110μl、5μl、2μl定容至1.5ml制備混合對(duì)照品溶液A。混合對(duì)照品溶液A中蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量分別為0.1155mg、0.0032mg、0.002mg。

2.3 供試品溶液制備

去無籽刺梨粉末約1g，精密稱定，精密加入100%甲醇25ml稱定重量，超聲提取30min，冷卻后補(bǔ)重，搖勻，靜止，過濾，收集殘?jiān)俅渭尤?5ml100%甲醇，重復(fù)上述提取步驟，合并濾液并減壓蒸發(fā)至幾無甲醇；加入10ml超純水，40ml水飽和正丁醇萃取兩次，再加入10ml乙酸乙酯萃取兩次，合并濾液，減壓蒸發(fā)至1ml左右，用甲醇溶解并定容至10ml，即得。

2.4線性關(guān)系的考察

分別精密吸取混合對(duì)照品A溶液2μl、4μl、8μl、10μl、20μl進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得各對(duì)照品的回歸方程和線性范圍(表1)。

表1對(duì)照品的線性關(guān)系和范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果蘆丁、槲皮素和山奈酚峰面積的RSD分別為1.102%、0.991%、1.110%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份樣品（JC）粉末6份，按2.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。結(jié)果蘆丁、槲皮素和山奈酚RSD分別為1.51%、2.01%、1.78%。表明方法的重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液（JC），分別在0、2、4、8、16、48h進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果蘆槲皮素和山奈酚峰面積的RSD分別為1.102%、0.991%、1.110%。表明供試樣品溶液48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的JC樣品粉末約0.5g平行6份，精密稱定。分別依次加入100%甲醇配置的蘆丁、槲皮素和山奈酚對(duì)照品350μl、15μl、2μl，按供試品溶液制備方法制備。精密吸取加樣回收溶液10μl，注入液相色譜儀測(cè)定其含量。根據(jù)公式，加樣回收率（%）=（A-B）/C*100(A為實(shí)測(cè)量，B為樣品中被測(cè)物質(zhì)量，C為加入對(duì)照品量），分別計(jì)算各成分加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品的含量測(cè)定取無籽刺梨果實(shí)粉末，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μl，注入液相色譜已進(jìn)行測(cè)定。采用外標(biāo)法計(jì)算無籽刺梨果實(shí)中3種黃酮類成分的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本研究建立了以HPLC法同時(shí)測(cè)定無籽刺梨果實(shí)中3種黃酮類成分含量的方法，這3種成分分別為蘆丁、槲皮素和山奈酚，該方法能夠較為準(zhǔn)確、穩(wěn)定的測(cè)定無籽刺梨果實(shí)中主要黃酮類成分的含量。

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

分別對(duì)3個(gè)被測(cè)成分進(jìn)行200-500nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)為268nm，槲皮素最大吸收波長(zhǎng)為359nm，山奈酚最大吸收波長(zhǎng)為360nm。為兼顧3個(gè)成分的最大吸收，試驗(yàn)過程中對(duì)已有文獻(xiàn)記載的黃酮類物質(zhì)較好吸收波長(zhǎng)分別做了測(cè)試，分別為254、265、280、360nm，最終確定360nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 供試品提取方法的考查

分別考察了不同提取方式、不同體積比甲醇、酸水解處理、不同料液比和不同提取時(shí)間。最終確定以1.0g粉末加入100%甲醇25ml作提取劑提取兩次，并使用水飽和正丁醇和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，作為供試品溶液的制備方法。

3.2.1 提取方式的考察

精密稱取JC無籽刺梨粉末約1.0g，3份，以100%甲醇30ml作提取劑，各以超聲30min2次、回流30min次以及超聲30min加2mol/L Hcl回流30min作為提取方法，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μl供試品溶劑注入高效液相色譜儀，色譜條件同2.1，結(jié)果如表4所示。

結(jié)果可知，超聲提取的成分色譜峰面積普遍較大，超聲加酸解回流的方式對(duì)槲皮素含量影響較大，故選取超聲提取方式。

3.2.2 甲醇體積比考察

精密稱取JC無籽刺梨粉末1.0g，6份，分別加入50%、60%、70%、80%、90%、100%v/v甲醇30ml作為提取溶劑，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μl供試品溶液注入高效液相色譜儀，色譜條件同2.1，結(jié)果如表5所示。

結(jié)果可知，100%甲醇提取的各成分色譜峰面積較大，譜圖基線較平，故選取100%甲醇作為提取溶劑。

3.2.3 料液比考察

精密稱取JC無籽刺梨果實(shí)粉末1.0g，4份，分別加入100%甲醇25ml、30ml、40ml和50ml作為提取溶劑，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μl供試品溶液注入高效液相色譜儀，色譜條件同2.1，結(jié)果如表6所示。

結(jié)果可知，料液比為1:25的提取效率較高。

3.2.4 提取時(shí)間考察

精密稱取JC無籽刺梨果實(shí)粉末1.0g，4份，以100%甲醇30ml作為提取溶劑，分別超聲提取30min、60min、90min、120min各兩次，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μl供試品溶液注入高效液相色譜儀，色譜條件同2.1，結(jié)果如表7所示。

結(jié)果表明，超聲30min提取2次時(shí)3種黃酮類成分的峰面積較大，且不再隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而增大，故確定提取時(shí)間為30min，提取2次。

最終確定以1.0g無籽刺梨果實(shí)粉末加入100%甲醇25ml，超聲30min，提取2次，分別使用水飽和正丁醇和乙酸乙酯萃各取2次，作為供試品溶液的制備方法。

3.3 色譜條件考察

對(duì)色譜系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水）、酸種類（磷酸、甲酸）、酸水濃度、流動(dòng)相梯度、柱溫及流速分別進(jìn)行了考察。由于樣品中大極性物質(zhì)較多，使供試樣品提取物全部達(dá)到基線分離是本研究的難點(diǎn)。選用甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，系統(tǒng)壓力較大，故初步選擇乙腈-水為流動(dòng)相；分別以0.1%的磷酸和甲酸作為流動(dòng)相B，使用磷酸的峰形和分離度較好；分別以0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%磷酸水溶液作為流動(dòng)相B，0.1%磷酸水溶液可以達(dá)到較好的分離；在增大或降低流動(dòng)相中有機(jī)相比例進(jìn)行反復(fù)的條件篩選，最終選定的色譜條件能較為理想的分離樣品提取物，且基線較平；考察了柱溫為25℃、30℃、40℃使的分離效果，確定30℃可以較好的分離；分別考察了流速為0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min，在0.7ml/min流速下分離較好。

最終確定的色譜條件為：

色譜柱：十八烷基鍵合硅膠為填料

檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm

體積流量：0.7ml/min

柱溫：30℃

進(jìn)樣量：10μl

流動(dòng)相：流動(dòng)相為A：乙腈，B：0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫程序： 0-5min，90-87%B；5-10min，87%B；10-15min，87%-85%B；15-20min，85%-84%B；20-32min，84%-82%B；32-35min，82%-80%B；35-40min，80%-78%B；40-55min，78%-75%B；55-70min，75%-70%B；70-80min，70%-60%B；80-90min，60%-35%B；90-95min，35%-20%B；95-105min，20%-10%B；105-110min，10%-5%B；110-115min，5%-10%B；115-120min，10%-20%B；120-130min，20%-90%B；130-150min，90%B。

當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。